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W I S S E N S C H A F T Abb. 2: Schematische Darstellung der Rekristallisation von verschiedenen S-Schicht-Fusionsproteinen auf festen Trägern, die mit sekundärem Zellwandpolymer (SZWP) beschichtet wurden. Chimäre S- Schichten die als funktionelle Sequenz (1) die variable Domäne eines Kamelantikörpers, (2) die IgG- Bindungsdomäne oder (3) Streptavidin inkorporieren. Je nach Fusionsprotein-Typ können entweder (1) Antigene, (2) Antikörper oder (3) biotinylierte Moleküle gebunden werden. tur-Funktionsanalysen ergaben, daß eine Cterminal um 200 Aminosäuren (AS) verkürzte SbpA-Form eine bessere Zugänglichkeit des C-Terminus aufwies als das Protein in seiner gesamten Länge von 1268 AS 6 . Auf diesen Resultaten basierend wurden S-Schicht-Fusionsproteine konstruiert, die entweder das Hauptbirkenpollen-Allergen (161 AS), Streptavidin (118 AS), die Immunglobulin G (IgG)- Bindungsdomäne (116 AS) oder verschiedene variable Domänen von Kamelantikörpern (117 AS) am C-Terminus des S-Schicht-Proteins trugen. Alle Fusionsproteine konnten in Escherichia coli rekombinant produziert werden. Anwendungsspektrum der S-Schicht-Fusionsproteine Das erste S-Schicht-Fusionsprotein, das die Sequenz des Hauptbirkenpollen-Allergens Bet v1 inkorporiert, wurde konstruiert, um spezifisch IgE-Moleküle aus dem Serum von Birkenpollenallergikern nachzuweisen. Dieses S-Schicht-Fusionsprotein besitzt einerseits die Fähigkeit zum Self-Assembly, andererseits die funktionelle Eigenschaft des fusionierten Allergens, Bet v1-spezifische IgE- Moleküle aus dem Serum von Allergikern zu binden. Dieses Fusionsprotein könnte auf Grund seiner spezifischen Eigenschaften sowohl in der Biochip-Technologie als auch in der antiallergischen Immuntherapie zur Anwendung kommen 7 . Auf Basis eines S-Schicht-Fusionsproteins, das als bioaktives Peptid Streptavidin inkorporiert, wurden mittels eines speziell entwikkelten Faltungsprotokolls in Gegenwart von monomeren Streptavidin, funktionelle S- Schicht-Streptavidin-Heterotetramere hergestellt, die zur Bindung jeglicher biotinylierter Moleküle (z.B. DNA, Oligonukleotide, Peptide, Antikörper etc.) befähigt sind 8 . Ein weiteres S-Schicht-Fusionsprotein, das die Bindungsstelle von Protein A für den konstanten Teil von IgG-Molekülen trägt kann auf Mikropartikeln aus biokompatiblen Polymeren rekristallisiert, mittels „Crosslinkern“ stabilisiert und für die spezifische Bindung von human-IgG ausgenützt werden. Diese funktionellen Mikropartikel sollen als spezifische IgG-Adsorbentien in der extrakorporalen Blutreinigung zum Einsatz kommen 9 . Weiters wurde durch die Fusion des S- Schicht-Proteins mit der variablen Domäne eines Kamelantikörpers, ein spezifisches Antigen-erkennendes Protein konstruiert. Die Besonderheit einer speziellen Gruppe von Kamelantikörpern im Vergleich zu konventionellen Antikörpern beruht auf dem völligen Fehlen der leichten Ketten sowie der Abwesenheit der ersten konstanten Domänen der schweren Ketten. Die Antigen-Bindungstasche wird also nur von der variablen Domäne der schweren Kette ausgebildet, wodurch sich eine Vereinfachung gegenüber den sogenannten „single chain“-Antikörpern ergibt, da auf den synthetischen Linker zwischen der variablen Domäne der leichten und der schweren Kette verzichtet werden kann. Als Modellsystem zur Überprüfung der Funktionalität der fusionierten variablen Domäne eines Kamelantikörpers wurde ein S-Schicht-Fusionsprotein hergestellt, das am C-Terminus eine gegen Lysozym gerichtete variable Domäne trägt. Lysozym als Antigen wurde auf Grund der gut aufgeklärten Antigen-/Antikörperbindung gewählt. Die Bindungsfähigkeit des Proteins für Lysozym wurde mittels ELISA, Immunoblots sowie anhand von Surface Plasmon Resonance (SPR)-Versuchen bestätigt. Die Fähigkeit, wie für dieses S-Schicht-Protein typisch, in Form eines quadratischen Gitters auf peptidoglykanhältigen Zellwandfragmenten als auch auf SZWP-beschichteten Goldplättchen zu assemblieren, konnte mit Hilfe des Elektronenmikroskops und des Atomkraftmikroskops (AFM) bestätigt werden 