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LABORWELT 

Nr. 4 / 2003 - Vol. 4 Das -Themenheft 

Biomolekulare 

selbst-assemblierende 

Systeme 

Dielektrophoretische 

Trennung biologischer 

Mikro- & Nanopartikel 

Bioseparation 

Biosepar Bioseparation ation 

Aufreinigung 

biotechnologischer 

Therapeutika 

Bioseparation mit 

monolithischen 

Kapillarsäulen 

Isolierung adulter 

Schwannscher Zellen 

Unkultivierbare 

Mikroorganismen als 

Wirkstoffressource 

Verbesserte 

HPLC-Analytik 

BIOCOM AG

Zum Thema � 

Bioseparation zeigt 

Umsatzstärke 

Mit 51 Prozent der Umsätze – rund 780 Mio. US-$ in diesem Jahr – 

belegen die Bioseparationstechnologien wie die 2D-Gelelektrophorese 

und HPLC den bei weitem größten Anteil des zukunftsträchtigen 

Proteomics-Marktes . Obgleich der Marktanteil laut einer aktuellen 

Studie des US-Marktforschungsunternehmens Front Line Strategic 

Management binnen fünf Jahren auf 44 Prozent sinken soll, bleiben 

die Techniken zur Trennung von Zellproteinen auch in Zukunft 

das umsatzstärkste Segment und wachsen bis zum Jahr 2008 auf 1,19 

Mrd. US-$. Für die Geräte- und Technologieanbieter gilt es, Proteine 

mit unterschiedlichsten Eigenschaften – sauer oder basisch, häufig 

oder selten, wasserlöslich oder wasserunlöslich, sehr groß oder extrem 

klein – reproduzierbar aufzutrennen. 

Im Vergleich der konkurrierenden Trenntechnologien 2D-Gelelektrophorese 

und LC/MS-Systeme attestiert die Studie den LC-Technologien 

eine wachsende Bedeutung. So zeigen monolithische Kapillarsäulen 

besonders bei kleinen Probenmengen eine verbesserte 

Trenneffizienz (vgl. Seite 19). Vor dem Hintergrund der schwierigen 

Reproduzierbarkeit der 2D-Gelelektrophorese richten sich die Hoffnungen 

unter anderem auf die Proteinfraktionierung durch vollautomatisierte 

2D-HPLC-Verfahren (Seite 21). 

Bitte nutzen Sie unseren Kennziffer-Service: online unter 

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Wenn Sie ein Produkt interessiert, einfach Nummer 

ankreuzen, Name und Adresse angeben und faxen/ 

mailen – Sie erhalten umgehend Informationen unserer 

Inserenten. 

Geht es dagegen um die industrielle Aufreinigung biotechnologischer 

Therapeutika – wie monoklonaler Antikörper aus Säugerzellen –, ermöglicht 

die „Expanded Bed Adsorption”-Technologie gegenüber 

konventionellen, zeitintensiven Zentrifugations- und Filtrationsverfahren 

die direkte Aufgabe des Fermenterinhaltes auf das Säulenbett 

und eine erste Aufreinigung in einem Schritt (Seite 14). 

Diese Ausgabe beschäftigt sich weiterhin mit der Nanobiotechnologie, 

wo sich einiges tut. So ist es österreichischen Wissenchaftlern 

gelungen, auf gentechnischem Wege funktionelle, bioaktive Peptide 

an selbst-assemblierende kristalline Zelloberflächenproteine, sogenannte 

S-Schicht-Proteine, zu fusionieren (Seite 4). Als Anwendungsmöglichkeiten 

bieten sich etwa „Lab-on-Chip”-Diagnostika an, da je 

nach Fusionsproteintyp Antigene, Antikörper oder DNA gebunden 

und nachgewiesen werden können. 

Wir begrüßen an dieser Stelle die Mitglieder der Deutschen Gesellschaft 

für Neurogenetik, des Netzwerkes Nutrigenomforschung und 

– im Zeichen der Nachwuchsförderung – der Biotechnologischen Studenteninitiative 

(btS), die seit kurzem im Rahmen ihrer Mitgliedschaft 

die LABORWELT beziehen. Gerne möchten wir Sie auch auf unseren 

im vorigen Heft gestarteten, kostenfreien akademischen Stellenmarkt 

aufmerksam machen (Seite 47). Wir wünschen Ihnen eine schöne, erholsame 

Urlaubszeit und sind Ende September mit dem Thema ‚Biooptik’ 

wieder für Sie da. 

Ihr LABORWELT-Team 

I N T R O 

INHALT � 

W I S S E N S C H A F T 

� Biomolekulare selbst-assemblierende Systeme 4 

Magdalena Pleschberger et al., Univ. f. Bodenkultur, Wien 


� Isolierung adulter Schwannscher Zellen 8 

Norbert Weidner et al., Universitätsklinik Regensburg 

B L I T Z L I C H T 

� Dielektrophoretische Trennung von Mikropartikeln 12 

Martin Stelzle et al., NMI, Universität Tübingen, Reutlingen 


� Aufreinigung biotechnologischer Therapeutika 14 

Silke Fetzer et al., Amersham Biosciences, Freiburg 


� Monolithische stationäre Phasen zur Bioseparation 19 

Sven Andrecht et al., Merck KGaA, Darmstadt 


� Proteinfraktionierung durch 2D-Chromatographie 21 

Dietmar Hansen et al., Beckman Coulter, Krefeld 


� Durchflußzytometrie und Zellsortierung 24 

Giovanni Salerno, DakoCytomation GmbH, Hamburg 

N E T Z W E R K 

� Nachhaltige Biokatalyse 27 

Rainer Erb et al., Deutsche Bundesstiftung Umwelt, Osnabrück 


� HPLC-Analytik durch das LaChrom Elite ® -System 30 

Wolf-Dieter Beinert et al., VWR International GmbH, Darmstadt 


� Unkultivierte Mikroorganismen als Ressource 33 

Guido Meurer, BRAIN AG, Zwingenberg 


� 2D-GE in den Proteomics: Zoom IPG Runner 36 

Karsten Wilking, Invitrogen GmbH, Karlsruhe 


� LIF-Detektion in HPLC und Kapillarelektrophorese 38 

Hagen Preik-Steinhoff et al., SunChrom GmbH, Friedrichsdorf 

� Produktwelt 44 

� Stellenmarkt 47 

� Verbände/Bestellformular 49 

� Termine/Impressum 50 

Die Hydroqualle Tima formosa wird im Zoo-Aquarium 

Berlin zusammen mit 12 anderen Quallenarten 

seit Jahren kontinuierlich aus ihren Polypen gezüchtet. 

Aufnahme: Christian Heller. 

LABORWELT 4. Jahrgang | Nr. 4/2003 | 3 

� 

Kennziffer 11 LW 04 · Informationen ordern? · www.biocom.de 

© Zoo-Aquarium, Berlin

Nanobiotechnologie 

� 


Biomolekulare selbstassemblierende 

Systeme für 

die Nanobiotechnologie 

Dipl.-Ing. Magdalena Pleschberger und Mag. Dr. Eva M. Egelseer, 

Zentrum für Ultrastrukturforschung und BMT-Research, Universität für Bodenkultur, Wien 

Biomolekulare selbst-assemblierende Systeme sind zukunftsweisende Bauprinzipien der 

„Bottom-up“-Strategie im Bereich der Nanotechnologie. Auf gentechnischem Weg ist es gelungen, 

funktionelle, bioaktive Peptide an kristalline Zelloberflächenproteine, sogenannte S- 

Schicht-Proteine, zu fusionieren. Auf Grund der kristallinen Struktur der S-Schichten sowie 

der hohen Dichte und der definierten Anordnung der fusionierten Peptid- oder Proteinsequenzen 

stellen chimäre S-Schichten eine ideale Matrix zur kontrollierten Bindung von Makromolekülen 

dar. 

Key Words: S-Schicht, Bacillus, rekombinante Fusionsproteine, sekundäres Zellwandpolymer 

Kristalline Zelloberflächen (sogenannte S- 

Schichten, englisch: surface-layers) bestehen 

aus einer einzigen Protein- oder Glykoproteinspezies 

und können als die einfachsten biologischen 

Membranen angesehen werden, 

die sich im Laufe der Evolution entwickelt 

haben 1-4 . Sie zählen zu den häufigsten Oberflächenstrukturen 

prokaryotischer Zellen. 

Auf Grund der hohen Regelmäßigkeit, so- 

wohl in der Anordnung der Poren als auch 

der funktionellen Gruppen, stellen S-Schichten 

einzigartige Systeme dar, um Struktur, 

Synthese, Genetik, den dynamischen Prozeß 

der Selbstorganisation sowie die Funktion 

einer supramolekularen Struktur zu erforschen. 

Isolierte S-Schicht-Untereinheiten 

zahlreicher Organismen besitzen die Fähigkeit, 

in Suspension, auf festen Trägern (z. B. 

Abb. 1: (1) Elektronenmikroskopische Aufnahme einer Gefrierätzung einer Bacillus sphaericus-Zelle, 

die das quadratische S-Schicht-Gitter zeigt, das von dem S-Schicht Protein SbpA gebildet wird. (2) 

Schematische Darstellung des quadratischen S-Schicht-Gittertyps. Eine morphologische Einheit (gelb) 

besteht aus vier Protein- oder Glykoprotein-Untereinheiten. (3) Atomkraftmikroskopische (AFM) Aufnahme, 

die die Rekristallisation des S-Schicht-Proteins SbpA in Form des quadratischen Gitters auf 

Silizium-Wafern, Gold-Chips, Plastikfolien), 

an der Wasser/Luft-Grenzfläche sowie auf 

Liposomen und Lipidfilmen in Form von 

monomolekularen kristallinen Gittern zu assemblieren. 

Die einzigartigen Eigenschaften 

von S-Schichten haben zu einem breiten Anwendungsspektrum 

im Bereich der Biotechnologie, 

der Biomimetik, der Molekularen 

Nanotechnologie, der Diagnostik und der 

Vakzineentwicklung geführt. 

Struktur und Aufbau der S-Schichten 

S-Schichten sind monomolekulare Assemblies, 

aufgebaut aus identischen Protein- oder 

Glykoprotein-Untereinheiten, mit einem 

Molekulargewicht von 40 bis 200 kDa. Sie 

bilden regelmäßige Gitter aus, die entweder 

schräge, quadratische (Abb. 1) oder hexagonale 

Symmetrie aufweisen. Die Gitterabstände 

der morphologischen Einheiten betragen 

3 bis 35 nm. Die S-Schicht findet sich bei 

Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien 

an der Oberfläche der Zellwand, dem 

Peptidoglykan oder dem Lipopolysaccharid 

der äußeren Membran. Bei den meisten Archaea 

stellen S-Schichten die einzige Zellwandkomponente 

außerhalb der Plasmamembran 

dar. Identitäten der S-Schicht-Proteinsequenz 

findet man zwischen den verschiedenen 

Bakterienstämmen hauptsächlich 

im Bereich des N-Terminus, der für die Verankerung 

der S-Schicht-Untereinheiten verantwortlich 

ist. Dieser interagiert über eine 

lektinartige Bindung mit einem spezifischen 

Glykan, dem sogenannten sekundären Zellwandpolymer 

(SZWP), das kovalent an das 

Peptidoglykan gebunden ist 5 . 

Fusion biologisch aktiver Peptid- oder 

Proteinsequenzen zur 

Funktionalisierung von Oberflächen 

Auf Grund ihrer einzigartigen Fähigkeit zur 

Selbstorganisation bei gleichzeitiger Erhaltung 

der Funktionalität des fusionierten Peptidanteils 

eröffnen S-Schicht Fusionsproteine 

erstmals die Möglichkeit der Herstellung von 

orientierten, funktionellen Proteingittern mit 

repetitiven Oberflächeneigenschaften bis in 

den Subnanometerbereich. Vereinfacht ergibt 

sich die Vorstellung eines molekularen Lego- 

Spiels, dessen Bausteine die Proteinkristalle 

repräsentieren. Basierend auf diesem „Baukastensystem“ 

eröffnen sich mannigfaltige 

Möglichkeiten, die durch die Fusion mit verschiedenen 

funktionellen Peptid- und Proteinsequenzen 

vervielfacht werden können. 

Basierend auf drei S-Schicht-Proteinen von 

verschiedenen Bacillus-Stämmen wurden 

unterschiedliche Fusionsproteine hergestellt. 

Besonders gute Rekristallisationseigenschaften 

auf festen Trägern zeigte das S-Schicht- 

Protein SbpA von Bacillus sphaericus. Struk- 

einem Goldplättchen zeigt. Kennziffer 12 LW 04 · www.biocom.de � 

4 | 4. Jahrgang | Nr. 4/2003 LABORWELT


Abb. 2: Schematische Darstellung der Rekristallisation von verschiedenen S-Schicht-Fusionsproteinen 

auf festen Trägern, die mit sekundärem Zellwandpolymer (SZWP) beschichtet wurden. Chimäre S- 

Schichten die als funktionelle Sequenz (1) die variable Domäne eines Kamelantikörpers, (2) die IgG- 

Bindungsdomäne oder (3) Streptavidin inkorporieren. Je nach Fusionsprotein-Typ können entweder (1) 

Antigene, (2) Antikörper oder (3) biotinylierte Moleküle gebunden werden. 

tur-Funktionsanalysen ergaben, daß eine Cterminal 

um 200 Aminosäuren (AS) verkürzte 

SbpA-Form eine bessere Zugänglichkeit des 

C-Terminus aufwies als das Protein in seiner 

gesamten Länge von 1268 AS 6 . Auf diesen 

Resultaten basierend wurden S-Schicht-Fusionsproteine 

konstruiert, die entweder das 

Hauptbirkenpollen-Allergen (161 AS), Streptavidin 

(118 AS), die Immunglobulin G (IgG)- 

Bindungsdomäne (116 AS) oder verschiedene 

variable Domänen von Kamelantikörpern 

(117 AS) am C-Terminus des S-Schicht-Proteins 

trugen. Alle Fusionsproteine konnten in 

Escherichia coli rekombinant produziert werden. 

Anwendungsspektrum der 

S-Schicht-Fusionsproteine 

Das erste S-Schicht-Fusionsprotein, das die 

Sequenz des Hauptbirkenpollen-Allergens 

Bet v1 inkorporiert, wurde konstruiert, um 

spezifisch IgE-Moleküle aus dem Serum von 

Birkenpollenallergikern nachzuweisen. Dieses 

S-Schicht-Fusionsprotein besitzt einerseits 

die Fähigkeit zum Self-Assembly, andererseits 

die funktionelle Eigenschaft des fusionierten 

Allergens, Bet v1-spezifische IgE- 

Moleküle aus dem Serum von Allergikern zu 

binden. Dieses Fusionsprotein könnte auf 

Grund seiner spezifischen Eigenschaften sowohl 

in der Biochip-Technologie als auch in 

der antiallergischen Immuntherapie zur Anwendung 

kommen 7 . 

Auf Basis eines S-Schicht-Fusionsproteins, 

das als bioaktives Peptid Streptavidin inkorporiert, 

wurden mittels eines speziell entwikkelten 

Faltungsprotokolls in Gegenwart von 

monomeren Streptavidin, funktionelle S- 

Schicht-Streptavidin-Heterotetramere herge- 

stellt, die zur Bindung jeglicher biotinylierter 

Moleküle (z.B. DNA, Oligonukleotide, 

Peptide, Antikörper etc.) befähigt sind 8 . 

Ein weiteres S-Schicht-Fusionsprotein, das 

die Bindungsstelle von Protein A für den konstanten 

Teil von IgG-Molekülen trägt kann 

auf Mikropartikeln aus biokompatiblen Polymeren 

rekristallisiert, mittels „Crosslinkern“ 

stabilisiert und für die spezifische Bindung 

von human-IgG ausgenützt werden. 

Diese funktionellen Mikropartikel sollen als 

spezifische IgG-Adsorbentien in der extrakorporalen 

Blutreinigung zum Einsatz kommen 

9 . 

Weiters wurde durch die Fusion des S- 

Schicht-Proteins mit der variablen Domäne 

eines Kamelantikörpers, ein spezifisches Antigen-erkennendes 

Protein konstruiert. Die 

Besonderheit einer speziellen Gruppe von 

Kamelantikörpern im Vergleich zu konventionellen 

Antikörpern beruht auf dem völligen 

Fehlen der leichten Ketten sowie der 

Abwesenheit der ersten konstanten Domänen 

der schweren Ketten. Die Antigen-Bindungstasche 

wird also nur von der variablen 

Domäne der schweren Kette ausgebildet, 

wodurch sich eine Vereinfachung gegenüber 

den sogenannten „single chain“-Antikörpern 

ergibt, da auf den synthetischen Linker zwischen 

der variablen Domäne der leichten und 

der schweren Kette verzichtet werden kann. 

Als Modellsystem zur Überprüfung der 

Funktionalität der fusionierten variablen 

Domäne eines Kamelantikörpers wurde ein 

S-Schicht-Fusionsprotein hergestellt, das am 

C-Terminus eine gegen Lysozym gerichtete 

variable Domäne trägt. Lysozym als Antigen 

wurde auf Grund der gut aufgeklärten Antigen-/Antikörperbindung 

gewählt. Die Bindungsfähigkeit 

des Proteins für Lysozym 

wurde mittels ELISA, Immunoblots sowie 

anhand von Surface Plasmon Resonance 

(SPR)-Versuchen bestätigt. Die Fähigkeit, wie 

für dieses S-Schicht-Protein typisch, in Form 

eines quadratischen Gitters auf peptidoglykanhältigen 

Zellwandfragmenten als auch 

auf SZWP-beschichteten Goldplättchen zu 

assemblieren, konnte mit Hilfe des Elektronenmikroskops 

und des Atomkraftmikroskops 

(AFM) bestätigt werden 10 . In weiterer 

Folge steht nun die Konstruktion eines Fusionsproteins 

bevor, das die variable Domäne 

eines Kamelantikörpers inkorporiert, die das 

Prostata-spezifische Antigen (PSA) erkennt. 

Das Monitoring der PSA-Konzentration im 

Blutserum wird zur Früherkennung von Prostatatumoren 

herangezogen. Eine PSA-bindende 

chimäre S-Schicht könnte daher in der 

Diagnostik zur PSA-Quantifizierung zur Anwendung 

kommen. 

Die Einsatzgebiete der S-Schicht-Fusionsproteine 

sind mannigfaltig. Rekristallisierte 

chimäre Proteine können zum Beispiel als 

„Lab-on-Chip“-Diagnostika ihre Anwendung 

finden. Ein breites Anwendungsspektrum 

eröffnet sich auch im Bereich der markierungsfreien 

Nachweissysteme basierend 

auf dem Quarz Crystal Microbalance Dissipation 

Monitoring (QCM-D), der Surface 

Acoustic Wave (SAW) oder der Surface Plasmon 

Resonance (SPR)-Technik, wobei ein 

Bindungsvorgang ohne die Notwendigkeit 

von markierten Molekülen nachgewiesen 

werden kann. 

Literatur 

[1] Sleytr, U. B., Messner, P., Pum, D., and Sára, M., Angew. Chem. Int. Ed. 38, 

(1999) 1034-1054 

[2] Sleytr, U. B., Sára, M., Pum, D., Schuster, B., Messner, P., and Schäffer, C. 

(2003) In: Biopolymers (Steinbüchel, A., and Fahnestock, S., eds) Vol. 7 pp. 

285-338, Wiley-VCH, Weinheim, Germany 

[3] Sleytr, U. B., Sára, M., Pum, D., and Schuster, B. (2002) In: Nano-Surface 

Chemistry (Rosoff, M., ed) pp. 333-389, Marcel Dekker, Inc., New York - 

Basel 

[4] Sára, M., and Sleytr, U. B., J Bacteriol 182, (2000) 859-868. 

[5] Ilk, N., Kosma, P., Puchberger, M., Egelseer, E. M., Mayer, H. F., Sleytr, U. B., 

and Sára, M., J Bacteriol 181, (1999) 7643-7646. 

[6] Ilk, N., Völlenkle, C., Egelseer, E. M., Breitwieser, A., Sleytr, U. B., and Sára, 

M., Appl Environ Microbiol 68, (2002) 3251-3260. 

[7] Breitwieser, A., Egelseer, E. M., Moll, D., Ilk, N., Hotzy, C., Bohle, B., Ebner, 

C., Sleytr, U. B., and Sára, M., Protein Eng 15, (2002) 243-249. 

[8] Moll, D., Huber, C., Schlegel, B., Pum, D., Sleytr, U. B., and Sára, M., Proc 

Natl Acad Sci U S A 99, (2002) 14646-14651. 

[9] Weber, V., Weigert, S., Sára, M., Sleytr, U. B., and Falkenhagen, D., Ther 

Apher 5, (2001) 433-438. 

[10] Pleschberger, M., Neubauer, A., Egelseer, E. M., Weigert, S., Lindner, B., 

Sleytr, U. B., Muyldermans, S., and Sára, M., Bioconjug Chem 14, (2003) 

440-448. 

Korrespondenzadresse 

Dipl.-Ing. Magdalena Pleschberger 

Mag. Dr. Eva M. Egelseer 

Zentrum für Ultrastrukturforschung und 

BMT-Research 

Universität für Bodenkultur 

Gregor Mendel-Straße 33, A-1180 Wien 

Tel.: +43-(0)1-47654 2209, Fax: -4789112 

eMail: magdalena.pleschberger@boku.ac.at 

Kennziffer 13 LW 04 · www.biocom.de 

6 | 4. Jahrgang | Nr. 4/2003 LABORWELT 

�


Zellbiologie � 

Effiziente Isolierung adulter 

Schwannscher Zellen aus 

peripheren Nerven 

Dr. Norbert Weidner, Dipl. Biol. Maurice Vroemen, 

Klinik und Poliklinik für Neurologie, Universitätsklinik Regensburg 

Der potentielle Einsatz autologer Schwannscher Zellen zur Regeneration nach Läsionen peripherer 

Nerven beziehungsweise Remyelinisierung erfordert eine rasche und effiziente Isolierung 

dieser Zellen aus Biopsien peripherer Nerven. Mit Hilfe der Magnet-aktivierten Separation 

von p75 low affinity nerve growth factor receptor-exprimierenden Schwannschen Zellen 

ist es gelungen, die benötigte Zeit zur Aufreinigung dieser Zellen von drei bis sechs Wochen 

auf neun Tage bei einem hohen Grad der Aufreinigung zu reduzieren. 

Key Words: MACS, Axon, Regeneration, autologe Schwannsche Zellen, Transplantation, Zellkultur, 

p75 low affinity nerve growth factor receptor 

Die Rekrutierung endogener Schwannscher 

Zellen ermöglicht eine erfolgreiche Regeneration 

geschädigter Nervenprojektionen 

(Axone) im peripheren Nervensystem. Dies 

ist jedoch nur bis zu einem bestimmten Ausmaß 

der Schädigung möglich. Bei längerstreckigen 

Nervenschädigungen beziehungsweise 

-durchtrennungen sind intrinsische Regenerationsvorgänge 

nicht mehr in der Lage, 

strukturelle und funktionelle Wiederherstellung 

zu ermöglichen. Auch die Autotrans- 

schädigter Nerven erzielt werden 1,2 . Darüber 

hinaus wurden Schwannsche Zellen auch erfolgreich 

zur Förderung der Nervenregeneration 

und Remyelinisierung im Zentralnervensystem 

(ZNS) eingesetzt 3-5 . Optimalerweise 

sollten dabei die Zellen autolog sein, das 

heißt, sie sollten aus dem Gewebe des betroffenen 

Individuums (periphere Nervenbiopsie) 

gewonnen und nach Vermehrung in Zellkultur 

wieder in den Patienten reimplantiert 

werden. 

Abb. 1: Zeitlicher Ablauf vom Zeitpunkt der Nervenbiopsie (Tag 0) bis zur morphologischen/durchflußzytometrischen 

Analyse MACS p75LNGFr-separierter Schwannscher Zellen (Tag 11). (Abbildung mit 

freundlicher Genehmigung von Elsevier, modifiziert aus J. NEUROSCI. METHODS Vol.124, Vroemen et al., 

Purification of Schwann cells by..., S.135-143, © 2003). 

plantation von Hautnervenfragmenten ist 

bezüglich der Ausdehnung einer Nervenschädigung 

limitiert. 

Alternativ können Schwannsche Zellen aus 

Biopsien von peripheren Nerven isoliert, in 

Kultur um ein Vielfaches vermehrt und nach 

Einbringen in Polymer-basierte, artifiziell 

hergestellte Leitstrukturen als Nervenersatz 

dienen. Durch den Einsatz derartiger Nervenersatzfragmente 

konnte tierexperimentell 

eine erfolgreiche Wiederaussprossung ge- 

Dieser Vorgang erfordert Zeit, die nach einer 

Nervenschädigung aber nur sehr begrenzt 

zur Verfügung steht, weil gleichzeitig 

intrinsische Reparaturvorgänge herunterreguliert 

werden 6 . Bislang existierende Verfahren 

erlauben die Isolierung Schwannscher 

Zellen je nach Methode in einem Zeitraum 

von drei bis sechs Wochen mit einer variablen 

Aufreinigungseffizienz 7-9 . 

Das Hauptproblem bei der Aufreinigung 

Schwannscher Zellen aus peripheren Nerven- 

fragmenten besteht in der Kontamination 

durch rasch proliferierende Bindegewebszellen, 

welche die Nervenfasern umgeben – die 

sogenannten Fibroblasten. Die hier vorgestellte 

Methode bedient sich der selektiven 

Expression des sogenannten p75 low affinity 

nerve growth factor receptors (p75LNGFr), der 

auf Schwannschen Zellen, nicht dagegen auf 

Fibroblasten exprimiert wird. Die eigentliche 

Aufreinigung p75LNGFr-exprimierender 

Schwannscher Zellen erfolgt mit einer etablierten 

Methode der Zellseparation, der sogenannten 

Magnet-aktivierten Zellseparation 

(MACS) 10 . 

Methode 

Der zeitliche Ablauf der MACS ist in Abbildung 

1 illustriert. Zunächst werden durchschnittlich 

35 mm lange Nervenfragmente 

des N. ischiadicus aus adulten Ratten entnommen, 

nach Entfernung bindegewebiger Hüllstrukturen 

(Peri-, Epineurium) in 1 mm dikke 

Stücke geschnitten und auf Kollagen beschichteten 

Kulturschalen ausplattiert. In den 

folgenden sieben Tagen werden diese Nervenfragmente 

in Kultur belassen, um die Degeneration 

und Auflösung von Zell-Zell-Verbindungen 

im Gewebeverband zu fördern. 

Am siebenten Tag erfolgt die Dissoziierung 

der Nervenfragmente mit Trypsin, Kollagenase, 

Hyaluronidase und Triturierung mit einer 

sterilen Einwegkanüle. 

Nach zwei weiteren Tagen in beschichteten 

Kulturflaschen erfolgt die eigentliche Aufreinigung 

der Schwannschen Zellen. Die Zellen 

werden nach Ablösen vom Boden der 

Zellkulturflaschen in Suspension gebracht, 

mit einem anti-p75LNGFr-spezifischen monoklonalen 

Primärantikörper und einem gegen 

Maus-IgG gerichteten Sekundärantikörper 

inkubiert, an den sogenannte Microbeads 

(Miltenyi Biotec, Jülich) gekoppelt sind. Derart 

inkubierte Zellsuspensionen werden auf 

eine MS-Säule (Miltenyi Biotec) aufgetragen, 

die sich in einem MiniMACS-Magneten befindet 

(Miltenyi Biotec). 

Schließlich werden Zellen, welche in der 

Säule verblieben sind (p75LNGFr-positive 

Fraktion) oder ohne Absorption die Säule 

durchgelaufen haben (p75LNGFr-negative 

Fraktion) sowie nicht aufgereinigte Zellsuspensionen 

zur Überprüfung der Reinheit 

mittels Phasenkontrastuntersuchung/Immunfluoreszenz-Zytochemie 

qualitativ und 

mittels Durchflußzytometrie quantitativ untersucht. 

Resultate 

Die zur Beurteilung der Morphologie herangezogene 

phasenkontrastmikroskopische 

Analyse zeigt, daß in der Magnetsäule verbliebene 

Zellen (p75LNGFr-positive Fraktion) 

fast ausschließlich die typische bipolare Mor- 



�


Abb. 2: Immunfluoreszenz-zytochemische Bestätigung der Identität Schwannscher Zellen nach MACSp75LNGFr-Aufreinigung. 

(A) Zellen der p75LNGFr-positiven Fraktion nach der MACS- Separation exprimieren 

27C7, einen für Schwannsche Zellen spezifischen Marker (grün). (B) Diese Zellen exprimieren 

gleichzeitig p75LNGFr (rot). (C) Die Überlagerung von A und B bestätigt, daß p75lNGFr- und 27C7-exprimierende 

Schwannsche Zellen identisch sind (Kerngegenfärbung mit Hoechst 33342, blau). Die Skalierung 

entspricht 100 µm. (Abbildung mit freundlicher Genehmigung von Elsevier, aus J. NEUROSCI. ME- 

THODS Vol.124, Vroemen et al., Purification of Schwann cells by..., S.135-143, © 2003). 

phologie Schwannscher Zellen in Kultur aufweisen. 

Die nicht adsorbierte Fraktion 

(p75LNGFr-negativ) enthält Zellen, welche 

den morphologischen Kriterien für Fibroblasten 

in Kultur entsprechen. Dies wird bestätigt 

durch immunzytochemische Untersuchen 

mit Markern, die für Schwannsche Zellen 

spezifisch sind (Abb. 2). 

Bei der Durchflußzytometrie wird der Anteil 

Schwannscher Zellen indirekt über das 

Vorhandensein Thy-1-exprimierender Fibroblasten 

berechnet. Thy-1 wird selektiv auf Fibroblasten, 

nicht jedoch auf Schwannschen 

Zellen exprimiert. Hierbei läßt sich zeigen, 

daß mit der MACS-Separation p75LNGFr-exprimierender 

Zellen zu 95 % reine Schwannsche 

Zellkulturen etabliert werden können – 

nach nur einem Durchlauf der MACS-Separation 

(Abb. 3). Darüber hinaus kann eine 

hohe Sensitivität der Isolierungsmethode 

nachgewiesen werden. Bestimmt man durch- 

flußzytometrisch den Anteil Schwannscher 

Zellen vor der MACS-Zellseparation und korreliert 

dies mit der Anzahl tatsächlich erhaltener 

Schwannscher Zellen nach der MACS- 

Zellseparation, so werden durchschnittlich 91 

% aller in Biopsien peripherer Nervenfragmente 

initial vorhandener Schwannscher Zellen 

nach MACS-Zellseparation für die weitere 

Expansion in Zellkultur gewonnen. 

