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Abb. 2: Aktivität rekombinanter Metagenom-LIL ® s gegen B. subtilis. Verschiedene Extrakte aus Transformanden wurden auf einer mit B. subtilis überschichteten Agarplatte aufgetragen. Antimikrobielle Aktivität gegen den Teststamm ist als Hemmhof um die Auftragsstelle erkennbar. banken (ABEL ® ) auf der Basis von Plasmidoder Cosmidvektoren in E.coli eingesetzt. Externe, induzierbare Promotoren für die Genexpression ermöglichen es, diese Banken in speziell entwickelten Assays auf spezifische Enyzme hin zu testen 5 . Niedermolekulare antimikrobielle Substanzen werden in Bakterien oft von einer Vielzahl von Proteinen synthetisiert, modifiziert und exportiert. Die für sie codierenden Gene sind in der Regel in Operons oder großen Genclustern gruppiert, die meist auch Gene für regulatorische Proteine und Enzyme enthalten, die den produzierenden Organismus resistent gegen den eigenen Wirkstoff macht. Abhängig von der Zahl beziehungsweise Größe der an der Synthese beteiligten Enzyme oder Enzymkomplexe variiert die Länge der Gencluster zwischen 10 und >100 kbp (Tab. 1). Um das Synthese- Potential einer Population funktionell zu erfassen, müssen daher große genomische Fragmente kloniert werden, um vollständige Stoffwechselwege rekombinant darzustellen. Zusammen mit der Arbeitsgruppe von Dr. Christa Schleper, TU Darmstadt, hat BRAIN Ver- Abb. 3: Enzymatische Aktivität rekombinanter E. coli-Klone aus Metagenom-Banken. Zum Nachweis von Oxidasen wurden Metagenomklone auf Agarplatten mit Indol ausplattiert. Positive Klone, die im Assay Indigo bilden, werden – wie abgebildet – im Einzelausstrich verifiziert. B L I T Z L I C H T fahren entwickelt, mit denen auch aus schwer zu handhabenden Proben wie huminsäurehaltigen Böden Metagenom-Fragmente von bis zu 600 kbp isoliert und kloniert werden können (Abb. 1) 6 . In Verbindung mit BAC-/ PAC-Vektoren entsprechender Kapazität - also ‚artifiziellen Chromosomen‘ wie pBeloBAC11 7 - werden LIL ® s erstellt, die mit Inserts von bis zu 300 kb selbst die bislang größten bekannten Gencluster vollständig abbilden können. Screening nach neuen Wirkstoffen Die Diversität und damit das Wirkstoffpotential von Metagenom- LILs belegt beispielhaft das Screening mit PCR-Primern, die konservierte Bereiche nicht-ribosomaler Peptid (NRP)-Synthasen in Genclustern targetieren. Sie zeigten bei einem Stichprobenumfang von 30 sequenzieten Genabschnitten 30 neue und bislang unbekannte NRP-Synthase-Sequenzen. Über die sequenz-homologe Identifizierung von Genclustern etabliert und charakterisiert BRAIN umfangreiche Banken von LIL ® - Klonen, um Naturstoffe rekombinant darzustellen und über kombinatorische Biosynthese zu derivatisieren. Primäre Metagenom- Tab. 1: Charakteristika einiger mikrobieller Wirkstoffe Wirkstoff Naturstoffklasse Wirkstoffproduzent Größe des Genclusters (kb) Puromycin Aminonukleosid Streptomyces alboniger 13 Tetrazyklin aromatisches Polyketid Streptomyces aureofaciens 30 Erythromycin Makrolid Saccharopolyspora erythraea 55 Bleomycin Glycopeptid Streptomyces verticillus 80 Rapamycin Makrolid Streptomyces hydroscopicus 110 LIL ® s bilden ferner die Basis für das