10 . In weiterer Folge steht nun die Konstruktion eines Fusionsproteins bevor, das die variable Domäne eines Kamelantikörpers inkorporiert, die das Prostata-spezifische Antigen (PSA) erkennt. Das Monitoring der PSA-Konzentration im Blutserum wird zur Früherkennung von Prostatatumoren herangezogen. Eine PSA-bindende chimäre S-Schicht könnte daher in der Diagnostik zur PSA-Quantifizierung zur Anwendung kommen. Die Einsatzgebiete der S-Schicht-Fusionsproteine sind mannigfaltig. Rekristallisierte chimäre Proteine können zum Beispiel als „Lab-on-Chip“-Diagnostika ihre Anwendung finden. Ein breites Anwendungsspektrum eröffnet sich auch im Bereich der markierungsfreien Nachweissysteme basierend auf dem Quarz Crystal Microbalance Dissipation Monitoring (QCM-D), der Surface Acoustic Wave (SAW) oder der Surface Plasmon Resonance (SPR)-Technik, wobei ein Bindungsvorgang ohne die Notwendigkeit von markierten Molekülen nachgewiesen werden kann. Literatur [1] Sleytr, U. B., Messner, P., Pum, D., and Sára, M., Angew. Chem. Int. Ed. 38, (1999) 1034-1054 [2] Sleytr, U. B., Sára, M., Pum, D., Schuster, B., Messner, P., and Schäffer, C. (2003) In: Biopolymers (Steinbüchel, A., and Fahnestock, S., eds) Vol. 7 pp. 285-338, Wiley-VCH, Weinheim, Germany [3] Sleytr, U. B., Sára, M., Pum, D., and Schuster, B. (2002) In: Nano-Surface Chemistry (Rosoff, M., ed) pp. 333-389, Marcel Dekker, Inc., New York - Basel [4] Sára, M., and Sleytr, U. B., J Bacteriol 182, (2000) 859-868. [5] Ilk, N., Kosma, P., Puchberger, M., Egelseer, E. M., Mayer, H. F., Sleytr, U. B., and Sára, M., J Bacteriol 181, (1999) 7643-7646. [6] Ilk, N., Völlenkle, C., Egelseer, E. M., Breitwieser, A., Sleytr, U. B., and Sára, M., Appl Environ Microbiol 68, (2002) 3251-3260. [7] Breitwieser, A., Egelseer, E. M., Moll, D., Ilk, N., Hotzy, C., Bohle, B., Ebner, C., Sleytr, U. B., and Sára, M., Protein Eng 15, (2002) 243-249. [8] Moll, D., Huber, C., Schlegel, B., Pum, D., Sleytr, U. B., and Sára, M., Proc Natl Acad Sci U S A 99, (2002) 14646-14651. [9] Weber, V., Weigert, S., Sára, M., Sleytr, U. B., and Falkenhagen, D., Ther Apher 5, (2001) 433-438. [10] Pleschberger, M., Neubauer, A., Egelseer, E. M., Weigert, S., Lindner, B., Sleytr, U. B., Muyldermans, S., and Sára, M., Bioconjug Chem 14, (2003) 440-448. Korrespondenzadresse Dipl.-Ing. Magdalena Pleschberger Mag. Dr. Eva M. Egelseer Zentrum für Ultrastrukturforschung und BMT-Research Universität für Bodenkultur Gregor Mendel-Straße 33, A-1180 Wien Tel.: +43-(0)1-47654 2209, Fax: -4789112 eMail: magdalena.pleschberger@boku.ac.at Kennziffer 13 LW 04 · www.biocom.de 6 | 4. Jahrgang | Nr. 4/2003 LABORWELT �
W I S S E N S C H A F T Zellbiologie � Effiziente Isolierung adulter Schwannscher Zellen aus peripheren Nerven Dr. Norbert Weidner, Dipl. Biol. Maurice Vroemen, Klinik und Poliklinik für Neurologie, Universitätsklinik Regensburg Der potentielle Einsatz autologer Schwannscher Zellen zur Regeneration nach Läsionen peripherer Nerven beziehungsweise Remyelinisierung erfordert eine rasche und effiziente Isolierung dieser Zellen aus Biopsien peripherer Nerven. Mit Hilfe der Magnet-aktivierten Separation von p75 low affinity nerve growth factor receptor-exprimierenden Schwannschen Zellen ist es gelungen, die benötigte Zeit zur Aufreinigung dieser Zellen von drei bis sechs Wochen auf neun Tage bei einem hohen Grad der Aufreinigung zu reduzieren. Key Words: MACS, Axon, Regeneration, autologe Schwannsche Zellen, Transplantation, Zellkultur, p75 low affinity nerve growth factor receptor Die Rekrutierung endogener Schwannscher Zellen ermöglicht eine erfolgreiche Regeneration geschädigter Nervenprojektionen (Axone) im peripheren Nervensystem. Dies ist jedoch nur bis zu einem bestimmten Ausmaß der Schädigung möglich. Bei längerstreckigen Nervenschädigungen beziehungsweise -durchtrennungen sind intrinsische Regenerationsvorgänge nicht mehr in der Lage, strukturelle und funktionelle Wiederherstellung zu ermöglichen. Auch die Autotrans- schädigter Nerven erzielt werden 1,2 . Darüber hinaus wurden Schwannsche Zellen auch erfolgreich zur