Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz

Neue Methoden zur Sequenzierung
festphasengebundener
Cyclopeptide
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
eines Doktors der Naturwissenschaften
an der Universität Konstanz
vorgelegt von
Angelika Semmler
Mathematisch-Naturwissenschaftliche Sektion
Fachbereich Chemie
Universität Konstanz
Oktober 2009

Dissertation der Universität Konstanz
Tag der mündlichen Prüfung: 03.12.2009
1. Referent: Prof. Dr. Valentin Wittmann
2. Referent: Prof. Dr. Dr. h. c. Michael Przybylski
Vorsitzender der Prüfungskommission: Prof. Dr. Gerhard Müller

meinem Großvater Albert Anton Höfert

Vorwort
Vorwort
Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von September 2005 bis Oktober 2009 in
der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. Valentin Wittmann im Fachbereich Chemie der
Universität Konstanz.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Valentin Wittmann für die Überlassung des
sehr interessanten und herausfordernden Themas und die freundliche Aufnahme in
die Arbeitsgruppe, sowie für das in mich gesetzte Vertrauen.
Herrn Prof. Dr. Michael Przybylski danke ich für die Übernahme des Zweitgut-
achtens.
Da wissenschaftliche Arbeit immer auch Diskussion, Kooperation und gegenseitige
Unterstützung bedeutet, möchte ich mich bei einigen Menschen bedanken:
Dominik Wöll für hilfreiche Diskussionen bei den Photolyse-Experimenten, Diana
Klingler für gemeinsame Gehversuche und manche spannende Stunde am LC-MS,
Markus Wieland und Astrid Joachimi für Unterstützung bei den SPR-Experimenten
und Anke Friemel für die Aufnahme der NMR-Spektren.
Ein besonderer Dank gebührt allen aktuellen und ehemaligen Mitgliedern der
Arbeitsgruppen Wittmann und Möller für eine wirklich tolle gemeinsame Zeit.
Besonders hervorheben möchte ich meine Laborkolleginnen Claudia Meßmer und
Mônica Boldt, mit denen so manch bitterer Labortag doch noch süß wurde. Für das
Suchen und Finden von Fehlern im Manuskript möchte ich mich bei Anja Meißner,
Henning Beckmann, Dominik Gauß und Christian Risinger bedanken. Außerdem
möchte ich Dominik „Dömi“ Gauß für die gemeinsame Peptidos-Zeit danken. Der
Laborerstbesetzung Frank Sicherl, Franklin John, Marco Worch, Caroline Maierhofer
und Daniel Specker danke ich für die herzliche Aufnahme und viele lustige Grillfeste.
Für den gemeinsamen Weg vom ersten Tag an der Uni Konstanz bis zum letzten,
danke ich Magnus Schmidt und Henning Beckmann.
I

Vorwort
Natürlich gibt es ein Leben außerhalb des Labors. Auch da war Christian immer für
mich da, ich danke Dir. Außerdem möchte ich meiner Familie und vor allem meiner
Mutter Resi danken, die immer an mich geglaubt hat. Für die Möglichkeit zum
Abschalten und Auspowern danke ich dem Masters-Team des RV Neptun; vor allem
meinen Mädels vom Doppelvierer (Anja, Conny und Claudia) danke ich für viele
gemeinsame Kilometer bei jedem Wetter.
II

Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
ABKÜRZUNGEN VII
1 EINLEITUNG 1
1.1 Cyclische Peptide – Was ist ihr Nutzen? 1
1.2 Cyclopeptidbibliotheken 4
1.3 Die Problematik der Analytik 6
1.3.1 Die Ermittlung von Peptidsequenzen aus OBOC-Bibliotheken 6
1.3.2 Sonderfall cyclische Peptide 8
1.4 Fluoreszenzmarkierte Phosphopeptide für SH2-Domänen-Mikroarray 10
2 AUFGABENSTELLUNG 13
2.1 Analytik von Cyclopeptiden 13
2.2 Synthese von fluoreszenzmarkierten Phosphopeptiden 14
3 SOLLBRUCHSTELLEN 15
3.1 Photolabile Sollbruchstelle 15
3.2 Methionin als Sollbruchstelle 26
3.2.1 Auswahl eines Linkers orthogonal zur Met-Sollbruchstelle 30
3.3 Tryptophan als Sollbruchstelle 40
3.4 Enzymatische Sollbruchstelle 44
3.5 Ringöffnung durch Edman-Abbau 46
III

