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Abb. 3: Genomische DNAs aus (v.l.n.r.) Tomatenblättern
(100 mg), Hefe (Saccharomyces, 1 ml),
Zellkultur (Affennieren, 10 7 Zellen), Blut (human,
100 µl), Lunge (Ratte, 150 mg), Phage Lambda
(2,5 ml, 8 x 10 11 /ml), Waldboden (0,5 g). M: Marker
Abb. 4 : Isolierung von pUC13-DNA aus 10 ml E.
coli SF8-Kulturen. Aufgetragen wurden gleiche
proportionale Volumina der Präparationen.
M: Marker; 1: ‚PrestoSpin D Plasmid Mini Spin‘-
Säulen-Kit, Eluat; 2: Säulendurchlauf; 3: Gesamt-
Plasmid-DNA im Rohlysat; 4: Plasmid-DNA mit
einem gravitationsgetriebenen Durchfluß-Säulen-Kit
(Anionenaustauscher) eines anderen Anbieters
gereinigt.
mM) von multivalenten Kationen, etwa
Mg 2+ , an negativ geladene Oberflächen. Untersuchungsergebnisse
weisen darauf hin,
daß die Mg 2+ -Komplexierung für die stabile
Bindung der negativ geladenenen Nukleinsäuren
an negativ geladene Oberflächen verantwortlich
ist 2 . Der Komplex wird aufgelöst,
wenn komplexierende Agenzien wie
EDTA die Mg 2+ -Ionen entfernen. Als Folge
gehen gebundene Nukleinsäuren in Lösung.
In den ‚PrestoSpin D‘-Kits von Molzym (zu
beziehen über Omnilab Life Science,
www.ols-biotech.de) laufen alle durch verschiedene
Verfahren erhaltene Zellysate
durch dasselbe Reinigungsverfahren nach
obigem Muster (Abb. 2).
Tonminerale als
Nukleinsäure-Bindematrix
Bindematrix für die ‚PrestoSpin D‘-Kits sind
Tonminerale. Sie zeichnen sich in Verbindung
mit dem Bindemechanismus der Kationen-Komplexierung
durch eine hohe Bindekapazität
von mehr als 28 µg/mg aus.
‚PrestoSpin D‘-Spin-Säulen bestehen aus einem
Gemisch aus hochgereinigtem Sand
und Ton. Die Nukleinsäure-Bindekapazität
der Säulen ist mit mehr als 80 µg eine der
bisher höchsten im Mini Spin-Säulenformat.
Die hohe Porosität der Säulenmatrix erlaubt
B L I T Z L I C H T
eine einfache Reinigung von Gesamt-Nukleinsäuren
oder DNA auch aus stark viskosen
Lösungen. So können größere Mengen an
Ausgangsmaterial in den Nukleinsäure-Reinigungsvorgang
eingehen.
Reinigung genomischer DNA
Die ‚PrestoSpin D‘-Kits erlauben die Reinigung
von Gesamt-Nukleinsäuren (Presto-
Spin D-Universal-Kit) beziehungsweise
DNA aus einer Vielzahl von Organismen
und Materialien (Abb. 3). Mit dem Presto-
Spin D-Universal-Kit kann sowohl genomische
DNA aus einer Vielzahl von biologischen
Materialien – unter anderem Bakteriophagen,
Bakterien, Hefen, Pilzen, tierischen
und pflanzlichen Geweben, Zellkulturen,
Blut, Böden und Sedimenten (Abb. 3)
– als auch Plasmid-DNA im Mini- und Midi-
Format gereinigt werden. Die Ausbeuten betragen,
je nach Ausgangsmaterial, bis zu 80
µg genomische DNA und 50 µg Plasmid-
DNA. Die Präparation hochreiner DNA aus
Zellysaten beträgt nur 10 bis 25 Minuten.
Die Lysisprotokolle sind darauf ausgelegt,
bei der Zelldesintegration freiwerdende Nukleinsäuren
effizient vor dem Verdau endogener
Nukleasen zu schützen. Dies wird
durch den Einsatz von hochchaotropem Guanidinhydrochlorid
erreicht. Nach einem vereinheitlichten
Protokoll werden Lysate auf
eine Spin-Säule gegeben, wo die DNA-Bindung
durch die Kationen-Komplexierung
erfolgt. Nieder- und hochmolekulare Verunreinigungen
(unter anderem Proteine, Polysaccharide,
Nukleotide, Aminosäuren, Salze)
werden mit einem speziellen alkoholhaltigen
Puffer durch kurze Zentrifugation ausgewaschen.
In einem zweiten Waschschritt mit 70%
Ethanol erfolgt die Beseitigung von Salzen,
wonach die reine DNA mit üblichem TE-Puffer
eluiert wird (10 mM Tris, 1 mM EDTA).
Optional kann RNA durch kurzzeitige Inkubation
mit RNase A in der Säule vor den
Waschschritten degradiert werden. Für jedes
der oben genannten biologischen Materialien
gibt es zudem je ein Spezialkit zur Isolierung
genomischer beziehungsweise von Plasmid-DNA.
Reinigung von Plasmid-DNA
Die Architektur und die hohe Bindekapazität
der Ton-Sand-Matrix in den ‚Mini Spin‘-
Säulen hat die Entwicklung eines Reinigungs-Kits
ermöglicht, mit dem Plasmid-
DNA im Midi-Maßstab (bis 50 µg) isoliert
werden kann (Abb. 4). ‚High copy‘-Plasmid-
Vektoren können aus 10 bis 20 ml Kulturen
in einem Verfahren gereinigt werden, das gegenüber
den ansonsten in diesem Maßstab
üblichen gravitationsgetriebenen Durchfluß-Säulen
(Anionenaustauscher) deutlich
schneller ist (etwa 45 Minuten gegenüber
mehr als 2 Stunden). Das Verfahren ist sehr
schonend, so daß die Plasmid-DNA fast aus-
schließlich in der Supercoil-Konformation
isoliert wird. Mit dem ‚PrestoSpin D Plasmid
Mini Spin‘-Säulen-Kit besteht weiterhin
die Option, Aufreinigungen aus bis zu 100
ml Kulturvolumen durchzuführen. Dies erlaubt
die Reinigung von ‚low copy‘-Plasmiden,
etwa für Screening-Zwecke (Abb. 5),
hochmolekularen rekombinanten Plasmiden
mit erniedrigter Kopiezahl (Abb. 6) sowie
von Cosmiden und BACs.
Literatur
[1] Hesselink, FT (1983) In: Adsorption from solution at the solid/liquid
interface, GD Parfitt, CH Rochester (ed.), pp. 377-412, Academic Press,
London.
[2] Lorenz, MG (1998) In: Microbial interactions in agriculture and forestry,
NS Subbarao, YR Dommergues (ed.), pp. 19-44, Oxford and IBH Publishing
Co., New Delhi.
Korrespondenzadresse
Prof. Dr. Michael Lorenz
Molzym GmbH & Co.KG
Leobener Strasse
D-28359 Bremen
Tel./Fax: +49-(0)421-218-8780 / -8781
eMail: info@molzym.com
www.molzym.com
Abb. 5: Isolierung von Plasmiden (Größe bis >50
kb, Pfeil) aus Wild-Bakterienstämmen.
Abb. 6: Restriktionsanalyse von rekombinanten
‚low copy‘-Plasmiden (4 ml Kulturvolumen). Die
Insertionen (Spalten 1-7) können 20 kb überschreiten
(Spalten 2, 4-6); Spalte 8: Vektor
LABORWELT 4. Jahrgang | Nr. 4/2003 | 41