Stimuliert man die Proliferation derart isolierter 

Schwannscher Zellen mit üblichen Methoden 

(Zugabe von Forskolin, Hypophysenextrakt), 

lassen sich Schwannsche Zellen über 

mindestens vier Passagen expandieren, ohne 

daß eine Überwucherung durch Fibroblasten 

beobachtet wird. 

Fazit 

Unsere Ergebnisse zeigen, daß sich mittels 

MACS-Zellseparation p75LNGFr-exprimie- 

Abb. 3: Durchflußzytometrische Analyse der Zellsuspensionen vor und nach MACS-p75LNGFr-Separation. 

Die Dot-Plots wurden durch die durchflußzytometrische Analyse Thy-1-exprimierender Zellen 

(Fibroblasten) generiert. Die mit R2 gekennzeichneten Rechtecke enthalten jeweils die Thy-1-positiven 

Zellen. (A) Noch nicht aufgereinigte Zellen sind zu fast gleichen Anteilen Thy-1 positiv oder negativ. 

(B) Der überwiegende Anteil der MACS p75LNGFr positiven Fraktion ist Thy-1 negativ. Aus der Tatsache, 

daß sich außer Schwann’schen Zellen und Fibroblasten keine nennenswerten alternativen Zellpopulationen 

in peripheren Nervenbiopsien befinden, ergibt sich, daß die Thy-1-negative Fraktion in der 

Durchflußzytometrie dem Anteil Schwann’scher Zellen entspricht. (C) Die MACS-p75LNGFr-negative 

Fraktion ist fast ausnahmslos Thy-1 positiv. (Abbildung mit freundlicher Genehmigung von Elsevier, 

modifiziert aus J. NEUROSCI. METHODS Vol.124, Vroemen et al., Purification of Schwann cells by..., S.135- 

render Zellen eine effiziente und schnelle Isolierung 

adulter Schwannscher Zellen aus peripheren 

Nervenfragmenten erzielen läßt. 

Zellschädigende Nebenwirkungen, wie sie 

durch den Einsatz zytotoxischer Substanzen 

zur Eliminierung sich rasch teilender Fibroblasten 

zu befürchten sind, entfallen bei diesem 

Ansatz der Zellaufreinigung. Bei der geringen 

Größe und der Biodegradierbarkeit 

werden die Microbeads im Rahmen des physiologisch 

stattfindenden Membran-Turnovers 

der Zellen entfernt, ohne die Funktion 

der Zelle in irgendeiner Weise zu beeinträchtigen 

11 . 

Die klinische Anwendung autologer Schwannscher 

Zellen als etablierter Transplantationsansatz 

zur Förderung der axonalen 

Regeneration im peripheren Nervensystem 

ist derzeit noch beschränkt. Transplantate 

autologer Schwannscher Zellen werden bereits 

im Rahmen einer klinischen Phase-I-Studie 

(Dr. Timothy Vollmer und Marco Rizzo, 

Yale University, USA) mit dem Ziel der Remyelinisierung 

bei Patienten mit Multiple 

Sklerose untersucht. 

Sollte die Aufreinigung p75LNGFr-exprimierender 

Schwannscher Zellen mittels 

MACS auf humanes Nervengewebe übertragbar 

sein, stellt sie eine vielversprechende 

Methode zur Gewinnung autologer Schwannscher 

Zellen dar. 

Literatur 

[1] Guenard, V., Kleitman, N., Morrissey, T.K., Bunge, R.P. and Aebischer, P., J 

Neurosci 12 (1992), 3310-20. 

[2] Rodriguez, F.J., Verdu, E., Ceballos, D. and Navarro, X., Exp Neurol 161 

(2000), 571-84. 

[3] Weidner, N., Blesch, A., Grill, R.J. and Tuszynski, M.H., J Comp Neurol 413 

(1999), 495-506. 

[4] Stangel, M. and Hartung, H.P., Prog Neurobiol 68 (2002), 361-76. 

[5] Bunge, M.B., Prog Brain Res 137 (2002), 275-82. 

[6] Zochodne, D.W., Muscle Nerve Suppl 9 (2000), S33-8. 

[7] Morrissey, T.K., Bunge, R.P. and Kleitman, N., J Neurobiol 28 (1995), 171- 

89. 

[8] Verdu, E., Rodriguez, F.J., Gudino-Cabrera, G., Nieto-Sampedro, M. and 

Navarro, X., J Neurosci Methods 99 (2000), 111-7. 

[9] Calderon-Martinez, D., Garavito, Z., Spinel, C. and Hurtado, H., J Neurosci 

Methods 114 (2002), 1-8. 

[10] Miltenyi, S., Muller, W., Weichel, W. and Radbruch, A., Cytometry 11 (1990), 

231-8. 

[11] Manyonda, I.T., Soltys, A.J. and Hay, F.C., J Immunol Methods 149 (1992), 

1-10. 


Dr. med. Norbert Weidner 

Klinik und Poliklinik für Neurologie 

Universitätsklinik Regensburg 

Universitätsstr. 84 

D-93053 Regensburg 

Tel: +49-(0)941-941-3310 

Fax: +49-(0)941-941-3005 

eMail: norbert.weidner@klinik.uniregensburg.de 

143, © 2003). Kennziffer 15 LW 04 · www.biocom.de � 



Bioseparation � 

Dielektrophoretische 

Trennung biologischer 

Mikro- und Nanopartikel 

Thomas Schnelle, Torsten Müller, Gabriele Gradl, Evotec Technologies GmbH, Hamburg 

Martin Stelzle, Jörg Kentsch, NMI an der Universität Tübingen, Reutlingen 

Angelika Haage, Andrea Normann, Mediagnost GmbH, Reutlingen 

Peter Geggier, Magnus Jäger, Fraunhofer-Institut für Biomedizinische Technik, St. Ingbert 

Für die Analyse sehr kleiner biologischer Partikel wie Viren und Bakterien steht oft nur ein 

indirekter Nachweis, wie etwa eine PCR-Reaktion oder ein ELISA-Test, zur Verfügung. Für 

einen direkten Nachweis der Partikel ist es meist erforderlich, diese in einer Probe komplexer 

Zusammensetzung aufzukonzenrieren oder abzuseparieren. Zu diesem Zweck wird 

das NanoVirDetect-System derzeit gemeinsam von den Unternehmen Evotec Technologies, 

Mediagnost, dem Fraunhofer-Institut für Biomedizinische Technik (IBMT) und dem Naturwissenschaftlichen 

und Medizinischen Institut (NMI) als vielseitige Technologieplattform zur 

Separation, Akkumulation und optischen Analyse komplexer Proben mit Partikeln im sub- 

Mikrometer-Bereich entwickelt. 

Das hier vorgestellte neue Verfahren basiert 

auf dem physikalische Prinzip der Dielektrophorese. 

Elektroden in Mikrokanälen erzeugen 

dabei hochfrequente elektrische Felder, 

die wiederum in Partikeln der Probensuspension 

Dipolmomente und entsprechende, 

sogenannte dielektrophoretische 

Kräfte hervorrufen (Abb.1). 

Dielektrophorese 

Zusammen mit ebenfalls wirkenden hydrodynamischen 

Reibungskräften ermöglicht 

dies das Sortieren von Partikeln bezüglich 

ihrer Größe und dielektrischen Eigenschaften 

1-2 . Während dielektrophoretische Kräfte 

proportional zur dritten Potenz des Radius 

zunehmen, variieren Reibungskräfte nur linear 

mit dem Radius. Da Frequenz und Amplitude 

des Feldes extern einstellbar sind, 

kann das System auf einfache Weise an eine 

bestimmte Trennaufgabe angepaßt werden 3 . 

Separation (Abb. 2), Akkumulation sowie 

das kontrollierte Einfangen einzelner Teilchen 

oder Partikelagglomerate durch dielektrophoretische 

Kräfte wurden bereits erfolgreich 

an Antikörper-beladenen Mikro- und 

Nano-Beads und Hepatitis-A-Viren erprobt. 

Im Gegensatz zu konventionellen Filterverfahren 

benötigt ein dielektrophoretisches 

Anreicherungssystem keine Poren und kann 

folglich weder verstopfen, noch sind Spülintervalle 

erforderlich, so daß ein solches System 

kontinuierlich betrieben werden kann. 

Es ist daher auch für homogene Nachweisreaktionen 

geeignet, das heißt, ein verwendeter 

Analyt wie etwa ein fluoreszenzmarkierter 

Antikörper muß nicht entfernt werden. 

Während bei einer Auftrennung partikelhaltiger 

Proben mit Hilfe der Free Flow- 

Elektrophorese (FFE, siehe LABORWELT 3/ 

2003) die Verdünnung der Probe nahezu un- 

Aufsicht 

Abb.1: Schematische Darstellung des Funktionsprinzips eines dielektrophoretischen Partikelfilters auf 

der Basis der Dielektrophorese in fluidischen Mikrosystemen. Ein Elektrodenpaar an Ober- bzw. Unterseite 

eines Kanals erzeugt ein inhomogenes elektrisches Feld, das Partikel in der Probensuspension 

polarisiert und entsprechende (hier abstoßend wirkende) dielektrophoretische Kräfte hervorruft. Zusammen 

mit ebenfalls wirksamen hydrodynamischen Reibungskräften ermöglicht dies eine Trennung 

nach Größe und dielektrischen Eigenschaften der Partikel. 

Hauptkanal 

Flußrichtung 

aktive Deflektorelektrode 

Abb. 2: Eine dielektrophoretische Filterstruktur in 

Aktion – die Abbildung zeigt einen Kanal mit darin 

eingebrachten Elektroden (nur die an der Kanaloberseite 

angebrachten Elektroden sind in 

dieser Aufsicht erkennbar). Eine Suspension mit 

Partikeln von 1 µm bzw. 0,5 µm Durchmesser 

wird von links nach rechts durch den Kanal gepumpt. 

Während die größeren Partikel eine ausreichend 

große abstoßende dielektrophoretische 

Kraft erfahren, um nach rechts unten in einen 

Seitenkanal abgelenkt zu werden, überwiegt für 

die kleineren Partikel die hydrodynamische Reibungskraft 

des vorbeiströmenden Mediums die 

dielektrophoretische Kraft, so daß diese Partikel 

die dielektrophoretische Barriere durchdringen 

können. 

vermeidbar ist, ermöglicht NanoVirDetect 

demgegenüber sogar eine Aufkonzentrierung 

der gewünschten Partikel in ein extrem 

kleines Flüssigkeitsvolumen von wenigen 

Picolitern. Dieses kann entweder direkt im 

Chip, zum Beispiel durch optische Detektionsverfahren 

wie die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie 

(FCS), analysiert oder 

über spezielle Fluidikports kontrolliert nach 

außen abgegeben werden. 

Das System ermöglicht die Verarbeitung 

kleinster Probenmengen von wenigen Mikrolitern. 

Ein essentieller Vorteil ist die Kombinierbarkeit 

mit hochsensitiven Analysetechniken 

wie der Einzelmolekülspektroskopie 

und der Impedanzmessung. Dies eröffnet 

neue Wege für den direkten Nachweis 

von Nanopartikeln. Darüber hinaus handelt 

es sich um ein geschlossenes Kompartiment, 

was insbesondere bei der Verarbeitung infektiöser 

Proben von großem Vorteil ist. 

Prototyp-Entwicklung 

Seitenkanal 

Abbildung 3 zeigt einen funktionsfähigen 

Prototypen des NanoVirDetect Systems (A). 

Deflektorarrays dienen zur Separation von 

Partikeln bestimmter Größe in einen Seitenkanal 

(B). Dielektrophoretische Trichterstrukturen 

(C) fokussieren Partikel in die Kanal- 


Fluid Port 

1mm 

0,5µm Partikel 

1µm Partikel 

20µm


mitte während sogenannte Feldkäfige (C) die Anreicherung und das 

Einfangen von Teilchen oder Aggregaten in einem Volumen von wenigen 

Picolitern ermöglichen. Sie können dann entweder unmittelbar 

dort mittels FCS analysiert werden oder über einen weiteren Fluidport 

kontrolliert nach außen abgegeben werden. Die elektrische und 

fluidische Kontaktierung des mehrfach verwendbaren Gesamtsystems 

erfolgt über eine spezielle, selbstjustierende Aufnahmevorrichtung. 

Proben- und Spüllösungen werden durch externe Spritzenpumpen 

zugeführt. 

Anwendungen 

Das NanoVirDetect-System soll in Zukunft für spezifische Anwendungen 

zur Separation oder Aufreinigung biologischer Mikro- und 

Nanopartikel wie etwa Viren, Zellorganellen und Bakterien weiterentwickelt 

werden. Anfragen bezüglich Entwicklungskooperation 

sind willkommen. Das Forschungsgerät „Cytocon 300“ für das Erarbeiten 

solcher Anwendungen an einem inversen Mikroskop ist bereits 

über die Evotec Technologies GmbH erhältlich. 

Literatur 

[1] Schnelle, T., et al., Paired microelectrode system: dielectrophoretic particle sorting and force calibration. Journal of 

Electrostatics, 1999. 47: p. 121-132. 

[2] Schnelle, T., et al., Dielectrophoretic manipulation of suspended submicron particles. Electrophoresis, 2000. 21: p. 66- 

73. 

[3] Dürr, M., et al., Microdevices for manipulation and accumulation of micro- and nanoparticles by dielectrophoresis. 

Electrophoresis, 2003. 24: p. 722-731. 


Dr. Martin Stelzle 

NMI, Universität Tübingen 

Markwiesenstraße 55 

D-72770 Reutlingen 

Tel.: +49-(0)7121-51530 75 

eMail: stelzle@nmi.de, 

www.nmi.de. 

Fluid Ports 

Rahmen 

elektrische Kontakte 

Kanäle 

Kanäle 

Abb. 3: Prototyp des NanoVirDetect-Systems mit Fluid Ports, Mikrokanälen 

und 3D-Elektroden-Strukturen für Separation, Akkumulation und das Einfangen 

von Partikeln aus partikelhaltigen Probenlösungen mittels dielektrophoretischer 

Kräfte. Das System vereinigt fluidische und elektrische Kontaktierung 

auf einem handlichen Chip und paßt in eine spezielle, selbstjustierende 

Aufnahmevorrichtung. 



Feldkäfig 

Fluid Port 

Deflector 

Array 

Trichter 

� 

� 

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LABORWELT 4. Jahrgang | Nr. 4/2003 | 13



Industrielle Aufreinigung 

biotechnologischer Therapeutika 

Reinheit 

Polishing 

(Finale Aufreinigung) 

Intermediate 

Purification 

(Entfernung der Hauptkontaminanten) 

Capture 

(Produktisolierung) 

Dr. Silke Fetzer, Michael Kaleja, Amersham Biosciences, Freiburg 

Das Isolieren und Reinigen eines biotechnologisch hergestellten Therapeutikums ist ein 

komplexer Vorgang, dessen Erfolg maßgeblich von einer auf die Rahmenbedingungen hin optimierten 

Strategie abhängt. Diese Strategie wird einerseits durch die spätere Verwendung der 

zu isolierenden Substanz bestimmt, etwa durch die Reinheitsanforderungen, die an ein diagnostisches, 

therapeutisches, oder technisches Protein gestellt werden. Andererseits spielt auch 

die Fermentationsquelle eine wichtige Rolle bei der Gestaltung des sogenannten „Downstream”- 

Prozesses. Die Auswahl der Fermentationsquelle hat auch einen entscheidenden Einfluß auf 

die Prozeß-Validierung sowie die Wirtschaftlichkeit des gesamten Verfahrens. Obwohl einige 

Proteine, wie beispielsweise Albumin und Immunglobuline immer noch aus natürlichen Quellen, 

nämlich humanem Blutplasma gewonnen werden, stammen die meisten zugelassenen 

Biopharmazeutika mittlerweile aus rekombinanten Technologien, bei denen Fermentationsquellen 

wie Hefe, Bakterien oder Säugerzellen eingesetzt werden. In klinischen Prüfungen werden 

zudem Substanzen untersucht, die aus Insektenzellen, oder transgenen Tieren und Pflanzen 

gewonnen wurden. Die Fermentationsquelle entscheidet über Qualität und Quantität des 

exprimierten Zielprodukts und über die Art und Anzahl kontaminierender Substanzen. Bei intrazellulärer 

Expression etwa wird ein Zielprotein in E. coli in sogenannten „Inclusion Bodies“ 

abgelagert. Ein Zellaufschluß setzt zahlreiche Proteasen frei. Bei einer Sekretion ins Periplasma 

verunreinigen große Mengen Endotoxin die Zielsubstanz. Wird eine Säugerzellkultur als 

Expressionssystem ausgewählt, spielt die Kontamination mit Viren die größte Rolle. Wirtszellproteine, 

Zusatzstoffe aus der Zellkultur sowie „Leakage”-Produkte gehören zu den Kontaminanten, 

die bei der Verwendung aller Expressionssysteme abgereichert werden müssen. Die 

Strategie des Downstream-Prozesses (siehe unten) muß also darauf abzielen, alle Kontaminanten 

abzureichern. Dabei hat die Anzahl der Schritte sowie deren Komplexität einen großen 

Einfluß auf die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens. Es empfiehlt sich, jedes Expressionsystem 

nicht nur im Hinblick auf die Produktionseffizienz für das biologisch aktive Zielprotein zu untersuchen, 

sondern auch die Konsequenzen für die Validierung des Verfahrens inklusive der regulatorischen 

Anforderungen zu analysieren. In diesem Artikel wird die Verwendung einer Säugerzellkultur 

und der nachfolgende Downstream-Prozeß zur Herstellung rekombinanter Proteine, 

insbesondere Monoklonaler Antikörper diskutiert. 

Endreinheit und 

Sicherheit erreichen 

Abtrennung der meisten 

Proteine, Nukleinsäuren 

Endotoxine, Viren 

Erste Aufreinigung 

Stabilisierung 

Klärung, Aufkonzentration 

Schritt 


Bei der Herstellung von Biopharmazeutika 

werden Säugerzellkulturen bevorzugt eingesetzt. 

Der Hauptvorteil liegt in der Expression 

komplexer biologisch aktiver Proteine mit 

korrekter post-translationaler Modifikation 

und Konformation, die nach der Sekretion 

aus dem Zellkulturüberstand gewonnen werden 

können. Nachteile, wie die relativ hohen 

Fermentationskosten, langsames Zellwachstum 

und das potentielle Risiko viraler Kontaminationen 

werden so aufgewogen. Abhängig 

vom Zielprodukt, der Zellinie, den Zellkulturbedingungen 

und der Fermentationsmethode 

liegen die exprimierten Proteinmengen 

im Bereich von zehn bis mehreren hundert 

Milligramm Produkt pro Liter Zellkultur 

pro Tag. Bei monoklonalen Antikörpern 

(MAbs) aus der Zellkultur von Ovarialzellen 

des chinesischen Hamsters (CHO) werden 

Expressionsmengen von 1-2 g/L erreicht. 

Derzeit werden Säugerzellkulturen zur 

Herstellung von Biopharmazeutika wie beispielsweise 

des „Tissue-Plasminogen-Aktivators” 

(tPA) – das erste kommerzielle Therapeutikum, 

das in Säugerzellkultur gewonnen 

wurde – sowie für die Produktion therapeutisch 

wirksamer MAbs eingesetzt. Das Potential 

von MAbs als therapeutische Antikörper 

wurde zwar schon vor 25 Jahren erkannt, 

deren eigene Immunogenizität führte jedoch 

zu Problemen. Der neue Boom dieser Proteinfamilie 

als Ziel-spezifische Therapeutika 

bei Krebs oder anderen chronischen Erkrankungen 

ist hauptsächlich den Fortschritten 

im molekularen Engineering zu verdanken, 

wodurch unerwünschte Immunantworten in 

Patienten vermieden werden können. 

Die am häufigsten verwendete Zellinie zur 

Expression biopharmazeutischer Proteine ist 

die CHO-Zellkultur. Für sie spricht, daß die 

Downstream-Prozeß-Strategie 

Ein typischer Downstream-Prozeß besteht aus zwei oder mehreren 

Stufen. Jede Stufe kann nochmal aus einem oder mehreren 

Schritten bestehen. 

– Der ‚Capture‘-Schritt (Produktisolierung) beschreibt die anfängliche 

Isolierung der Zielsubstanz aus dem Fermentationsausgangsmaterial 

sowie den ersten Reinigungsschritt. Das Produkt 

wird ankonzentriert und in ein Milieu überführt, in dem die 

biologische Aktivität gesichert ist. 

– Der ‚Intermediate purification‘-Schritt besteht aus einem oder 

mehreren Schritten, in deren Verlauf Verunreinigungen und kritische 

Kontaminationen wie DNA, Viren und Endotoxin abgereichert 

werden, um die Sicherheit des Produktes für den Patienten 

zu gewährleisten. Je nach Auswahl der Fermentationsquelle 

werden mehrere ‚Intermediate purification‘-Schritte benötigt. 

– Im ‚Polishing-Schritt‘ (finale Aufreinigung) schließlich werden 

auch noch minimale Spuren von Kontaminationen sowie unerwünschte Produkt-Heterogenitäten entfernt. Er stellt die finale Sicherheitsstufe 

dar. Die Details dieser „Drei-Stufen-Strategie” hängen maßgeblich unter anderem von den folgenden Faktoren ab: Den Charakteristika des 

Ausgangsmaterials, den Reinheitsanforderungen an das Zielprotein, die ökonomischen Vorgaben für das gesamte Verfahren. Aktuelle Entwicklungen 

in der Zellkulturtechnologie, dem molekularen Engineering und in den Reinigungstechniken sowie der immer größer werdende 

Druck das Biopharmazeutikum so schnell wie möglich zur Marktreife zu führen, resultieren in einer Reduktion der Anzahl der Einzelschritte und 

damit in der Verkürzung des gesamten Herstellungsverfahrens. 


�


Abb. 1: Überblick des Isolierungs- und Aufreinigungsprozesses von humanen MAbs. Der genaue Prozeß 

vom Fermenter zum endgültigen Produkt variiert in Abhängigkeit von der Kulturmethode, den 

Reinheitsanforderungen, der Prozeß-Ökonomie. Die Strategien sind auch für andere rekombinante 

Proteine anwendbar. 

Zellen gut wachsen, sich schnell teilen und 

relativ robust sind. Genetisch veränderte 

CHO-Zellen werden zur Produktion der Blutgerinnungsfaktoren 

VII und VIII eingesetzt. 

Andere häufig eingesetzte epitheliale Zellinien 

sind Baby Hamster Kidney (BHK), African 

Green Monkey (COS und CV-1) sowie 

Hybridoma Zellen. 

Protein-Expression – Zellkultursysteme 

Säugerzellen wachsen in zwei Arten von Zellkultursystemen 

– in Suspensionskulturen 

oder adhäsiv in Kontakt mit Oberflächen 

oder Microcarriern. Dies hat einen entschei- 

Abb. 2: Produktionsanlage für Monoklonale Antikörper 

– Streamline rProtein A-Säule (li.) und 

Zellkultur-Fermenter (re.) 

denden Einfluß auf die Konfiguration des Reaktorsystems. 

Zellen in Suspension werden 

in Hohlfaserreaktoren (Hollow-Fibre-Reaktoren), 

Fluidized-Bed-Reaktoren, wie beispielsweise 

dem ‚Cytopilot‘, und Stirred-Tank-Reaktoren 

kultiviert. Zellen, die Kontakt zu 

Oberflächen benötigen, werden in Hollow- 

Fibre-Reaktoren und Fluidized-Bed-Reaktoren 

kultiviert. Die unterschiedliche Fragilität 

der Zellen bei mechanischem Streß sollte bei 

der Konfiguration des Reaktors berücksichtigt 

werden. Verschiedene Rührvorrichtungen 

dürfen die empfindlichen Zellen nicht beschädigen, 

da sonst Kontaminationen wie 

Proteasen oder DNA freigesetzt werden, die 

den nachfolgenden „Downstream”-Prozeß 

erschweren. Ferner kann eine unzureichende 

Versorgung mit Nährstoffen und Sauerstoff 

zum Absterben der Zellen führen. 

Zellkulturmedien 

Die Zellkulturmedien stellen eine komplexe 

Mischung aus Proteinen, Polysacchariden, Lipiden, 

Steroiden, Vitaminen, Salzen, Aminosäuren, 

Phenolrot und Wachstumsfaktoren 

dar und können zudem auch Viren enthalten. 

Werden Zellkultur-Zusatzstoffe – sogenannte 

Supplemente – eingesetzt, steigt das 

Risiko unerwünschter Kontaminationen wie 

beispielsweise durch Prione, den Erregern 

der TSE (Transmissible Spongiform Encephalopathies), 

deren Entfernung im nachfolgenden 

Downstream-Prozeß sichergestellt wer- 

den muß. In der Vergangenheit wurde den 

Zellkulturmedien routinemäßig 10% fetales 

Kälberserum zugefügt. Heute werden moderne 

serum-freie Supplemente zugesetzt 

und der Trend zur komplett Protein-freien 

Zellkultur trägt entscheidend zur Sicherheit 

der Herstellungsverfahren bei. Mittlerweile 

sind für individuelle Zellinien optimierte 

Supplement-Mischungen erhältlich. Dadurch 

wird eine genau definierte, reproduzierbare 

Zusammensetzung des Zellkulturmediums 

gewährleistet und der nachfolgende Downstream-Prozeß 

signifikant erleichtert. 

Downstream-Prozeß 

Im industriellen Maßstab ist es üblich, Proteine 

ohne angehängte Fusionsproteine oder 

Tags nativ zu exprimieren, um den intrazellulären 

in vivo-Faltungsprozeß nicht zu beeinflussen 

(manchmal werden Proteine aus 

Funktionsgründen mit einem IgG-Fc-Teil exprimiert). 

Aus diesem Grund hat sich kein 

universell einsetzbarer Reinigungsschritt als 

‚Capture‘-Schritt (Produktisolierung) entwikkelt. 

Als Folge werden unterschiedliche Reinigungsmethoden 

für die verschiedenen Proteine 

verwendet und publiziert. Im folgenden 

wird eine kurze Übersicht über chromatographische 

Reinigungsschritte zur Aufreinigung 

Monoklonaler Antikörper (MAbs) gegeben, 

die als eine wichtige therapeutische Substanzklasse 

in Säugerzellen exprimiert werden. 

Da die meisten MAbs bei geringer Salzkonzentration 

und im neutralen und alkalischen 

Milieu löslich und stabil sind, werden diese 

Bedingungen häufig für den ‚Capture‘-Schritt 

gewählt. Jedoch wirken einige monoklonale 

Antikörper als Kryoglobuline. Dies hat eine 

reduzierte Löslichkeit bei Temperaturen unter 

37 ° C zur Folge. Stark basische MAbs aggregieren 

in Gegenwart polyvalenter Anionen 

(Phosphaten, Citraten, Sulfaten, Boraten) 

zu stabilen ionischen Komplexen. 

Deshalb sollten Puffer immer mit großer 

Sorgfalt ausgewählt werden. Des weiteren 

komplexieren MAbs mit Nukleinsäuren. Diese 

Reaktion ist bei Zugabe von 0,3 bis 1 M 

NaCl reversibel. Allerdings führt die höhere 

Salzkonzentration zur Destabilisierung. 

Wenn dem Kulturmedium fetales Kälberserum 

hinzugefügt wurde, so sollte der nachfolgende 

Downstream-Prozeß die Entfernung 

von IgG und Albumin aus dem Serum 

gewährleisten. 

‚Capture‘-Schritt 

MAbs aus Säugerzellen werden in das Kulturmedium 

exprimiert. Es gibt zwei Ansätze 

zur Isolierung und Reinigung eines Produktes 

(Abb. 1). Beim traditionellen Verfahren 

wird die Zentrifugation oder Filtration zur 

Abtrennung der Zellen und zur Reduzierung 

des Ausgangsvolumens eingesetzt. Danach 

werden gepackte Chromatographiesäulen für 

die weitere Aufreinigung verwendet. Eine 


alternative Methode stellt die sogenannte „Expanded Bed Adsorption“ 

(EBA) dar, die immer häufiger im industriellen Maßstab eingesetzt 

wird. Bei dieser Methode kann der gesamte Fermenterinhalt ohne 

die vorhergehende Entfernung von Zellen direkt auf eine Chromatographiesäule 

aufgegeben werden, deren normalerweise gepacktes Bett 

für den ‚Capture‘-Schritt expandiert ist. Hier erfolgt dann die Entfernung 

der Zellen, die Reduzierung des Ausgangsvolumens und die 

erste chromatographische Reinigung („Capture”) in einem einzigen 

Schritt. Nach dem EBA-Schritt folgen ein oder zwei zusätzliche chromatographische 

Reinigungsschritte, um die benötigte Reinheit des 

Endprodukts zu gewährleisten. 

Affinitätschromatographie mit Protein A 

Aufgrund ihrer hohen Selektivität stellt die Affinitätschromatographie 

(AC) mit Protein A-Liganden die effizienteste Technik für die Aufreinigung 

von MAbs dar. Mit Ausnahme von IgG 3 binden alle Unterklassen 

von humanen IgG unter neutralen und alkalischen Konditionen 

mit ihrem Fc-Teil an Protein A. Diese Bindung erfolgt sowohl bei 

geringer, als auch bei hoher Salzkonzentration. Normalerweise ist nur 

eine geringfügige oder gar keine Probenvorbereitung zur Aufgabe und 

Bindung des MAbs an Protein A-Chromatographie-Medien erforderlich. 

Die Art der Glykosylierung hat keinen Einfluß auf die Bindung. 

Die Elution der MAbs erfolgt durch Verringerung des pH-Wertes. Um 

die Elution bei höheren pH-Werten bis zu pH 8 zu ermöglichen, werden 

teilweise 30-60 % Ethylenglykol oder 1-2 M Harnstoff zugesetzt. 

Wird fetales Kälberserum im Kulturmedium verwendet, kann das IgG 

bovinen Ursprungs mehr als 50 % des zu eluierenden IgG ausmachen. 

Wie bei jedem Affinitätsmedium können auch kleinste Mengen 

Protein A-Ligand in der eluierenden Probe enthalten sein. 

Ionenaustauschchromatographie (IEC) und hydrophobe 

Interaktionschromatographie (HIC) 

Die Kationen- und Anionenaustauschchromatographie finden häufig 

Anwendung zur Isolierung von MAbs. Relativ hohe Auflösung, 

hohe Kapazität, hohe Rückgewinnungsraten und insbesondere die 

effektive Konzentrierung des Produkts zählen zu den Stärken der IEC. 

Die Bindungsbedingungen (Puffer, Salzkonzentration, pH) und die 

Wahl eines Kationen- oder Anionenaustauschers hängen vom isoelektrischen 

Punkt und der Stabilität des Antikörpers ab. 

