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B L I T Z L I C H T Bioseparation � DNAce Quick Clean-Verfahren verkürzt DNA-Aufreinigung Slava Pavlovets, Bioline Ltd., London Die Firma Bioline hat mit DNAce Quick Clean ein einfaches, schnelles und preiswertes System zur DNA-Fällung auf den Markt gebracht. Bei dem neuen Verfahren wird in 15 Minuten doppelsträngige DNA mit mehr als 50 Basenpaaren (Bp) aus PCR, enzymatischem Verdau oder anderen biochemischen Reaktionen aufgereinigt und aufkonzentriert. Durch die Behandlung mit DNAce Quick Clean werden mehr als 98% der Enzyme, Primer und markierten oder unmarkierten dNTPs (Desoxyribo-Nucleosidtriphosphate) entfernt. Das neue Verfahren liefert, verglichen mit anderen Verfahren wie der Ethanol-Fällung oder der Säulenchromatographie, eine gleich gute oder sogar bessere Ausbeute und Reinheit der DNA. DNAce Quick Clean eignet sich besonders für Hochdurchsatzanwendungen mit DNA-Arrays, bei konventioneller Sequenzierung, Genotypisierung sowie SNP-Typisierung. DNA- Fragmente mit mehr als 50 Bp können ohne organische Lösungsmittel, Glass-milk ® oder Chromatographiesäulen in nur 15 Minuten abgetrennt werden. Bei nahezu 100prozentiger Ausbeute kann die aufgereinigte DNA sofort weiterverarbeitet werden. Im Vergleich dazu dauert das Verfahren mit der Säulenchromatographie 20 Minuten, eine Fällung mit Ethanol 30 Minuten. In unserem Experiment führten wir eine PCR mit anschließender Aufreinigung durch. Bei der PCR entstanden ein 125 Bp-großes doppelsträngiges DNA-Fragment (dsDNA) und – was bei nicht optimalen Bedingungen häufig der Fall ist – auch ein kleines einzelsträngiges Nebenprodukt (ssDNA). Im Gegensatz zur Aufreinigung mit herkömmlichen Kieselgel-Membranen, bei denen die ssDNA nicht abgetrennt wird, werden DNA- Fragmente, die kleiner als 50 Bp sind, mit dem DNAce Quick Clean abgetrennt (Abb. 1). Quick Clean wird mit dem PCR-Mix entweder im Verhältnis 1:1 (v/v) oder 1:2 (v/v) gemischt. Wenn im Ausgangsgemisch neben dsDNA auch RNA enthalten ist, kann diese ebenfalls mit Quick Clean von der dsDNA getrennt werden. Besonders deutlich ist die Trennung bei einem Mischungsverhältnis von 1:1 (v/v), während bei einem 1:2-Verhältnis (v/v) die RNA vermehrt ausfällt (siehe Tabelle). Die Aufreinigung mit Quick Clean erfolgt in drei Schritten: 1. Der PCR-Mix und DNAce Quick Clean werden im Verhältnis 1:1 (v/v) gemischt. Wenn das DNA-Fragment kleiner als 100 Bp ist, wird die doppelte Menge von Quick Clean empfohlen. Anschließend wird für fünf Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Eine längere Inkubationsdauer erhöht die Ausbeute und wird bei DNA-Fragmenten empfohlen, die kleiner als 100 Bp sind. 2. Die Proben werden in einer Tischzentrifuge zehn Minuten lang auf höchster Stufe zentrifugiert. Auch hier erhöht eine längere Dauer die Ausbeute. Der Überstand wird verworfen. Ein oder mehrere Waschschritte mit 70prozentigem Ethanol verbessern die Ausbeute. 3. Das DNA-Pellet wird mit der gewünschten Menge TE-Puffer, Wasser oder einem anderen geeigneten Puffer resuspendiert und ist für weitere Untersuchungen einsetzbar. In einem weiteren Versuch wurde der DNA-Größenmarker Hyperladder V (Bioline) mit DNAce Quick Clean aufgereinigt (Abb. 2). Hyperladder V umfaßt 25 bis 500 Bp und besteht aus 12 Banden, die in gleichmäßigen Abständen angeordnet sind. Alle Fragmente mit mehr als 50 Bp wurden vollständig ausgefällt, während die kleineren Fragmente im Überstand abgetrennt wurden. Mit Quick Clean lassen sich verschiedene Bestandteile von der dsDNA effektiv ab- Tab. 1: Fraktionen der mit der dsDNA durch die Quick Clean-Behandlung ausgefällten Bestandteile Bestandteile Mischungsverhältnis 1:1 (v/v) Mischungsverhältnis 1:2 (v/v) ssDNA 10% 25% RNA 8% 37% Primer/Primerdimere
