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W I S S E N S C H A F T Abb. 2: Immunfluoreszenz-zytochemische Bestätigung der Identität Schwannscher Zellen nach MACSp75LNGFr-Aufreinigung. (A) Zellen der p75LNGFr-positiven Fraktion nach der MACS- Separation exprimieren 27C7, einen für Schwannsche Zellen spezifischen Marker (grün). (B) Diese Zellen exprimieren gleichzeitig p75LNGFr (rot). (C) Die Überlagerung von A und B bestätigt, daß p75lNGFr- und 27C7-exprimierende Schwannsche Zellen identisch sind (Kerngegenfärbung mit Hoechst 33342, blau). Die Skalierung entspricht 100 µm. (Abbildung mit freundlicher Genehmigung von Elsevier, aus J. NEUROSCI. ME- THODS Vol.124, Vroemen et al., Purification of Schwann cells by..., S.135-143, © 2003). phologie Schwannscher Zellen in Kultur aufweisen. Die nicht adsorbierte Fraktion (p75LNGFr-negativ) enthält Zellen, welche den morphologischen Kriterien für Fibroblasten in Kultur entsprechen. Dies wird bestätigt durch immunzytochemische Untersuchen mit Markern, die für Schwannsche Zellen spezifisch sind (Abb. 2). Bei der Durchflußzytometrie wird der Anteil Schwannscher Zellen indirekt über das Vorhandensein Thy-1-exprimierender Fibroblasten berechnet. Thy-1 wird selektiv auf Fibroblasten, nicht jedoch auf Schwannschen Zellen exprimiert. Hierbei läßt sich zeigen, daß mit der MACS-Separation p75LNGFr-exprimierender Zellen zu 95 % reine Schwannsche Zellkulturen etabliert werden können – nach nur einem Durchlauf der MACS-Separation (Abb. 3). Darüber hinaus kann eine hohe Sensitivität der Isolierungsmethode nachgewiesen werden. Bestimmt man durch- flußzytometrisch den Anteil Schwannscher Zellen vor der MACS-Zellseparation und korreliert dies mit der Anzahl tatsächlich erhaltener Schwannscher Zellen nach der MACS- Zellseparation, so werden durchschnittlich 91 % aller in Biopsien peripherer Nervenfragmente initial vorhandener Schwannscher Zellen nach MACS-Zellseparation für die weitere Expansion in Zellkultur gewonnen. Stimuliert man die Proliferation derart isolierter Schwannscher Zellen mit üblichen Methoden (Zugabe von Forskolin, Hypophysenextrakt), lassen sich Schwannsche Zellen über mindestens vier Passagen expandieren, ohne daß eine Überwucherung durch Fibroblasten beobachtet wird. Fazit Unsere Ergebnisse zeigen, daß sich mittels MACS-Zellseparation p75LNGFr-exprimie- Abb. 3: Durchflußzytometrische Analyse der Zellsuspensionen vor und nach MACS-p75LNGFr-Separation. Die Dot-Plots wurden durch die durchflußzytometrische Analyse Thy-1-exprimierender Zellen (Fibroblasten) generiert. Die mit R2 gekennzeichneten Rechtecke enthalten jeweils die Thy-1-positiven Zellen. (A) Noch nicht aufgereinigte Zellen sind zu fast gleichen Anteilen Thy-1 positiv oder negativ. (B) Der überwiegende Anteil der MACS p75LNGFr positiven Fraktion ist Thy-1 negativ. Aus der Tatsache, daß sich außer Schwann’schen Zellen und Fibroblasten keine nennenswerten alternativen Zellpopulationen in peripheren Nervenbiopsien befinden, ergibt sich, daß die Thy-1-negative Fraktion in der Durchflußzytometrie dem Anteil Schwann’scher Zellen entspricht. (C) Die MACS-p75LNGFr-negative Fraktion ist fast ausnahmslos Thy-1 positiv. (Abbildung mit freundlicher Genehmigung von Elsevier, modifiziert aus J. NEUROSCI. METHODS Vol.124, Vroemen et al., Purification of Schwann cells by..., S.135- render Zellen eine effiziente und schnelle Isolierung adulter Schwannscher Zellen aus peripheren Nervenfragmenten erzielen läßt. Zellschädigende Nebenwirkungen, wie sie durch den Einsatz zytotoxischer Substanzen zur Eliminierung sich rasch teilender Fibroblasten zu befürchten sind, entfallen bei diesem Ansatz der Zellaufreinigung. Bei der geringen Größe und der Biodegradierbarkeit werden die Microbeads