Für HIC werden hohe Salzkonzentrationen zur Probenadsorption 

benötigt, weshalb diese Technik weniger zum Einsatz kommt. Wenn 

die Probe aber bereits in hoher Salzkonzentration vorliegt und frei 

von mechanischen Verunreinigungen ist, kann HIC eine sehr effektive 

Reinigungstechnik für den ‚Capture‘-Schritt sein. 

Expanded Bed-Adsorption mit STREAMLINE TM rProtein A 

Die „Expanded Bed Adsorption“ (EBA) ermöglicht die direkte Probenaufgabe 

des Fermenterinhaltes bei gleichzeitiger Anreicherung und 

„Capture”-Reinigung des MAbs. Zeitintensive Zentrifugations- und 

Filtrationsschritte werden dadurch überflüssig. Darüber hinaus wird 

das Produkt sehr schonend gehandhabt und mechanische Scherkräfte 

elimiert, die besonders während des Zentrifugationsprozesses auftreten. 

Säugerzellen sind gegenüber Scherkräften sehr empfindlich und 

fragil. Bei Verwendung der EBA-Technologie und den Streamline-Medien 

werden keine Scherkräfte erzeugt. 

Diese Technik basiert auf dem Einsatz eines expandierten Säulenbettes, 

bei dem uniforme Adsorptionspartikel verwendet und eine 

konstante Flußrate ermöglicht werden. Dadurch können Zellen, Zellbestandteile 

und nicht bindende Verunreinigungen des Fermenterinhalts 

die Säule ungehindert passieren, während die Zielmoleküle adsorbiert 

werden. Dies macht Streamline zu einer erfolgreichen Technologie 

zur Isolierung und Anreicherung von Produkten, die in Säugerzellen 

exprimiert wurden. Die Anwendung von Streamline für 

CHO-Zellen und der Vergleich des ‚Capture‘-Schrittes für ein in CHO- 


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Tab. 1: Effizienz unterschiedlicher chromatographischer Trenntechniken 6 bei der Entfernung zelleigener 

Kontaminanten aus human MAbs. Unterschiede aufgrund veränderter Reinigungsbedingungen sind 

möglich. 

Chromatographie-Technik Endotoxine Nukleinsäuren Viren Fußnote 

Protein A (AC) ++ ++ +++ 1 

Anionen-IEC ++ +++ +++ 2 

Kationen-IEC + +++ ++ 3 

Hydrophobe Interaktion + +++ ++ 4 

Gelfiltration + + + 5 

1) Komplexe zwischen MAbs und Nukleinsäuren werden durch die bei der Protein A- Affinitätschromatographie möglichen, hohen Salzkonzentration gelöst. 

2) Nukleinsäuren binden sehr stark an Anionenaustauscher. Stark basische IgG and IgM bilden speziell bei geringer Salzkonzentration stabile Komplexe mit DNA. 

Folglich ist der Abreicherungseffekt reduziert. 

3) Nukleinsäuren binden nicht an Kationenaustauscher. 

4) Nukleinsäuren binden nicht an HIC Medien. Komplexe zwischen Antikörper und Nukleinsäuren werden bei hoher Salzkonzentration gelöst. Endotoxine können 

speziell bei hoher Salzkonzentration in wäßriger Lösung Mizellen bilden. Diese hochmolekularen Komplexe werden von dem Chromatographie-Medium ausgeschlossen. 

5) Bei geringer Salzkonzentration bilden Nukleinsäuren Komplexe mit MAbs. Daraus resultiert ein geringerer Abreicherungsfaktor. 

Zellen exprimiertes Fc-Fusionsprotein mit 

Hilfe von Streamline-EBA mit der konventionellen 

Aufreinigung (Filtration und gepackte 

Säule) sind detailliert beschrieben worden 

1,2 . 

‚Intermediate purification‘ – 

Entfernung der Hauptkontaminanten 

Obwohl der ‚Capture‘-Schritt mit der Protein 

A-Affinitätschromatographie aufgrund der 

Selektivität sehr effizient ist, werden zur Abreicherung 

weiterer Verunreinigungen normalerweise 

noch zusätzliche chromatographische 

Trennschritte (intermediate purification) 

eingesetzt. Insbesondere Endotoxine, Nukleinsäuren, 

Viren und potentielle „Leakage“- 

Produkte (zum Beispiel ausgeblutetes Protein 

A) müssen noch entfernt werden. Für diesen 

Zwischenschritt werden häufig IEC und 

HIC verwendet. Welche der Techniken zum 

Einsatz kommt, hängt im wesentlichen von 

der Art des MAbs ab. 

Die ausgewählten chromatographischen 

Trennmedien haben in der Regel Partikelgrößen 

zwischen 30 und 90 µm, um die benötigte 

Auflösung zu erzielen. Bei einigen Reinigungsprozessen 

ist die nach dem ‚Capture‘- 

Schritt erreichte Reinheit bereits so groß, daß 

auf den Zwischenschritt verzichtet werden 

kann. 

‚Polishing‘-Schritt 

Der ‚Polishing‘-Schritt (finale Aufreinigung) 

beschreibt den letzten Schritt des Reinigungsprozesses. 

An dieser Stelle ist das Produkt 

Vorteile 

– Protein wird in das Kulturmedium 

exprimiert 

– Protein wird selbst mit komplexen, 

posttranslationalen Modifikationen in 

biologisch aktiver Form exprimiert 

– Bewährtes System für zugelassene 

Biopharmazeutika 

bereits relativ rein, das Produktvolumen sehr 

klein und damit die Produktkonzentration 

und der Produktwert sehr hoch. Insbesondere 

Dimere, Oligomere, Produktheterogenitäten 

und ausgeblutetes Protein A werden hier 

entfernt. Um die für die therapeutische Anwendung 

benötigte Reinheit zu erzielen, 

werden hochauflösende chromatographische 

Techniken eingesetzt. Die Chromatographiemedien 

haben nun Partikelgrößen zwischen 

10 und 30 µm. 

Beispiele für hochauflösende Chromatographiemedien 

sind die SOURCE TM 15-Ionenaustauscher 

und die SOURCE TM 15-HIC-Medien. 

Gelfiltration (GF) stellt eine weitere effektive 

Technik für die finale Aufreinigung dar, ist 

aber bezüglich des Probenauftragvolumens limitiert. 

Reversed-Phase-Chromatographie 

(RPC) wird seltener zur Aufreinigung von 

MAbs verwendet, da zur Elution organische 

Lösungsmittel eingesetzt werden müssen, die 

zur Denaturierung der MAbs führen. 

Entfernung von Viren und anderen 

Verunreinigungen 

Aufgrund der Komplexität und der Kultivierungsdauer 

von Säugerzellen sind diese Zellinien 

für Verunreinigungen anfällig, außerdem 

werden erhebliche Mengen zelleigener 

Produkte ins Zellkulturmedium abgegeben. 

Werden dem Kulturmedium Wachstumsfaktoren 

zugefügt, so ist mit zusätzlichen Verunreinigungen 

zu rechnen, da diese häufig 

tierischen Ursprungs sind. Eine typische Verunreinigung 

stellen Prione dar. Die Entfernung 

und Überwachung der potentiellen 

Nachteile 

– Langsames Zellwachstum 

– Relative geringe Expressionsrate des 

Zielproteins 

– Hohe Kosten für das Kulturmedium 

– Empfindlich gegenüber Scherkräften 

– Risiko der Virus- und Mycoplasmen- 

Kontamination 

– Sicherheitsbedenken wegen 

transformierter Zellininen 

Abb. 3: Vor- und Nachteile von Säugetierzellen zur Herstellung von Biopharmazeutika 

Verunreinigungen ist ein wichtiger Bestandteil 

des Reinigungsprozesses, deren Abreicherung 

dokumentiert werden muß. Um die Virussicherheit 

des Biotherapeutikums zu gewährleisten, 

erwarten die Zulassungsbehörden 

den Einsatz von mindestens zwei robusten 

Inaktivierungs- und Abreicherungsschritten, 

wie zum Beispiel die Lösungsmittel/Detergentien 

Methode (Solvent-Detergent), 

Nanofiltration oder Hitze-Behandlung. 

Die eingesetzten Chromatographieschritte 

tragen ebenfalls wesentlich zur Virus-Inaktivierung 

und Abreicherung bei. Tabelle 1 

zeigt eine Einschätzung des Abreicherungspotentials 

unterschiedlicher Chromatographietechniken 

für solche zelleigenen, typischen 

Verunreingungen. Zu den Verunreinigungen, 

für die eine Qualitätskontrolle erforderlich 

sein kann, gehören zelleigene Proteine, 

DNA, Endotoxine, Prione, Viren, bioorganische 

Rückstände, „Leakage”-Produkte, 

Enzyme, Abbauprodukte sowie verschiedene 

Produktheterogenitäten. 

Ausblick 

Trotz bekannter Nachteile von Säugerzellkulturen 

als biotechnologische Expressionssysteme 

stellen sie die wichtigste Quelle zur Herstellung 

von großen, komplexen Proteinen 

dar (Abb. 3). Neue Entwicklungen in der Zellkultur-Technologie 

und dem molekularen 

Engineering führen zu immer effektiveren, 

kostengünstigeren und besser definierten 

Herstellungsverfahren. Der neue Boom, monoklonale 

Antikörper als Biotherapeutika 

einzusetzen, treibt diese Entwicklungen entscheidend 

voran. 

Literatur 

[1] Expanded bed adsorption with CHO cells, Amersham Biosciences application 

note, code number 18-1144-77. 

[2] Expanded bed adsorption with CHO cells, Amersham Biosciences, Downstream 

32, code number 18-1145-45. 

[3] Purification of recombinant hepatitis B surface antigen produced by 

transformed Chinese hamster ovary (CHO) cell line grown in culture. 

Makonnen, B., Yafang, M., Berglöf, J., Janson J-C. Bioseparation 1 (1991), 

397-408 

[4] Application Note 210: Monoclonal antibody purification on Phenyl Sepharose 

High Performance, Amersham Biosciences, code number 18-1020- 

58 (1991) 

[5] Chamow S. and Ashkenazi A. Antibody Fusion Proteins Wiley Liss Inc, New 

York, (1999). 

[6] Gagnon P. Purification Tools for Monoclonal Antibodies Validated Biosystems, 

Tucson, Arizona (1996) 

[7] Matejtschuk P., Baker R.M., and Chapman G.E., in Bioseparation and 

Bioprocessing vol 2, (Subramanian G., ed) Wiley-VCH Weinheim, pp 223- 

252 (1998). 

[8] Sofer G and Hagel L. Handbook of Process Chromatography, Academic 

Press, San Diego (1997). 

Kontakt 

Michael Kaleja 

Amersham Biosciences Europe GmbH 

Munzinger Str. 9 

D-79111 Freiburg 

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Fax: +49-(0)761-4519-315 

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www.amershambiosciences.com 



LC-MS � 

Monolithische stationäre 

Phasen für Bioseparationen 

Sven Andrecht, Dieter Lubda, Robertus Hendriks, Merck KGaA, Darmstadt 

Die Analyse von Polypeptiden und Proteinen erfordert aufgrund der Komplexität und der Dynamik 

des eukaryotischen Proteoms schnelle, empfindliche und reproduzierbare Methoden. 

Bislang routinemäßig eingesetzte Trennmethoden, wie die 2D-Gelelektrophorese, unterliegen 

allerdings Beschränkungen, so daß neue Entwicklungen – insbesondere im Bereich Kapillar-/Nano-HPLC-MS 

– an Bedeutung gewinnen. Eine solche Neuentwicklung sind monolithische 

stationäre Phasen, die im Gegensatz zu konventionell gepackten, partikulären Trennsäulen 

aus einer durchgängigen, einheitlichen, organischen oder anorganischen Matrix ohne 

Fritten bestehen. Die Anwendung solcher Trennsäulen wird am Beispiel von anorganischen, 

Silica-basierten 100 µm I.D. RP18e-Kapillarsäulen (Handelsname: Chromolith TM CapRod TM ) 

dargestellt. Durch ihre definierte, homogene Poren-Struktur ermöglichen diese monolithischen 

Silica-Kapillarsäulen sehr schnelle Trennungen bei gleichzeitig hoher Trennleistung. 

Dies erlaubt eine Reduktion von Analysezeiten verglichen mit Standard Nano-HPLC-Trennungen 

mit konventionell gepackten, partikulären Trennsäulen. 

Da Proteine in der Zelle die Funktionseinheiten 

der Gene darstellen und fast alle Therapie-Ansätze 

auf Proteinebene ansetzen, 

sind Proteom-Studien wesentlich, um 

grundlegende Informationen für die Charakterisierung 

zellularer Prozesse und 

menschlicher Krankheiten auf molekularer 

Ebene zu erhalten 1 . Derzeit kommen dazu 

hauptsächlich zwei komplementäre Technologien 

zum Einsatz: die 2D-Gelelektrophorese- 

und Flüssigkeits-Chromatographische 

(LC)-Strategien 2 . Beide Verfahren erfordern 

schnelle, effiziente und reproduzierbare Methoden 

für die Trennung von Proteinen und 

Peptiden vor der massenspektrometrischen 

Analyse, um Daten von hoher Qualität für 

die Peptid- und Protein-Identifikation zu gewinnen. 

Dies gilt besonders für eukaryotische 

Zellen mit ihrem komplexen und dynamischen 

Proteom. 

Ergänzend zu der 2D-Gelelektrophorese, 

die etwa Beschränkungen bei der Auftrennung 

von sehr kleinen, sehr großen, sehr sauren, 

sehr basischen oder hydrophoben Proteinen 

unterliegt und Schwierigkeiten bei der 

Protein-Färbung sowie -Quantifizierung bereitet 

3 , finden Kapillar- und Nano-HPLC-Verfahren 

in Kombination mit Massenspektrometrie 

(MS) verstärkt Einsatz bei den Proteomics-Studien, 

für die oft nur begrenzte Probenmengen 

zur Verfügung stehen 2 . Getrieben 

durch das Bedürfnis nach einer hohen Sensitivität 

und auch durch Entwicklungen in der 

Massenspektrometrie werden die HPLC-Säulendurchmesser 

immer kleiner – bis hin zu 

Kapillar- und Nano-LC-Dimensionen. Traditionell 

enthalten die Kapillar- und Nano-LC- 

Trennsäulen partikuläre Materialien, gewöhnlich 

Silica, die mit Hilfe von Fritten in 

den Säulen zurückgehalten werden. Um den 

immer höher werdenden Trennproblemen 

mit komplexen, kleinen Probenmengen gerecht 

zu werden, werden nicht nur die Säulendimensionen 

immer kleiner, sondern auch 

die verwendeten Partikel. Solche µm-kleinen 

Partikel in Kapillar- oder Nano-Säulen gepackt, 

führen allerdings zu Problemen: der 

Säulenrückdruck steigt selbst bei niedrigen 

Flußraten stark an. Dies führt zu Einschränkungen 

bei den Säulendimensionen und den 

verwendeten Flußraten, die eine leichte 

Handhabung und schnelle Analyse massiv erschweren. 

Darüber hinaus führt ein konstanter 

Betrieb bei hohen Säulenrückdrücken zu 

einer starken mechanischen Abnutzung der 

HPLC-Hardware. Um diese bisherigen Leistungsgrenzen 

partikulärer Säulen zu überwinden 

und zu praktischen Lösungen für die 

Chromatographie zu kommen, ist eine neue 

Art von Trennsäulen entwickelt worden. 

Monolithen 

Der neue Ansatz, Methoden für eine schnelle 

HPLC-Trennung mit hohem Durchsatz zu 

entwickeln, beruht auf der Entwicklung von 

monolithischen Trennsäulen, die entweder aus 

einer organischen oder einer anorganischen 

Matrix bestehen. Diese Matrix bildet eine 

durchgängige, einheitliche stationäre Phase 

ohne die begrenzenden Fritten gepackter, konventioneller, 

partikulärer Trennsäulen. 

Das Potential und die Vorteile monolithischer 

Trennsäulen erkannte Knox 4 bereits vor 

mehr als zwanzig Jahren. Er schlug vor, eine 

stabile Matrix in einer Säule herzustellen. 

Knox postulierte Verbindungsporen, die ein 

gut strukturiertes Netzwerk für den Durchfluß 

der mobilen Phase aufbauen. Zwischenzeitlich 

haben verschiedene Forschungsgrup- 

pen 5-9 monolithische Materialien auf ihre Eignung 

für die HPLC-Trennung geprüft. Basierend 

auf dem Material, aus dem die Trennsäulen 

hergestellt werden, lassen sie sich einteilen 

in organische Polymer- oder Silica-basierte 

monolithische Trennsäulen. 

Organische Monolithen 

Hjerten et al. 5 und Frechet et al. 6 haben die 

Herstellung stationärer Phasen aus Polyacrylamiden 

oder Poly(styrol-codivinylbenzol) in 

Anwesenheit von Porogenen beschrieben, die 

zu polymeren, monolithischen Materialien 

mit einer permanenten Makroporen-Struktur 

führen. Monolithische, organische Polymere 

sind auch erfolgreich innerhalb von Kapillaren 

hergestellt worden und für Trennungen 

mittels HPLC und Kapillarelektrochromatographie 

(CEC) eingesetzt worden. Der chromatographische 

Einsatz solcher polymeren 

Materialien zeigt allerdings in einigen Fällen 

Nachteile. So ist zum Beispiel bekannt, daß 

die meisten organischen Polymere – insbesondere 

gering vernetzte – dazu tendieren, 

in organischen Lösungsmitteln zu quellen 

Abb. 1: REM-Aufnahme eines Querschnittes einer 

monolithischen Chromolith TM CapRod TM 

100µm I.D.-Kapillarsäule mit Makro- und Mesoporen 

im Kieselgel-Skelett 

oder zu schrumpfen oder organische Polymere 

zum Teil eine geringe mechanische Stabilität 

aufweisen. Das Quellen und Schrumpfen 

kann zu einer dramatischen Veränderung 

der chromatographischen Trenneigenschaften 

führen. Außerdem weist die Struktur der 

porösen organischen Polymere oft Mikroporen 

auf, die die Trenneffizienz und Peak-Symmetrie 

negativ beeinflussen. Allerdings zeigen 

organische, polymere, monolithische Materialien 

eine ausgezeichnete Bioverträglichkeit, 

können in einem breiten pH-Bereich eingesetzt 

und sogar mit aggressiven mobilen 

Phasen gereinigt werden. 

Anorganische Monolithen 

Silica-basierte monolithische Materialen sind 

ursprünglich basierend auf der Arbeit von 



Abb. 2: Vergleichende Darstellung von (A) Bodenhöhe H gegen lineare Geschwindigkeit u der mobilen 

Phase mit Pentylbenzol als Probe und (B) Säulenrückdruck P gegen die lineare Geschwindigkeit u der 

mobilen Phase zwischen einer 75µm I.D. RP18e (3µm) konventionellen, partikulären und einer 100µm 

I.D. Chromolith TM CapRod TM monolithischen Kapillarsäule. 

Nakanishi und Soga 10 hergestellt worden. Sie 

haben ein neues Sol-Gel-Verfahren für die 

Herstellung monolithischer Silica-Trennsäulen 

mit einer bimodalen Poren-Struktur entwickelt. 

Anhand dieser Arbeit haben Prof. 

Dr. Nobuo Tanaka, Kyoto Institute of Technology, 

das Unternehmen Merck KGaA und 

andere 11-12 das zugrundeliegende Sol-Gel- 

Verfahren weiterentwickelt, um monolithische 

Kapillarsäulen (50-200µm I.D.) herzustellen, 

die für HPLC- und CEC-Trennungen 

eingesetzt werden können. Dabei entsteht 

Abb. 3: Trennung eines tryptischen Verdaus von 

Beta-Lactoglobulin auf einer 100µm I.D. monolithischen 

Silica-Kapillarsäule unter Verwendung 

eines Wasser/Acetonitril-Gradienten und Ameisensäure 

als Ionenpaarreagenz 

eine stabile monolithische Phase innerhalb 

der Kapillarsäule mit einer spezifischen Poren-Struktur 

aus Makroporen und Mesoporen, 

in der Schrumpfungsprozesse vernachlässigbar 

sind. Die Makropore kann als 

durchgängige Pore beschrieben werden, mit 

einer durchschnittlichen Größe von 2 µm. 

Hieraus resultiert eine außergewöhnliche 

Permeabilität, die zu niedrigen Säulenrückdrücken 

führt. Die Mesoporen befinden sich 

in einem Kieselgel-Skelett mit einer Größenverteilung 

um 13 nm (Abb. 1). 

Die monolithischen Silica-Kapillarsäulen 

haben den wesentlichen praktischen Vorteil, 

daß kein Ummantelungs-Verfahren der Silica-Monolithe 

notwendig ist und die Kapillarmonolithen 

in ihrer Länge variabel sind, 

da bei dem Sol-Gel-Prozeß keine Fritten benötigt 

werden und die definierte Porenstruktur 

zu niedrigen Säulenrückdrücken führt. 

Dies ermöglicht eine leichte Handhabung. 

Durch schnelle Adsorptions- und Desorptionsprozesse 

an dem nur wenige Mikrometer 

dickem Kieselgel-Skelett zeigen die unter 

dem Namen Chromolith TM CapRod TM vermarkteten 

100µm I.D. RP18e-Säulen bei der 

Trennung sehr flache H/u-Kurven (Bodenhöhe 

H / lineare Geschwindigkeit u) verglichen 

mit konventionellen, partikulären Säu- 

len (Abb. 2a). Die Trennleistung der monolithischen 

Silica-Kapillarsäulen beträgt etwa 

100.000 N/m und ist vergleichbar mit sehr 

guten partikulären 3-5 µm-HPLC-Säulen. 

Auffällig ist allerdings der geringe Säulenrückdruck. 

Im Vergleich zu einer konventionellen, 

partikulären Säule ist er deutlich niedriger 

(Abb. 2b). Durch die flache H/u-Kurve 

und den geringen Säulenrückdruck können 

die Silica-Kapillarsäulen problemlos 

auch bei höheren Flußraten mit vernachlässigbarem 

Einfluß auf die Effizienz eingesetzt 

werden. 

Die Selektivität der monolithischen Silica- 

Kapillarsäulen, die zur Oberflächenmodifizierung 

mit C18-Silanen und einem ‚endcapping 

Reagenz‘ derivatisiert werden, ist vergleichbar 

zu konventionellen Reversed Phase-Materialien. 

Abbildung 3 zeigt die Trennung 

von Polypeptiden auf einer 100 µm I.D. 

Chromolith TM CapRod TM -Säule. Bei Verwendung 

eines Wasser/Acetonitril-Gradienten 

mit TFA oder insbesondere Ameisensäure als 

Ionenpaarreagenz können die Polypeptide 

effizient und sensitiv aufgetrennt werden 

und zum Beispiel einer anschließenden massenspektrometrischen 

Analyse zur Peptid-/ 

Proteinidentifikation zugeführt werden. 

Zusammenfassung 

Die Silica-Kapillarmonolithen zeigen durch 

ihre definierte, homogene Poren-Struktur einen 

verbesserten Massentransfer und eine 

verbesserte Trenneffizienz, die eine schnelle, 

effiziente und vor allem reproduzierbare 

Trennung verschiedenster Moleküle erlaubt. 

Ein wesentliches Einsatzgebiet der monolithischen 

Silica-Kapillarsäulen ist im Moment 

die Proteomforschung, bei der gerade 

diese Möglichkeiten für die Trennung und 

Identifizierung von Polypeptiden bedeutend 

sind. 

Literatur 

[1] A. Pandey und M. Mann, Nature 405 (2000) 837-46. 

[2] J. Peng und S.P. Gygi, J. Mass Spectrom. 36 (2001) 1083-1091. 

[3] K.H. Lee, Trends Biotechnology 19 (2001) 217-222. 

[4] J.H. Knox und P.A. Bristow, Chromatographia 10 (1977), 279. 

[5] Ch.M. Zeug et al., J. Chromatogr. A 753 (1997) 227-234. 

[6] S. Xie et al., J. Chromatogr. A 775 (1997) 65-72. 

[7] H. Minakuchi et al., Anal. Chem. 68 (1996) 3498-3501. 

[8] D. Lubda et al., J. of Sol-Gel Science and Technology 23 (2002) 185–189. 

[9] A. Premstaller et al., Anal. Chem. 74 (2002) 4688-4693. 

[10] K. Nakanishi und N. Soga, J. Non Cryst. Solids 139 (1992) 1-13, 14–24. 

[11] N. Tanaka et al., J. High Resol. Chromatogr. 23 (2000) 111. 

[12] N. Ishizuka et al., J. Chromatogr. A 960 (2002) 85-96. 


Dr. Sven Andrecht 

Merck KGaA 

Life Science Products R&D Proteomics 

Frankfurter Straße 250 

D- 64271 Darmstadt 

Tel.: +49-(0)6151-72-95-86 

Fax: +49-(0)6151-72-95-93 

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Proteomics � 

Proteinfraktionierung 

durch vollautomatisierte 

2D-Chromatographie 


Dr. Dietmar Hansen, Dietmar Janke, Dr. Christoph Krüll, Beckman Coulter GmbH, Krefeld 

Die ProteomeLab-Initiative von Beckman Coulter fokussiert auf die Entwicklung neuer 

Produkte in der Proteomforschung und gründet sich auf Schlüsseltechnologien einschließlich 

Automation (Pipettiersysteme), Durchflußzytometrie, Elektrophorese, Chromatographie, 

Zentrifugation und Spektrophotometrie. Eines dieser neuen Produkte ist das zweidimensionale 

Chromatographiesystem zur Proteinfraktionierung (PF2D). Dabei wird die erste Dimension 

der Auftrennung mit einer Chromatofokussierung durchgeführt, die zweite Dimension 

mit einer Reversed-Phase-Chromatographie. Die intakten Proteine können anschließend 

identifiziert und charakterisiert werden. Die Technik ist vollautomatisiert. 

Key Words: Proteom-Forschung, 2D-Chromatographie, HPLC, Differential-Display, 

Automation 

Viele Projekte zur Genomsequenzierung sind 

mittlerweile erfolgreich abgeschlossen, auch 

das menschliche Genom ist vollständig sequenziert. 

Mit ‚nur‘ etwa 30.000 Genen erwies 

sich das humane Genom als weniger komplex 

als ursprünglich erwartet. Dies liegt zum Teil 

daran, daß entgegen dem ursprünglichen zentralen 

Dogma der Molekularbiologe ein Gen 

tatsächlich für mehrere Proteine kodieren 

kann. Da Proteine außerdem post-translational 

modifiziert werden können, ergibt sich auf 

Proteinebene ein sehr komplexes Bild. Die 

Auftrennung, Isolierung und Quantifizierung 

aller Bestandteile des Proteoms steht deshalb 

im Mittelpunkt des Interesses. Ein Proteom 

ist die quantitative Darstellung des gesamten 

Proteinexpressionmusters einer Zelle, eines 

Organismus oder einer Körperflüssigkeit un- 

Abb. 1: Das ProteomeLab PF2D-System zur vollautomatischen 2D-HPLC 

ter genau definierten Bedingungen 1 . Unterschiede 

im Proteinexpressionsmuster von 

Zellen verschiedener Herkunft sind ein 

Schlüssel zum Verständnis der Zellentwicklung 

aber vor allem auch zum Verständnis 

von Krankheiten und daraus abgeleitet von 

Therapiemöglichkeiten. 

Technologien zur Proteinauftrennung 

Zum Auftrennen einer großen Anzahl von 

Proteinen wird meistens die 2D-Gelelektrophorese 

eingesetzt. Bei dieser Methode gibt 

es aber einige erhebliche Nachteile. So ist es 

zum Beispiel schwierig, Proteine so anzufärben, 

daß die Fragmente quantitativ für eine 

nachfolgende Analyse erhalten bleiben. Der 

Nachweis von in geringen Mengen vorhan- 



� 

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Abb 2. Beispiel einer UV/pI Map mit einem Chromatogramm der zweiten Dimension von Fraktion 17 (li.) 

einer Mauszellinie 

denen Proteinen ist zudem über Anfärbemethoden 

schwierig zu erbringen, da die Mengen 

exprimierter Proteine in der Zelle um 

sechs Größenordnungen differieren können. 

Ebenso werden stark saure und basische oder 

hochpolare sowie hydrophobe Proteine nur 

unzulänglich über direkte Anfärbung detektiert. 

Zudem sind die Bedingungen für eine 

2D-Gelelektrophorese nur sehr schwierig zu 

reproduzieren, weshalb der Vergleich mehrerer 

Gele sehr schwierig wird. Wegen dieser 

Nachteile ist es fraglich, ob diese Methode 

überhaupt genügend Informationen zur Analyse 

des Proteinexpressionsstatus liefern 

kann. Vor diesem Hintergrund ist auch eine 

vollständige Automatisierung der 2D-Gelelektrophorese 

fraglich. 

Beckman Coulter geht deshalb mit dem 

ProteomeLab TM PF2D einen anderen Weg und 

betreibt Proteinfraktionierung mit zweidimensionaler 

HPLC. Die Auftrennung in der 

ersten Dimension geschieht durch eine Chromatofokussierung 

im Bereich von pH 8,5 bis 

pH 4 2 . Für die zweite Dimension wird eine 

Reversed-Phase-Chromatographie auf einer 

speziellen Säule mit nicht porösem Trennmaterial 

durchgeführt – also eine Trennung nach 

der Hydrophobizität. Da die Partikel nicht 

porös sind, ist eine sehr hohe Trennleistung 

gegeben. Das Gerät arbeitet vollautomatisch. 

Die Fraktionen der ersten Dimension werden 

in einem Autosampler gesammelt, der 

selbständig die zweite Dimension einspritzt. 

Die Detektion übernehmen UV Detektoren bei 

280 nm. Die Ergebnisse werden zu einer UV/ 

pI Map (Abb. 1) zusammengefaßt. Hier wird 

das Chromatogramm jeder Fraktion in einer 

Spur dargestellt. Die Farben der Spots stehen 

für die unterschiedlichen Extinktionen 3 . Die 

einzelnen Fraktionen werden in einem Fraktionssammler 

aufgefangen und die intakten 

Proteine stehen zur weiteren Untersuchungen 

bereit. Die detektierten Proteine werden durch 

die Software ProteoSuite in einer UV/pI 

Map (Abb. 2) zusammengefaßt. Hier wird das 

Chromatogramm jeder Fraktion in einer Spur 

Abb. 3: „Differential-Display“ von behandelten und unbehandelten Zellen einer Dickdarmkrebs-Zellinie. 

Links ist das Proteinexpressionsmuster einer unbehandelten Zelle und auf der rechten Seite das 

Muster einer behandelten Zelle zu sehen. Die mittlere Abbildung gibt die errechnete Differenz wieder. 

dargestellt. Die Farben der Spots stehen für 

die unterschiedlichen Extinktionen. 