aktivitäts-basierte Screening nach rekombinanten Naturstoffen, die durch Produkte unbekannter Gencluster synthetisiert werden. Obwohl E. coli kleinere Gencluster heterolog exprimiert (Abb. 2), ist dieser Wirt aufgrund der 4‘-Phosphopantothenylierung von Apo-Acyl-/Peptidyl-Carrier-Proteinen oder -Domänen zur Synthese neuer Substanzen aus dem Metagenom weniger geeignet. Daher werden vor allem Streptomyces oder Pseudomonas als Produzenten eingesetzt. Sie verfügen über einen ausgeprägten Sekundärmetabolismus und so über die nötige biosynthetische Ausstattung, um Apo-Enzyme zu prozessieren, Grundbausteine für die Synthese rekombinanter Naturstoffe bereitzustellen und Produkte zu exportieren. Proprietäre, flexible Shuttle-Vektoren, die wirtsspezifische Flip-Kassetten enthalten, ermöglichen die Erstellung von Metagenom- LIL ® s, die in unterschiedlichen Systemen exprimiert werden können. Screening nach Enzymen Beim Screening von Metagenom-Banken nach neuartigen Biokatalysatoren werden die gleichen sequenz- und aktivitätsbasierten Strategien verwendet wie bei der Suche nach nie- dermolekularen Wirkstoffen. Abgesehen von großen Enzymkomplexen, die sich nur über die Expression von LIL ® s darstellen lassen, können Enzyme auch über ABEL ® s exprimiert werden (Abb. 3). In einem von der Deutschen Bundesstiftung Umwelt geförderten Projekt sucht BRAIN in Kooperation mit Prof. Dr. Uwe Bornscheuer, Universität Greifswald, und Dr. Christa Schleper, TU Darmstadt, in Metagenom-Banken aus Boden neue Esterasen und Lipasen. Die etwa 50 derzeit erhältlichen Enzyme dieser Klassen genügen in Bezug auf Substratspezifität, Enantioselektivität oder pH-Stabilität nicht immer den Anforderungen spezifischer Produktionsprozesse. In speziell entwickelten aktivitätsbasierten Hochdurchsatz-Testverfahren wird deshalb nach Esterasen und Lipasen mit neuen Eigenschaften und Aktivitätsprofilen für den Einsatz in der Fein- und Spezialchemie gesucht. Ausblick Die Metagenomik, mit deren Hilfe grundlegende Fragen der Evolution, Ökologie und Physiologie von unkultivierten Mikroorganismen geklärt werden sollten, hat sich inzwischen auch als fruchtbares anwendungsbezogenes Arbeitsgebiet etabliert. Mit den neuen Technologien, die das Metagenom zugänglich machen, eröffnet sich eine neue Quelle für Enzyme und neue Wirkstoffe. Die umfangreichen neuen Ressourcen, die sie zugänglich macht, bieten neue Möglichkeiten zur Entwicklung umweltfreundlicher Herstellungsverfahren und wirkungsvoller medizinischer Therapien. Literatur [1] Torsvik, V., Goksyr, J., Soil Biol. Biochem. 10 (1978), 7-12 [2] Handelsman, J., Rondon, M. R., Brady, S. F., Clardy, J. and Goodman, R. M., Chem. Biol. 5: (1998), R245-249 [3] Cragg, G. M., Newman, D. J. and Snader, K. M. (1997): Natural products in drug discovery and development. J. Nat. Prod. 60: 52-60 [4] Amann, R. I., Ludwig, W. and Schleifer, K. H., Microbiol. Rev. 59 (1995), 143-169 [5] Lorenz, P., Liebeton, K., Niehaus, F., Schleper, C., Eck, J., J. Biocatal. Biotransform 21 (2003), 87-91 [6] Quaiser, A. et al., Environ. MIcrobiol. 4 (2002), 603-611 [7] Shizuya, H. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 8794-8797 Korrespondenzadresse Dr. Guido Meurer, BRAIN AG Darmstädter Str. 34, D-64673 Zwingenberg Tel./Fax: +49-(0)6251-9331-29 / -11 eMail: gm@brain-biotech.de www.brain-biotech.de 34 | 4. Jahrgang | Nr. 4/2003 LABORWELT