Inhaltsverzeichnis
4 ANALYTIK 47
4.1 De-novo-Sequenzierung 47
4.1.1 Massenspektrometrische Untersuchung der Bibliothek von cyclischen Peptiden mit photolabiler
Sollbruchstelle 50
4.1.2 Massenspektrometrische Untersuchung nach Anwendung der Met-Sollbruchstelle 51
4.2 Partieller Edman-Abbau (PED) 56
4.2.1 Die Mikrosequenzierung – der klassische Edman-Abbau 56
4.2.2 Partieller Edman-Abbau (PED) – die Leitersequenzierung 58
4.2.3 Erweiterung des PEDs auf OBOC-Cyclopeptidbibliotheken 59
5 ANWENDUNG DER METHODE 71
5.1 Streptavidin: Ein biologisches Modelltarget 71
5.2 Aufbau einer OBOC-Cyclopeptidbibliothek 75
5.3 Das Screening 77
5.3.1 Etablierung des Screenings 78
5.3.2 Screening der OBOC-Cyclopeptidbibliothek 86 81
5.4 Die Hitbead-Peptidsequenzen 83
5.5 Bestimmung der Bindungskonstanten 86
5.5.1 Synthese der ausgesuchten Peptidsequenzen 87
5.5.2 SPR-Experimente 88
6 SYNTHESE FLUORESZENZMARKIERTER PHOSPHOPEPTIDE 95
6.1 Darstellung von Phosphopeptiden 95
6.2 Auswahl des Fluoreszenzlabels 98
6.3 Synthese der beiden Peptide Y241 und pY241 99
6.4 Synthese der beiden Peptide Y230 und pY230 102
IV

Inhaltsverzeichnis
7 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 109
7.1 Analytik von Cyclopeptiden 109
7.2 Fluoreszenzmarkierte Phosphopeptide 114
8 EXPERIMENTELLER TEIL 117
8.1 Allgemeine Angaben zur Analytik 117
8.1.1 HPLC 117
8.1.2 Massenspektrometrie 117
8.1.3 Kernresonanzspektroskopie 118
8.1.4 Infrarotspektroskopie 119
8.1.5 UV-Vis-Absorptionsspektroskopie 119
8.2 Allgemeine Arbeitsvorschriften für die SPPS 120
8.3 Synthetisierte Peptide 131
8.3.1 Synthese der photolabilen cyclischen Peptide 8-12 131
8.3.2 Synthese des cyclischen Peptids 31 zur Untersuchung von Methionin als Sollbruchstelle 134
8.3.3 Synthese des cyclischen Peptids 41 zur Untersuchung von Methionin als Sollbruchstelle 136
8.3.4 Synthese des Peptids 51/52 zur Stabilitätsuntersuchung des Glykolamid-Linkers und des HMBA-
Linkers 138
8.3.5 Synthese des festphasengebundenen Peptids 63 zur Untersuchung der Trp-Xaa Sollbruchstelle 140
8.3.6 Synthese des festphasengebundenen Peptids 66 zur Untersuchung von Trp als Linker 141
8.3.7 Synthese des festphasengebundenen Peptids 77 als Modellpeptid zur Etablierung des Partiellen
Edman-Abbaus (PED) 142
8.3.8 Synthese des Peptids 71 zur Untersuchung einer enzymatischen Ringöffnung 143
8.3.9 Synthese der Peptide (92-97) zur Bestimmung der KD-Werte 147
8.3.10 Synthese der fluoreszenzmarkierten Peptide 150
8.4 Modell in Lösung zur Aufklärung der Nebenreaktion im PED 156
8.4.1 Synthese von 5-Isopropyl-3-phenyl-2-thiohydantoin (PTH-Val) 81 156
8.4.2 Synthese von 5-Isopropyl-3-phenyl-2-hydantoin 82 157
8.5 On-bead-Screening 158
8.5.1 Zusammensetzung der Puffer und Lösungen für das Screening: 158
8.5.2 Biotinyliertes TentaGel S-NH2 159
8.5.3 Enzymgekoppelter Farbreaktionstest 160
8.5.4 Partielle Edman-Sequenzierung 161
V