Detektion differentieller 

Proteinexpression 

Der Vergleich der Proteinexpression zweier 

verschiedener Zellen oder Gewebe liefert 

wichtige Informationen. So können Unterschiede 

zwischen malignem und gesundem 

Gewebe die an der Entartung gesunder Zellen 

beteiligten Proteine aufzeigen. Zur Profilierung 

potentieller Medikamente können 

Zellen mit dem Wirkstoff-Kandidaten behandelt 

werden. Der Vergleich mit gesunden oder 

unbehandelten Zellen derselben Zellinie zeigt 

dann die Unterschiede auf, die für das Verständnis 

der Funktion wichtig sind. Das Softwaremodul 

DeltaVue zeigt diese Unterschiede 

in einem „Differential-Display“ 

schnell und zuverlässig an (Abb. 3). Starke 

Färbungen der Spots stehen für Proteine, deren 

Konzentration erhöht oder erniedrigt sind. 

Zum Identifizieren der Proteine kann optional 

eine Online-Massenspektroskopie erfolgen 

4 . Die durch einen Fraktionssammler in Mikrotiterplatten 

aufgefangenen Proteine stehen 

für weitere Anwendungen zur Verfügung. Ein 

‚Peak-Picking‘ wie bei der 2D-Gelelektrophorese 

entfällt 5 . Die fraktionierten Proteine können 

auf einem Biomek-Pipettierer weiter prozessiert 

werden. Applikationen stehen etwa 

zum tryptischen Verdau, Umsalzen und Spotten 

auf MALDI-Targets zur Verfügung. 


Fazit 

ProteomeLab PF2D stellt eine wichtige 

Technologie zur Analyse des Proteoms dar. 

Eine aufwendige Automation von 2D- Elektrophorese 

Systemen mit der Gelherstellung, 

der Auftrennung, der Spotdetektion und des 

Spotpickings ist nicht erforderlich. Dem in 

den neuen Markstudien (zum Beispiel 

Frost&Sullivan 2003) veröffentlichten stark 

erhöhten Bedarf an Automation in der Proteomforschung 

– mit Wachstumsraten um 

15% allein im Bereich Proteinaufreinigung inklusive 

der Fraktionierung, das entspricht 

etwa 110 Mio. US-$ in 2004 – wird hier bereits 

Rechnung getragen. 

Literatur 

[1] Lottspeich, Zorbas, Bioanalytik, Spektrum Verlag Heidelberg (1998), 815-820 

[2] B. Lubman, Journal of Chromatographie B, 782 (2002) 183-196 

[3] T.C. Hunteret al.; Journal of Chromatographie B, 782 (2002) 183-196 

[4] B.E. Chong et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., 15, (2001) 291-296 

[5] M.T. Kachmann et al., Chem., 74 (2002) 1779-1791 


Dr. Dietmar Hansen 

Beckman Coulter GmbH 

Europapark Fichtenhain B13 

D-47807 Krefeld 

eMail: dhansen@beckman.com 

www.beckman.com


Zellseparation � 

Durchflußzytometrie und 

Zellsortierung 

Giovanni Salerno, Lothar Gröbe, Knut Petkau, DakoCytomation GmbH, Hamburg 

Während der Begriff Zytometrie umfassend die Messung von physiko-chemischen Eigenschaften 

von Zellen beschreibt, ist die Durchflußzytometrie eine etablierte Methode die dabei 

verwendet wird. Durch einen präzise geregelten Differenzdruck zwischen Trägerflüssigkeit 

und Probenlösung werden Zellen oder Partikel in eine gemeinsame Strömung gezwungen. 

Dabei bewegen sie sich wie Perlen an einer Schnur aufgereiht vor einer Meßeinrichtung vorbei. 

Die Zellsortierung ist die logische Weiterentwicklung dieses Vorgangs: Nach der Messung 

und der Identifizierung der gewünschten Zellpopulation wird durch eine elektrisches 

Aufladen des Flüssigkeitsstrahls eine Trennung der Zellen in einem elektrischen Feld ermöglicht. 

Die Digitalisierung der Signale in Verbindung mit einer Multiparameter-Datenaufnahme 

bei Ereignisraten von mehr 100.000 Zellen/s und einer 4-Wege-Sortierung haben den 

Einsatzbereich der Durchflußzytometrie erweitert: Neben den schon „traditionellen“ Gebieten, 

wie Immunologie, Krebsforschung, Biologie und Genetik, kann die Durchflußzytometrie 

heute als wesentliches Werkzeug in der Arzneimittelforschung und der Hochdurchsatz-Analyse 

(HTS) angesehen werden. 

Analyzer messen Proben, Zellen oder Partikel 

und liefern Daten, die in Listmode-Dateien 

abspeicherbar sind. Zellsorter analysieren 

und trennen (sortieren) einzelne Populationen 

aus komplexen Proben. Während 

Analyzer in der Regel geschlossene Systeme 

sind, in denen die Flüssigkeit durch eine 

transparente Quarzküvette strömt, sind 

Hochgeschwindigkeits-Zellsorter „offene“ 

Systeme (jet-in-air-Prinzip). 

Fluoreszenz 

Zytometer bestimmen externe und interne 

zelluläre und nicht-zelluläre Eigenschaften 

durch die Messung der Lichtstreuung und 

von emittiertem Fluoreszenzlicht. Fluoreszenz 

entsteht, wenn Elektronen, die durch 

Licht einer bestimmten Wellenlänge angeregt 

werden, anschließend in einen weniger an- 

Abb: 1. DakoCytomation MoFlo ® IT und DT, mit 

Strahlengängen für 3 Laser (DakoCytomation, 

Fort Collins CO, USA). 

geregten Zustand (meist den Grundzustand) 

zurückkehren. Daraus ergeben sich Emissions- 

und Absorbtionsspektren. Der sogenannte 

Stokes-Shift ist die Differenz zwischen 

den Maxima der Absorptions- und 

Emissionsspektren. Der Absorptionskoeffizient 

gibt an, wieviel Licht bei einer bestimmten 

Wellenlänge absorbiert wird, während 

die Quantenausbeute angibt, wie viel Photonen 

pro absorbiertem Photon emittiert 

werden. Die Forschung an Fluoreszenzfarbstoffen 

fand Verbindungen, deren maximaler 

Absorptionskoeffizient in der Nähe der 

wichtigsten Laser-Emissionslinien liegen 

und die gleichzeitig eine hohe Quantenausbeute 

aufweisen. 

Laser 

Laser (Light Amplification by Stimulated 

Emission of Radiation) erzeugen einen intensiven 

Strahl von monochromatischem, kohärenten 

und kollimierten Licht. Moderne Analyzer 

haben in der Regel eine festgelegte Laser-Anordnung, 

während Zellsorter flexibler 

sind. Beide Geräte können bis zu drei Laser 

integriert haben und decken damit eine Vielzahl 

von Anwendungen. 

Fließzelle 

Die Fließzelle ist speziell konstruiert um die 

Suspension (Zellen oder andere Partikel) 

durch die hydrodynamische Fokussierung 

im Zentrum eines isotonischen Flüssigkeitsstroms 

(Sheath) zu fuhren. In Zytometern 

kommt einer von vier Flow-Zellen-Typen 

zum Einsatz. Die Auswahl eines speziellen 

Typs ist immer ein Kompromiß zwischen 

optischer Empfindlichkeit und den erreichbaren 

Leistungen beim Sortieren: 

– Jet-in-air: optimal zum Sortieren, schlechtere 

optische Eigenschaften 

– Durchflußküvette: Erste Wahl in den optischen 

Eigenschaften, kann zum Sortieren 

verwendet werden 

– Strömung in Objektträger: beste optische 

Eigenschaften, keine Sortiermöglichkeit 

– Offene Strömung entlang einer Oberfläche: 

beste optische Eigenschaften, keine 

Sortiermöglichkeit 

Jet-in-air- und hydrodynamische 

Fokussierung 

Dieses Prinzip stellt die beste Lösung für 

Hochgeschwindigkeits-Zellsorter dar, da die 

Möglichkeit besteht, mit hohen Drücken zu 

arbeiten (bis zu 80 PSI) und damit Sortierraten 

von mehr als 100.000 Ereignissen pro Sekunde 

zu erreichen. Die Probensuspension 

wird in das Zentrum einer Strömung einer 

partikelfreien isotonischen Salzlösung eingespeist. 

Eine Druckregelung stabilisiert die 

dabei entstehende laminare Strömung und 

ordnet die Partikel wie Perlen auf einer 

Schnur an. Die Laser werden direkt unterhalb 

der Düse auf den Strahl fokussiert und liefern 

das Anregungslicht. 

Detektoren 

Das Streu- und Fluoreszenzlicht wird durch 

Photomultiplier (PMT) oder Photodioden 

(PD) in elektrische Signale gewandelt. Während 

PD hauptsächlich zur Messung des Vorwärtsstreulichts 

eingesetzt werden, werden 

PMTs aufgrund ihrer höheren Empfindlichkeit 

für den Nachweis des Fluoreszenzlichts 

verwendet. 

Meßparameter und Optik 

Wenn der Laserstrahl die Partikel anregt, tritt 

gleichzeitig Lichtstreuung und die Emission 

von Fluoreszenzlicht auf. Das Vorwärtsstreulichtsignal 

(FSC), das normalerweise von einer 

Diode nachgewiesen wird, korreliert mit 

der Partikelgröße, der Form und der optischen 

Homogenität. Es gibt wichtige Einflüsse 

die das Signal beeinflussen: der Winkelbereich, 

über den das Streulicht gesammelt 

wird, Strahlblenden und der Unterschied im 

Brechungsindex zwischen Partikeln und 

Transportmedium. Das Seitwärtsstreulichtsignal 

(SSC), das von einem PMT im 90°-Winkel 

nachgewiesen wird, gibt Informationen 

über die innere Beschaffenheit. Fluoreszenzlichtsignale 

werden ebenfalls mit PMTs im 

90°-Winkel gemessen. 

Anregungsbereich und 

Detektionsbereich 

Um Streulicht und Fluoreszenzlicht getrennt 

nachzuweisen, wird der optische Strahlen- 


Abb. 2: DakoCytomation MoFlo ® Z-Konfiguration, 

mit Filtern und dichroitischen Spiegeln für die 

Anregung mit einer 488 nm-Laserlinie. (Dako- 

Cytomation, Fort Collins CO, USA) 

gang in einer speziellen orthogonalen Anordnung 

aufgespalten: Anregungsbereich und 

Detektionsbereich sind über eine Objektivlinse 

verbunden. (siehe Abb. 1). Das Streulicht 

wird einerseits durch eine Linse vor 

dem FSC-Detektor und gleichzeitig durch 

das Objektiv gesammelt, senkrecht zu Laserstrahl 

und Flüssigkeitsstrom. 

Detektionsbereich 

Dichroitische Spiegel (DC), die entweder in 

„longpass“ (LP, kürzere Wellenlängen werden 

reflektiert) oder „shortpass“ (SP, längere 

Wellenlängen werden reflektiert) Version 

unter 45° entlang des Strahlengangs angeordnet 

sind, spalten das Fluoreszenzlicht in 


verschiedene Wellenlängenbereiche auf (siehe 

Abb. 2) die jeweils getrennt von einem eigenen 

PMT gemessen werden. 

Kompensation 

Unglücklicherweise beginnen Emissionsspektren 

im allgemeinen mit einem steilen Anstieg 

auf der kurzwelligen Seite, gefolgt von einem 

langsamen Abfall der Intensität zu längeren 

Wellenlängen hin. Spektrale Überlappung ist 

normalerweise kein großes Problem auf der 

kurzwelligen Seite. Wirkliche Probleme treten 

auf, wenn Fluoreszenzlicht des kurzwelligeren 

Farbstoffs (z.B. FITC) im Bereich des 

Bandpassfilters strahlt, der für langwellige 

Farbstoffe gedacht ist (z.B. PE). Diese spektrale 

Überlappung von FITC in den Filterbereich 

von PE würde zu einem falschen Beitrag 

im PE-Signal führen. Um den korrekten 

Betrag des PE-Signals messen zu können, 

muß die beobachtete Signalintensität durch 

Subtraktion eines Prozentanteils der beobachteten 

FITC-Intensität „kompensiert“ werden. 

Die Digitalisierung und die Möglichkeiten der 

Digitalen Signalverarbeitung (DSP) ermöglichen 

die Kompensation mittels Software-Algorithmen: 

Die Meßergebnisse können nach 

der Datenaufnahme kompensiert werden, die 

Originaldaten zusammen mit den kompensierten 

im selben Listmode-Datenfile gespeichert 

werden. In den vergangenen Jahren hat 

das Interesse an der pathologischen Wirkung 

von kleinen Lymphozyten Subpopulationen 

die Entwicklung von Vielfarbanalysen (6 bis 

9 Farben) vorangetrieben. 

Zell-Sortierung 

Zellsorter gewinnen hochreine Populationen 

aus heterogenem Probenmaterial. Die ge- 


Anzeige 

Abb. 3: Sortierprinzip eines Jet-in-air-Zellsorters. 

Nach der Aufnahme der Daten und einer 

positiven Identifizierung durch die Elektronik 

erreicht die gewünschte Zelle den Abrißpunkt. 

Unmittelbar vor der Abtrennung wird der gesamte 

Flüssigkeitsstrahl aufgeladen. Die Ziel-Zelle 

verläßt den Strahl im Innern eines geladenen 

Tröpfchens, das im Anschluß daran durch ein 

elektrisches Feld in ein spezielles Röhrchen abgelenkt 

wird. Im linken Teil des Bildes sind Abrißpunkt 

und Tröpfchen zu sehen, wie sie von der 

Droplet-Kamera des MoFlo aufgenommen werden 

(DakoCytomation GmbH, Freiburg). 

wünschte Population wird bei der Messung 

durch eine beliebige Kombination von Streulichtverhalten 

und Fluoreszenzintensitäten 

identifiziert und anschließend in separate 

Röhren sortiert (siehe Abb. 3). Die gebräuchlichste 

Art zu sortieren basiert auf der Erzeugung 

von Tröpfchen: Bei festgelegten 

Druck- und Frequenzwerten zerfällt jede 

Strömung durch eine Düse in einem definierten 

Abstand von der Düse (Abrißpunkt) 

in Einzeltröpfchen, die mittels eines elektrischen 

Feldes abgelenkt werden. 


�


Tab.: Definition von Reinheit, Rückgewinnung und Ausbeute für die Planung von Sortierexperimenten lichkeit mehr als ein Tröpfchen aufzuladen: 

Reinheit % Anzahl der gewünschten Partikel in der sortierten Probe 

(Purity) Alle Partikel in der sortierten Probe 

Rückgewinnung % Anzahl der gewünschten Partikel in der sortierten Probe 

(Recovery) Anzahl der detektierten gewünschten Partikel 

Ausbeute % Anzahl der gewünschten Partikel in der sortierten Probe 

(Yield) Anzahl der gewünschten Partikel in der Ausgangsprobe 

Bei einem Zellsorter, der bei einem Druck 

von 60 PSI, mit einer 70 µm-Düse und einer 

Anregungsfrequenz von 100 kHz arbeitet, 

strömt die Flüssigkeit mit ca. 25 m/s, und 

der Abrißpunkt liegt ungefähr 12 mm unterhalb 

der Düse. Die Frequenz der Anregungsschwingung, 

die durch einen Piezokristall 

im Innern des Düsenkopfes erzeugt 

wird, entspricht der Anzahl Tröpfchen, die 

pro Sekunde gebildet werden. Die Zeit, die 

zwischen der Detektion eines Partikels am 

Fokussierungspunkt des Laserstrahls und 

dem Erreichen des Abrißpunktes verstreicht, 

heißt „drop delay“. 

Wenn ein detektiertes Partikel nach der 

Messung als gewünscht identifiziert wurde 

und den Abrißpunkt erreicht, wird der gesamte 

Flüssigkeitsstrahl aufgeladen und das 

Teilchen verläßt dann den Strahl im Inneren 

eines elektrisch geladenen Tröpfchens. Das 

Tröpfchen wird anschließend durch ein zwischen 

zwei Elektroden angelegtes elektrisches 

Feld in ein Auffangröhrchen abgelenkt. 

Tröpfchen ohne oder mit unerwünschten 

Partikeln werden durch eine Abfallsammelvorrichtung 

entsorgt. 

Es ist offensichtlich, daß die Stabilität der 

Strömung und ein konstantes „drop delay“ 

die wichtigsten Bedingungen sind. Um nur 

das gewünschte Partikel zu sortieren, muß 

die Aufladung des Flüssigkeitsstrahls mit 

genau der passenden Verzögerung erfolgen. 

Jede Abweichung von dieser Zeitverzögerung 

aufgrund von Druckschwankungen, 

Luftblasen, Änderungen der laminaren Strömung 

oder der Temperatur beeinflussen 

dramatisch die Reinheit und Ausbeute der 

sortierten Population. 

Sortierlogik und Ladungs-Hüllkurve 

Bei der Planung von Sortierexperimenten ist 

es wichtig, die Definitionen von Reinheit, 

Rückgewinnung und Ausbeute in die Überlegungen 

mit einzubeziehen (siehe Tabelle). 

Beim Sortieren ist die Wahrscheinlichkeit, daß 

zwei Ereignisse gleichzeitig auftreten (koinzident), 

direkt proportional zur Ereignisrate. 

Da die Elektronik diese zwei Ereignisse nicht 

unterscheiden kann, werden diese verworfen 

(„hard aborts“) wobei nicht nur falsche Partikel, 

sondern auch positive verlorengehen, 

was die Ausbeute beeinträchtigt. 

Falls die Ausbeute kritisch ist, wie etwa bei 

der Isolation sehr seltener Zellen, werden bei 

reduzierter Reinheit alle gewünschten Partikel 

sortiert, auch wenn dabei „einige“ falsche 

mitsortiert werden. Statistisch betrachtet 

hängt die Ausbeute vom zufälligen Auftreten 

seltener Ereignisse ab, die einer Poisson- 

Statistik folgen. Es kann einfach gezeigt werden, 

daß bei einer festen Ereignisrate und 

Totzeit, eine Erhöhung der Tröpfchenfrequenz 

die Ausbeute erhöht (siehe Abb. 4). 

Falls die Reinheit entscheidend ist, wie bei 

der Isolation von Einzelzellen für Klonierungsexperimente, 

werden sowohl Wiederfindung 

als auch Ausbeute vermindert: Jedes 

Mal, wenn die Gefahr besteht, daß ungewünschte 

Partikel mitsortiert werden, verwirft 

die Elektronik dieses Ereignis und erhöht 

dadurch die Gesamtverlustrate. Deshalb 

arbeiten Zellsorter mit verschieden Algorithmen 

– auch als Sortierlogik oder Verlustlogik 

bezeichnet – die den Anforderungen entsprechend 

ausgewählt werden können. Neben 

der Sortierlogik besteht auch die Mög- 

Abb. 4: Ausbeute und Poisson-Statistik. 

Bei einer konstanten 

Totzeit von 5,5 µs 

verringert sich die Ausbeute 

mit ansteigender Ereignisrate. 

Bei höheren Zählraten 

verwirft die Elektronik aufgrund 

der steigenden Anzahl 

von Koinzidenzen immer 

mehr Partikel, darunter auch 

positive Zellen. Indem man 

die Anregungsfrequenz und 

damit die Zahl der Tröpfchen 

/s erhöht, kann die Ausbeute 

gesteigert werden. 

die Sortier-„Hüllkurve“ kann geändert werden, 

so daß ein, zwei oder auch drei Töpfchen 

gleichzeitig geladen werden, um damit 

zeitweise die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, 

das gewünschte Partikel zu sortieren. 

Diskussion 

Eine Vielzahl an Experimenten können heute 

vollständig mittels der Durchflußzytometrie 

durchgeführt werden. State-of-the-art-Analyzer 

bieten 11 Parameter, 9 Farben und 3 Anregungslaser 

kombiniert mit digitaler Softwarekompensation 

und Analyseraten von mehr als 

50.000 Zellen/s. Hochgeschwindigkeits- 

Zellsorter können gleichzeitig vier verschiedene 

Zielpopulationen mit unabhängiger Sortierlogik 

bei einer Geschwindigkeit von bis zu 

100.000 Zellen/s weitgehend automatisch sortieren, 

wobei gleichzeitig Reinheit, Wiederfindung 

und Ausbeute optimiert und im Falle 

einer Störung die Proben sichergestellt und 

die Störung gemeldet werden. Moderne Geräte 

können jede Art von Platten mit extremer 

Genauigkeit und Reinheit sortieren, vom 

Objektträger bis zur 1536-Well-Mikrotiterplatte. 

Die Verbindung solcher Systeme mit robotischen 

Plattenmanipulatoren erlauben vollautomatische 

Hochdurchsatz-Analysen, wobei 

bis zu 32 Parameter für jedes einzelne Ereignis 

gemessen werden können. Durchflußzytometrie 

und Zellsortierung sind heutzutage 

etablierte und wertvolle Werkzeuge für 

die Analyse und Isolation von Zellen und 

anderen Partikeln die in der Forschung sowie 

klinischen und industriellen Anwendungen 

eine glänzende Zukunft haben. 

Literatur 

[1] Shapiro, H M. Practical Flow Cytometry – third edition. Wiley Liss, New 

York 1995, p. 43. 

[2] Melamed MR, Lindmo T, Mendelsohn ML. Flow Cytometry and Sorting, 2nd 

ed. Wiley-Liss, New York, 1990 

[3] Roederer, M. Compensation. Current Protocols in Cytometry. Wiley, New 

York, 1999. 

[4] Stewart, C.C., Stewart, S.J. Four color compensation. Cytometry (Communications) 

1999; 38: 161-175. 

[5] Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow 

cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods 

2000; 243: 77-97. 

[6] De Rosa, S.C., Herzenberg, L.A., Herzenberg, L.A., Roederer, M. 11-color, 

13-parameter flow cytometry: identification of human naïve T cells by 

phenotype, function, and T cell receptor diversity. Nature Medicine 

2001: 7: 245-248. 

[7] Bigos, M., Baumgarth, N., Jager, C.G., Herman, O.C., Nozaki, T., Stovel, R.T., 

Parks, D.R., et al. Nine color eleven parameter immunophenotyping using 

three laser flow cytometry. Cytometry 1999; 36: 36-45. 

[8] Corcoran, R.M., Lopez, P.A. Cells sorting at 50,000 events per second – 

Practical consideration. Cytomation Inc., Application note. Cytomation Inc, 

Fort Collins, Colorado USA. 

[9] Ashcroft, R.G., Lopez, P.A. Commercial high speed machines open new 

opportunities in high throughput flow cytometry (HTFC). Journal of Immunological 

Methods, 2000: 243: 13-24. 


DakoCytomation GmbH 

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D-22083 Hamburg 

Tel.: +49-(0)40-6969-47-0 

www.dakocytomation.de 


Biotechnologie � 

Nachhaltige Biokatalyse 


Dr. Rainer Erb 1 , Dr. Stefanie Heiden 2 

1 Zentrum für Umweltkommunikation der Deutschen Bundesstiftung Umwelt gGmbH 

2 Deutsche Bundesstiftung Umwelt, Osnabrück 

Biotechnologischen Innovationen kommt eine besondere Bedeutung bei der Realisierung ökonomisch 

rentabler und ökologisch vorteilhafter Produktionsverfahren zu: Ressourcen werden 

geschont, Umweltbelastungen vermieden oder verringert und unternehmerische Risiken minimiert 

2 . Hierzu trägt insbesondere der Einsatz von Biokatalysatoren entscheidend bei. „Biokatalysatoren“ 

meint hier sowohl Ganzzellsysteme als auch isolierte Enzyme oder katalytisch aktive 

Nukleinsäuren. Aufgrund der Summe an positiven Eigenschaften wie Spezifität, Selektivität und 

Effektivität wird durch diverse Studien ein wachsender Markt für den Einsatz von Biokatalysatoren/Enzymen 

vorausgesagt: Die OECD 7 etwa bezifferte den Weltmarkt für industrielle Enzyme 

im Jahr 1998 auf rund 1 Mrd. US-$, wobei sie eine jährliche Steigerungsrate von 10 % prognostizierte 

(betrachteter Zeitrahmen: 1995 bis 2000). Das Marktvolumen der Produkte, die mit Hilfe 

von Enzymen hergestellt werden oder die Enzyme als wesentliche Komponente enthalten, wird 

auf etwa 100 Mrd. US-$ geschätzt und liegt damit um etwa zwei Größenordnungen über dem 

Preis für industrielle Enzyme. 

Rund 90 % aller Chemieprodukte durchlaufen 

bei Ihrer Herstellung ein katalytisches Verfahren, 

oft unter Inkaufnahme hoher Mengen 

an teuer zu entsorgenden Abfällen sowie hoher 

Aufwendungen für Arbeits- und Gesundheitsschutz. 

Zudem bedingen die hohen Anforderungen 

an die Produktreinheit sehr energie-, 

stoff- und zeitaufwendige Nachreinigungen. 

Die Verfahren sind häufig auch durch 

den Einsatz von Lösungsmitteln, toxischen 

Katalysatoren und Schutzgruppenchemie 

gekennzeichnet. Unter Berücksichtigung der 

hohen Kosten – wobei der Umweltkostenanteil 

nicht zu unterschätzen ist – stellt der Einsatz 

von Biokatalysatoren auch unter ökonomischen 

Gesichtspunkten eine interessante 

Verfahrensalternative dar. Aufgrund ihrer Spezifität 

und Enantioselektivität, die insbesondere 

für die Herstellung von Feinchemikalien 

von enormer Bedeutung ist, sind Biokatalysatoren 

klassischen chemischen Katalysatoren 

weit überlegen. Die wirtschaftliche Bedeutung 

der asymmetrischen Synthese wird durch folgende 

Zahlen belegt: Der Umsatz enantiomerenreiner 

Pharmazeutika verdoppelte sich von 

1994 bis 1997 auf 90 Mrd. US-$. Weitere jährli- 

Tierfutter: 

Phosphat liegt gebunden 

als Phytinsäure vor 

P 

P P 

P 

P 

P 

Rekombinante 

Phytase 

Monogastrische Tiere: 

Keine Verwertung von Phytinsäure; 

Exkretion von Phytinsäurekomplexen 

OH 

P P 

P 

P 

P 

+ P i 

Inositolpentaphosphat und 

frei verfügbares Phosphat 

che Steigerungsraten im zweistelligen Bereich 

werden prognostiziert, wobei vorsichtige 

Schätzungen davon ausgehen, daß innerhalb 

der allernächsten Zukunft 80 % aller chiralen 

Pharmazeutika enantiomerenrein vertrieben 

werden. Nach Frost & Sullivan (2001) 1 wird 

der Marktwert für die Chiraltechnologie von 

6,6 Mrd. US-$ im Jahr 2000 auf 16 Mrd. US-$ 

im Jahr 2007 anwachsen. 

DBU fördert „Integrierte Biotechnologie“ 

Einem breiten Einsatz von Biokatalysatoren, 

wie etwa zur Substitution konventioneller industrieller 

Produktionsverfahren oder zur Effizienzsteigerung 

bestehender Produktionsverfahren 

durch Neukombination mit biotechnologischen 

Verfahren/Produkten, stehen jedoch 

häufig auch inhärente Nachteile entgegen: 

So liegen hohe und stabile katalytische 

Aktivitäten konventioneller Enzyme in der 

Regel nur innerhalb enger Temperatur- und 

pH-Wert-Grenzen und in wäßrigen Medien 

vor, weshalb eine wirtschaftliche Nutzung 

wenig aussichtsreich erscheint. Daher stehen 

Optimierung und Auffinden neuartiger Enzy- 

Umweltbelastung durch 

Phosphat-Eintrag in Böden, 

Gewässer, Grundwasser 

Umweltentlastung 

durch optimierte 

Futterverwertung 

Abb. 1: Der Einsatz mikrobiell 

produzierter 

Phytase reduziert die 

kostspielige Zugabe 

anorganischer Phosphate 

zum Tierfutter, 

macht lebensnotwendige 

Makro- und Spurenelemente 

verfügbar und 

verringert maßgeblich 

die Belastung von Böden, 

Gewässern und 

Grundwasser 3 . 

me mit industriell relevanten Eigenschaften 

sowie die gleichzeitige Entwicklung effizienter 

Produktionsverfahren im Mittelpunkt der 

durch die Deutsche Bundesstiftung Umwelt 

(DBU) initiierten und unterstützten Initiativen 

„Verbund Biokatalyse“ (www. biokatalyse.de) 

sowie „InnovationsCentrum Biokatalyse“ – 

kurz: ICBio (www.icbio.de). Berücksichtigt werden 

dabei sowohl neue Ansätze aus der Bio-/ 

Verfahrenstechnik (Modellierung, Downstream-Processing, 

Sensorik) als auch innovative 

Produktionssysteme (Ganzzellsysteme, 

isolierte Biokatalysatoren) sowie moderne molekularbiologische 

und biochemische Ansätze 

(Expressionssysteme, evolutives Biokatalysatoren-Design, 

Stoffwechselflux-Analysen). 

Während der Verbund Biokatalyse einen in 

sich abgeschlossenen Forschungsverbund darstellt, 

der bereits seit 2000 durch die DBU unterstützt 

wird, handelt es sich bei ICBio um 

ein für Interessierte weiterhin offenes Programm 

der DBU im Bereich „Integrierte Biotechnologie“. 

An zwei bereits in der Bearbeitung sehr weit 

fortgeschrittenen Beispielen wird im folgenden 

das besondere Potential zur Umweltentlastung 

und Ressourcenschonung durch die 

industrielle Nutzung von Biokatalysatoren 

aufgezeigt. 

Bakterielle Phytase 

Der Lehrstuhl für Fermentationstechnik der 

Universität Bielefeld hat gemeinsam mit der 

ASA Spezialenzyme GmbH, Wolfenbüttel, ein 

industrielles Verfahren zur Produktion rekombinanter 

bakterieller Phytase entwickelt. Der 

für die Tierernährung lebensnotwendige Phosphor 

liegt in Futtermitteln in Form komplexer 

Verbindungen vor, die monogastrische Tiere 

(Nicht-Wiederkäuer) wie Schweine und 

Geflügel nicht verwerten können. Diese Phytinsäuresalze 

(Phytate) werden mit dem Kot 

wieder ausgeschieden und gelangen über 

Düngung landwirtschaftlich genutzter Flächen 

in Böden, Gewässer und Grundwasser 

(Abb. 1). Anorganische Phosphate müssen 

dementsprechend zur Sicherung der Phosphorversorgung 

der Tiere zugesetzt werden. 