B L I T Z L I C H T Protein-Separation � 2D-Gelelektrophorese in den Proteomics: ZOOM IPGRunner Karsten Wilking, Invitrogen GmbH, Karlsruhe Die zweidimensionale (2D) Gelelektrophorese nutzt zwei voneinander unabhängige Eigenschaften von Proteinen zur hochauflösenden Fraktionierung eines Proteingemisches: die Ladung und das Molekulargewicht. In der ersten Dimension werden Proteine durch isoelektrische Fokussierung (IEF) nach ihrer Ladung aufgetrennt, in der zweiten Dimension mit Hilfe der SDS-PAGE nach ihrer Masse. Die 2D-Gelelektrophorese ist kosten-, zeit- und arbeitsintensiv. Beim neuen ZOOM ® IPGRunner-System handelt es sich dagegen um eine einfache und schnelle Methode zur isoelektrischen Fokussierung in der ersten Dimension, die zudem kein Mineralöl mehr benötigt. Die elektrophoretische Auftrennung der Proteine, die in der ersten Dimension auf sieben Zentimeter langen Strips mit immobilisiertem pH- Gradienten und in der zweiten Dimension in NuPAGE ® Novex 4 bis 12 % Bis-Tris ZOOM ® -Gelen stattfindet, dauert statt bislang 24 nur noch maximal fünf Stunden. Key Words: 2D-Gelelektrophorese, Proteine-Auftrennung, IEF, SDS-PAGE Die zweidimensionale (2D) Gelelektrophorese gilt inzwischen als ‚goldener Standard‘ zur Auftrennung von Proteingemischen. Durch ihre hohe Auflösung ermöglicht sie die Analyse signifikanter Unterschiede in der Zusammensetzung biologischer Proben. In der Praxis wird die 2D-Gelelektrophorese in der klinischen Diagnostik eingesetzt, bei der Identifizierung neuer Wirkstoff-Targets und der Analyse umweltbedingter und arzneimittelbedingter Toxizitäten. In Kombination mit der Massenspektrometrie gilt sie außerdem inzwischen als Kerntechnologie in der Proteomforschung. Die 2D-Gelelektrophorese basiert darauf, dass ein komplexes Proteingemisch Bestandteile unterschiedlicher Ladung und Masse enthält. Aufgrund dieser Eigenschaften können die einzelnen Komponenten in der ersten Dimension durch isoelektrische Fokussierung nach Ladung und in der zweiten Dimension durch SDS-PAGE nach Masse aufgetrennt werden. Zu sehen sind diese Unterschiede in Form von unterschiedlichen elektrophoretischen Mobilitäten. Bisher benötig- te man für eine 2D-Gelelektrophorese teure und Spezialgeräte, die viel Platz einnehmen. Zuverlässige Ergebnisse erforderten einen erheblichen Zeitaufwand sowie ein hohes Maß an Erfahrung. Beschleunigte IEF-Auftrennung Bei dem neuen ZOOM ® IPGRunner-System handelt es sich um ein neuartiges Verfahren, das den Vorgang der zweidimensionalen Auftrennung wesentlich vereinfacht und beschleunigt. Die isoelektrische Fokussierung erfolgt auf sieben Zentimeter langen Strips. Diese sind mit linearen Gradienten für pH = 4,5–5,5; 5,3–6,3 und 6,1–7,1 erhältlich und decken damit die pH-Bereiche ab, in denen die meisten Proteine detektiert werden können. Außerdem lassen sich Proteingemische mit den neuen Streifen mit einer höheren Auflösung in einem engen, ausgewählten pH-Bereich darstellen. Dies erhöht die Chance, geringe Mengen eines Proteins in komplexen Gemischen