B L I T Z L I C H T Metagenomik � Unkultivierte Mikroorganismen als Ressource für neuartige Enzyme und Wirkstoffe Dr. Guido Meurer, Dr. Jürgen Eck, B.R.A.I.N AG, Zwingenberg Als Torsvik und Goksyr 1 1978 die direkte Isolation von DNA aus einer Umweltprobe beschrieben, öffneten sie den Weg zur umfassenden molekularbiologischen Untersuchung der unkultivierbaren mikrobiellen Biodiversität. Erst 20 Jahre später prägten Goodman et al. 2 den Begriff „Metagenom“ für die Gesamtheit der Genome von Organismen aus einem bestimmten Habitat und gaben damit dieser Forschungsrichtung ihren Namen. Daß die Metagenomik inzwischen den Kinderschuhen entwachsen ist, belegt der erste Workshop zu diesem Thema, den Dr. Christa Schleper, TU Darmstadt und die BRAIN AG Mitte Juni in Darmstadt ausrichteten (siehe transkript 10/2003). Zwei Tage lang diskutierten Wissenschaftler der Metagenomik die Erforschung der Evolution, Physiologie, Ökologie und industriellen Nutzung mikrobieller Gemeinschaften. Neben der Grundlagenforschung profitiert vor allem auch die Biotechnologie von der Metagenomik, da sie den Zugang zu bisher nicht genutzten Quellen für neuartige Enzyme, Biokatalysatoren und bioaktive Substanzen eröffnet. Im Rahmen einer nachhaltigen Produktion setzt die Prozeßindustrie zunehmend auf mikrobielle Enzyme zur Biotransformation. Bei einer jährlichen Wachstumsrate von vier Prozent wird der Umsatz an Enzymen für Reinigungsmittel, in der Textil-, Leder- und Papierindustrie sowie der Chemiebranche im Jahr 2005 allein in den USA voraussichtlich insgesamt 336 Mio. US-$ betragen (Business Communications Comp., 2001). Vor allem bei der Synthese enantiomerenreiner Intermediate, mit denen im vergangenen Jahr 14,5 Mrd. US- $ umgesetzt wurden (D&MD Reports, 2003), verspricht man sich vom Einsatz stereoselektiver Enzyme kosteneffiziente, ressourcenschonende Herstellungsverfahren. Bedarf an neuen Enzymen, Biokatalysatoren und Wirkstoffen Für viele Prozesse stehen allerdings keine geeigneten Biokatalysatoren zur Verfügung. Auch hier baut man aufgrund ihrer biosynthetischen Vielfalt auf Mikroorganismen als Lieferanten für neuartige Enzyme, die bisher nur chemisch katalysierbare Reaktionen ermöglichen. Um den Bedarf an neuartigen Wirkstoffen und Enzymen zu decken, reicht die Zahl der heute bekannten und kultivierbaren Mikroorganismen allerdings nicht aus. So gehört etwa die Mehrzahl der mit klassischen Methoden gewonnenen Enzyme zu Gruppen mit bereits bekannten Reaktionsmechanismen. Um neue Biokatalysatoren und Substanzklassen zu identifizieren, müssen neue mikrobielle Ressourcen erschlossen werden. Naturstoffe aus Bakterien und Pilzen sind aber nicht nur in der chemischen Industrie gefragt. Trotz moderner Methoden wie der kombinatorischen Chemie zur Definition neuer Leitstrukturen sind bioaktive Substanzen als Basis neuer Medikamente weiterhin von Bedeutung. 