Inhaltsverzeichnis
8.6 SPR-Experimente zur Bestimmung der KD-Werte 162
8.6.1 Zusammensetzung der Puffer und Lösungen für die SPR-Experimente 162
8.6.2 Durchführung der SPR-Experimente 163
9 LITERATURVERZEICHNIS 165
10 ANHANG 171
VI

Abkürzungen
Abkürzungen
Die Abkürzungen der Aminosäuren und Peptide richtet sich nach den Vorschlägen
der IUPAC-IUB-Kommission für biochemische Nomenklatur. Diese können auf
folgender Internetseite abgerufen werden URL: http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb.
Cyclische Peptide werden durch ein vorgestelltes cyclo gekennzeichnet. Im Fall einer
Seitenketten-Cyclisierung sind die an der Ringbildung beteiligten Aminosäuren
unterstrichen.
AAV allgemeine Arbeitsvorschrift
Abb. Abbildung
abs. absolut
Ac Acetyl
All Allyl
Alloc Allyloxycarbonyl
AP Alkalische Phosphatase
aq. wässrig
BCIP 5-Brom-4-chlor-3-indoylphoshat-Dinatriumsalz
BNPS 2-Bromo-2-(2-nitrophenylsulfenyl)
Boc
tert. Butyloxycarbonyl
BrCN Bromcyan
Bu Butyl
Bzl Benzyl
bzw beziehungsweise
c Konzentration
ca. circa (ungefähr)
CHCA α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure
COSY correlation spectroscopy
DCC N,N’-Dicyclohexhylcarbodiimid
DCM Dichlormethan
DHB 2,5-Dihydroxybenzoesäure
DIPEA Diisopropylethylamin
VII

Abkürzungen
DMF N,N’-Dimethylformamid
EDC N-Ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid
EDT Ethandithiol
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
ESI Elektrospray-Ionisation
eq. Äquivalente
Fl Fluoreszenzlabel
Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
GC Gaschromatographie
h Stunde
HATU O-Azabenzotriazolyl-1,1,3,3-tetramethyluronium-Hexafluoro-
phosphat
HBTU O-Benzotriazolyl-1,1,3,3-tetramethyluronium-Hexafluorophosphat
HMBA 4-Hydroxymethylbenzoesäure
HOAt Hydroxyazabenzotriazol
HOBt Hydroxybenzotriazol
Hsl Homoserinlacton
HSQC heteronuclear single quantum correlation
IC50 Inhibitionskonstante
ID Innendurchmesser
IR Infrarot
J Kopplungskonstante
KD Dissoziationskonstante
kDa kilo Dalton
M Molar
MALDI matrix assisted laser desorption ionisiation
Me Methyl
MeCN Acetonitril
MeIm Methylimidazol
MHz Megahertz
min Minuten
ml Milliliter
MS Massenspektrometrie
MSNT 1-(Mesitylene-2-sulphonyl)-3-nitro-1H-1,2,4-triazole
VIII

NBT p-Nitroblau-Tetrazoliumchlorid
NBS N-Bromsuccinimid
neg. negativ
NHS N-Hydroxysuccinimid
NMP n-Methylpyrrolidin
NMR nuclear magnetic resonance (Kernspinresonanz)
Nu Nucleophil
OBOC one-bead-one-compound
Pbf 2,2,4,6,7-Pentamethyldihydro-benzofuran-5-sulfonyl
PBS Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
PE Polyethylen
PED partial edman degradation (partieller Edman-Abbau)
Pip Piperidin
PITC Phenylisothiocyanat
Pll Photolabilerlinker
pos. positiv
PTH 3-Phenyl-2-thiohydantoin
pY Phosphotyrosin
Abkürzungen
PyAOP 7-Azabenzotriazol-1-yloxytris(pyrrolidino)phosphonium-Hexa-
fluorophosphat
PyBOP Benzotriazol-1-yloxytris(pyrrolidino)phosphonium-Hexafluoro-
phosphat
Pyr Pyridin
ROESY rotating frame nuclear Overhauser and exchange spectroscopy
RP-HPLC Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie
RU resonance units
SA Streptavidin
SH2 Scr-homology-2
SPPS solid phase peptide synthesis
SPR surface plasmon resonance (Oberflächen-Plasmonen-Resonanz)
SRBS Sulforhodamin-B-sulfonyl
Su Succinimid
TBS Tris-gepufferte Salzlösung
TFA Trifluoressigsäure
IX