Diese Zusätze können bis zu 30 % der Futtermittelkosten 

ausmachen. Zudem zeigen Phytate 

stark metallbindende Eigenschaften und 

vermindern die Verfügbarkeit lebensnotwendiger 

Makro- und Spurenelemente. Sie binden 

schließlich auch Nahrungsmittelproteine und 

verhindern so deren proteolytische Verdauung. 

Diese anti-nutritiven Eigenschaften machen 

Phytate zu unerwünschten Inhaltsstoffen 

in Futtermitteln. 

Eine Lösung dieses Problems stellt der Zusatz 

des Enzyms Phytase zum Futtermittel dar. 

Bislang wurde Phytase industriell hauptsächlich 

durch Fermentation von Pilzen (Aspergillus 

sp.) hergestellt, die Phytase in das Medium 

sekretieren. Im Gegensatz zu Pilz-Phytasen 

besitzt die Phytase von Escherichia coli Eigenschaften, 

die eine höhere Effektivität als 



Tab. 1: Vergleich der Phytasen aus den heterologen Expressionssystemen A. niger und E. coli; die erstmalige 

Isolierung der E. coli-Phytase (Stamm ATCC 33965) gelang der Arbeitsgruppe Dr. Ralf Greiner, 

Bundesanstalt für Ernährung, Karlsruhe; die Phytase zeigte keinerlei Homologie zu bisher bekannten 

Phytasen aus Aspergillus 4 . 

Phytase aus dem Phytase aus dem 

Aspergillus niger-System Escherichia coli-System 

Lokalisierung Kulturmedium Periplasma 

Spezifische Aktivität 100 U mg -1 750 U mg -1 

Molmasse 48 kDa 42 kDa 

pH-Optimum 5,0 und 2,2 4,5 

K M 390 µM 2,64 µM 

Wechselzahl 220 s -1 6200 s -1 

Temperaturoptimum 55 °C 55°C 

Futteradditiv bewirken: Hier sind die wesentlich 

höhere spezifische Aktivität, ein geringeres 

pH-Optimum, Resistenz gegenüber proteolytischem 

Abbau im Tiermagen sowie Temperaturstabilität 

beim Pelletieren zu nennen 

(Tab. 1). Zur Überexpression und extrazellulären 

Produktion der Phytase in E. coli wurde 

ein Expressionvektor entwickelt, wobei ein Sekretionssystem 

auf Basis der kontrollierten 

Expression des kil-Gens integriert wurde 5 . Mittels 

eines Fließinjektions-Analyse-Systems zur 

Glukose-geregelten Zufütterung bei der Fermentation 

wurde die Phytaseausbeute signifikant 

erhöht 6 . Durch zusätzliche Entwicklung 

eines effizienten Aufarbeitungsverfahrens 

konnte ein Produktpreis kalkuliert werden, 

der um ein Drittel unter dem derzeit erhältlicher 

Phytasen liegt. In Summe ermöglicht das 

neuartige Verfahren eine wesentlich umweltfreundlichere 

und kostenoptimierte Phytaseproduktion 

(Tab. 2). 

Optimierung der L-Serin-Gewinnung 

Der steigende Bedarf an der Aminosäure L- 

Serin für die Pharma- und Ernährungsmittelindustrie 

macht die Etablierung einer alternativen 

biotechnologischen Darstellungsvariante 

zur energieaufwendigen und emissionsträchtigen 

klassischen sauren Hydrolyse proteinogener 

Rohstoffe notwendig. Ziel des Projekts 

der Amino GmbH, Frellstedt, mit der Forschungszentrum 

Jülich GmbH und dem Lehrstuhl 

für Ordnungs- und Prozeßpolitik der 

Wirtschaftswirtschaftlichen Fakultät der Uni 

Hannover war es, ein hocheffizientes biotechnologisches 

Verfahren zur gezielten Herstellung 

der Aminosäure L-Serin aus Glukose zu 

entwickeln 8 . Durch gezieltes Metabolic Engi- 

neering des Stoffwechsels von Corynebacterium 

glutamicum wurde ein Serinproduktionsstamm 

konstruiert. Dabei wurde festgestellt, 

daß die Überexpression der drei Biosynthesegene 

serA, serC und serB jedoch nur zu einer 

geringen, wenngleich signifikanten Steigerung 

der L-Serin-Bildung führte. Erst die Überexpression 

aller Synthesegene in Verbindung mit 

dem Ausschalten des für den Serinabbau verantwortlichen 

Enzyms, der L-Serin-Dehydratase, 

führte zu einer 80fachen Steigerung der 

Serinbildung. In Mutanten, in denen zusätzlich 

zu diesen beiden rationalen Maßnahmen 

die Serinvorstufe und Glykolyseintermediat 

3-Phosphoglycerat angestaut wird, wurde die 

Serinausbeute bezogen auf das Produkt nochmals 

um das 6fache gesteigert, auf 2,5 g/l. 

Trotz dieser ermutigenden Ergebnisse sind 

weitere Fortschritte erforderlich, um eine wirtschaftliche 

Produktion von Serin im industriellen 

Maßstab zu ermöglichen. Als Ziel für die 

Produktion wurde in der Modellbildung für 

die begleitende Ökobilanz und Wirtschaftlichkeitsanalyse 

für das fermentative Verfahren 

von 30 g/l Produktausbeute und 47 % Aufarbeitungsausbeute 

ausgegangen. Unter diesen 

Bedingungen zeigen sich signifikante ökologische 

Vorteile des fermentativen Verfahrens 

gegenüber den Referenzverfahren der sauren 

Hydrolyse. Insbesondere in den ökobilanziellen 

Wirkungskategorien Energiebedarf, Treibhauseffekt, 

Wasserverbrauch, Abwasser und 

mit Einschränkung auch in der Kategorie 

Ozonbildung ist das fermentative Verfahren 

der sauren Hydrolyse überlegen. Aus ökonomischer 

Sicht bietet die Fermentation bei diesen 

Zielparametern relativ zur sauren Hydrolyse 

und unter den Bedingungen eines deutschen 

Produktionsstandorts zwar Kostenvor- 

Tab. 2: Vergleich der Produktion von Phytase in rekombinanten E. coli-Zellen und der Pilzkultur 

A. niger. Die angegebenen Kosten beziehen sich auf betrachtete Fermentationsprozesse in einer Größenordnung 

von 50 m 3 . Quelle: Dr. Gerhard Miksch, Lehrstuhl für Fermentationstechnik der Technischen 

Fakultät, Universität Bielefeld. 

Parameter Escherichia coli Aspergillus niger Einsparung 

Mediumkosten 3.480 (D) 3.480 (D) 0 (D) 0 (%) 

Abwasserkosten 35 (D) 360 (D) 325 (D) 90 (%) 

Energiekosten 1.950 (D) 6.800 (D) 4.850 (D) 71 (%) 

Lohnkosten 490 (D) 1.715 (D) 1.225 (D) 71 (%) 

Abschreibungen 645 (D) 2.255 (D) 1.610 (D) 71 (%) 

Summen 6.600 (D) 14.610 (D) 8.010 (D) 55 (%) 

teile; um aber im internationalen Wettbewerb 

dauerhaft bestehen zu können und angesichts 

des herrschenden Preisdrucks auf dem Markt 

für Aminosäuren auch in ungünstigen Marktphasen 

mit ausreichenden Deckungsbeiträgen 

produzieren zu können, ist eine weitere Verbesserung 

des Stamms und des Gesamtprozesses 

erforderlich. 

Mehr Biokatalyse 

Nicht nur auf dem DBU-Messestand im Rahmen 

der BioTechnica 2003, sondern auch in 

einem zur Messe erscheinenden transkript-Sonderband 

finden sich zahlreiche weitere Beispiele, 

welche die wegweisende Etablierung biotechnologischer 

Innovationen im Sinn einer 

nachhaltigen Entwicklung demonstrieren. 

Abb. 2: Im Stoffwechsel von C. glutamicum zur 

Konstruktion eines Serinproduktionsstamms 

vorgenommene gezielte Veränderungen. Quelle: 

Dr. Petra Peters-Wendisch, Institut für Biotechnologie 

1, Forschungszentrum Jülich GmbH. 

Literatur 

[1] Frost & Sullivan. (Report 3835), New York (2001). 

[2] Heiden, S., Burschel, C., Erb, R. (Hrsg.), Biotechnologie als interdisziplinäre 

Herausforderung, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg (2001) 

[3] Heiden, S., Erb, R., In: Heiden, S., Burschel, C., Erb, R. (Hrsg.) Biotechnologie 

als interdisziplinäre Herausforderung, Spektrum Akademischer Verlag, 

Heidelberg (2001), 323-370. 

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[6] Miksch, G., Kleist, S., Friehs, K., Flaschel, E, In: Erb, R., Heiden, S. (Hrsg.): 

Sonderausgabe der DBU in Kooperation mit BIOspektrum, Spektrum Akademischer 

Verlag, Heidelberg (2001), 60-62. 

[7] OECD (Hrsg.) Biotechnology for Clean Industrial Products and Processes – 

Towards Industrial Sustainibility. Paris (1998): 

[8] Peters-Wendisch, P., Eggeling, L., Netzer, R., Sahm, H., Serger, H., Müller, U., 

Wilke, B., Faurie, R., In: Heiden, S., Erb, R. (Hrsg.): Sonderausgabe der DBU in 

Kooperation mit BIOspektrum, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 

(2001), 65-69. 


Dr. Rainer Erb 

Zentrum für Umweltkommunikation der 

Deutschen Bundesstiftung Umwelt gGmbH 

An der Bornau 2, D- 49090 Osnabrück 

Tel./Fax: +49-(0)541-9633-950 / -990 

eMail: r.erb@dbu.de 



�


Chromatographie � 

Effizienzsteigerung in der 

HPLC-Analytik durch das 

LaChrom Elite ® -System 

Wolf-Dieter Beinert, Reinhold Spatz, Darrol Müller, VWR International GmbH, Darmstadt 

Das neue LaChrom Elite HPLC-System bietet mannigfaltige Aspekte und Funktionen zur Effizienzsteigerung 

im Chromatographielabor. Einerseits weisen die Module des Systems eine 

sehr hohe Probenkapazität und optimierte Eigenschaften für die schnelle Hochdurchsatz- 

Chromatographie auf. Die Anwendung von Chromolith-Säulen bei erhöhten Fließgeschwindigkeiten 

birgt ein besonders hohes Einsparpotential, stellt aber auch besondere Anforderungen 

an das System. Andererseits bieten das EZChrom Elite-Chromatographiedatensystem 

und verschiedene weitere Softwaremodule Unterstützung und Zeiteinsparungspotentiale 

bei der Automatisierung des Analysenprozesses, bei der Schulung der Mitarbeiter, der 

Softwarevalidierung, bei der Automatisierung der Methodenentwicklung und -validierung 

sowie bei der automatischen Qualifikation (OQ, PQ) des HPLC-Systems. 

Key Words: Chromatographie, High-Throughput, Automatisierung 

Das neue LaChrom Elite-System von VWR 

International (Abb. 1) basiert auf Hardwareund 

Softwaretechnologien, die eine beträchtliche 

Steigerung der Leistung, der Anwendungsflexibilität 

und der Effizienz in der 

HPLC-Analytik ermöglichen. Die Präzision, 

Richtigkeit und Nachweis-Empfindlichkeit 

des Systems liefert Analysenergebnisse höchster 

Qualität und Aussagekraft. Dies gilt auch 

für den Betrieb unter extremen Bedingungen, 

wie bei der Mikro-HPLC mit 1 mm-Säulen 

oder bei der Chromatographie mit hohen 

Flußraten und Chromolith-Säulen. Ein 

Aspekt dieser Neuentwicklung ist die Effizienzerhöhung 

der HPLC-Analytik im Hinblick 

auf alle Aspekte der Hardware- und 

Abb.1: Das LaChrom 

Elite-System 

Software-Komponenten sowie der HPLC- 

Methodik. 

Schnelle Hochdurchsatz- 

Chromatographie 

Alle Module des LaChrom Elite-Systems 

wurden auch für die schnelle Hochdurchsatz- 

Chromatographie mit Chromolith-Säulen 

oder kurzen Säulen optimiert. Der geringe 

Rückdruck von (bitte quantifizieren) der 

Chromolith-Säulen hat den Vorteil, daß 

HPLC-Analysen bei erhöhten Fließgeschwindigkeiten 

durchgeführt werden können, ohne 

daß sich die Auflösung vermindert. Da die 

Komponenten durch beschleunigte Austauschprozesse 

in der Chromolith ® -Säule früher 

eluieren, können die Analysenzeit erheblich 

reduziert und Lösungsmittel pro Analyse 

eingespart werden. 

Die L-2130 HTA (High Throughput Analysis)-Pumpe 

des LaChrom Elite-Systems arbeitet 

optimal mit Säulen von 2 bis 4,6 mm 

Innendurchmesser und mit Chromolith-Säulen 

bei erhöhten Fließgeschwindigkeiten bis 

10 ml/min (Abb. 2). Für die Pumpen wurden 

spezielle Gradientensteuerungstechnologien, 

wie PASS (Pump Autosampler Synchronisation) 

und EPIC (Electronic Pulse Isolation 

and Compensation), entwickelt. Für die 

Hochdurchsatz-Analytik wurde ein L-2200- 

Autosampler mit einem Probenteller ausgestattet, 

der bis zu 200 Standardgläschen oder 

drei Mikrotiterplatten mit bis zu 1.152 Proben 

aufnehmen kann. Für temperaturempfindliche 

Proben kann ein Peltier-Kühlrack 

mit der gleichen Probenkapazität eingesetzt 

werden. Die kurze Injektionszeit des Auto- 

samplers verringert die Analysenzeit, und die 

Minimierung der Druckpulsation bei der Injektion 

verlängert die Lebensdauer der Säule 

und des gesamten Systems. Im L-2300-Säulenthermostat 

wird das Peltier-Thermostatelement 

durch ein zusätzliches Umluftgeblä- 

Abb. 2: Hochgeschwindigkeits-Chromatographie 

mit einer Chromolith-Säule: Phenolanalyse unter 

Anwendung eines kombinierten Lösungsmittlelund 

Fluß-Gradienten zur Beschleunigung der Elution 

der beiden letzten Komponenten. Bedingungen, 

Probe: 7 Phenole, Säule: Chromolith Performance 

RP-18e, 100-4.6 mm, Eluent A: Wasser mit 

0,1 % Phosphorsäure, B: Acetonitril, Gradient: 0-2 

min: 28% B, 3 ml/min; 2-2,2 min 28-80% B, 3-5 ml/ 

min; 2,2-5 min: 80% B, 5 ml/min, Detektion: bei 220 

nm mit 0,1 s Ansprechzeitkonstante, Temperatur: 

35°C, Injektionsvolumen: 10 µl 

se ergänzt. Dies gewährleistet ein schnelles 

Einstellen der Solltemperatur. Darüber hinaus 

minimiert dieses Prinzip Temperaturgradienten 

innerhalb des thermostatisierten Raumes 

und garantiert einen effizienten Wärmeübergang 

auf die Säule. Eine Vorheizzone im 

Säulenthermostat ermöglicht es, die Länge 

der vorgeheizten Verbindungskapillare an 

die jeweilige Fließgeschwindigkeit anzupassen. 

Das Vorheizen des Eluenten vermeidet 

Temperaturgradienten in der Säule und führt 

zu besserer Peakform und schmaleren Peaks. 

Die LaChrom Elite UV-, DAD-, Fluoreszenz- 

und Brechungsindex-Detektoren enthalten 

einen aktiven Rauschfilter, für den die 

Ansprechzeit (response time) in einem Bereich 

von 0,05 bis 8 Sekunden anwählbar ist. 

Damit kann die Datenerfassung von Peaks 

auch für die schnelle Chromatographie optimiert 

werden. Sehr schmale, schnell eluierende 

Peaks können unter Erhaltung der Peakform 

mit höchstem Signal-Rausch-Verhältnis 

aufgezeichnet werden (Abb. 3). 

Gerätesteuerung und 

Datenauswertung 

Das LaChrom Elite-System wird über ein 

bedienungsfreundliches EZChrom Elite 

Chromatographie-Datensystem gesteuert, 

das eine Automatisierung des Analysenprozesses 

– auch für Multi-Methoden-Anwendungen 

– ermöglicht. EZChrom Elite ist ein 

generelles Chromatographiedatensystem, 

das über entsprechend validierte Treibermodule 

die Steuerung einer Vielzahl verschiedener 

HPLC- und GC-Systeme erlaubt. Eine 

übersichtliche graphische Status-Anzeige der 


Chromatographie-Software (Abb. 4) informiert 

ständig über aktuelle System-Bedingungen 

und die laufende Analyse. Säulen, Detektorzelle, 

Detektorlampen und Dichtungen der 

Pumpe und des Autosamplers sind leicht von 

vorne zugänglich und können schnell und 

ohne Aufwand ausgetauscht werden. Darüber 

hinaus lassen sich alle Zubehörteile leicht von 

vorne installieren. LaChrom Elite basiert auf 

bewährter und sehr robuster Merck-Hitachi- 

Technologie. Dies garantiert minimale Ausfallzeiten 

und eine hohe Produktivität der Analytik. 

Vollautomatisierte Methodenentwicklung 

In Kombination mit dem LaChrom Elite-System 

kann ChromSword Auto, eine von VWR 

International entwickelte Software, neue 

HPLC-Methoden vollständig automatisch 

entwickeln oder bestehende Methoden verbessern. 

Dazu werden die Analysenzeit, die 

Peakauflösung und die Robustheit der Methode 

optimiert (Abb. 5). Auf diese Weise können 

sowohl bei der Methodenentwicklung als 

auch in der Routine-Analytik erhebliche Einsparungen 

von Zeit, Arbeitsaufwand und Lösungsmittelverbrauch 

realisiert werden. 

Automatische Methodenvalidierung 

Die ebenfalls von VWR entwickelte Software 

Validation Manager prüft nach internationalen 

Richtlinien und anerkannten statistischen 

Rechenverfahren, ob die Analysenmethode für 

den vorgesehenen Zweck geeignet ist und erstellt 

automatisch den erforderlichen Validierungsreport. 

Zusätzlich enthält die Software 

Funktionen zur Erstellung des Validierungsplans, 

des Probenvorbereitungsplans, von 

EZChrom Elite-Injektionstabellen und zum 

Import der Analysendaten. Damit können im 

Verlauf des Validierungsprozesses Tage oder 

sogar Wochen an Arbeit eingespart werden. 

Automatische Systemqualifizierung 

Bevor eine Analysenserie gestartet wird, sollte 

erst nachgewiesen werden, daß das HPLC- 

System entsprechend den Anforderungen gut 

funktioniert. Diese „Operational Qualification“ 

(OQ)- und „Performance Qualification“ 

(PQ)-Schritte stellen Tests der verschiedenen 

Module auf ihre Spezifikationen und ein Test 

des Gesamtsystems mit einer realen Applikation 

auf die laborspezifischen Anforderungen 

dar. Die Auto Validation-Software ermöglicht 

die vollautomatische Durchführung 

der Operational Qualification (OQ) des La- 

Chrom Elite-Systems. 

Mit Hilfe dieser Software und zertifizierten 

LiChroTest Standard-Proben werden die 

einzelnen Module des Systems auf Hersteller-Spezifikationen 

geprüft und die erforderliche 

Dokumentation erstellt. Für die Performance 

Qualification steht ein Test-Kit zur Verfügung, 

der Test-Methoden, eine HPLC-Säu- 


Abb. 3: Hochgeschwindigkeits-Chromatographie 

mit einer Chromolith-Säule 

bei 5 ml/min: 

Einfluß unterschiedlicher 

Ansprechzeitkonstanten 

auf die Peakform und – 

auflösung 

le, Test-Proben und eine komplette Beschreibung 

des Qualifikationsverfahrens mit einem 

Beispiel-Test-Report enthält. Auf diese Weise 

können OQ und PQ des Systems vollautomatisch, 

zeitsparend durchgeführt und dokumentiert 

werden. 

Fazit 

Das LaChrom Elite-System weist einen sehr 

breiten Einsatzbereich auf und wurde auch 

für den Einsatz in der schnellen Hochdurchsatz-Chromatographie 

optimiert. Alle Module 

des Systems enthalten spezielle Funktionen 

und Eigenschaften, die Vorteile in diesem 

Anwendungsbereich bieten und es erlauben, 

die Produktivität der Routineanalytik 

erheblich zu steigern. 

Insbesondere die schnelle Chromatographie 

mit Chromolith-Säulen bei hohen Fließgeschwindigkeiten 

weist ein großes Potential 

zur Zeiteinsparung und Kostenreduzierung 

auf. Das allgemeine Chromatographie- 

datensystem EZChrom Elite eröffnet neue 

Aspekte der Kostenreduktion durch einfache 

Bedienung sowie einen dadurch reduzierten 

Trainings- und Validierungsaufwand. Zusätzliche 

Softwaremodule erlauben die vollautomatische 

Methodenentwicklung, die automatische 

Methodenvalidierung und die automatische 

Systemqualifizierung. Sie eröffnen 

weitere Möglichkeiten, erhebliche Einsparungen 

von Aufwand und Zeit zu realisieren 

und die Effizienz und Produktivität 

des Analysenlabors zu steigern. 

Korrespondenzaddresse 

Darrol Müller 

VWR International GmbH 

Hilpertstr. 20 A 

D-64295 Darmstadt 

Tel.: +49-(0)6151-3972-212 

Fax: +49-(0)6151-3972-101 

eMail: darrol.mueller@de.vwr.com 

www.vwr.com 

Abb. 4: Einfache Kontrolle des LaChrom Elite-Systems durch die System-Statusanzeige in der EZ- 

Chrom Elite Chromatographie-Software 

Abb. 5: Automatische HPLC-Methodenentwicklung mit ChromSword Auto in Kombination mit dem La- 

Chrom Elite System; Probe: Pharmazeutische Formulierung (Wirkstoff, Hilfsstoffe und Verunreinigungen); 

Säule: Purospher RP 18e, 125-3; Eluent: Wasser / Acetonitril, 1 ml/min, Optimierungsverfahren: 

Start mit Strukturformeln und virtueller Chromatographie für 2 Wirkstoffe); Intelligent Peak Tracking 

Zeitaufwand: 32 h automatische Optimierung; beste isokratischen Bedingungen, 10 verschiedene Gradienten-Bedingungen, 

bis zu 19 Peaks getrennt 




DNAce Quick Clean-Verfahren 

verkürzt DNA-Aufreinigung 

Slava Pavlovets, Bioline Ltd., London 

Die Firma Bioline hat mit DNAce Quick Clean ein einfaches, schnelles und preiswertes System 

zur DNA-Fällung auf den Markt gebracht. Bei dem neuen Verfahren wird in 15 Minuten 

doppelsträngige DNA mit mehr als 50 Basenpaaren (Bp) aus PCR, enzymatischem Verdau 

oder anderen biochemischen Reaktionen aufgereinigt und aufkonzentriert. Durch die Behandlung 

mit DNAce Quick Clean werden mehr als 98% der Enzyme, Primer und markierten oder 

unmarkierten dNTPs (Desoxyribo-Nucleosidtriphosphate) entfernt. Das neue Verfahren liefert, 

verglichen mit anderen Verfahren wie der Ethanol-Fällung oder der Säulenchromatographie, 

eine gleich gute oder sogar bessere Ausbeute und Reinheit der DNA. 

DNAce Quick Clean eignet sich besonders für 

Hochdurchsatzanwendungen mit DNA-Arrays, 

bei konventioneller Sequenzierung, Genotypisierung 

sowie SNP-Typisierung. DNA- 

Fragmente mit mehr als 50 Bp können ohne 

organische Lösungsmittel, Glass-milk ® oder 

Chromatographiesäulen in nur 15 Minuten 

abgetrennt werden. Bei nahezu 100prozentiger 

Ausbeute kann die aufgereinigte DNA 

sofort weiterverarbeitet werden. Im Vergleich 

dazu dauert das Verfahren mit der Säulenchromatographie 

20 Minuten, eine Fällung 

mit Ethanol 30 Minuten. 

In unserem Experiment führten wir eine 

PCR mit anschließender Aufreinigung durch. 

Bei der PCR entstanden ein 125 Bp-großes 

doppelsträngiges DNA-Fragment (dsDNA) 

und – was bei nicht optimalen Bedingungen 

häufig der Fall ist – auch ein kleines einzelsträngiges 

Nebenprodukt (ssDNA). Im Gegensatz 

zur Aufreinigung mit herkömmlichen 

Kieselgel-Membranen, bei denen die 

ssDNA nicht abgetrennt wird, werden DNA- 

Fragmente, die kleiner als 50 Bp sind, mit dem 

DNAce Quick Clean abgetrennt (Abb. 1). 

Quick Clean wird mit dem PCR-Mix entweder 

im Verhältnis 1:1 (v/v) oder 1:2 (v/v) 

gemischt. Wenn im Ausgangsgemisch neben 

dsDNA auch RNA enthalten ist, kann diese 

ebenfalls mit Quick Clean von der dsDNA 

getrennt werden. 

Besonders deutlich ist die Trennung bei 

einem Mischungsverhältnis von 1:1 (v/v), 

während bei einem 1:2-Verhältnis (v/v) die 

RNA vermehrt ausfällt (siehe Tabelle). Die 

Aufreinigung mit Quick Clean erfolgt in drei 

Schritten: 

1. Der PCR-Mix und DNAce Quick Clean 

werden im Verhältnis 1:1 (v/v) gemischt. 

Wenn das DNA-Fragment kleiner als 100 Bp 

ist, wird die doppelte Menge von Quick Clean 

empfohlen. Anschließend wird für fünf 

Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. 

Eine längere Inkubationsdauer erhöht die 

Ausbeute und wird bei DNA-Fragmenten 

empfohlen, die kleiner als 100 Bp sind. 

2. Die Proben werden in einer Tischzentrifuge 

zehn Minuten lang auf höchster Stufe 

zentrifugiert. Auch hier erhöht eine längere 

Dauer die Ausbeute. Der Überstand wird verworfen. 

Ein oder mehrere Waschschritte mit 

70prozentigem Ethanol verbessern die Ausbeute. 

3. Das DNA-Pellet wird mit der gewünschten 

Menge TE-Puffer, Wasser oder einem anderen 

geeigneten Puffer resuspendiert und ist 

für weitere Untersuchungen einsetzbar. 

In einem weiteren Versuch wurde der 

DNA-Größenmarker Hyperladder V (Bioline) 

mit DNAce Quick Clean aufgereinigt 

(Abb. 2). Hyperladder V umfaßt 25 bis 500 

Bp und besteht aus 12 Banden, die in gleichmäßigen 

Abständen angeordnet sind. Alle 

Fragmente mit mehr als 50 Bp wurden vollständig 

ausgefällt, während die kleineren 

Fragmente im Überstand abgetrennt wurden. 

Mit Quick Clean lassen sich verschiedene 

Bestandteile von der dsDNA effektiv ab- 

Tab. 1: Fraktionen der mit der dsDNA durch die Quick Clean-Behandlung ausgefällten Bestandteile 

Bestandteile Mischungsverhältnis 1:1 (v/v) Mischungsverhältnis 1:2 (v/v) 

ssDNA 10% 25% 

RNA 8% 37% 

Primer/Primerdimere


Metagenomik � 

Unkultivierte Mikroorganismen 

als Ressource für neuartige 

Enzyme und Wirkstoffe 

Dr. Guido Meurer, Dr. Jürgen Eck, B.R.A.I.N AG, Zwingenberg 

Als Torsvik und Goksyr 1 1978 die direkte Isolation von DNA aus einer Umweltprobe beschrieben, 

öffneten sie den Weg zur umfassenden molekularbiologischen Untersuchung der unkultivierbaren 

mikrobiellen Biodiversität. Erst 20 Jahre später prägten Goodman et al. 2 den 

Begriff „Metagenom“ für die Gesamtheit der Genome von Organismen aus einem bestimmten 

Habitat und gaben damit dieser Forschungsrichtung ihren Namen. Daß die Metagenomik 

inzwischen den Kinderschuhen entwachsen ist, belegt der erste Workshop zu diesem Thema, 

den Dr. Christa Schleper, TU Darmstadt und die BRAIN AG Mitte Juni in Darmstadt ausrichteten 

(siehe transkript 10/2003). Zwei Tage lang diskutierten Wissenschaftler der Metagenomik 

die Erforschung der Evolution, Physiologie, Ökologie und industriellen Nutzung mikrobieller 

Gemeinschaften. Neben der Grundlagenforschung profitiert vor allem auch die Biotechnologie 

von der Metagenomik, da sie den Zugang zu bisher nicht genutzten Quellen für 

neuartige Enzyme, Biokatalysatoren und bioaktive Substanzen eröffnet. 

Im Rahmen einer nachhaltigen Produktion 

setzt die Prozeßindustrie zunehmend auf mikrobielle 

Enzyme zur Biotransformation. Bei 

einer jährlichen Wachstumsrate von vier Prozent 

wird der Umsatz an Enzymen für Reinigungsmittel, 

in der Textil-, Leder- und Papierindustrie 

sowie der Chemiebranche im Jahr 

2005 allein in den USA voraussichtlich insgesamt 

336 Mio. US-$ betragen (Business Communications 

Comp., 2001). Vor allem bei der 

Synthese enantiomerenreiner Intermediate, 

mit denen im vergangenen Jahr 14,5 Mrd. US- 

$ umgesetzt wurden (D&MD Reports, 2003), 

verspricht man sich vom Einsatz stereoselektiver 

Enzyme kosteneffiziente, ressourcenschonende 

Herstellungsverfahren. 

Bedarf an neuen Enzymen, 

Biokatalysatoren und Wirkstoffen 

Für viele Prozesse stehen allerdings keine geeigneten 

Biokatalysatoren zur Verfügung. 

Auch hier baut man aufgrund ihrer biosynthetischen 

Vielfalt auf Mikroorganismen als 

Lieferanten für neuartige Enzyme, die bisher 

nur chemisch katalysierbare Reaktionen ermöglichen. 

Um den Bedarf an neuartigen 

Wirkstoffen und Enzymen zu decken, reicht 

die Zahl der heute bekannten und kultivierbaren 

Mikroorganismen allerdings nicht aus. 

So gehört etwa die Mehrzahl der mit klassischen 

Methoden gewonnenen Enzyme zu 

Gruppen mit bereits bekannten Reaktionsmechanismen. 

Um neue Biokatalysatoren und 

Substanzklassen zu identifizieren, müssen 

neue mikrobielle Ressourcen erschlossen werden. 

