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Die Auswahl der Lichtquelle ist ein Beispiel
für die Kompromisse bei der Konstruktion der
Fluoreszenzdetektoren. Bei dem Standard-
Fluoreszenz-Detektor wird ein Bereich von 190
bis 900 nm abgedeckt, wobei bei der Messung
ein Bereich von ± 10 nm um die gewünschte
Anregungswellenlänge relevant ist. Der Rest
der Lampenenergie wird verschwendet und
kann durch entstehende Wärmeenergie zur
Dekomposition der Probe führen. Bei der Laser-induzierten
Fluoreszenz wird der Laser
speziell auf die Applikation und die dabei benötigte
Wellenlänge hin ausgewählt. Mit Hilfe
der Kopplungseinheit (Abb. 3, Teil 2) sowie
der Kombination des Objektives mit der Kugellinse
(Abb. 3, Teil 7 und 9) kann die Anregungsstrahlung
der Laserquelle präzise auf
die Meßzelle fokussiert werden. Die Linse mit
der großen Apertur maximiert die Fluoreszenz-Intensität
durch die Optimierung der Illumination
(Ausleuchtung) des Inneren der
Kapillare. Ein weiterer Vorteil der Laser ist, daß
diese monochromatisches Licht liefern. Dies
stellt sicher, daß die gewünschte Wellenlänge
zum Einsatz kommt. Bei der konventionellen
Fluoreszenz kann es dazu kommen, daß der
Monochromator seine Kalibration verliert und
damit nicht mehr die gewünschte Wellenlänge
beobachtet wird.
Einsatz von Laser-induzierter
Fluoreszenz
Die Vorteile der Laser-Induzierten Fluoreszenz
lassen diese Detektionsweise besonders geeignet
im Zusammenhang mit der Kapillar-Elektrophorese
und der Nano- und Mikro-HPLC
erscheinen. Dies liegt insbesondere in der genauen
Fokussierung des Laserstrahls auf die
Kapillare, die in der CE und der Nano- und
Mikro-HPLC in Kombination mit der Kugellinse
die Meßzelle darstellt. Tabelle 1 zeigt eine
Auswahl an Molekülen mit einer natürlichen
Fluoreszenz, dem eingesetzten Laser, der verwendeten
Methode sowie dem Detektionslimit.
Daneben sind eine Vielzahl weiterer Laser
und Wellenlängen verfügbar sowie bei
nicht vorhandener natürlicher Fluoreszenz
unterschiedliche Möglichkeiten der Derivatisierung
(weiterführende Literatur zur Derivatisierung1,
2 ).
Als Beispiel für die Leistungsfähigkeit der
Detektion derivatisierter Proben zeigt die Abbildung
4 die Trennung und Detektion von
fünf Peptiden, die ihre biologische Funktion
in sehr geringen Konzentrationen ausüben.
Das eingesetzte Analysensystem bestand aus
einem Agilent Kapillar-Elektrophorese-System
mit einem Picometrics ZETALIF 2000-
Detektor und einem Argon-Ionen-Laser
(488 nm, 15 mW). Als Trennsäule diente eine
77 cm lange fused-silica-Kapillare mit einem
Innendurchmesser von 50 µm (62 cm effektive
Länge). Der Puffer bestand aus einem Gemisch
von 40 mM Borat und 10 % Ethylenglykol
(v : v) bei einem pH =10. Als Spannung
wurden 23 kV bei 54 µA angelegt, die Injekti-
B L I T Z L I C H T
Abb. 3: Schematische Darstellung des optischen
Layouts des ZETALIF Laser-induzierten Fluoreszenzdetektors:
1. Laser, 2. Kopplungs-Einheit, 3.
Lichtleiter, 4. Kollimator, 5. Laserstrahl, 6. halbdurchlässiger
Spiegel, 7. Objektiv, 8. Laserstrahl,
9. Kugellinse, 10. Kapillare, 11. Fluoreszenzsignal,
12. Filterblock, 13. Photonenverstärker
on erfolgte mit 50 mbar über 10 Minuten mit
2 Minuten umgekehrter Polarität von -23 kV.
Die Konzentration der fünf Peptide in dem
wäßrigen Standard betrug 5 x 10 –1 M, womit
sich ein rechnerisches Detektionslimit von 10
Attomol bei einem Signal-Rauschverhältnis
von 1 : 3 ergibt. Wenn auch die Bestimmung
dieser biologischen Peptide aufgrund ihrer
Metabolisierung in vivo schwierig ist, so
scheint die Sensitivität der vorgestellten Me-
Tab. 1: Komponenten mit natürlicher Fluoreszenz
thode für wäßrige Standards und der damit
möglichen Anwendung in in vitro-Versuchssystemen
ausreichend 12 . Gerade die exakte
Fokussierung des Laserstrahls auf die Kapillare
läßt diese Detektionsmethode geeignet im
Zusammenspiel mit der Kapillar-Elektrophorese
und der Nano- und Mikro-HPLC erscheinen
– eine in Zeiten der Proteomics zukunftsweisende
Miniaturisierung der Trenntechnik.
Literatur
[1] G.G. Guibault, Practical Fluorescence, Marcel Dekker, New York (1990)
[2] G. Lunn, L.C. Hellwig, Handbook of Derivatization for HPC, Wiley-Interscience
(1998)
[3] C. Prata, P. Bonnfous, N. Fraysse, M. Treilhou, V. Poinsot, F. Couderc,
Electrophoresis 22 (2001), 4129-4138
[4] S. J. Lillard, E. S. Yeung Analytical Chemistry 67 (1995), 3421-3426
[5] G. M. Janini, G. M. Muschick, H. Issacq, Journal of Chromatography 16
(1993), 1877-1890
[6] T. T. Lee, E. S. Yeung Analytical Chemistry 64 (1992) 3045-3051
[7] S. N. Nie, R. Dadoo, R. Zare, Analyical Cemistry 65 (1993), 3571-3575
[8] J. Kuijt, C. Garcia-Ruiz, G. J. Stroomberg, M. L. Marina, F. Ariese, U. A.
Brinkman, C. Gooijer, Journal of Chromatography A 907 (2001), 291-299
[9] P. Britz-McKibbin, K. Otsuka, S. Terabe Analytical Chemistry 15 (2002),
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[10] N. Simeon, Chatelut, P. Canal, M. Nertz, F. Couderc Journal of Chromatography
A 853 (1999), 449-454
[11] G. Hemple, P. Schulze-Westhoff, S. Flege, N. Laubrock, J. Boos, Electrophoresis
19 (1998) 2939-2943
[12] G. Bönner, Kinine und ACE-Hemmer in Herz-Kreislauf Informationen, Arcis
Verlag, München (1994)
Korrespondenzadresse
Dr. Hagen Preik-Steinhoff
SunChrom GmbH
Max-Planck-Str. 22
D-61381 Friedrichsdorf
eMail: hpreik@sunchrom.de
Substanz Wellenlänge Detektionslimit Trennmethode Referenz
Tryptophan 266 0,15 nM CE 3
Serotonin 266 1 nM CE 4
Peptide 266 1-10 nM CE 5
Proteine 266 60 ng/mL CE 6
PAH 325,266 nM, nM CE, CE 7, 8
Riboflavin 488 nM HPLC 9
Anthracycline 488 nM HPLC und CE 10, 11
Abb. 4: Detektion FITC-markierter Peptide mittels CE und LIF. 1. Bradykinin, 2. Angiotensin II, 3. Substanz
P, 4. Leucin-Enkephalin und 5. Tryptophan-Leucin-Dipetid. Informationen siehe Text.
LABORWELT 4. Jahrgang | Nr. 4/2003 | 39