Abkürzungen
TG Tenta Gel
Thi Thienylalanin
THF Tetrahydrofuran
TIS Triisopropylsilan
TNBS 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure
TOF time of flight
TOCSY total correlation spectroscopy
tR Retentionszeit
Tris Tri(hydroxymethyl)-aminomethan
Trt Trityl
UV Ultraviolett
Xaa beliebige Aminosäure
X

1 Einleitung
1.1 Cyclische Peptide – Was ist ihr Nutzen?
1 Einleitung
Cyclische Peptide sind in der Natur weit verbreitet. Man kann sie in Pflanzen,
Pilzen [1] , maritimen Schwämmen, anderen einfachen marinen Lebewesen und
Bakterien nachweisen. [2, 3] Wie andere Naturstoffe auch, zeigen viele cyclische
Peptide ein vielversprechendes therapeutisches Potential. Durch ihre
Aminosäurebausteine sind sie dem menschlichen Organismus nicht fremd. Im
Vergleich zu ihren linearen Analoga weisen sie eine höhere metabolische Stabilität
(verminderter enzymatischer Abbau in vivo) auf, wodurch eine größere
Wirkungsdauer bei medizinischem Einsatz zu erwarten ist. Zudem wird die kon-
formative Flexibilität des Peptidrückgrats durch die cyclische Form beträchtlich
reduziert. Dies kann eine deutliche Erhöhung der Bindungsaffinität und der
Rezeptorselektivität hervorrufen. Desweiteren wurde eine erhöhte Membrandurch-
gängigkeit postuliert, welche jedoch noch diskutiert wird [4] .
Auch heute schon stellen cyclische Peptide eine Verbindungsklasse dar, die
entscheidende Beiträge zur Behandlung von Krankheiten leisten konnten.
Cyclosporin A 1, auch Ciclosporin, als Medikament unter Sandimmun (Novartis),
Cicloral (Hexal) und Ciclosporin Pro (Teva) bekannt (Abb. 1.1), ein Immuno-
suppressivum, wird als Calcineurin-Inhibitor vor allem in der Transplantationsmedizin
verwendet. Der Wirkstoff bindet an Calcineurin und blockiert im Zellplasma so die
Bindung an NF-AT (nuclear factor activating t-Cell), ein Gen-regulierendes Protein. In
aktivierten T-Zellen ist Calcineurin für die Dephosphorylierung von NF-AT
verantwortlich. Daraufhin kann NF-AT in den Zellen transloziert werden und dort die
Transkription von zahlreichen Zytokinen und Zelloberflächenrezeptoren (u. a.
Interleukin-2 und Gamma-Interferon) aktivieren. Als Arzneimittel eingesetzt führt
Cyclosporin A also zu einer eingeschränkten Aktivität des Immunsystems und senkt
somit zum Beispiel das Risiko der Organabstoßung nach einer Transplantation.
1

1 Einleitung
Echinocandin 2 (Abb. 1.1) gab einer ganzen Substanzgruppe ihren Namen. Zur
Wirkstoffklasse der Antimykotika zugehörig, werden sie zur Behandlung von
Pilzinfektionen eingesetzt. Echinocandine inhibieren die β(1-3)-D-Glucan Synthase,
ein Enzym zur Synthese von β(1-3)-D-Glucan. Dieses ist ein wichtiger Baustein für
den Aufbau von Zellwänden in Pilzen.
Das cyclische Depsipeptid Daptomycin 3 (Abb. 1.1), als Medikament unter Cubicin
bekannt (Cubist Pharmaceuticals), ist ein Antibiotikum. Der Arzneistoff wird vor allem
bei Haut- und Weichteilinfektionen mit gram-positiven Problemkeimen eingesetzt.
Oftmals ist der Wirkstoff auch dann noch wirksam, wenn andere Antibiotika aufgrund
von Resistenzen bei der Therapie versagen.
2
Abb. 1.1: Beispiele für cyclische Peptide in der Therapie. Ciclosporin 1, ein Immuno-
suppressivum, Echinocandin 2, ein Antimykotikum und Deptamycin 3, ein
Antibiotikum.