39 Prozent der zwischen 1983 und 1994 neu zugelassenen 520 Arzneimittel basieren auf Naturstoffen. Bei antibakteriellen und antitumoralen Medikamenten liegt der Anteil sogar bei über 60 Prozent 3 . Speziell für diese Indikationen konzentriert sich die Suche nach neuartigen Leitstrukturen auf Bakterien, Archaea und niedere Pilze, denn sie haben im Lauf der Evolution Synthesewege für eine unüberschaubare Vielfalt von bioaktiven Peptiden und niedermolekularen Substanzen entwickelt. Screeningprogramme, die sich auf bislang ungenutzte Ressourcen konzentrieren, sollen den Pool an neuen Naturstoffen erweitern. Da die so gewonnenen Isolate jedoch meist schwer kultivierbar sind, stehen die von ihnen produzierten Naturstoffe nicht in beliebiger Menge und gleichbleibender Qualität zur Verfügung. Dies erschwert die präklinische Entwicklung pharmakologischer Wirkstoffe und macht deren großtechnische Herstellung unter Nutzung der Originalproduzenten praktisch unmöglich. Rekombinante Darstellung von Enzymen und Naturstoffen aus Metagenom-Banken Derzeit sind rund 5.000 Bakterienarten bekannt. Dies ist aber nur ein Bruchteil der, vorsichtig geschätzt, 40.000 bis 4.000.000 Bakterien-Spezies. Deren Charakterisierung, Analyse und biotechnologische Nutzung wird aber dadurch erschwert, daß – wie molekularbio- logische Untersuchungen zeigen – 99 Prozent der in einer Umweltprobe enthaltenen Mikroorganismen mit gängigen Methoden nicht kultiviert werden können 4 . Selbst eingehend erforschte Habitate wie Böden und Sedimente sind daher als Quelle neuer technischer Enzyme und Wirkstoffe kaum erschlossen. Um diese Ressourcen zu nutzen, werden bei BRAIN AG moderne molekulargenetische und biochemische Verfahren zur rekombinanten Darstellung von Naturstoffen aus Umwelt- DNA entwickelt und angewendet. Unabhängig von der Kultivierbarkeit der Organismen wird genomische DNA direkt aus Proben isoliert und in geeigneten Vektoren als rekombinante Genbank in heterologen Wirten dargestellt. Im Idealfall enthält eine solche Metagenom-Bank den Großteil der gesamten genomischen Information einer mikrobiellen Population. Diese direkte Abbildung in einer flexibel einsetzbaren Genbank erweitert signifikant die verfügbare Biodiversität um die bislang nicht kultivierten Mikroorganismen. Insbesondere sichert die heterologe Darstellung von Naturstoffen und Enzymen in Wirtsorganismen, die unter standardisierbaren Bedingungen kultiviert werden können, daß diese Substanzen für die weitere Entwicklung nachhaltig verfügbar sind. Umwelt-DNA wird in komplexen ‚large insert libraries‘ (Metagenom-LIL ® ) oder ‚activity-based expression libraries‘ (Metagenom- ABEL ® ) gesichert, die jeweils für unterschiedliche Untersuchungen und Anwendungen optimiert sind. Bei der Suche nach neuartigen technischen Enzymen und Biokatalysatoren werden in der Regel komplexe Expressions- Abb. 1: Nach schonender Isolierung der Metagenom-DNA aus Bodenproben können durch Puls- Feld-Elektrophorese in einem Zwei-Phasen-Gel, bei dem die erste Phase Polyvinylpyrrolidon zur Komplexierung von Polyphenolen enthält, DNA- Fragemente von bis zu 600 kBp gelelektrophoretisch aufgereinigt werden. LABORWELT 4. Jahrgang | Nr. 4/2003 | 33
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