Förderung der Nervenregeneration und Remyelinisierung im Zentralnervensystem (ZNS) eingesetzt 3-5 . Optimalerweise sollten dabei die Zellen autolog sein, das heißt, sie sollten aus dem Gewebe des betroffenen Individuums (periphere Nervenbiopsie) gewonnen und nach Vermehrung in Zellkultur wieder in den Patienten reimplantiert werden. Abb. 1: Zeitlicher Ablauf vom Zeitpunkt der Nervenbiopsie (Tag 0) bis zur morphologischen/durchflußzytometrischen Analyse MACS p75LNGFr-separierter Schwannscher Zellen (Tag 11). (Abbildung mit freundlicher Genehmigung von Elsevier, modifiziert aus J. NEUROSCI. METHODS Vol.124, Vroemen et al., Purification of Schwann cells by..., S.135-143, © 2003). plantation von Hautnervenfragmenten ist bezüglich der Ausdehnung einer Nervenschädigung limitiert. Alternativ können Schwannsche Zellen aus Biopsien von peripheren Nerven isoliert, in Kultur um ein Vielfaches vermehrt und nach Einbringen in Polymer-basierte, artifiziell hergestellte Leitstrukturen als Nervenersatz dienen. Durch den Einsatz derartiger Nervenersatzfragmente konnte tierexperimentell eine erfolgreiche Wiederaussprossung ge- Dieser Vorgang erfordert Zeit, die nach einer Nervenschädigung aber nur sehr begrenzt zur Verfügung steht, weil gleichzeitig intrinsische Reparaturvorgänge herunterreguliert werden 6 . Bislang existierende Verfahren erlauben die Isolierung Schwannscher Zellen je nach Methode in einem Zeitraum von drei bis sechs Wochen mit einer variablen Aufreinigungseffizienz 7-9 . Das Hauptproblem bei der Aufreinigung Schwannscher Zellen aus peripheren Nerven- fragmenten besteht in der Kontamination durch rasch proliferierende Bindegewebszellen, welche die Nervenfasern umgeben – die sogenannten Fibroblasten. Die hier vorgestellte Methode bedient sich der selektiven Expression des sogenannten p75 low affinity nerve growth factor receptors (p75LNGFr), der auf Schwannschen Zellen, nicht dagegen auf Fibroblasten exprimiert wird. Die eigentliche Aufreinigung p75LNGFr-exprimierender Schwannscher Zellen erfolgt mit einer etablierten Methode der Zellseparation, der sogenannten Magnet-aktivierten Zellseparation (MACS) 10 . Methode Der zeitliche Ablauf der MACS ist in Abbildung 1 illustriert. Zunächst werden durchschnittlich 35 mm lange Nervenfragmente des N. ischiadicus aus adulten Ratten entnommen, nach Entfernung bindegewebiger Hüllstrukturen (Peri-, Epineurium) in 1 mm dikke Stücke geschnitten und auf Kollagen beschichteten Kulturschalen ausplattiert. In den folgenden sieben Tagen werden diese Nervenfragmente in Kultur belassen, um die Degeneration und Auflösung von Zell-Zell-Verbindungen im Gewebeverband zu fördern. Am siebenten Tag erfolgt die Dissoziierung der Nervenfragmente mit Trypsin, Kollagenase, Hyaluronidase und Triturierung mit einer sterilen Einwegkanüle. Nach zwei weiteren Tagen in beschichteten Kulturflaschen erfolgt die eigentliche Aufreinigung der Schwannschen Zellen. Die Zellen werden nach Ablösen vom Boden der Zellkulturflaschen in Suspension gebracht, mit einem anti-p75LNGFr-spezifischen monoklonalen Primärantikörper und einem gegen Maus-IgG gerichteten Sekundärantikörper inkubiert, an den sogenannte Microbeads (Miltenyi Biotec, Jülich) gekoppelt sind. Derart inkubierte Zellsuspensionen werden auf eine MS-Säule (Miltenyi Biotec) aufgetragen, die sich in einem MiniMACS-Magneten befindet (Miltenyi Biotec). Schließlich werden Zellen, welche in der Säule verblieben sind (p75LNGFr-positive Fraktion) oder ohne Absorption die Säule durchgelaufen haben (p75LNGFr-negative Fraktion) sowie nicht aufgereinigte Zellsuspensionen zur Überprüfung der Reinheit mittels Phasenkontrastuntersuchung/Immunfluoreszenz-Zytochemie qualitativ und mittels Durchflußzytometrie quantitativ untersucht. Resultate Die zur Beurteilung der Morphologie herangezogene phasenkontrastmikroskopische Analyse zeigt, daß in der Magnetsäule verbliebene Zellen (p75LNGFr-positive Fraktion) fast ausschließlich die typische bipolare Mor- Kennziffer 14 LW 04 · www.biocom.de 8 | 4. Jahrgang | Nr. 4/2003 LABORWELT �
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