Naturstoffe aus Bakterien und Pilzen sind 

aber nicht nur in der chemischen Industrie 

gefragt. Trotz moderner Methoden wie der 

kombinatorischen Chemie zur Definition neuer 

Leitstrukturen sind bioaktive Substanzen 

als Basis neuer Medikamente weiterhin von 

Bedeutung. 39 Prozent der zwischen 1983 und 

1994 neu zugelassenen 520 Arzneimittel basieren 

auf Naturstoffen. Bei antibakteriellen 

und antitumoralen Medikamenten liegt der 

Anteil sogar bei über 60 Prozent 3 . Speziell für 

diese Indikationen konzentriert sich die Suche 

nach neuartigen Leitstrukturen auf Bakterien, 

Archaea und niedere Pilze, denn sie haben 

im Lauf der Evolution Synthesewege für 

eine unüberschaubare Vielfalt von bioaktiven 

Peptiden und niedermolekularen Substanzen 

entwickelt. Screeningprogramme, die sich auf 

bislang ungenutzte Ressourcen konzentrieren, 

sollen den Pool an neuen Naturstoffen erweitern. 

Da die so gewonnenen Isolate jedoch 

meist schwer kultivierbar sind, stehen die von 

ihnen produzierten Naturstoffe nicht in beliebiger 

Menge und gleichbleibender Qualität 

zur Verfügung. Dies erschwert die präklinische 

Entwicklung pharmakologischer Wirkstoffe 

und macht deren großtechnische Herstellung 

unter Nutzung der Originalproduzenten 

praktisch unmöglich. 

Rekombinante Darstellung von 

Enzymen und Naturstoffen aus 

Metagenom-Banken 

Derzeit sind rund 5.000 Bakterienarten bekannt. 

Dies ist aber nur ein Bruchteil der, vorsichtig 

geschätzt, 40.000 bis 4.000.000 Bakterien-Spezies. 

Deren Charakterisierung, Analyse 

und biotechnologische Nutzung wird aber 

dadurch erschwert, daß – wie molekularbio- 

logische Untersuchungen zeigen – 99 Prozent 

der in einer Umweltprobe enthaltenen Mikroorganismen 

mit gängigen Methoden nicht 

kultiviert werden können 4 . Selbst eingehend 

erforschte Habitate wie Böden und Sedimente 

sind daher als Quelle neuer technischer 

Enzyme und Wirkstoffe kaum erschlossen. 

Um diese Ressourcen zu nutzen, werden bei 

BRAIN AG moderne molekulargenetische 

und biochemische Verfahren zur rekombinanten 

Darstellung von Naturstoffen aus Umwelt- 

DNA entwickelt und angewendet. 

Unabhängig von der Kultivierbarkeit der 

Organismen wird genomische DNA direkt aus 

Proben isoliert und in geeigneten Vektoren als 

rekombinante Genbank in heterologen Wirten 

dargestellt. Im Idealfall enthält eine solche 

Metagenom-Bank den Großteil der gesamten 

genomischen Information einer mikrobiellen 

Population. Diese direkte Abbildung in einer 

flexibel einsetzbaren Genbank erweitert signifikant 

die verfügbare Biodiversität um die bislang 

nicht kultivierten Mikroorganismen. Insbesondere 

sichert die heterologe Darstellung 

von Naturstoffen und Enzymen in Wirtsorganismen, 

die unter standardisierbaren Bedingungen 

kultiviert werden können, daß diese 

Substanzen für die weitere Entwicklung nachhaltig 

verfügbar sind. 

Umwelt-DNA wird in komplexen ‚large insert 

libraries‘ (Metagenom-LIL ® ) oder ‚activity-based 

expression libraries‘ (Metagenom- 

ABEL ® ) gesichert, die jeweils für unterschiedliche 

Untersuchungen und Anwendungen optimiert 

sind. Bei der Suche nach neuartigen 

technischen Enzymen und Biokatalysatoren 

werden in der Regel komplexe Expressions- 

Abb. 1: Nach schonender Isolierung der Metagenom-DNA 

aus Bodenproben können durch Puls- 

Feld-Elektrophorese in einem Zwei-Phasen-Gel, 

bei dem die erste Phase Polyvinylpyrrolidon zur 

Komplexierung von Polyphenolen enthält, DNA- 

Fragemente von bis zu 600 kBp gelelektrophoretisch 

aufgereinigt werden. 


Abb. 2: Aktivität rekombinanter Metagenom-LIL ® s 

gegen B. subtilis. Verschiedene Extrakte aus 

Transformanden wurden auf einer mit B. subtilis 

überschichteten Agarplatte aufgetragen. Antimikrobielle 

Aktivität gegen den Teststamm ist als 

Hemmhof um die Auftragsstelle erkennbar. 

banken (ABEL ® ) auf der Basis von Plasmidoder 

Cosmidvektoren in E.coli eingesetzt. Externe, 

induzierbare Promotoren für die Genexpression 

ermöglichen es, diese Banken in 

speziell entwickelten Assays auf spezifische 

Enyzme hin zu testen 5 . Niedermolekulare antimikrobielle 

Substanzen werden in Bakterien 

oft von einer Vielzahl von Proteinen synthetisiert, 

modifiziert und exportiert. Die für 

sie codierenden Gene sind in der Regel in 

Operons oder großen Genclustern gruppiert, 

die meist auch Gene für regulatorische Proteine 

und Enzyme enthalten, die den produzierenden 

Organismus resistent gegen den eigenen 

Wirkstoff macht. Abhängig von der 

Zahl beziehungsweise Größe der an der Synthese 

beteiligten Enzyme oder Enzymkomplexe 

variiert die Länge der Gencluster zwischen 

10 und >100 kbp (Tab. 1). Um das Synthese- 

Potential einer Population funktionell zu erfassen, 

müssen daher große genomische Fragmente 

kloniert werden, um vollständige Stoffwechselwege 

rekombinant darzustellen. Zusammen 

mit der Arbeitsgruppe von Dr. Christa 

Schleper, TU Darmstadt, hat BRAIN Ver- 

Abb. 3: Enzymatische Aktivität rekombinanter E. 

coli-Klone aus Metagenom-Banken. Zum Nachweis 

von Oxidasen wurden Metagenomklone auf 

Agarplatten mit Indol ausplattiert. Positive Klone, 

die im Assay Indigo bilden, werden – wie abgebildet 

– im Einzelausstrich verifiziert. 


fahren entwickelt, mit denen auch aus schwer 

zu handhabenden Proben wie huminsäurehaltigen 

Böden Metagenom-Fragmente von 

bis zu 600 kbp isoliert und kloniert werden 

können (Abb. 1) 6 . In Verbindung mit BAC-/ 

PAC-Vektoren entsprechender Kapazität - also 

‚artifiziellen Chromosomen‘ wie pBeloBAC11 7 

- werden LIL ® s erstellt, die mit Inserts von bis 

zu 300 kb selbst die bislang größten bekannten 

Gencluster vollständig abbilden können. 

Screening nach neuen Wirkstoffen 

Die Diversität und damit das Wirkstoffpotential 

von Metagenom- LILs belegt beispielhaft 

das Screening mit PCR-Primern, die konservierte 

Bereiche nicht-ribosomaler Peptid 

(NRP)-Synthasen in Genclustern targetieren. 

Sie zeigten bei einem Stichprobenumfang von 

30 sequenzieten Genabschnitten 30 neue und 

bislang unbekannte NRP-Synthase-Sequenzen. 

Über die sequenz-homologe Identifizierung 

von Genclustern etabliert und charakterisiert 

BRAIN umfangreiche Banken von LIL ® - 

Klonen, um Naturstoffe rekombinant darzustellen 

und über kombinatorische Biosynthese 

zu derivatisieren. Primäre Metagenom- 

Tab. 1: Charakteristika einiger mikrobieller Wirkstoffe 

Wirkstoff Naturstoffklasse Wirkstoffproduzent Größe des 

Genclusters (kb) 

Puromycin Aminonukleosid Streptomyces alboniger 13 

Tetrazyklin aromatisches Polyketid Streptomyces aureofaciens 30 

Erythromycin Makrolid Saccharopolyspora erythraea 55 

Bleomycin Glycopeptid Streptomyces verticillus 80 

Rapamycin Makrolid Streptomyces hydroscopicus 110 

LIL ® s bilden ferner die Basis für das aktivitäts-basierte 

Screening nach rekombinanten 

Naturstoffen, die durch Produkte unbekannter 

Gencluster synthetisiert werden. Obwohl 

E. coli kleinere Gencluster heterolog exprimiert 

(Abb. 2), ist dieser Wirt aufgrund der 4‘-Phosphopantothenylierung 

von Apo-Acyl-/Peptidyl-Carrier-Proteinen 

oder -Domänen zur 

Synthese neuer Substanzen aus dem Metagenom 

weniger geeignet. Daher werden vor allem 

Streptomyces oder Pseudomonas als Produzenten 

eingesetzt. Sie verfügen über einen ausgeprägten 

Sekundärmetabolismus und so 

über die nötige biosynthetische Ausstattung, 

um Apo-Enzyme zu prozessieren, Grundbausteine 

für die Synthese rekombinanter Naturstoffe 

bereitzustellen und Produkte zu exportieren. 

Proprietäre, flexible Shuttle-Vektoren, 

die wirtsspezifische Flip-Kassetten enthalten, 

ermöglichen die Erstellung von Metagenom- 

LIL ® s, die in unterschiedlichen Systemen exprimiert 

werden können. 

Screening nach Enzymen 

Beim Screening von Metagenom-Banken nach 

neuartigen Biokatalysatoren werden die gleichen 

sequenz- und aktivitätsbasierten Strategien 

verwendet wie bei der Suche nach nie- 

dermolekularen Wirkstoffen. Abgesehen von 

großen Enzymkomplexen, die sich nur über 

die Expression von LIL ® s darstellen lassen, 

können Enzyme auch über ABEL ® s exprimiert 

werden (Abb. 3). In einem von der Deutschen 

Bundesstiftung Umwelt geförderten Projekt 

sucht BRAIN in Kooperation mit Prof. Dr. 

Uwe Bornscheuer, Universität Greifswald, 

und Dr. Christa Schleper, TU Darmstadt, in 

Metagenom-Banken aus Boden neue Esterasen 

und Lipasen. Die etwa 50 derzeit erhältlichen 

Enzyme dieser Klassen genügen in 

Bezug auf Substratspezifität, Enantioselektivität 

oder pH-Stabilität nicht immer den Anforderungen 

spezifischer Produktionsprozesse. 

In speziell entwickelten aktivitätsbasierten 

Hochdurchsatz-Testverfahren wird deshalb 

nach Esterasen und Lipasen mit neuen Eigenschaften 

und Aktivitätsprofilen für den Einsatz 

in der Fein- und Spezialchemie gesucht. 

Ausblick 

Die Metagenomik, mit deren Hilfe grundlegende 

Fragen der Evolution, Ökologie und 

Physiologie von unkultivierten Mikroorganismen 

geklärt werden sollten, hat sich inzwi- 

schen auch als fruchtbares anwendungsbezogenes 

Arbeitsgebiet etabliert. Mit den neuen 

Technologien, die das Metagenom zugänglich 

machen, eröffnet sich eine neue Quelle für 

Enzyme und neue Wirkstoffe. Die umfangreichen 

neuen Ressourcen, die sie zugänglich 

macht, bieten neue Möglichkeiten zur Entwicklung 

umweltfreundlicher Herstellungsverfahren 

und wirkungsvoller medizinischer 

Therapien. 

Literatur 

[1] Torsvik, V., Goksyr, J., Soil Biol. Biochem. 10 (1978), 7-12 

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Chem. Biol. 5: (1998), R245-249 

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[5] Lorenz, P., Liebeton, K., Niehaus, F., Schleper, C., Eck, J., J. Biocatal. 

Biotransform 21 (2003), 87-91 

[6] Quaiser, A. et al., Environ. MIcrobiol. 4 (2002), 603-611 

[7] Shizuya, H. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 8794-8797 


Dr. Guido Meurer, BRAIN AG 

Darmstädter Str. 34, D-64673 Zwingenberg 

Tel./Fax: +49-(0)6251-9331-29 / -11 

eMail: gm@brain-biotech.de 

www.brain-biotech.de 



Protein-Separation � 

2D-Gelelektrophorese in 

den Proteomics: 

ZOOM IPGRunner 

Karsten Wilking, Invitrogen GmbH, Karlsruhe 

Die zweidimensionale (2D) Gelelektrophorese nutzt zwei voneinander unabhängige Eigenschaften 

von Proteinen zur hochauflösenden Fraktionierung eines Proteingemisches: die 

Ladung und das Molekulargewicht. In der ersten Dimension werden Proteine durch isoelektrische 

Fokussierung (IEF) nach ihrer Ladung aufgetrennt, in der zweiten Dimension mit 

Hilfe der SDS-PAGE nach ihrer Masse. Die 2D-Gelelektrophorese ist kosten-, zeit- und arbeitsintensiv. 

Beim neuen ZOOM ® IPGRunner-System handelt es sich dagegen um eine 

einfache und schnelle Methode zur isoelektrischen Fokussierung in der ersten Dimension, 

die zudem kein Mineralöl mehr benötigt. Die elektrophoretische Auftrennung der Proteine, 

die in der ersten Dimension auf sieben Zentimeter langen Strips mit immobilisiertem pH- 

Gradienten und in der zweiten Dimension in NuPAGE ® Novex 4 bis 12 % Bis-Tris ZOOM ® -Gelen 

stattfindet, dauert statt bislang 24 nur noch maximal fünf Stunden. 

Key Words: 2D-Gelelektrophorese, Proteine-Auftrennung, IEF, SDS-PAGE 

Die zweidimensionale (2D) Gelelektrophorese 

gilt inzwischen als ‚goldener Standard‘ zur 

Auftrennung von Proteingemischen. Durch 

ihre hohe Auflösung ermöglicht sie die Analyse 

signifikanter Unterschiede in der Zusammensetzung 

biologischer Proben. In der Praxis 

wird die 2D-Gelelektrophorese in der klinischen 

Diagnostik eingesetzt, bei der Identifizierung 

neuer Wirkstoff-Targets und der 

Analyse umweltbedingter und arzneimittelbedingter 

Toxizitäten. In Kombination mit 

der Massenspektrometrie gilt sie außerdem 

inzwischen als Kerntechnologie in der Proteomforschung. 

Die 2D-Gelelektrophorese basiert darauf, 

dass ein komplexes Proteingemisch Bestandteile 

unterschiedlicher Ladung und Masse 

enthält. Aufgrund dieser Eigenschaften können 

die einzelnen Komponenten in der ersten 

Dimension durch isoelektrische Fokussierung 

nach Ladung und in der zweiten Dimension 

durch SDS-PAGE nach Masse aufgetrennt 

werden. Zu sehen sind diese Unterschiede 

in Form von unterschiedlichen elektrophoretischen 

Mobilitäten. Bisher benötig- 

te man für eine 2D-Gelelektrophorese teure 

und Spezialgeräte, die viel Platz einnehmen. 

Zuverlässige Ergebnisse erforderten einen erheblichen 

Zeitaufwand sowie ein hohes Maß 

an Erfahrung. 

Beschleunigte IEF-Auftrennung 

Bei dem neuen ZOOM ® IPGRunner-System 

handelt es sich um ein neuartiges Verfahren, 

das den Vorgang der zweidimensionalen 

Auftrennung wesentlich vereinfacht 

und beschleunigt. Die isoelektrische Fokussierung 

erfolgt auf sieben Zentimeter langen 

Strips. Diese sind mit linearen Gradienten für 

pH = 4,5–5,5; 5,3–6,3 und 6,1–7,1 erhältlich 

und decken damit die pH-Bereiche ab, in 

denen die meisten Proteine detektiert werden 

können. Außerdem lassen sich Proteingemische 

mit den neuen Streifen mit einer höheren 

Auflösung in einem engen, ausgewählten 

pH-Bereich darstellen. Dies erhöht die 

Chance, geringe Mengen eines Proteins in 

komplexen Gemischen nachzuweisen, auch 

bei hohen Proteinkonzentrationen. 

Tab. 1: Volumeneinsparung der benötigten Reagenzien beim ZOOM ® IPGRunner-Verfahren im Vergleich 

zur Standardmethode 1 

Puffer/Reagenz Benötigte Volumina 

ZOOM IPG Standardverfahren 2D-Gele 

Probenvolumen/Ladepuffervolumen 38 µl/117 µl 38 µl/361 µl 

Mineralöl 0 ml 1,8 ml 

Reduktionspuffer 10 ml 20 ml 

Alkylierungspuffer 5 ml 10 ml 

SDS-PAGE-Laufpuffer 450 ml 1,4 l 

Fixieren/Färben/Entfärben ca. 300 ml ca. 1 l 

Die Auftrennung in der zweiten Dimension 

erfolgt auf kleinen (8 cm x 8 cm), aber 

gleichzeitig hochauflösenden NuPAGE-Gelen. 

Mit einer speziell hierfür entwickelten 

Minizelle, dem IPGRunner, können die Fokussierung 

und die Elektrophorese in einer 

einzigen vertikalen Einheit erfolgen. Diese 

vereinfachte Anordnung spart Platz und Zeit. 

Diese neue 2D-Gelelektrophorese wird beispielsweise 

verwendet, um Rattenleberextrakte 

und E. coli-Lysate aufzutrennen: Die 

Rehydrierung der Strips erfolgt dazu direkt 

in der Kassette, die bis zu sechs IPG-Strips 

aufnehmen kann. 

Die Proben werden zusammen mit Rehydrierungspuffer 

(2 M Thio-Harnstoff, 7 M 

Harnstoff, 0,5 % ZOOM ® -Trägerampholyte, 

2,0 % CHAPS, 20 mM DTT) direkt in das dafür 

vorgesehene Fenster der Kassette pipettiert 

und die Strips daraufhin in die dafür vorgesehenen 

Taschen eingeführt. Während der 

Rehydrierung werden die Probenvertiefungen 

mit Abdeckfolie verschlossen, um eine 

luftdichte Umgebung zu schaffen, und die 

Rehydrierung erfolgt wie beim konventionellen 

Verfahren im Lauf von 8 bis 16 Stunden 

bei Raumtemperatur. Danach wird die Folie 

abgezogen und die Pipettieröffnungen werden 

entfernt. An jedes Ende der IPGRunner-Kassette 

wird ein Elektrodensaugdocht 

platziert, der mit 750 µl entionisiertem Wasser 

befeuchtet wird. 

Die Kassetten und der Puffertank werden 

nun zusammengebaut und in die Minizelle 

eingesetzt, in der später auch die SDS-PAGE 

stattfindet. Die äußere Kammer der Minizelle 

wird mit Wasser befüllt. Die Dauer der 

isoelektrischen Fokussierung beträgt 1,5 

Stunden verglichen mit bis zu 24 Stunden zur 

Fokussierung von Proteinen bei konventionellen 

Systemen mit Ölimmersion. Die Effizienz 

dieses elektrischen Systems erlaubt eine 

vollständige Fokussierung bei einer Spannung 

von höchstens 2.000 Volt. 

2. Dimension mit NuPAGE-Gelen 

Die Elektrophorese in der zweiten Dimension 

wird unter Verwendung von NuPAGE ® - 

Gelen durchgeführt. Die erforderliche Äquilibrierung 

der Strips erfolgt mit NuPAGE ® - 

LDS-Probenpuffer in Gegenwart von Reduktions- 

und Alkylierungsmitteln. Die Strips mit 

den in der IEF aufgetrennten Proben werden 

dazu 15 Minuten lang in 5 ml Probenpuffer 

mit 50 mM DTT inkubiert, gefolgt von einer 

15-minütigen Inkubation in Probenpuffer mit 

125 mM Iodacetamid. Die Dauer der Reduktions- 

und Alkylierungsschritte verkürzt sich 

auf die Hälfte und es ist nur etwa halb so viel 

Puffer erforderlich wie bei herkömmlichen 

Verfahren (Tab. 1). 

Die Proteine auf den IPG-Strips werden mit 

NuPAGE-Gelen aufgetrennt. Dazu wird je ein 

IPG-Strip nach der Reduktion und Äquilibrierung 

einzeln der Länge nach in die Vertiefung 

eines Gels eingesetzt und diese mit 



Abb.1: Auftrennung von E.coli-Lysat mit dem ZOOM ® IPGRunner-Verfahren nach Anfärben des Gels 

durch Silberfärbung (links, SilverQuest Silver Staining-Kit, Invitrogen) oder Coomassie-Blau (rechts, 

SimplyBlue SafeStain, Invitrogen) 

400 µl 0,5%-iger Agaroselösung – hergestellt 

im entsprechenden Laufpuffer – verschlossen. 

Parallel dazu wird ein passender Molekulargewichtsstandard 

daneben in die dafür 

vorgesehene Tasche pipettiert. Die SDS-PAGE 

erfolgt nach Standardvorgehensweise bei 200 

Volt in 45 bis 50 Minuten. Die in den 2D-Gelen 

aufgetrennten Proteine können entweder 

durch Silberfärbung oder andere übliche Färbemethoden, 

wie etwa Coomassie-Färbung, 

sichtbar gemacht und ausgewertet werden 

(Abb. 1). 

Tab. 2: Zeitersparnis bei der 2D-Gelelektrophorese mit dem ZOOM ® IPGRunner-Verfahren im Vergleich 

zur Standardmethode 1 

Schritt Pro 2D-Gel benötigte Zeit 

ZOOM IPG Standardverfahren 2D-Gele 

Probenvorbereitung 15 Min. 15 Min. 

Rehydratisierung 18 Std. 18 Std. 

IEF 3 Std. (~ 1.500 Vh) 24 Std. (~ 74.000 Vh) 

Reduktion + Alkylierung 45 Min. 1, 5 Std. 

SDS-PAGE 50 Min. 6,5 Std. 

Fixieren/Färben/Entfärben ca. 7 Std. ca. 8-9 Std. 

Das gesamte Verfahren, beginnend mit der 

IEF und SDS-PAGE bis hin zur Färbung der 

fertigen Gele, dauert etwa neun Stunden, ausschließlich 

der Rehydratisierungszeit, im Vergleich 

zu zirka 36 Stunden beim Standardverfahren 

(Tab. 2). Vor allem bei kleinen Proteinmengen 

übertrifft die Qualität der Auftrennung 

des Proteingemisches mit dem 

ZOOM ® IPGRunner-System die Auflösung 

auf herkömmlichen 2D-Gelen. So wurden 

nach 2D-Auftrennung von 20 µg Rattenleberextrakt 

im ZOOM ® IPGRunner-System 

durch automatisierte Bildanalyse etwa doppelt 

so viele Spots nachgewiesen wie im Standard 

2D-Gel. 

Die Bildakquisition und Auswertung benötigen 

wesentlich weniger Zeit. Auch die 

prozentuale Abdeckung der Proteinzusammensetzung 

ist bei geringen Probenmengen 

im Durchschnitt höher. In der Identifizierung 

durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie 

ergab sich außerdem eine höhere Ionendichte 

der Spots, auch bei Spots geringerer Intensität. 

Ein weiterer Vorteil des ZOOM ® IPG Runner-Systems 

ist, daß täglich zahlreiche 

Proben in der ersten Dimension aufgetrennt 

werden können. Die fokussierten Streifen 

werden dann entweder gemeinsam ausgewertet 

oder in der Kassette bei –80°C aufbewahrt 

und später in der zweiten Dimension 

analysiert. Aufgrund ihrer geringen Größe 

kann die IPGRunner-Minizelle überall 

aufbewahrt und verwendet werden, da keine 

spezielle IEF-Station mehr erforderlich 

ist. 

Fazit 

Das einfache, leicht erlernbare neue Verfahren 

macht den Laborablauf effektiver und effizienter. 

Das ZOOM ® IPGRunner-System 

ermöglicht eine konsistente Reproduzierbarkeit 

der 2D-Gelelektrophorese mittels einfacher 

Technik. Damit eignet sich die Technologie 

für den Einsatz in allen pharmazeutischen 

und biotechnologischen Labors. 

Literatur 

[1] Pisano, M. R., Biedermen, K., Allen, D., Saxton, M., Nunez, R., Bala, K. 

Kontaktadresse 

Karsten Wilking 

Invitrogen GmbH 

Emmy-Noether-Str. 10 

D-76131 Karlsruhe 

Tel.: +49-(0)721-61890 

eMail: karsten.wilking@invitrogen.com 

www.invitrogen.com 

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Chromatographie � 

Laser-induzierte Fluoreszenz- 

Detektion in der HPLC und CE 

Dr. Hagen Preik-Steinhoff, Dr. Jürgen Grebner und Günes Barka, 

SunChrom GmbH, Friedrichsdorf; 

Dr. Christophe Bayle, Picometrics S.A., Toulouse, Frankreich 

UV-VIS-Detektoren sind für die Hochdruck-Flüssig-Chromatographie (HPLC) und Kapillar- 

Elektrophorese (CE) Mittel der Wahl für eine große Anzahl von Applikationen. Daneben sind 

eine Vielzahl weiterer Nachweismethoden/Detektoren entwickelt worden, wie etwa Fluoreszenz-basierte 

Systeme, die Vorteile hinsichtlich der Sensitivität und Selektivität gegenüber 

der UV-VIS-Detektion aufweisen. Eine Weiterentwicklung – die sogenannte Laser-Induzierte- 

Fluoreszenz (LIF) – stellt einen erneuten Quantensprung in Hinblick auf die Sensitivität dar. 

Die Hochdruck-Flüssigchromatographie 

(HPLC) und die Kapillar-Elektrophorese (CE) 

stellen zwei unverzichtbare Trenntechniken 

zur Analyse komplexer Stoffgemische dar. Für 

diese Analysentechnik stellt der UV-VIS- Detektor 

den universellen Detektor für eine große 

Anzahl von Applikationen dar. Daneben 

sind weitere Nachweismethoden entwickelt 

worden mit Verbesserungen in Hinblick auf 

die Sensitivität oder Selektivität. Einer der sensitivsten 

Detektoren ist dabei der Fluoreszenz- 

Detektor, der, ausgestattet mit einer Gleichspannungs- 

oder gepulsten Xenon-Lampe, das 

Spektrum vom UV-Bereich bis zum nahen Infrarot 

abdeckt. 

Wesentlicher Vorteil der Fluoreszenz-Detektion 

ist die signifikant erhöhte Sensitivität und 

damit Nachweisempfindlichkeit, verglichen 

mit dem Standard-Absorptions-Detektor. So 

kann etwa ein Signal von Rhodamin-123 von 

1 x 10 –12 M bei einem Signal /Rausch-Verhältnis 

von 1 : 10 aufgezeichnet werden (etwa mit 

dem Picometrics ZETALIF 2000-Detektor). In 

der Regel wird bei der Fluoreszenz-Detektion 

Abb. 1: Evolution 

Laser-Induzierter 

Fluoreszenz (LIF)- 

Detektor 

das Signal gegen eine mobile Phase gemessen, 

die nicht fluoresziert. Damit ist das Basislinien-Signal 

gleich oder sehr nahe Null und das 

Signal der eigentlichen Probe hebt sich entsprechend 

deutlich ab. Im Vergleich dazu wird 

bei der Absorptions-Detektion die Transmission 

der Probe gegen die des Blanks gemessen, 

die ebenfalls über eine Absorption verfügt. 

Bei sehr niedriger Konzentration der Probe 

sind die Unterschiede zwischen Blank und 

Probe sehr gering. Dies bedeutet, daß das Basislinien-Signal 

relativ zum Signal der Probe 

sehr hoch ist. Damit heben sich geringe Konzentrationswerte 

der Probe weniger deutlich 

von der Grundabsorption ab, wodurch der 

Fehler einer solchen Messung signifikant werden 

kann. 

Ein weiterer Vorteil der Fluoreszenz-Detektion 

ist ihre Selektivität. Während bei der Absorptions-Detektion 

die Probe auf Basis einer 

Wellenlänge detektiert wird, sind es bei der 

Fluoreszenz-Detektion zwei Wellenlängen 

(Anregungs- und Emmisionswellenlänge). 

Koeluieren etwa zwei Substanzen, die dieselbe 

Absorptionswellenlänge haben bei unterschiedlicher 

Emmisionswellenlänge, so kann 

der Fluoreszenz-Detektor die Identität im Vergleich 

zum Absorptions-Detektor aufzeigen. 

Darüber hinaus stellt ein gegebenenfalls notwendiger 

Derivatisierungsschritt ebenfalls einen 

selektiven Reaktionsschritt dar, indem das 

Derivatisierungsreagenz spezifisch für eine 

entsprechende Molekülfunktion gewählt werden 

kann. 

Laser-Induzierte Fluoreszenz 

Die Laser-Induzierte Fluoreszenz weist der 

Standard-Fluoreszenz gegenüber neben der 

größeren Sensitivität weitere Vorteile auf, wie 

die Verwendung monochromatischen Lichtes 

und eine Maximierung der Fluoreszenz-Intensität. 

Ein Vergleich derselben Applikation mit 

einem Standard-Fluoreszenz-Detektor und einem 

LIF-Detektor ist in Abbildung 2 gezeigt. 

A B 

Abb. 2: Sensitivität eines Laser-Induzierten Fluoreszenz-Detektors 

im Vergleich zu einem Standard-Fluoreszenz 

Detektor. Chromatogramm A 

zeigt die Datenaufnahme mit einem konventionellen 

Fluoreszenz-Detektor mit einer Xenon- 

Lampe (150 W) bei einer Anregungswellenlänge 

von 488 nm und einer Emmisionswellenlänge 

von 580 nm. Das Injektionsvolumen betrug 10 µL. 

Chromatogramm B zeigt die Datenaufnahme mit 

einem ZETALIF-Laser Induzierter Fluoreszenz- 

Detektor mit einem 20 mW-Argon-Laser und 

einer Anregungswellenlänge von 488 nm und 

einer Emissionswellenlänge von > 520 nm. Das 

Injektionsvolumen betrug 5 µL. Aufgegeben wurde 

in beiden Fällen ein Lösungsgemisch aus 

1,8 x10 –9 M Doxorubicin und 1,8 x 10 –9 M Daunorubicin. 

Die mobile Phase bestand aus Phosphorsäure/Acetonitril 

(68/32) bei einem pH=4 

und einer Flußrate von 0,5 mL/min. 

Dabei wurde ein Gemisch aus Doxorubicin 

und Daunorubicin (je 1,8 x 10 –9 M) auf einer 

Econosphere C 18 -RP-Säule isokratisch getrennt 

(Eluent: Phosphorsäure/Acetonitril 68/32, 

pH = 4; Flußrate 0,5 mL/min). Deutlich wird 

das signifikant bessere Signal-Rausch-Verhältnis 

bei der LIF-Detektion (bei 5 µL Probe 

S / N > 500) im Vergleich zur Standard-Fluoreszenz 

(bei 10 µL Probe S / N = 11). 