1 Einleitung
Neben ihrem breiten Einsatzbereich als Wirkstoffe eignen sich cyclische Peptide,
aufgrund ihrer hohen Rezeptorselektivität und Bindungsaffinität, auch als molekulare
Hilfsmittel in der Diagnostik. So kann beispielsweise rheumatische Arthritis mit dem
sogenannten anti-CCP-Test mit einer Sensitivität von nahezu 80% und einer
Spezifität von nahezu 98% nachgewiesen werden. [5] Zur Diagnostik wird im Blut nach
Rheumafaktoren (RF-Antikörpern) gesucht. Peptide, bei denen Arginin durch das
Enzym Peptidylarginin-Deiminase (PAD) in Citrullin umgewandelt wurde, konnten als
natürliches Antigen mit rheumatoider Arthritis in Zusammenhang gebracht werden.
Antikörper gegen citrullinierte Peptid-/Protein-Antigene (ACPA) gelten als
sogenannter Biomarker für die rheumatoide Arthritis und werden in einem ELISA
(enzym-linked immunosorbent assay) nachgewiesen. Es gelang, ein synthetisches
cyclisches Peptid darzustellen, das sich vom natürlichen Antigen ableitet und eine
deutlich erhöhte Bindungsaffinität zu diesem Antikörper aufweist. Für den Anti-CCP-
Test wird dieses cyclische citrullinierte Peptid (ccp) an der Oberfläche von
Mikrotiterplatten immobilisiert. Daraufhin erfolgt eine Inkubation mit dem Antikörper
(ACPA in Patientenserum). Durch erneute Inkubation mit einem anti-humanen IgG-
Peroxidase-Konjugat und anschließender Farbreaktion kann der Biomarker ACPA
nachgewiesen werden. Diese Entwicklung hat nicht nur zu einer deutlichen
Verbesserung in der Labordiagnostik geführt, sondern ermöglicht auch die Diagnose
der Krankheit in frühen Stadien.
Desweiteren eignen sich cyclische Peptide auch als molekulare Werkzeuge bei der
Suche nach einem hoch affinen Rezeptor (oder beim Verständnis des Struktur-
Wirkungs-Mechanismus). [6] Die konformative Einschränkung der cyclischen Peptide
erleichtert die Bestimmung der für die biologische Wirkung bedeutenden drei-
dimensionalen Struktur der aktiven Substanzen.
3

1 Einleitung
1.2 Cyclopeptidbibliotheken
Die Auswahl an Methoden zur Darstellung von Cyclopeptidbibliotheken ist
inzwischen sehr groß. Prinzipiell eignen sich alle Methoden, die auch für die
Synthese von Bibliotheken linearer Peptide zur Verfügung stehen; da man
üblicherweise zunächst die lineare Peptidsequenz synthetisiert und anschließend
unter Einsatz einer gezielten Schutzgruppenstrategie eine selektive Cyclisierung
vornehmen kann. Gängige Verfahren zur Synthese von Peptidbibliotheken sind
Multiple-Pin-Methode, [7] Tea-Bag-Methode, [8] Split-Mix-Methode, [9, 10] lichtgesteuerte
Synthese [11] und Spot-Synthese [12] Viele dieser Methoden erfordern jedoch eine
spezielle und vor allem teure Laborausstattung. Bei der sogenannten Split-Mix-
Methode [9, 10] ist das nicht der Fall, weshalb sie häufig die Methode der Wahl ist.
Abb. 1.2 Das Prinzip der Split-Mix-Methode.
Bei der von Furka vorgestellten Split-Mix-Methode wird das Harz vor dem ersten
Reaktionsschritt in mehrere gleich große Aliquote aufgeteilt (engl. split) und separat
mit dem entsprechenden Reaktionsbaustein zur Reaktion gebracht. Nach der
Reaktion werden die Harzaliquote vereinigt (engl. mixed) und nach der Aufarbeitung
erneut aufgeteilt, um den zweiten Baustein anzukuppeln (Abb. 1.2). Dieser Zyklus,
bestehend aus Aufteilen, Reaktion und Vereinigen, wird solange wiederholt, bis die
gewünschte Anzahl der Schritte erreicht ist. Man erhält eine Bibliothek mit
4