im Rahmen des physiologisch stattfindenden Membran-Turnovers der Zellen entfernt, ohne die Funktion der Zelle in irgendeiner Weise zu beeinträchtigen 11 . Die klinische Anwendung autologer Schwannscher Zellen als etablierter Transplantationsansatz zur Förderung der axonalen Regeneration im peripheren Nervensystem ist derzeit noch beschränkt. Transplantate autologer Schwannscher Zellen werden bereits im Rahmen einer klinischen Phase-I-Studie (Dr. Timothy Vollmer und Marco Rizzo, Yale University, USA) mit dem Ziel der Remyelinisierung bei Patienten mit Multiple Sklerose untersucht. Sollte die Aufreinigung p75LNGFr-exprimierender Schwannscher Zellen mittels MACS auf humanes Nervengewebe übertragbar sein, stellt sie eine vielversprechende Methode zur Gewinnung autologer Schwannscher Zellen dar. Literatur [1] Guenard, V., Kleitman, N., Morrissey, T.K., Bunge, R.P. and Aebischer, P., J Neurosci 12 (1992), 3310-20. [2] Rodriguez, F.J., Verdu, E., Ceballos, D. and Navarro, X., Exp Neurol 161 (2000), 571-84. [3] Weidner, N., Blesch, A., Grill, R.J. and Tuszynski, M.H., J Comp Neurol 413 (1999), 495-506. [4] Stangel, M. and Hartung, H.P., Prog Neurobiol 68 (2002), 361-76. [5] Bunge, M.B., Prog Brain Res 137 (2002), 275-82. [6] Zochodne, D.W., Muscle Nerve Suppl 9 (2000), S33-8. [7] Morrissey, T.K., Bunge, R.P. and Kleitman, N., J Neurobiol 28 (1995), 171- 89. [8] Verdu, E., Rodriguez, F.J., Gudino-Cabrera, G., Nieto-Sampedro, M. and Navarro, X., J Neurosci Methods 99 (2000), 111-7. [9] Calderon-Martinez, D., Garavito, Z., Spinel, C. and Hurtado, H., J Neurosci Methods 114 (2002), 1-8. [10] Miltenyi, S., Muller, W., Weichel, W. and Radbruch, A., Cytometry 11 (1990), 231-8. [11] Manyonda, I.T., Soltys, A.J. and Hay, F.C., J Immunol Methods 149 (1992), 1-10. Korrespondenzadresse Dr. med. Norbert Weidner Klinik und Poliklinik für Neurologie Universitätsklinik Regensburg Universitätsstr. 84 D-93053 Regensburg Tel: +49-(0)941-941-3310 Fax: +49-(0)941-941-3005 eMail: norbert.weidner@klinik.uniregensburg.de 143, © 2003). Kennziffer 15 LW 04 · www.biocom.de � 10 | 4. Jahrgang | Nr. 4/2003 LABORWELT
B L I T Z L I C H T Bioseparation � Dielektrophoretische Trennung biologischer Mikro- und Nanopartikel Thomas Schnelle, Torsten Müller, Gabriele Gradl, Evotec Technologies GmbH, Hamburg Martin Stelzle, Jörg Kentsch, NMI an der Universität Tübingen, Reutlingen Angelika Haage, Andrea Normann, Mediagnost GmbH, Reutlingen Peter Geggier, Magnus Jäger, Fraunhofer-Institut für Biomedizinische Technik, St. Ingbert Für die Analyse sehr kleiner biologischer Partikel wie Viren und Bakterien steht oft nur ein indirekter Nachweis, wie etwa eine PCR-Reaktion oder ein ELISA-Test, zur Verfügung. Für einen direkten Nachweis der Partikel ist es meist erforderlich, diese in einer Probe komplexer Zusammensetzung aufzukonzenrieren oder abzuseparieren. Zu diesem Zweck wird das NanoVirDetect-System derzeit gemeinsam von den Unternehmen Evotec Technologies, Mediagnost, dem Fraunhofer-Institut für Biomedizinische Technik (IBMT) und dem Naturwissenschaftlichen und Medizinischen Institut (NMI) als vielseitige Technologieplattform zur Separation, Akkumulation und optischen Analyse komplexer Proben mit Partikeln im sub- Mikrometer-Bereich entwickelt. Das hier vorgestellte neue Verfahren basiert auf dem physikalische Prinzip der Dielektrophorese. Elektroden in Mikrokanälen erzeugen dabei hochfrequente elektrische Felder, die wiederum in Partikeln der Probensuspension Dipolmomente und entsprechende, sogenannte dielektrophoretische Kräfte hervorrufen (Abb.1). Dielektrophorese Zusammen mit ebenfalls wirkenden hydrodynamischen Reibungskräften ermöglicht dies das Sortieren von Partikeln bezüglich ihrer Größe und dielektrischen