Dieser Unterschied ist hauptsächlich durch 

den unterschiedlichen Aufbau der beiden Geräte 

bedingt. Das Standard-Fluoreszenz-Gerät 

besteht – grob dargestellt – aus einer Lichtquelle, 

Anregungswellenlängen-Einheit, Meßzelle, 

Emissionwellenlängen-Einheit und dem 

Photonenverstärker. Darüber hinaus wird oftmals 

der Lichtstrahl geteilt, um einen Teil einer 

Referenzdiode zuzuführen und damit Veränderungen 

der Lichtquellenenergie registrieren 

und kompensieren zu können. Da der LIF- 

Detektor eine streng monochromatische Anregungswellenlänge 

produziert, können alle 

Funktionsteile entsprechend auf das Fluoreszenzsignal 

und die Sensitivität hin optimiert 

werden (siehe Abb. 3). 


Die Auswahl der Lichtquelle ist ein Beispiel 

für die Kompromisse bei der Konstruktion der 

Fluoreszenzdetektoren. Bei dem Standard- 

Fluoreszenz-Detektor wird ein Bereich von 190 

bis 900 nm abgedeckt, wobei bei der Messung 

ein Bereich von ± 10 nm um die gewünschte 

Anregungswellenlänge relevant ist. Der Rest 

der Lampenenergie wird verschwendet und 

kann durch entstehende Wärmeenergie zur 

Dekomposition der Probe führen. Bei der Laser-induzierten 

Fluoreszenz wird der Laser 

speziell auf die Applikation und die dabei benötigte 

Wellenlänge hin ausgewählt. Mit Hilfe 

der Kopplungseinheit (Abb. 3, Teil 2) sowie 

der Kombination des Objektives mit der Kugellinse 

(Abb. 3, Teil 7 und 9) kann die Anregungsstrahlung 

der Laserquelle präzise auf 

die Meßzelle fokussiert werden. Die Linse mit 

der großen Apertur maximiert die Fluoreszenz-Intensität 

durch die Optimierung der Illumination 

(Ausleuchtung) des Inneren der 

Kapillare. Ein weiterer Vorteil der Laser ist, daß 

diese monochromatisches Licht liefern. Dies 

stellt sicher, daß die gewünschte Wellenlänge 

zum Einsatz kommt. Bei der konventionellen 

Fluoreszenz kann es dazu kommen, daß der 

Monochromator seine Kalibration verliert und 

damit nicht mehr die gewünschte Wellenlänge 

beobachtet wird. 

Einsatz von Laser-induzierter 

Fluoreszenz 

Die Vorteile der Laser-Induzierten Fluoreszenz 

lassen diese Detektionsweise besonders geeignet 

im Zusammenhang mit der Kapillar-Elektrophorese 

und der Nano- und Mikro-HPLC 

erscheinen. Dies liegt insbesondere in der genauen 

Fokussierung des Laserstrahls auf die 

Kapillare, die in der CE und der Nano- und 

Mikro-HPLC in Kombination mit der Kugellinse 

die Meßzelle darstellt. Tabelle 1 zeigt eine 

Auswahl an Molekülen mit einer natürlichen 

Fluoreszenz, dem eingesetzten Laser, der verwendeten 

Methode sowie dem Detektionslimit. 

Daneben sind eine Vielzahl weiterer Laser 

und Wellenlängen verfügbar sowie bei 

nicht vorhandener natürlicher Fluoreszenz 

unterschiedliche Möglichkeiten der Derivatisierung 

(weiterführende Literatur zur Derivatisierung1, 

2 ). 

Als Beispiel für die Leistungsfähigkeit der 

Detektion derivatisierter Proben zeigt die Abbildung 

4 die Trennung und Detektion von 

fünf Peptiden, die ihre biologische Funktion 

in sehr geringen Konzentrationen ausüben. 

Das eingesetzte Analysensystem bestand aus 

einem Agilent Kapillar-Elektrophorese-System 

mit einem Picometrics ZETALIF 2000- 

Detektor und einem Argon-Ionen-Laser 

(488 nm, 15 mW). Als Trennsäule diente eine 

77 cm lange fused-silica-Kapillare mit einem 

Innendurchmesser von 50 µm (62 cm effektive 

Länge). Der Puffer bestand aus einem Gemisch 

von 40 mM Borat und 10 % Ethylenglykol 

(v : v) bei einem pH =10. Als Spannung 

wurden 23 kV bei 54 µA angelegt, die Injekti- 


Abb. 3: Schematische Darstellung des optischen 

Layouts des ZETALIF Laser-induzierten Fluoreszenzdetektors: 

1. Laser, 2. Kopplungs-Einheit, 3. 

Lichtleiter, 4. Kollimator, 5. Laserstrahl, 6. halbdurchlässiger 

Spiegel, 7. Objektiv, 8. Laserstrahl, 

9. Kugellinse, 10. Kapillare, 11. Fluoreszenzsignal, 

12. Filterblock, 13. Photonenverstärker 

on erfolgte mit 50 mbar über 10 Minuten mit 

2 Minuten umgekehrter Polarität von -23 kV. 

Die Konzentration der fünf Peptide in dem 

wäßrigen Standard betrug 5 x 10 –1 M, womit 

sich ein rechnerisches Detektionslimit von 10 

Attomol bei einem Signal-Rauschverhältnis 

von 1 : 3 ergibt. Wenn auch die Bestimmung 

dieser biologischen Peptide aufgrund ihrer 

Metabolisierung in vivo schwierig ist, so 

scheint die Sensitivität der vorgestellten Me- 

Tab. 1: Komponenten mit natürlicher Fluoreszenz 

thode für wäßrige Standards und der damit 

möglichen Anwendung in in vitro-Versuchssystemen 

ausreichend 12 . Gerade die exakte 

Fokussierung des Laserstrahls auf die Kapillare 

läßt diese Detektionsmethode geeignet im 

Zusammenspiel mit der Kapillar-Elektrophorese 

und der Nano- und Mikro-HPLC erscheinen 

– eine in Zeiten der Proteomics zukunftsweisende 

Miniaturisierung der Trenntechnik. 

Literatur 

[1] G.G. Guibault, Practical Fluorescence, Marcel Dekker, New York (1990) 

[2] G. Lunn, L.C. Hellwig, Handbook of Derivatization for HPC, Wiley-Interscience 

(1998) 

[3] C. Prata, P. Bonnfous, N. Fraysse, M. Treilhou, V. Poinsot, F. Couderc, 

Electrophoresis 22 (2001), 4129-4138 

[4] S. J. Lillard, E. S. Yeung Analytical Chemistry 67 (1995), 3421-3426 

[5] G. M. Janini, G. M. Muschick, H. Issacq, Journal of Chromatography 16 

(1993), 1877-1890 

[6] T. T. Lee, E. S. Yeung Analytical Chemistry 64 (1992) 3045-3051 

[7] S. N. Nie, R. Dadoo, R. Zare, Analyical Cemistry 65 (1993), 3571-3575 

[8] J. Kuijt, C. Garcia-Ruiz, G. J. Stroomberg, M. L. Marina, F. Ariese, U. A. 

Brinkman, C. Gooijer, Journal of Chromatography A 907 (2001), 291-299 

[9] P. Britz-McKibbin, K. Otsuka, S. Terabe Analytical Chemistry 15 (2002), 

3736-3743 

[10] N. Simeon, Chatelut, P. Canal, M. Nertz, F. Couderc Journal of Chromatography 

A 853 (1999), 449-454 

[11] G. Hemple, P. Schulze-Westhoff, S. Flege, N. Laubrock, J. Boos, Electrophoresis 

19 (1998) 2939-2943 

[12] G. Bönner, Kinine und ACE-Hemmer in Herz-Kreislauf Informationen, Arcis 

Verlag, München (1994) 


Dr. Hagen Preik-Steinhoff 

SunChrom GmbH 

Max-Planck-Str. 22 

D-61381 Friedrichsdorf 

eMail: hpreik@sunchrom.de 

Substanz Wellenlänge Detektionslimit Trennmethode Referenz 

Tryptophan 266 0,15 nM CE 3 

Serotonin 266 1 nM CE 4 

Peptide 266 1-10 nM CE 5 

Proteine 266 60 ng/mL CE 6 

PAH 325,266 nM, nM CE, CE 7, 8 

Riboflavin 488 nM HPLC 9 

Anthracycline 488 nM HPLC und CE 10, 11 

Abb. 4: Detektion FITC-markierter Peptide mittels CE und LIF. 1. Bradykinin, 2. Angiotensin II, 3. Substanz 

P, 4. Leucin-Enkephalin und 5. Tryptophan-Leucin-Dipetid. Informationen siehe Text. 



Nukleinsäure-Separation � 

Nukleinsäureaufreinigung 

durch Kationen-Komplexierung 

Prof. Dr. Michael Lorenz, Molzym GmbH & Co.KG, Bremen 

Marktübliche Nukleinsäurereinigungs-Kits beruhen auf zwei physiko-chemischen Interaktionsmechanismen 

von DNA mit Oberflächen: Anionenaustausch (Gravitationsfluß-Säulen) 

und Ladungskompensation durch hohe Salzkonzentration (Silika-Technologie). Die Firma 

Molzym hat einen auf einem anderen Bindungsmechanismus beruhenden Mini Spin 

Gesamtnukleinsäure- und DNA-Reinigungs-Kit entwickelt. Nach diesem Bindungsmechanismus 

interagieren negativ geladene DNA- und RNA-Moleküle mit negativ geladenen Oberflächen 

infolge einer Komplexierung von multivalenten Kationen. Die Nukleinsäuren werden 

frei, wenn die multivalenten Kationen durch komplexierende Agenzien wie EDTA entfernt 

werden (Abb. 1). Dieser reversible Bindungsvorgang wird ausgenutzt, um Nukleinsäuren 

aus Zell-Lysaten zu reinigen. Als Matrix haben sich Tonminerale aufgrund ihrer 

hohen Bindungskapazität (mehr als 28 µg/mg Ton) als besonders geeignet erwiesen. Mit 

der Molzym ‚PrestoSpin D Mini Spin-Säulen‘-Kitserie können Nukleinsäuren aus Bakteriophagen, 

Bakterien, Pilzen und Hefen, Pflanzen, Böden, Geweben, Nahrungsmitteln, Blut 

und Zellkulturen hochrein, in hoher Ausbeute und mit geringer ‚Hands-on‘-Zeit isoliert 

werden. Neu ist zudem die Mini Spin-Säulen-Aufreinigung von Plasmiden im Midi-Format, 

Cosmiden und BACs. 

Key Words: Gesamt-Nukleinsäure-Reinigung, DNA-Bindungsmechanismus, multivalente 

Kationen, Komplexierung, ‚Mini Spin‘-Säulen, Tonmatrix, Plasmid-DNA, genomische DNA 

Nukleinsäuren haben eine zentrale Stellung 

in der modernen molekularen Analytik. Als 

mögliche Anwendungen sind unter anderem 

Genomanalysen, der genetische Fingerabdruck 

im Täter- und Vaterschaftsnachweis, 

Diagnosen erblich bedingter Krankheiten, 

Infektionsdiagnosen, die Züchtungsanalytik 

und die Qualitätskontrolle in der Nahrungsmittelindustrie 

zu nennen. Lange Zeit 

war die Präparation von reinen Nukleinsäuren 

eine zeit- und kostenintensive Prozedur. 

Zudem mußten große Probemengen verarbeitet 

und gesundheitsschädliche Chemikalien 

wie Chloroform und Phenol eingesetzt 

werden. In den letzten 15 Jahren hat sich ein 

ständig steigender Bedarf an schnellen und 

kostengünstigen Nukleinsäure-Präparati- 

Abb. 1: Interaktionsmodell der DNA-Proben mit 

der Tonmatrix (siehe Text zur Erläuterung) 

onsverfahren entwickelt. Als Standard für 

den täglichen Laborbedarf gelten mittlerweile 

die ‚Mini Spin‘-Säulenreinigungen 

beziehungsweise 96- und 386-well-Plattenverfahren 

für die automatisierte Nukleinsäurereinigung. 

Ein Nukleinsäure-Reinigungs-Kit sollte 

folgende Anforderungen erfüllen: hohe 

Reinheit der isolierten DNA, hohe Bindekapazität 

der Säule und dadurch hohe DNA- 

Ausbeuten, einfache Handhabung und niedrige 

‚Hands-on‘-Zeit. Das Angebot von Kits 

reicht von speziellen Anwendungen wie für 

die Isolierung von Plasmiden, Cosmiden, 

BACs (bacterial artificial chromosomes), 

DNA aus Blut oder Nahrungsmitteln bis hin 

zu weitgefächerten Applikationen in einem 

Kit (zum Beispiel Gewebe, Bakterien, Hefen, 

Viren). 

PrestoSpin D – DNA-Adsorption 

durch Kationen-Komplexierung 

Reinigungen von Nukleinsäuren mit marktüblichen 

Kits folgen dem Schema Binden- 

Waschen-Eluieren. Bei der Anionenaustauschchromatographie 

in gravitationsgetriebenen 

Durchfluß-Säulen binden Nukleinsäulen 

an die Matrix durch ionische Interaktion. 

Kontaminationen des Zellysates werden 

mit Puffern aus der Säule gewaschen. 

Die gebundenen Nukleinsäuren werden im 

Anschluß mit hohen Salzkonzentrationen 

freigesetzt, im Eluat mit Ethanol gefällt und 

schließlich in Wasser oder Tris-Puffer gelöst. 

Weitverbreitet sind ‚Mini Spin-Säulen‘-Reinigungskits, 

die Aufreinigungen aus geringerem 

Ausgangsmaterial erlauben (25 bis 

200 mg). Als DNA-Bindematrix dienen Silika-Membranen, 

an die Nukleinsäuren in Anwesenheit 

von hohen Konzentrationen chaotroper 

Guanidinsalze binden. Der genaue 

Bindemechanismus ist noch nicht vollständig 

aufgeklärt, doch geht man von einen Entropie-Effekt 

aus 1 . Alkoholhaltige Waschpuffer 

sorgen für die Entfernung von Verunreinigungen. 

Am Ende werden die Nukleinsäuren 

mit Wasser oder Tris-Puffern eluiert. Das 

Verfahren ist insgesamt schneller als das mit 

Anionenaustausch-Durchfluß-Säulen, nicht 

zuletzt weil eine Ethanol-Präzipitation der 

eluierten DNA ausgelassen werden kann. 

Molzym hat ein weiteres Prinzip der 

DNA-Bindung an Oberflächen in die Entwicklung 

von Nukleinsäure-Reinigungs- 

Kits umgesetzt (Abb. 1,). Negativ geladene 

DNA- und RNA-Moleküle binden in Anwesenheit 

geringer Konzentrationen (50 bis 100 

Genomische DNA 

enthaltendes Lysat 

Plasmid DNAhaltiges 

Lysat 

DNA-Binden 

Waschschritte 

DNA-Elution 

reine DNA 

Abb. 2: Schema des Isolierungs- und Reinigungsprozesses 

für genomische und Plasmid- 

DNA mit dem PrestoSpin D-Universalkit 


Abb. 3: Genomische DNAs aus (v.l.n.r.) Tomatenblättern 

(100 mg), Hefe (Saccharomyces, 1 ml), 

Zellkultur (Affennieren, 10 7 Zellen), Blut (human, 

100 µl), Lunge (Ratte, 150 mg), Phage Lambda 

(2,5 ml, 8 x 10 11 /ml), Waldboden (0,5 g). M: Marker 

Abb. 4 : Isolierung von pUC13-DNA aus 10 ml E. 

coli SF8-Kulturen. Aufgetragen wurden gleiche 

proportionale Volumina der Präparationen. 

M: Marker; 1: ‚PrestoSpin D Plasmid Mini Spin‘- 

Säulen-Kit, Eluat; 2: Säulendurchlauf; 3: Gesamt- 

Plasmid-DNA im Rohlysat; 4: Plasmid-DNA mit 

einem gravitationsgetriebenen Durchfluß-Säulen-Kit 

(Anionenaustauscher) eines anderen Anbieters 

gereinigt. 

mM) von multivalenten Kationen, etwa 

Mg 2+ , an negativ geladene Oberflächen. Untersuchungsergebnisse 

weisen darauf hin, 

daß die Mg 2+ -Komplexierung für die stabile 

Bindung der negativ geladenenen Nukleinsäuren 

an negativ geladene Oberflächen verantwortlich 

ist 2 . Der Komplex wird aufgelöst, 

wenn komplexierende Agenzien wie 

EDTA die Mg 2+ -Ionen entfernen. Als Folge 

gehen gebundene Nukleinsäuren in Lösung. 

In den ‚PrestoSpin D‘-Kits von Molzym (zu 

beziehen über Omnilab Life Science, 

www.ols-biotech.de) laufen alle durch verschiedene 

Verfahren erhaltene Zellysate 

durch dasselbe Reinigungsverfahren nach 

obigem Muster (Abb. 2). 

Tonminerale als 

Nukleinsäure-Bindematrix 

Bindematrix für die ‚PrestoSpin D‘-Kits sind 

Tonminerale. Sie zeichnen sich in Verbindung 

mit dem Bindemechanismus der Kationen-Komplexierung 

durch eine hohe Bindekapazität 

von mehr als 28 µg/mg aus. 

‚PrestoSpin D‘-Spin-Säulen bestehen aus einem 

Gemisch aus hochgereinigtem Sand 

und Ton. Die Nukleinsäure-Bindekapazität 

der Säulen ist mit mehr als 80 µg eine der 

bisher höchsten im Mini Spin-Säulenformat. 

Die hohe Porosität der Säulenmatrix erlaubt 


eine einfache Reinigung von Gesamt-Nukleinsäuren 

oder DNA auch aus stark viskosen 

Lösungen. So können größere Mengen an 

Ausgangsmaterial in den Nukleinsäure-Reinigungsvorgang 

eingehen. 

Reinigung genomischer DNA 

Die ‚PrestoSpin D‘-Kits erlauben die Reinigung 

von Gesamt-Nukleinsäuren (Presto- 

Spin D-Universal-Kit) beziehungsweise 

DNA aus einer Vielzahl von Organismen 

und Materialien (Abb. 3). Mit dem Presto- 

Spin D-Universal-Kit kann sowohl genomische 

DNA aus einer Vielzahl von biologischen 

Materialien – unter anderem Bakteriophagen, 

Bakterien, Hefen, Pilzen, tierischen 

und pflanzlichen Geweben, Zellkulturen, 

Blut, Böden und Sedimenten (Abb. 3) 

– als auch Plasmid-DNA im Mini- und Midi- 

Format gereinigt werden. Die Ausbeuten betragen, 

je nach Ausgangsmaterial, bis zu 80 

µg genomische DNA und 50 µg Plasmid- 

DNA. Die Präparation hochreiner DNA aus 

Zellysaten beträgt nur 10 bis 25 Minuten. 

Die Lysisprotokolle sind darauf ausgelegt, 

bei der Zelldesintegration freiwerdende Nukleinsäuren 

effizient vor dem Verdau endogener 

Nukleasen zu schützen. Dies wird 

durch den Einsatz von hochchaotropem Guanidinhydrochlorid 

erreicht. Nach einem vereinheitlichten 

Protokoll werden Lysate auf 

eine Spin-Säule gegeben, wo die DNA-Bindung 

durch die Kationen-Komplexierung 

erfolgt. Nieder- und hochmolekulare Verunreinigungen 

(unter anderem Proteine, Polysaccharide, 

Nukleotide, Aminosäuren, Salze) 

werden mit einem speziellen alkoholhaltigen 

Puffer durch kurze Zentrifugation ausgewaschen. 

In einem zweiten Waschschritt mit 70% 

Ethanol erfolgt die Beseitigung von Salzen, 

wonach die reine DNA mit üblichem TE-Puffer 

eluiert wird (10 mM Tris, 1 mM EDTA). 

Optional kann RNA durch kurzzeitige Inkubation 

mit RNase A in der Säule vor den 

Waschschritten degradiert werden. Für jedes 

der oben genannten biologischen Materialien 

gibt es zudem je ein Spezialkit zur Isolierung 

genomischer beziehungsweise von Plasmid-DNA. 

Reinigung von Plasmid-DNA 

Die Architektur und die hohe Bindekapazität 

der Ton-Sand-Matrix in den ‚Mini Spin‘- 

Säulen hat die Entwicklung eines Reinigungs-Kits 

ermöglicht, mit dem Plasmid- 

DNA im Midi-Maßstab (bis 50 µg) isoliert 

werden kann (Abb. 4). ‚High copy‘-Plasmid- 

Vektoren können aus 10 bis 20 ml Kulturen 

in einem Verfahren gereinigt werden, das gegenüber 

den ansonsten in diesem Maßstab 

üblichen gravitationsgetriebenen Durchfluß-Säulen 

(Anionenaustauscher) deutlich 

schneller ist (etwa 45 Minuten gegenüber 

mehr als 2 Stunden). Das Verfahren ist sehr 

schonend, so daß die Plasmid-DNA fast aus- 

schließlich in der Supercoil-Konformation 

isoliert wird. Mit dem ‚PrestoSpin D Plasmid 

Mini Spin‘-Säulen-Kit besteht weiterhin 

die Option, Aufreinigungen aus bis zu 100 

ml Kulturvolumen durchzuführen. Dies erlaubt 

die Reinigung von ‚low copy‘-Plasmiden, 

etwa für Screening-Zwecke (Abb. 5), 

hochmolekularen rekombinanten Plasmiden 

mit erniedrigter Kopiezahl (Abb. 6) sowie 

von Cosmiden und BACs. 

Literatur 

[1] Hesselink, FT (1983) In: Adsorption from solution at the solid/liquid 

interface, GD Parfitt, CH Rochester (ed.), pp. 377-412, Academic Press, 

London. 

[2] Lorenz, MG (1998) In: Microbial interactions in agriculture and forestry, 

NS Subbarao, YR Dommergues (ed.), pp. 19-44, Oxford and IBH Publishing 

Co., New Delhi. 


Prof. Dr. Michael Lorenz 

Molzym GmbH & Co.KG 

Leobener Strasse 

D-28359 Bremen 

Tel./Fax: +49-(0)421-218-8780 / -8781 

eMail: info@molzym.com 

www.molzym.com 

Abb. 5: Isolierung von Plasmiden (Größe bis >50 

kb, Pfeil) aus Wild-Bakterienstämmen. 

Abb. 6: Restriktionsanalyse von rekombinanten 

‚low copy‘-Plasmiden (4 ml Kulturvolumen). Die 

Insertionen (Spalten 1-7) können 20 kb überschreiten 

(Spalten 2, 4-6); Spalte 8: Vektor 



Gentechnik � 

dialog gentechnik – 

Drehscheibe zwischen 

Wissenschaft und Öffentlichkeit 

Im Jahr 1997 fand in Österreich das Gentechnik-Volksbegehren 

statt, mit dem 1,2 Millionen 

Österreicher – rund 10% der Wahlberechtigten 

– per Unterschrift die Forderungen 

nach gentechnikfreier Nahrung, keinen 

Freisetzungen und keinen Patenten auf Leben 

unterstützten. Zwei Jahre später ergab 

eine Eurobarometer-Studie (1999), daß 35% 

der Europäer der Ansicht waren, gentechnikfreie 

Tomaten enthielten keine Gene, 30% 

waren unschlüßig. Dieses beunruhigende 

Verhältnis rief einige österreichische Wissenschaftler 

auf den Plan, die sich die Verbesserung 

des Wissensstandes in der Öffentlichkeit 

über die Gentechnik und ihren Anwendungen 

zum Ziel setzten. Noch im gleichen 

Jahr schlossen sich mehrere österreichische 

wissenschaftliche Gesellschaften zur Plattform 

‚Gentechnik & Wir‘ zusammen, um verständlich, 

ausgewogen und kompetent zu informieren. 

Mit der Gründung der Koordinationsstelle 

für Öffentlichkeitsarbeit 1999 wurde die 

Initiative institutionalisiert. Die Finanzierung 

der Koordinationsstelle sowie ihrer Aktivitäten 

erfolgte über projektbezogene Mittel 

öffentlicher Institutionen. Im Jahr 2001 

konstituierte sich die Plattform zum Verein. 

Die Umbenennung in ‚dialog gentechnik‘ 

Albert Karsai, dialog gentechnik, Wien 

sollte der Entwicklung des Vereins von einer 

reinen Informationsstelle hin zu einer 

Einrichtung, die den Dialog zwischen Wissenschaft 

und Öffentlichkeit fördert, Rechnung 

tragen. Der Dialog entspricht auch dem 

modernen Verständnis von Öffentlichkeitsarbeit 

im Bereich Life Sciences. Seit dem Gentechnik-Volksbegehren 

sind fünf Jahre vergangen. 

Zu den erfolgreichen Projekten des Vereins 

gehören unter anderem ein österreichweiter 

Schulwettbewerb zum Thema Humangenetik 

(2000/2001), die Ausstellung ‚Schau 

GEN-au‘ im Rahmen der Science Week 

(2000/2001, siehe rechts), das Symposium 

„Gentechnik entlang der Nahrungskette“ 

(2002) sowie Seminare für Lehrer, Wissenschaftler, 

Journalisten und Politiker (siehe 

unten). Besonders in aktuellen Projekten, von 

denen nachfolgend einige vorgestellt werden, 

zeigen sich die Bemühungen zum Dialog. 

EU-Projekt ECOD-BIO 

‚dialog gentechnik‘ koordiniert ein EU-Projekt 

zur Vernetzung biowissenschaftlicher Informationsstellen 

in Europa. Ziel ist der Austausch 

von Erfahrungen und Materialien, 

Journalisten legen bei einem Seminar von ‚dialog gentechnik‘ selber Hand an im Labor. 

das Erarbeiten von Best-practice-Strategien 

für einzelne Zielgruppen und eine europaweite 

Homepage mit zielgruppengerechten 

Informationen sowie einer Bilddatenbank. 

Das Projekt begann am 1. August 2002 und 

läuft mehr als drei Jahre lang. Insgesamt sind 

acht Partner aus sieben Ländern beteiligt: 

‚dialog gentechnik‘ (Österreich), Flanders Interuniversity 

Institute for Biotechnology 

(Belgien), Informationssekretariat Biotechnologie 

(Deutschland), Bieri Information and 

Communication Services (Schweiz), Association 

Biotrin (Tschechien), Flad & Flad Communication 

GmbH (Deutschland), Istituto 

Superiore di Oncologia (Italien) und Agro- 

BioInstitute (Bulgarien). 

Öffentlichkeitsarbeit des 

Genomforschungsprogramms GEN-AU 

‚dialog gentechnik‘ ist die zentrale Auskunftsstelle 

zu allen Themenbereichen der 

Genomforschung im Rahmen des Genomforschungsprogramms 

GEN-AU. Dazu gehört 

die inhaltliche Betreuung der Homepage des 

GEN-AU-Programms und die Bereitstellung 

allgemein verständlicher Beschreibungen 

der Arbeitsgebiete und der Methoden der 

Genomforschung. Der potentielle Nutzen für 

Mensch und Umwelt wird genauso besprochen 

wie die ethischen, rechtlichen und gesellschaftlichen 

Fragen, die Anwendungen 

der Genomforschung derzeit aufwerfen. Zusätzlich 

organisiert ‚dialog gentechnik‘ einen 

Diskurstag über Gendiagnostik, betreut die 

aus dem Diskurstag hervorgegangenen Arbeitskreise 

und ermöglicht Schülern im Sommer 

diesen Jahres eine „Summer School” in 

Genomforschungslabors. 

Konferenz: Genetische Daten 

Gemeinsam mit dem Institut für Technikfolgen-Abschätzung 

der Österreichischen Akademie 

der Wissenschaften, dem Institut für 

Wissenschaftstheorie und -forschung der 

Universität Wien und ‚dialog gentechnik‘ 

organisierte die PR-Agentur communication 

matters eine Bürgerkonferenz zum Thema 

„Genetische Daten: woher, wozu, wohin” 

nach dem Vorbild der dänischen Konsensukonferenzen 

(20. bis 23. Juni 2003). Diese 

Konferenz war ein Instrument zur partizipativen 

Technologiebewertung. Ein Laienpanel 

aus zwölf Personen arbeitete sich an zwei Wochenenden 

in das Thema ein, lud Experten 

zu einer öffentlichen Befragung und verfaßte 

anschließend eine gemeinsame Stellungnahme, 

die auch dem Nationalrat übergeben 

wurde. Die Empfehlungen konzentrierten 

sich auf vier Themenbereiche: 

– Information/Beratung/Bewußtseinsbildung: 

Gefordert werden die psychologische 

Begleitung von betroffenen Personen sowie 

Informationen über eine mögliche Betroffenheit 

von Verwandten und eine breite Aufklärung 

der Bevölkerung über Humangenetik. 


Ausstellung Schau GENau in Wien 

– Forschung: Befürwortet werden eine staatliche Finanzierung unabhängiger 

Forschung und Massenscreenings unter kontrollierten Bedingungen. 

– Datenschutz/Recht: Gefordert werden diverse Maßnahmen im medizinischen 

Bereich, um die Sicherheit und das Bewußtsein für die 

Sensibilität genetischer Daten zu erhöhen. 

– Ethik: Begrüßt wird die Meinungsvielfalt ethischer Positionen, besonders 

betroffene Gruppen sollten einbezogen werden. 

„Koexistenz“ in der Landwirtschaft 

Die Koexistenz von gentechnikfrei produzierenden Landwirten und 

solchen, die gentechnisch veränderte Pflanzen anbauen wollen, ist 

ein kontroverses Thema innerhalb der Europäischen Union. Bislang 

spielten sich Diskussionen fast auschließlich im akademischen Bereich 

ab. Mit dem von ‚dialog gentechnik‘ organisierten Workshop 

„Koexistenz“ für die Landwirtschaft (Herbst 2003) soll die Diskussion 

zur landwirtschaftlichen Basis getragen werden. Neben der 

Projekttätigkeit versteht sich ‚dialoggentechnik‘ aber auch weiterhin 

als Informationsstelle, die Anfragen beantwortet, Experten für 

Vorträge, Interviews oder Recherchen vermittelt oder Führungen und 

praktische Demonstrationen am Universitäts-Campus für Schulklassen 

organisiert. Ferner bietet die neu gestaltete Homepage unter 

www.dialog-gentechnik.at Informationen zum Thema Gentechnik. 

Seit dem Volksbegehren hat sich die Stimmung innerhalb der Bevölkerung 

gegenüber der Gentechnik nicht wesentlich geändert. Die 

Mehrheit der Österreicher wollen keine gentechnisch veränderten 

Lebensmittel. Untersuchungen zeigen, daß ein höherer Grad an Informiertheit 

nicht zwangsläufig zu einem Anstieg der Zustimmung 

führt (Eurobarometer-Studie 1999). Die Maxime in der Vergangenheit 

- „Wenn die Leute erst ausreichend informiert sind, befürworten 

sie auch die Gentechnik“ – stimmt so einfach nicht. ‚dialog gentechnik‘ 

sieht sich hier auch in seiner Philosophie bestätigt: „Wir 

wollen, daß sich die Bevölkerung aufgrund ausgewogener wissenschaftlicher 

Fakten eine fundierte eigene Meinung bildet. Es ist nicht 

unser Anliegen, eine bestimmte Einstellung zu transportieren“, betonte 

Prof. Dr. Andrea Barta, Institut für Medizinische Biochemie der 

Universität Wien und Sprecherin des Vereins. 