nachzuweisen, auch bei hohen Proteinkonzentrationen. Tab. 1: Volumeneinsparung der benötigten Reagenzien beim ZOOM ® IPGRunner-Verfahren im Vergleich zur Standardmethode 1 Puffer/Reagenz Benötigte Volumina ZOOM IPG Standardverfahren 2D-Gele Probenvolumen/Ladepuffervolumen 38 µl/117 µl 38 µl/361 µl Mineralöl 0 ml 1,8 ml Reduktionspuffer 10 ml 20 ml Alkylierungspuffer 5 ml 10 ml SDS-PAGE-Laufpuffer 450 ml 1,4 l Fixieren/Färben/Entfärben ca. 300 ml ca. 1 l Die Auftrennung in der zweiten Dimension erfolgt auf kleinen (8 cm x 8 cm), aber gleichzeitig hochauflösenden NuPAGE-Gelen. Mit einer speziell hierfür entwickelten Minizelle, dem IPGRunner, können die Fokussierung und die Elektrophorese in einer einzigen vertikalen Einheit erfolgen. Diese vereinfachte Anordnung spart Platz und Zeit. Diese neue 2D-Gelelektrophorese wird beispielsweise verwendet, um Rattenleberextrakte und E. coli-Lysate aufzutrennen: Die Rehydrierung der Strips erfolgt dazu direkt in der Kassette, die bis zu sechs IPG-Strips aufnehmen kann. Die Proben werden zusammen mit Rehydrierungspuffer (2 M Thio-Harnstoff, 7 M Harnstoff, 0,5 % ZOOM ® -Trägerampholyte, 2,0 % CHAPS, 20 mM DTT) direkt in das dafür vorgesehene Fenster der Kassette pipettiert und die Strips daraufhin in die dafür vorgesehenen Taschen eingeführt. Während der Rehydrierung werden die Probenvertiefungen mit Abdeckfolie verschlossen, um eine luftdichte Umgebung zu schaffen, und die Rehydrierung erfolgt wie beim konventionellen Verfahren im Lauf von 8 bis 16 Stunden bei Raumtemperatur. Danach wird die Folie abgezogen und die Pipettieröffnungen werden entfernt. An jedes Ende der IPGRunner-Kassette wird ein Elektrodensaugdocht platziert, der mit 750 µl entionisiertem Wasser befeuchtet wird. Die Kassetten und der Puffertank werden nun zusammengebaut und in die Minizelle eingesetzt, in der später auch die SDS-PAGE stattfindet. Die äußere Kammer der Minizelle wird mit Wasser befüllt. Die Dauer der isoelektrischen Fokussierung beträgt 1,5 Stunden verglichen mit bis zu 24 Stunden zur Fokussierung von Proteinen bei konventionellen Systemen mit Ölimmersion. Die Effizienz dieses elektrischen Systems erlaubt eine vollständige Fokussierung bei einer Spannung von höchstens 2.000 Volt. 2. Dimension mit NuPAGE-Gelen Die Elektrophorese in der zweiten Dimension wird unter Verwendung von NuPAGE ® - Gelen durchgeführt. Die erforderliche Äquilibrierung der Strips erfolgt mit NuPAGE ® - LDS-Probenpuffer in Gegenwart von Reduktions- und Alkylierungsmitteln. Die Strips mit den in der IEF aufgetrennten Proben werden dazu 15 Minuten lang in 5 ml Probenpuffer mit 50 mM DTT inkubiert, gefolgt von einer 15-minütigen Inkubation in Probenpuffer mit 125 mM Iodacetamid. Die Dauer der Reduktions- und Alkylierungsschritte verkürzt sich auf die Hälfte und es ist nur etwa halb so viel Puffer erforderlich wie bei herkömmlichen Verfahren (Tab. 1). Die Proteine auf den IPG-Strips werden mit NuPAGE-Gelen aufgetrennt. Dazu wird je ein IPG-Strip nach der Reduktion und Äquilibrierung einzeln der Länge nach in die Vertiefung eines Gels eingesetzt und diese mit 36 | 4. Jahrgang | Nr. 4/2003 LABORWELT
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