1 Die subzelluläre Lokalisation und Wirkung auf a-Tubulin von ...

präformierten Taschen wurden je 3µl der auf Eis gelegten
Sequenzreaktionen pipettiert. Durch die angelegte Spannung wanderten die
Banden, die sich in ihrer Länge immer um ein Nukleotid unterschieden,
durch das Gel. Hierbei wurden diese mit Hilfe der markierten Primer von
einem Laser detektiert. Mit Hilfe eines angeschlossenen Rechners konnte
ein fortlaufendes Bild der durch das Gel laufenden Banden erstellt werden
(s. Abbildung 3). Mit diesem konnte dann die Sequenz des untersuchten
DNA-Stückes ermittelt werden.
3.2.6 Mutagenese der Spastin-cDNA
Bei der in dieser Arbeit verwendeten „site-directed mutagenesis“ wird durch entsprechend
konzipierte Primer mit Hilfe einer PCR eine Veränderung der Basenfolge bewirkt. Hier
wurden Punktmutationen eingeführt, die zu einem Aminosäureshift führten. Bei dieser
Methode wird das restliche Gen mit dem Vektor unverändert übernommen. In E. coli
klonierte DNA wird von den Bakterien methyliert. Die durch die Mutagenese entstandene
DNA weist keine Methylierungen auf. Dadurch ist es möglich durch ein spezielles Restriktionsenzym
nur die methylierte, unveränderte DNA abzubauen.
Material: Stratagene QuikChange XL (Cat-Nr. 200517)
Im Kit: XL 10-Gold Ultracompetent Cells
enthält: PfuTurbo DNA-Polymerase
QuikSolution
DpnI (Restriktionsendonuklease)
10xReaktionspuffer: 100mM KCL
100mM (NH 4 ) 2 SO 4
200mM Tris-HCL (pH 8,8)
20mM MgSO 4
1% Triton X-100
1mg/ml Bovine Serum Albumin (BSA)
Klonierungsplatten:
1l LB-Medium
15g Agar-Agar
1‰ Ampicillin
2‰ X-Gal
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