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B L I T Z L I C H T Abb.1: Auftrennung von E.coli-Lysat mit dem ZOOM ® IPGRunner-Verfahren nach Anfärben des Gels durch Silberfärbung (links, SilverQuest Silver Staining-Kit, Invitrogen) oder Coomassie-Blau (rechts, SimplyBlue SafeStain, Invitrogen) 400 µl 0,5%-iger Agaroselösung – hergestellt im entsprechenden Laufpuffer – verschlossen. Parallel dazu wird ein passender Molekulargewichtsstandard daneben in die dafür vorgesehene Tasche pipettiert. Die SDS-PAGE erfolgt nach Standardvorgehensweise bei 200 Volt in 45 bis 50 Minuten. Die in den 2D-Gelen aufgetrennten Proteine können entweder durch Silberfärbung oder andere übliche Färbemethoden, wie etwa Coomassie-Färbung, sichtbar gemacht und ausgewertet werden (Abb. 1). Tab. 2: Zeitersparnis bei der 2D-Gelelektrophorese mit dem ZOOM ® IPGRunner-Verfahren im Vergleich zur Standardmethode 1 Schritt Pro 2D-Gel benötigte Zeit ZOOM IPG Standardverfahren 2D-Gele Probenvorbereitung 15 Min. 15 Min. Rehydratisierung 18 Std. 18 Std. IEF 3 Std. (~ 1.500 Vh) 24 Std. (~ 74.000 Vh) Reduktion + Alkylierung 45 Min. 1, 5 Std. SDS-PAGE 50 Min. 6,5 Std. Fixieren/Färben/Entfärben ca. 7 Std. ca. 8-9 Std. Das gesamte Verfahren, beginnend mit der IEF und SDS-PAGE bis hin zur Färbung der fertigen Gele, dauert etwa neun Stunden, ausschließlich der Rehydratisierungszeit, im Vergleich zu zirka 36 Stunden beim Standardverfahren (Tab. 2). Vor allem bei kleinen Proteinmengen übertrifft die Qualität der Auftrennung des Proteingemisches mit dem ZOOM ® IPGRunner-System die Auflösung auf herkömmlichen 2D-Gelen. So wurden nach 2D-Auftrennung von 20 µg Rattenleberextrakt im ZOOM ® IPGRunner-System durch automatisierte Bildanalyse etwa doppelt so viele Spots nachgewiesen wie im Standard 2D-Gel. Die Bildakquisition und Auswertung benötigen wesentlich weniger Zeit. Auch die prozentuale Abdeckung der Proteinzusammensetzung ist bei geringen Probenmengen im Durchschnitt höher. In der Identifizierung durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie ergab sich außerdem eine höhere Ionendichte der Spots, auch bei Spots geringerer Intensität. Ein weiterer Vorteil des ZOOM ® IPG Runner-Systems ist, daß täglich zahlreiche Proben in der ersten Dimension aufgetrennt werden können. Die fokussierten Streifen werden dann entweder gemeinsam ausgewertet oder in der Kassette bei –80°C aufbewahrt und später in der zweiten Dimension analysiert. Aufgrund ihrer geringen Größe kann die IPGRunner-Minizelle überall aufbewahrt und verwendet werden, da keine spezielle IEF-Station mehr erforderlich ist. Fazit Das einfache, leicht erlernbare neue Verfahren macht den Laborablauf effektiver und effizienter. Das ZOOM ® IPGRunner-System ermöglicht eine konsistente Reproduzierbarkeit der 2D-Gelelektrophorese mittels einfacher Technik. Damit eignet sich die Technologie für den Einsatz in allen pharmazeutischen und biotechnologischen Labors. Literatur [1] Pisano, M. R., Biedermen, K., Allen, D., Saxton, M., Nunez, R., Bala, K. Kontaktadresse Karsten Wilking Invitrogen GmbH Emmy-Noether-Str. 10 D-76131 Karlsruhe Tel.: +49-(0)721-61890 eMail: karsten.wilking@invitrogen.com www.invitrogen.com Anzeige LABORWELT 4. Jahrgang | Nr. 4/2003 | 37
B L I T Z L I C H T Chromatographie � Laser-induzierte Fluoreszenz- Detektion in der HPLC und CE Dr. Hagen Preik-Steinhoff, Dr. Jürgen Grebner und Günes Barka, SunChrom GmbH, Friedrichsdorf; Dr. Christophe Bayle, Picometrics S.A., Toulouse, Frankreich UV-VIS-Detektoren sind für die Hochdruck-Flüssig-Chromatographie (HPLC) und Kapillar- Elektrophorese (CE) Mittel der Wahl für eine große Anzahl von Applikationen. Daneben sind eine Vielzahl weiterer Nachweismethoden/Detektoren entwickelt worden, wie etwa Fluoreszenz-basierte Systeme, die Vorteile hinsichtlich der Sensitivität und Selektivität gegenüber der UV-VIS-Detektion aufweisen. Eine Weiterentwicklung – die sogenannte Laser-Induzierte- Fluoreszenz (LIF) – stellt einen erneuten Quantensprung in Hinblick auf die Sensitivität dar. Die Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) und die Kapillar-Elektrophorese (CE) stellen zwei unverzichtbare Trenntechniken zur Analyse komplexer Stoffgemische dar. Für diese Analysentechnik stellt der UV-VIS- Detektor den universellen Detektor für eine große Anzahl von Applikationen dar. Daneben sind weitere Nachweismethoden entwickelt worden mit Verbesserungen in Hinblick auf die Sensitivität oder Selektivität. Einer