Kontaktadresse 

Dipl.-Ing. Albert Karsai 

dialog gentechnik 

Campus Vienna Biocenter 6/1 

Rennweg 95B, A-1030 Wien 

Tel./Fax: +43-(0)1-4277-53036 / -53099 

eMail: office@dialog-gentechnik.at 

www.dialog-gentechnik.at 


Foto: Erwin Hermann 

Anzeige 


P R O D U K T W E L T 


HS 400 Hybridization Station für reproduzierbare 

Microarray-Verarbeitung 

Die neue HS 400 Hybridization Station von 

Tecan ermöglicht eine automatisierte parallele 

Hybridisierung von vier Microarrays auf 

Objektträger-Format. Das kompakte, leicht 

zu bedienende System stellt eine Lösung für 

einen kleinen bis mittleren Durchsatz der Hybridisierung 

dar – bis zu vier Objektträger pro 

Durchlauf. Inkubationen können im Temperaturbereich 

von 15 bis 85 ° C durchgeführt 

werden. Die parallele Verarbeitung garantiert 

Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Inkubationszeiten. 

Die Flüssigkeiten in der Hybridisierungskammer 

werden aktiv über den Array bewegt 

und die Objektträger direkt im Gerät getrocknet. 

Durch die gleichmäßige Verteilung der 

Flüssigkeit werden die Waschschritte effizient 

ausgeführt. Eine optionale Barcodeerkennung 

bietet zusätzliche Sicherheit. Das Beladen 

der Arrays wird erleichtert, indem alle 

vier Objektträger in einem speziellen Halter 

eingesetzt werden können. Diese Halter können 

direkt in den Scannern der LS Serie von 

Tecan verwendet werden. Das HS 400-System 

erlaubt den Stand-alone-Betrieb durch ein 

integriertes Touch-Screen Modul oder kann 

alternativ von einem PC gesteuert werden. 

Um den Durchsatz zu erhöhen oder unterschiedliche 

Protokolle abzuarbeiten, können 

mehrere Systeme gleichzeitig von nur einem 

PC angesteuert werden. 

Das einfach zu bedienende und flexible 

Systemmit hoher Qualität und Leistungsfähigkeit 

stellt eine optimale Lösung für eine 

verbesserte Reproduzierbarkeit und Sicherheit 

für die automatisierte Microarray-Verarbeitung 

dar. 


Präzises Temperieren für GLP/GMP-konforme 

chromatographische Separation 

Der Chromatographieschrank KBC von Binder 

bietet Raum für die Unterbringung großer 

Säulen oder auch 

kompletter Chromatographie-Anlagen. 

Stabile und 

von äußeren Temperaturschwankungenunabhängige 

Prozeßabläufe sind 

so jederzeit sichergestellt 

und ein Höchstmaß an 

Reproduzierbarkeit der 

Trennung garantiert. 

Das präzise Einhalten 

von Temperaturwerten 

ermöglicht GLP-/GMPkonformes 

Arbeiten und 

die validierte chromatographische 

Separationen. 

Mit einem zuverlässigen 

und leistungsstarken Kältemodul 

bietet der KBC 

optimale Voraussetzungen 

für die Chromatographie 

von wärmeempfind- 

lichen, instabilen Komponenten wie fragilen 

Naturstoffen. Das APT.-Line-Luftführungsprinzip 

sorgt im gesamten 

Temperaturspektrum 

von –5°C bis +99,9 °C für 

optimale räumliche Temperaturgenauigkeiten. 

Durch die Vollsichtglasscheibe 

sind die Prozesse 

im Innenraum stets 

uneingeschränkt kontrollierbar. 

Die Chromatographieschränke 

sind mit 

einem Innenraumvolumen 

von 400 und 700 l erhältlich. 

Mit dem Softwarepaket 

DataControlSystem 

APT-COM 3.0 ist ferner 

optional eine Daten- und 

Kommunikationssoftware 

für GMP-konforme 

Datenaufzeichnung erhältlich. 


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RNA-Isolation im 

Hochdurchsatz 

Die Analyse der Genexpression setzt die Isolierung 

intakter RNA voraus. Mit dem Concert 

96 RNA-Kit von Invitrogen läßt sich 

Gesamt-RNA mit hoher Ausbeute und Qualität 

aus Bakterien, Hefe, Pflanzen und tierischen 

Zellen isolieren, und das in weniger als 

einer Stunde. Das System umfaßt 96-well-Filter- 

und Sammelplatten sowie alle notwendigen 

Puffer- und Waschlösungen für eine 

nicht-organische, automatisierte RNA-Isolation 

im Hochdurchsatzverfahren. 

Zur Aufbereitung werden die Zell- und Gewebeproben 

in Guanidinisothiocyanat (GTC) 

gelöst, um Proteine zu denaturieren und 

RNasen zu deaktivieren. Es folgt eine Reihe 

an Wasch- und Trennschritten, bei der die 

intakte RNA nach Wunsch mit Hilfe der Vakuumfiltration 

oder Zentrifugation vom Rest 

der Probe abgetrennt wird. Zurück bleibt eine 

hochreine Gesamt-RNA. Ferner gewährleistet 

die Konstruktion der Filter eine gleichmäßige 

RNA-Ausbeute über alle Kammern 

der 96-well-Platte hinweg. Die isolierte RNA 

läßt sich für alle gängigen molekularbiologischen 

Verfahren verwenden, etwa für RT- 

PCR oder bei Northern-Blottings. Der Concert 

96 RNA-Kit eignet sich für den Einsatz 

in Kombination mit zahlreichen Robotern. 

Auch ohne den Kauf eines Mehrfachkits, 

läßt sich ein breites Spektrum an Probengrößen 

und -typen aufbereiten. 


High speed microcentrifuge 

with digital control system 

Labnet International has introduced a new 

high speed microcentrifuge, the Spectrafuge 

24D. It features a digital control system that 

is easy-to-use and provides precision control 

of operation. Included with the centrifuge is 

a high capacity rotor for 1.5 or 2.0 ml tubes, 

and the unique design of this rotor makes it 

easy to load and unload sample tubes. 

The speed of the Spectrafuge 24D is variable 

to a maximum of 14,300 rpm (16,300 x g) 

for quick separation of nucleic acid and protein 

samples. A digital timer accurately controls 

run time, or can be set for a „quick spin”. 

The digital displays on the front panel show 

run time as well as speed in RPM, or the calculated 

g-force value. Although the Spectrafuge 

is brushless, quiet and compact, it is priced 

less than most of its brush motor counterparts. 

In addition, the Spectrafuge is 

available in five hot new colors. 

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Neue Workstation für Toxizitätstestung von Zellen 

Die Sparte ‚Drug Discovery‘ von Thermo 

Electron Corporation bietet eine neue Workstation 

für die Toxizitätstestung von Zellen 

anbieten, die eine optimale Komplettlösung 

für hohen Probendurchsatz darstellt. Die integrierte 

Workstation wurde in Zusammenarbeit 

mit Thermo Labsystems und Thermo 

CRS entwickelt. Zusammen mit anwendungsspezifischen 

Reagenzienkits, automatischer 

Datenanalyse und Berichtserstellung 

stellt sie ein umfassendes Systempaket dar. 

Die Kapazität der ‚Cellular Assay Workstation‘ 

reicht auch für Wiederholungs-Screening 

und Target-Validierung in der Drug-Discovery 

aus. Das System besteht aus einem Roboter 

zur Bewegung der Platte, einer Liquid- 

Handling-Station, einem Zelleninkubator 

und einem Mikrotiterplattenphotometer. 

Derzeit kann es mit zwei Toxizitätstests arbeiten. 

Der Vitotox Genotoxicity-Assay liefert 


Corning improves 

cryogenic vials 

The Corning ® Internal and External Thread 

Cryogenic Vials have been improved and are 

now certified RNase- and DNase-free, have 

new black graduations for quicker volume 

identification, and are packaged in a resealable 

bag for easier, more secure storage. They 

also feature a larger marking area for easy to 

read labels, embossed lot numbers on the bag 

for better identification and sample tracking 

and multilanguage product use guidelines. 

Corning vials are available in 1.2 mL, 2.0 mL, 

4.0 mL, and 5.0 mL sizes with either a round 

or conical bottom. Self-standing vials have a 

special base design and can be locked into 

storage racks and trays. 

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innerhalb weniger Stunden Ergebnisse und 

bildet damit die Grundlage für das erste und 

bislang einzige System auf dem Markt, das 

automatische Gentoxizitätstests durchführt. 

Der Vitotox-Test arbeitet mit rekombinanten 

Organismen, kommt mit minimalen Probenmengen 

aus und spart so kostspielige Reagenzien 

ein. 

Mit dem CytoPro HTS General Cytotoxicity-Assay 

lassen sich Änderungen im Stoffwechsel 

von Säugerzellinien verfolgten. Der 

ist für das Screenen von Zytotoxinen sowie 

Zytokinen gedacht. Im Gegensatz zu den 

meisten anderen Zytotoxizitätstests kommt 

der CytoPro-Test ohne gefährliche Chemikalien 

aus. Bei beiden Tests führt die ‚Cellular 

Assay Workstation‘ automatisch umfangreiche 

Qualitätskontrollen durch, mit denen sowohl 

Meßgerät als auch Testablauf überwacht 

werden. 


Halbmikro-Waage mit 

UniBloc-Technologie 

Shimadzu hat mit seiner neuen Professional- 

Baureihe AUW-D/AUW/AUX/AUY sein 

Sortiment der Analysenwaagen und Halbmikro-Waagen 

erweitert. Das Herzstück bildet 

eine Hochleistungsmeßzelle, der UniBloc. 

Dadurch sind höhere Präzisionen, schnellere 

Ansprechzeiten und stabile Analysenresultate 

möglich. Eine benutzerdefinierte vollautomatische 

interne Justierung ist ebenso wie 

die Justierung bei Änderung der Umgebungsbedingungen 

erhältlich. Weitere Funktionen 

beinhalten eine hintergrundbeleuchtete 

Anzeige (nur AUW) und die serienmäßig 

integrierte RS-232C-Schnittstelle. 

Die AUW-D-Serie, eine im vollautomatischen 

Dual-Bereich betriebene Analysen- / 

Halbmikrowaage besticht durch ihren Wägebereich 

von bis zu 220 g /82 g bei einer Ablesbarkeit 

von 0,0001 g/0,00001 g und ihrer 

Stabilität. Dabei wird die gesamte Struktur 

der Meßzelle aus einem einzigen Block gefertigt. 

Parallelführung, das Gehänge und die 

Übersetzungshebel sind bereits integriert. 

Neben einer Reduzierung der beweglichen 

Teile werden auch Torsionskräfte und Spannungen 

verhindert. Shimadzu bietet die 

„UniBloc"-Technologie in seinen Plattformwaagen 

der Serie BX-K/BW-K sowie in den 

Präzisionswaagen der Modellreihe UX/UW 

an. Durch die Hochleistungs-Meßzelle und 

eine spezielle Digitaleinheit reduziert sich die 

Ansprechzeit der UX/UW-Waagen auf bis zu 

0,7 Sekunden. 


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PAK-Analytik mit TACS 

Da einige polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe 

(PAK) als krebserregend eingestuft 

werden, ist eine genaue Analytik erforderlich. 

Als Methode der Wahl, im Gegensatz 

zu klassischen flüssig/flüssig-Extraktionen, 

bietet sich die Gelpermeationschromatographie 

an, da sie durch das TACS durchgängig 

automatisiert wird. Insbesondere bei Ölen 

kann die Analytik schnell und reproduzierbar 

durchgeführt werden. Das entsprechende 

Öl wird exakt eingewogen, ein interner 

Standard zugegeben und das Öl in das 

TACS gestellt. Die Ölmatrix und andere störende 

Begleitstoffe werden abgetrennt und 

zurück bleiben die Analyten von Interesse. Ein 

zusätzlicher Lösungsmittelaustausch kann 

auf Wunsch automatisiert werden. Entsprechend 

der verwendeten Analytik, kann der 

aufkonzentrierte Extrakt dann direkt vermessen 

oder weiter bearbeitet werden. PAK treten 

ubiquitär auf und sind auch in vielen fettreichen 

Lebensmitteln vermehrt enthalten. 


HPLC product line brochure 

Beckman Coulter has published a new brochure 

on its System Gold ® modular HPLC 

product line. It discribes the specialised application 

of HPLC for peptide mapping and 

protein analysis, enhanced with Beckman 

Coulter‘s proprietary solvent delivery technology. 

Applications in drug discovery and 

development are presented, as well as builtin 

features that help support regulatory competence. 

The brochure also describes the latest 

advancements in Beckman Coulter‘s 32 

Karat software platform, providing true 32bit 

control and data analysis for Beckman 

Coulter‘s HPLC and capillary electrophoresis 

systems. 

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Hochauflösendes ElektroSpray-Ionisierungs- 

Flugzeit-Massenspektrometer 

Das neue ElektroSpray-Ionisierungs-Flugzeit-Massenspektrometer 

(ESI-TOF) der Bruker 

Daltonik GmbH, das microTOF LC ist ein 

zukunftsweisendes ESI-TOF- 

Tischgerät mit höherer Performance 

für Forschungszwecke 

und verbesserten analytischen 

Anforderungen. ESI-TOF-Tischgeräte 

werden in der Pharma-Industrie, 

in der Biotechnik und 

von akademischen Forschern 

für genaue Massenermittlung 

verwendet, die die eindeutige 

Identifizierung kleiner Moleküle 

in den Metabolomics und der 

Chemie erlaubt. 

Das neue microTOF LC ist das 

erste leistungsstarke ESI-TOF- 

Tischgerät auf dem Markt. Obwohl 

es kleinere Abmessungen 

als andere ESI-TOF-Tischgeräte 

hat, zeichnet es sich durch etwa 

doppelte Auflösung (FWHM 

Auflösung 10.000) und erheblich verbesserte 

Massengenauigkeit aus – ohne die Notwendigkeit 

einer umständlichen internen Kali- 

brierung und des Signalintensitätsabgleichs. 

Das microTOF besitzt Hochgeschwindig- 

LC 

keits-Analog-Digital-Konverter (ADC), die 

zuverlässige quantitative Messungen 

erlauben und genaue, 

unverzerrte isotopische Muster 

erzeugen. Aufgrund seiner 

Schnelligkeit und Empfindlichkeit 

erfüllt das microTOF eine LC 

Schlüsselanforderung für 

schnelle Hochdurchsatz-LC/ 

MS- und Hochdurchsatz-CE/ 

MS-Analysen. Es mißt mit Akquisitionsraten 

größer als 

10 kHz, die mit – sofortiger , fliegender 

– Signalmittelwertbildung 

in Echtzeit 20 volle Spektren 

pro Sekunde aufnehmen 

können. 

Das microTOF erweitert 

LC 

die Produktlinie der ESI-TOF 

Massenspektrometrie-Produktlinie 

bei Bruker Daltonics, die 

bisher aus den in der Forschung angewandten 

großen und schweren Geräten BioTOFTM , 

ESI-TOF und ESI-Q-q-TOF bestand. 


Leica MATS-Wärmeplatte für optimales Mikroskopieren 

In der biologischen, medizinischen und pharmakologischen 

Forschung kommt der mikroskopischen 

Analyse lebender Zellen und temperaturempfindlicher 

Proben eine hohe Bedeutung 

zu. Hierfür müssen spezielle Bedin- 

gungen eingehalten werden, vor allem eine 

sorgfältig kontrollierte Temperatur. 

Die Leica MATS-Wärmeplatte (Microscope-stage 

Automatic Thermocontrol System) 

aus heizbarem, optischen Glas ist eine 

wirksame Lösung zum Schutz und zur Temperaturkontrolle 

von lebenden Zellen während 

der mikroskopischen Bearbeitung. Kritische 

Temperatursprünge werden vermieden, 

da Leica MATS eine gleichmäßige und 

konstante Temperatur über die gesamte Fläche 

garantiert. 

Durch eine hohe Temperaturstabilität (weniger 

als 0,5°C Schwankungen über 5 Stunden 

bei 37°C), die automatische Protokollierung, 

Bedienung in 0,1°C-Schritten und die 

präzise digitale Anzeige liefert Leica MATS 

stabile, zuverlässige und reproduzierbare Bedingungen 

für temperaturempfindliche Experimente 

bis 50°C. 

Die große, ebene Arbeitsfläche bietet Platz 

für mehrere Petrischalen oder Objektträger 

gleichzeitig. Leica MATS ist verfügbar für die 

gesamte Palette der Mikroskope – für Leica 

Stereomikroskope im Durchlicht ebenso wie 

für aufrechte und inverse Labor- und Forschungsmikroskope. 


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New mouse gene 

expression products 

Applied Biosystems has added a comprehensive 

collection of pre-designed primer and 

probe sets for mouse assays to its Assayson-Demand 

gene expression product range. 

These gene-specific sets usng TaqMan ® 

probes help researchers to quickly and easily 

perform quantitative gene expression studies 

on mouse genes. More than 8,000 assays are 

available in a single tube format and require 

only a few set-up and pipetting steps to generate 

sensitive, reproducible and quantitative 

gene expression data. They are simple to 

use and save researchers weeks or months of 

time they would have spent if they designed, 

formulated and tested their own assays. 


Roche führt AmpliChip 

CYP450-Test in den USA ein 

Roche Diagnostics hat mit dem AmpliChip 

CYP450 Tests auf Microarray-Basis den ersten 

pharmakogenomischen Biochip für klinische 

Anwendungen in den USA eingeführt. 

Der auf der Technologie von Affymetrix 

basierende Chip gibt Aufschluß darüber, wie 

genetische Variationen beim Menschen den 

Stoffwechsel von Medikamenten beeinflussen. 

So können bestimmte natürlich Polymorphismen 

in zwei Genen – CYP2D6 und 

CYP2C19 – nachgewiesen werden, die beim 

Stoffwechsel von Medikamenten eine wichtige 

Rolle spielen. 

Diese genetischen Variationen beeinflussen 

die individuell unterschiedliche Geschwindigkeit, 

mit welcher der Organismus 

eine Reihe häufig verwendeter Medikamente 

metabolisiert. Die Kenntnis dieser Variationen 

kann die Wahl des bestgeeigneten Medikamentes 

und der richtigen Dosierung unterstützen. 

Zudem lassen sich medikamentöse 

Therapien vermeiden, die beim Patienten 

schwere Nebenwirkungen verursachen 

würden. 

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Impressum 

LABORWELT (ISSN 1611-0854) 

erscheint zweimonatlich im Verlag der 

BIOCOM AG 

Stralsunder Str. 58-59 

D- 13355 Berlin 

Tel./Fax: 030/264921-0 / 030/264921-11 

eMail: laborwelt@biocom.de 

Internet: www.biocom.de 

Redaktion: 

Dipl.-Biol. Veronika Szentpétery (verantw.) 

Tel.: 030/264921-48 

Dipl.-Biol. Thomas Gabrielczyk 

Tel.: 030/264921-50 

Anzeigenleitung: 

Oliver Schnell 

Tel. 030/264921-45 

eMail: schnell@biocom.de 

Leserservice: 

Angelika Werner 

Tel. 030/264921-40 

Bildtechnik und Layout: 

Heiko Fritz 

Graphik-Design: 

Michaela Reblin 

Druck 

Mayer & Söhne, D- 86551 Aichach 

Mitglieder der DECHEMA-Fachsektion 

Biotechnologie, der Österreichischen 

Gesellschaft für Biotechnologie ÖGBT, der 

Neurowissenschaftlichen Gesellschaft NWG, 

der Gesellschaft für Genetik GfG, der 

Deutschen Gesellschaft für Proteomforschung 

DGPF, des Verbandes Deutscher Biologen 

vdbiol, der Deutschen Gesellschaft für 

Neurogenetik DGNG, des Vereins zur 

Förderung der Nutrigenomforschung, der 

Biotechnologischen Studenteninitiative e.V. (btS) 

sowie die Wissenschaftler des Nationalen 

Genomforschungsnetzes NGFN erhalten die 

Zeitschrift im Rahmen ihrer Mitgliedschaft. 

Für einen regelmäßigen Bezug von 

LABORWELT ist eine kostenlose Registrierung 

unter www.biocom.de oder per Fax (siehe Seite 

49) erforderlich. 

Namentlich gekennzeichnete Beiträge stehen 

in der inhaltlichen Verantwortung der Autoren. 

Alle Beiträge sind urheberrechtlich geschützt. 

Ohne schriftliche Genehmigung der BIOCOM 

AG darf kein Teil in irgendeiner Form reproduziert 

oder mit elektronischen Systemen verarbeitet, 

vervielfältigt oder verbreitet werden. 

© BIOCOM AG, Berlin 

® BIOCOM ist eine geschützte Marke der 

BIOCOM AG, Berlin 

BIOCOM ® AG 

T E R M I N E 

04.-05.08.03: Symposium „Integrative Bio- 

Informatik”, Bielefeld 

Info: Ralf Hofestäft, Universität Bielefeld, Technische Fakultät, 

AG Bioinformatik, Universitätsstrasse 25, D-33615 Bielefeld 

(Tel.: +49-(0)521-1065-283, bio-workshop@techfak.unibielefeld.de, 

http://cweb.uni-bielefeld.de/agbi/home/index.cw) 

24.08.-29.08.03: 11th European Congress on 

Biotechnology – Building Bridges between 

Biosciences and Bioengineering, Basel 

Info: ECB11, c/o AKM Congress Service, PO Box, Clarastrasse 

57, CH-4005 Basel, Switzerland (Tel.: +41-61-686-77-11, 

Fax: +41-61-686-77-88, info@akm.ch, www.ecb11.ch) 

25.-26.08.03: Partnering Day des Nationalen 

Genomforschungsnetzes (NGFN), Bonn 

Info: Projektmanagement NGFN, Projektträger im DLR, 

Pf. 240107, D-53154 Bonn (Tel.: +49-(0)228-3821-331, 

Fax: +49-(0)228-3821-332, eMail: pm-ngfn@dlr.de, 

Web: www.ngfn.de) 

02.-03.09.03: 2nd Proteome Forum, Rostock 

Info: Michael O. Glocker, Proteome Center, Universität Rostock, 

Joachim-Jungius-Str. 9, D-18059 Rostock 

(Tel./Fax: +49-(0)381-40-59-770 /-686, 

eMail: michael.glocker@med.uni-rostock.de, 

Web: www.pzr.uni-rostock.de/ProteomForum) 

03.-05.09.03: VAAM-Meeting „Molekularbiologie 

der Pilze”, Göttingen 

Info: Prof. Dr. Ursula Kües, Georg-August Universität 

Göttingen, Büsgenweg 2, D-37077 Göttingen 

(Tel.: +49-(0)551-397-024, Fax: +49-(0)551-397-705, 

eMail: pilztag@uni-goettingen.de, 

Web: www.pilztagung.uni-goettingen.de 

03.-05.09.03: 2nd International Conference 

„Cell-Based Assays”, Zürich 

03.-04.09.03: „Proteinase Inhibitors” – 2nd International 

Industry Conference, Zürich 

Info: Laura Beachus, IBC Life Sciences 

(Tel.: +44-(0)-1932-893-856, Fax: +44-(0)-1932-893-893, 

cust.serv@informa.com, www.ibc-lifesci.com/proteinase) 

04.-05.09.03: „Proteins: Targets, Tools and 

Therapeutics“-Symposium, Halle/Saale 

Info: Dr. Barbara Kampa, BioService Halle GmbH, Weinbergweg 

22, D-06120 Halle/Saale (Tel.: +49-(0)345-55-59-963, 

Fax: +49-(0)345-55-59-669, eMail: kampa@bioservicehalle.com, 

Web: www.bioservice-halle.com) 

07.-09.09.03: Functional Genomics „From 

Bacteria to Man”, Greifwald 

Info: Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald, Medizinische 

Fakultät – AG Funtionelle Genomforschung, Walther-Rathenau-Str. 

49A, D-17489 Greifswald (Tel.: +49-(0)3834-515-655, 

Fax: +49-(0)3834-515-656), www.functional-genomics.de) 

14.-17.09.03: Proteomic Forum, München 

Info: Prof. Dr. Angelika Görg, TU München, D-85350 Freising- 

Weihenstephan (Tel.: +49-(0)8161-714265, 

Fax: +49-(0)8161-714264, eMail: angelika.gorg@wzw.tum.de, 

Web: www.weihenstephan.de/blm/deg/Forum2003.htm 

16.-18.09.03: GVC/DECHEMA-Jahrestagungen 

2003, Mannheim 

Info: DECHEMA e.V., Theodor-Heuss-Allee 25, D- 60486 

Frankfurt (Tel.: +49-(0)69-7564-333, -129, Fax: +49-(0)69- 

7564--441, -176, eMail: tagungen@dechema.de, 

Web: www.dechema.de) 

17.-20.09.03: IDS-3 – 3rd International Dendrimer 

Symposium, Berlin 

Info: Barbara Feißt, DECHEMA e.V., Theodor-Heuss-Allee 25, 

D- 60486 Frankfurt (Tel.: +49-(0)69-7564-333, Fax: +49- 

(0)69-7564-441, eMail: info@ids-3.de, Web: www.ids-3.de) 

17.-18.09.03: Kooperationsforum „MedTech – 

Pharma – Biotech”, München 

Info: Thomas Feigl, Bayern Innovativ GmbH, Gewerbemueumsplatz 

2, D-90403 Nürnberg (Tel.: +49-(0)911-206-71-330, 

Fax: +49-(0)911-206-71-788, eMail: med@bayern- 

18.-19.09.03: Symposium des Nationalen 

Genomforschungsnetzes (NGFN) „Functional 

Genomics of Infectious Diseases and 

Inflammation”, Tübingen 

Info: Maike Gernhöfer, Institut für Med. Mikrobiologie und 

Krankenhaushygiene, Universitätsklinikum Tübingen, Elfriede- 

Aulhorn-Str. 6, D-72076 Tübingen (Tel.: +49-(0)7071-2982359, 

eMail: maike.gernhoefer@med.uni-tuebingen.de, 

Web: www.tuebingenome.de/symposium) 

18.09.03: 2. Internationaler Workshop „Scanning 

Probe Microscopy in Life Sciences”, Berlin 

Info: Zsuzsa Konczos, JPK Instruments AG, Bouchéstr. 12, 

D-12435 Berlin (Tel./Fax: +49-(0)30-5331-12073/ -1202, 

eMail: kpnczos@jpk.com, Web: www.spm-workshop.jpk.com) 

18.-20.09.03: Symposium „Structure and Function 

of Soil Microbiota”, Marburg/Lahn 

Info: Philipps-Universität Marburg, Department of Biology, 

Collaborative Research Centre 395 (SFB 395), Karl-von- 

Frisch-Strasse 8, D-35043 Marburg (Tel./Fax: +49-(0)6421- 

28-26811 /-26812, eMail: info@soilmicrobiota.de, 

Web: www.soilmicrobiota.de/) 

20.-04.09.03: ELSO 2003 & GBM-Tagung, Dresden 

Info: ELSO Office, Ingeborg Fatscher, P.O. Box 1151, D-69199 

Sandhausen (Tel.: +49-(0)6224-925-613, Fax: +49-(0)6224- 

925-610, -11, -12, eMail: contact@elso.org, 

Web: www.labhoo.com/elso/ELSO.asp) 

22.-23.09.03: Workshop und Fortbildungslehrgang 

„Gentechnische Sicherheit”, Hannover 

Info: Stefan Gerstel, Medizinische Hochschule Hannover 

(Tel.: +49-(0)511-532-5696, Fax: +49-(0)511-532-8580, 

email: Gerstel.Stefan@mh-hannover, Web: www.mhhannover.de/vorstand/biologsicherheit/seite2.htm) 

22.-23.09.03: Seminar „Entwicklung und 

Optimierung von HPLC”, Saarbrücken 

Info: Dr. Klinkner & Partner GmbH, IT Park Saarland, Geb. C1, 

Altenkesseler Straße 17, D-66115 Saarbrücken 

(Tel.: +49-(0)681-97-62-23-0, Fax: +49-(0)681-97-62-23-5, 

eMail: info@klinkner.de, Web: www.klinkner.de) 

24.-25.09.03: Conference „Drug Discovery 

Informatics 2003”, Mainz 

Info: Worldwide Business Research (Tel.: +44-20-7368-9400, 

eMail: drugdiscoveryinformatics@wbr.co.uk, 

Web: www.wbresearch.com/drugdiscovery/) 

25.09.-04.10.03: EMBO Practical Course „Modern 

Methods in Cell Biology”, Heidelberg, Germany 

Info: Course & Conference Office, European Molecular Biology 

Laboratory (EMBL), Meyerhofstr. 1, D-69117 Heidelberg 

(eMail: courses@embl-heidelberg.de) 

29.09.-02.10.03: NanoBioTec 2003, Forum 

„Nanobiotechnology meets Industry”, Münster 

Info: Maria Jaklin,CeNTech GmbH, Mendelstr. 11, D-48149 

Münster: (Tel: +49-(0)251-9801860, Fax: +49-(0)251- 

9801861, eMail: office@nanobiotec.de, 

Web: www.nanobiotec.de) 

05.-08.10.03: European Conference on 

Prokaryotic Genomes, Göttingen 

Info: Heike Geiling, DECHEMA e.V., Theodor-Heuss-Allee 25, 

D-60481 Frankfurt a.M. (Tel.: +49-(0)69-7564-280, 

Fax: +49-(0)69-7564-176, eMail: geiling@dechema.de, 

Web: www.dechema.de/prokagen) 

07.-09.10.03: BIOTECHNICA 2003, Hannover 

Info: Oliver Wedekind, Deutsche Messe AG, Messegelände, 

D- 30521 Hannover (Tel.: +49-(0)511-89-32128, 

Fax: +49-(0)511-89-31218, eMail: info@messe.de, 

Web: www.biotechnica.de) 

07.10.03: 2nd artus PCR-Symposium, Hamburg 

Info: Rebecca Bigott, artus GmbH, Königstraße 4a, D-22767 

Hamburg (Tel.: +49-(0)40-41-364-763, Fax: +49-(0)40-41- 

364-720, eMail: bigott@artus-biotech.de, Web: www.artusbiotech.de/) 

innovativ.de, Web: www.bayern-innovativ.de/med2003)) Kennziffer 35 LW 04 · www.biocom.de �

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