Eigenschaften 1-2 . Während dielektrophoretische Kräfte proportional zur dritten Potenz des Radius zunehmen, variieren Reibungskräfte nur linear mit dem Radius. Da Frequenz und Amplitude des Feldes extern einstellbar sind, kann das System auf einfache Weise an eine bestimmte Trennaufgabe angepaßt werden 3 . Separation (Abb. 2), Akkumulation sowie das kontrollierte Einfangen einzelner Teilchen oder Partikelagglomerate durch dielektrophoretische Kräfte wurden bereits erfolgreich an Antikörper-beladenen Mikro- und Nano-Beads und Hepatitis-A-Viren erprobt. Im Gegensatz zu konventionellen Filterverfahren benötigt ein dielektrophoretisches Anreicherungssystem keine Poren und kann folglich weder verstopfen, noch sind Spülintervalle erforderlich, so daß ein solches System kontinuierlich betrieben werden kann. Es ist daher auch für homogene Nachweisreaktionen geeignet, das heißt, ein verwendeter Analyt wie etwa ein fluoreszenzmarkierter Antikörper muß nicht entfernt werden. Während bei einer Auftrennung partikelhaltiger Proben mit Hilfe der Free Flow- Elektrophorese (FFE, siehe LABORWELT 3/ 2003) die Verdünnung der Probe nahezu un- Aufsicht Abb.1: Schematische Darstellung des Funktionsprinzips eines dielektrophoretischen Partikelfilters auf der Basis der Dielektrophorese in fluidischen Mikrosystemen. Ein Elektrodenpaar an Ober- bzw. Unterseite eines Kanals erzeugt ein inhomogenes elektrisches Feld, das Partikel in der Probensuspension polarisiert und entsprechende (hier abstoßend wirkende) dielektrophoretische Kräfte hervorruft. Zusammen mit ebenfalls wirksamen hydrodynamischen Reibungskräften ermöglicht dies eine Trennung nach Größe und dielektrischen Eigenschaften der Partikel. Hauptkanal Flußrichtung aktive Deflektorelektrode Abb. 2: Eine dielektrophoretische Filterstruktur in Aktion – die Abbildung zeigt einen Kanal mit darin eingebrachten Elektroden (nur die an der Kanaloberseite angebrachten Elektroden sind in dieser Aufsicht erkennbar). Eine Suspension mit Partikeln von 1 µm bzw. 0,5 µm Durchmesser wird von links nach rechts durch den Kanal gepumpt. Während die größeren Partikel eine ausreichend große abstoßende dielektrophoretische Kraft erfahren, um nach rechts unten in einen Seitenkanal abgelenkt zu werden, überwiegt für die kleineren Partikel die hydrodynamische Reibungskraft des vorbeiströmenden Mediums die dielektrophoretische Kraft, so daß diese Partikel die dielektrophoretische Barriere durchdringen können. vermeidbar ist, ermöglicht NanoVirDetect demgegenüber sogar eine Aufkonzentrierung der gewünschten Partikel in ein extrem kleines Flüssigkeitsvolumen von wenigen Picolitern. Dieses kann entweder direkt im Chip, zum Beispiel durch optische Detektionsverfahren wie die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS), analysiert oder über spezielle Fluidikports kontrolliert nach außen abgegeben werden. Das System ermöglicht die Verarbeitung kleinster Probenmengen von wenigen Mikrolitern. Ein essentieller Vorteil ist die Kombinierbarkeit mit hochsensitiven Analysetechniken wie der Einzelmolekülspektroskopie und der Impedanzmessung. Dies eröffnet neue Wege für den direkten Nachweis von Nanopartikeln. Darüber hinaus handelt es sich um ein geschlossenes Kompartiment, was insbesondere bei der Verarbeitung infektiöser Proben von großem Vorteil ist. Prototyp-Entwicklung Seitenkanal Abbildung 3 zeigt einen funktionsfähigen Prototypen des NanoVirDetect Systems (A). Deflektorarrays dienen zur Separation von Partikeln bestimmter Größe in einen Seitenkanal (B). Dielektrophoretische Trichterstrukturen (C) fokussieren Partikel in die Kanal- 12 | 4. Jahrgang | Nr. 4/2003 LABORWELT Fluid Port 1mm 0,5µm Partikel 1µm Partikel 20µm
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