der sensitivsten Detektoren ist dabei der Fluoreszenz- Detektor, der, ausgestattet mit einer Gleichspannungs- oder gepulsten Xenon-Lampe, das Spektrum vom UV-Bereich bis zum nahen Infrarot abdeckt. Wesentlicher Vorteil der Fluoreszenz-Detektion ist die signifikant erhöhte Sensitivität und damit Nachweisempfindlichkeit, verglichen mit dem Standard-Absorptions-Detektor. So kann etwa ein Signal von Rhodamin-123 von 1 x 10 –12 M bei einem Signal /Rausch-Verhältnis von 1 : 10 aufgezeichnet werden (etwa mit dem Picometrics ZETALIF 2000-Detektor). In der Regel wird bei der Fluoreszenz-Detektion Abb. 1: Evolution Laser-Induzierter Fluoreszenz (LIF)- Detektor das Signal gegen eine mobile Phase gemessen, die nicht fluoresziert. Damit ist das Basislinien-Signal gleich oder sehr nahe Null und das Signal der eigentlichen Probe hebt sich entsprechend deutlich ab. Im Vergleich dazu wird bei der Absorptions-Detektion die Transmission der Probe gegen die des Blanks gemessen, die ebenfalls über eine Absorption verfügt. Bei sehr niedriger Konzentration der Probe sind die Unterschiede zwischen Blank und Probe sehr gering. Dies bedeutet, daß das Basislinien-Signal relativ zum Signal der Probe sehr hoch ist. Damit heben sich geringe Konzentrationswerte der Probe weniger deutlich von der Grundabsorption ab, wodurch der Fehler einer solchen Messung signifikant werden kann. Ein weiterer Vorteil der Fluoreszenz-Detektion ist ihre Selektivität. Während bei der Absorptions-Detektion die Probe auf Basis einer Wellenlänge detektiert wird, sind es bei der Fluoreszenz-Detektion zwei Wellenlängen (Anregungs- und Emmisionswellenlänge). Koeluieren etwa zwei Substanzen, die dieselbe Absorptionswellenlänge haben bei unterschiedlicher Emmisionswellenlänge, so kann der Fluoreszenz-Detektor die Identität im Vergleich zum Absorptions-Detektor aufzeigen. Darüber hinaus stellt ein gegebenenfalls notwendiger Derivatisierungsschritt ebenfalls einen selektiven Reaktionsschritt dar, indem das Derivatisierungsreagenz spezifisch für eine entsprechende Molekülfunktion gewählt werden kann. Laser-Induzierte Fluoreszenz Die Laser-Induzierte Fluoreszenz weist der Standard-Fluoreszenz gegenüber neben der größeren Sensitivität weitere Vorteile auf, wie die Verwendung monochromatischen Lichtes und eine Maximierung der Fluoreszenz-Intensität. Ein Vergleich derselben Applikation mit einem Standard-Fluoreszenz-Detektor und einem LIF-Detektor ist in Abbildung 2 gezeigt. A B Abb. 2: Sensitivität eines Laser-Induzierten Fluoreszenz-Detektors im Vergleich zu einem Standard-Fluoreszenz Detektor. Chromatogramm A zeigt die Datenaufnahme mit einem konventionellen Fluoreszenz-Detektor mit einer Xenon- Lampe (150 W) bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Emmisionswellenlänge von 580 nm. Das Injektionsvolumen betrug 10 µL. Chromatogramm B zeigt die Datenaufnahme mit einem ZETALIF-Laser Induzierter Fluoreszenz- Detektor mit einem 20 mW-Argon-Laser und einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Emissionswellenlänge von > 520 nm. Das Injektionsvolumen betrug 5 µL. Aufgegeben wurde in beiden Fällen ein Lösungsgemisch aus 1,8 x10 –9 M Doxorubicin und 1,8 x 10 –9 M Daunorubicin. Die mobile Phase bestand aus Phosphorsäure/Acetonitril (68/32) bei einem pH=4 und einer Flußrate von 0,5 mL/min. Dabei wurde ein Gemisch aus Doxorubicin und Daunorubicin (je 1,8 x 10 –9 M) auf einer Econosphere C 18 -RP-Säule isokratisch getrennt (Eluent: Phosphorsäure/Acetonitril 68/32, pH = 4; Flußrate 0,5 mL/min). Deutlich wird das signifikant bessere Signal-Rausch-Verhältnis bei der LIF-Detektion (bei 5 µL Probe S / N > 500) im Vergleich zur Standard-Fluoreszenz (bei 10 µL Probe S / N = 11). Dieser Unterschied ist hauptsächlich durch den unterschiedlichen Aufbau der beiden Geräte bedingt. Das Standard-Fluoreszenz-Gerät besteht – grob dargestellt – aus einer Lichtquelle, Anregungswellenlängen-Einheit, Meßzelle, Emissionwellenlängen-Einheit und dem Photonenverstärker. Darüber hinaus wird oftmals der Lichtstrahl geteilt, um einen Teil einer Referenzdiode zuzuführen und damit Veränderungen der Lichtquellenenergie registrieren und kompensieren zu können. Da der LIF- Detektor eine streng monochromatische Anregungswellenlänge produziert, können alle Funktionsteile entsprechend auf das Fluoreszenzsignal und die Sensitivität hin optimiert werden (siehe Abb. 3). 38 | 4. Jahrgang | Nr. 4/2003 LABORWELT
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