1 Einleitung
N = a x Komponenten, wobei a die Anzahl der Reaktionsbausteine pro Zyklus und x
die Anzahl der Zyklen ist. Da sich pro Reaktionsgefäß immer nur ein Reaktand in
Lösung befindet, können alle Reaktionen, trotz unterschiedlicher Kinetik, bis zum
vollständigen Umsatz geführt werden. Das vorrangige Ziel von Furka bestand in der
Darstellung von Peptidmischungen innerhalb kürzester Zeit.
1991 erkannten Lam et al. ein weiteres Potential von Split-Mix-Bibliotheken. [13] Auf
jeder Harzkugel einer Substanzbibliothek befindet sich nur eine Verbindung in
vielfacher Kopie (One-Bead-One-Compound, OBOC). Verzichtet man also auf die
Abspaltung des Peptids vom Harz, kann man eine große Anzahl von Peptiden testen
und anschließend getrennt identifizieren. Um sicherzustellen, dass jede theoretisch
mögliche Verbindung in der Bibliothek enthalten ist, muss die Anzahl der
eingesetzten Harzkugeln groß genug sein. Statistische Musterrechnungen hierzu
können den Publikationen von Burgess et al. [14] und Zhao et al. [15] entnommen
werden.
5

1 Einleitung
1.3 Die Problematik der Analytik
1.3.1 Die Ermittlung von Peptidsequenzen aus OBOC-Bibliotheken
Der Preis, den man für die hohe Syntheseeffizienz der OBOC-Bibliotheken zu zahlen
hat, ist die Notwendigkeit einer eindeutigen Substanzidentifikation jeder positiv
getesteten Kugel. Zur Sequenzierung von linearen Hitpeptiden aus einer OBOC-
Bibliothek stehen vier verschiedene Methoden zur Wahl. Diese sind im Fließschema
in Abb. 1.3 dargestellt.
Abb. 1.3 Methode zur Ermittlung der Peptidsequenz, die sich auf einer als positiv
getesteten Harzkugel aus einer OBOC-Bibliothek befindet.
Bei der Leitersynthese [16] wird das Problem der Analytik bereits während der
Synthese, das heißt dem Split-Mix-Aufbau der Bibliothek, bedacht. Hierzu wird bei
jedem Kupplungsschritt ein kleiner Teil der im Aufbau befindlichen Peptidsequenz
gecappt, beispielsweise durch Zugabe von 5% Ac-Ala-OH oder der entsprechenden
Boc-geschützten Aminosäure. Die weiteren Arbeitsschritte verlaufen analog zum
6

1 Einleitung
Split-Mix-Protokoll. Nach dem Screening werden die positiv getesteten Kugeln
aussortiert. Die an der Kugel gebundene Peptidleiter muss nur noch abgespalten
werden und steht dann zur massenspektrometrischen Analyse zur Verfügung. Aus
den erhaltenen Massenspektren kann nun die Sequenz ausgelesen werden. Der
große Nachteil dieser Methode ist, dass das One-Bead-One-Compound Prinzip
verloren geht, da sich beim Screening die ganze Peptidleiter auf der Kugel befindet
und somit alle „Leitersprossen“ als potentielle aktive Verbindungen zur Verfügung
stehen. In späteren Veröffentlichungen [17] versuchte man, dieses Problem durch eine
Aufteilung der Kugel in äußere und innere Schale (biphasic beads) zu umgehen. Die
Synthese wird dabei so modifiziert, dass beim Screening der Bibliothek die eigentlich
zu testende Substanz dem Target/Rezeptor auf der äußeren Schale angeboten wird,
während sich die zur Verschlüsselung mitsynthetisierte Peptidleiter im Innern der
Kugel befindet.
Ganz ohne Verschlüsselung kommen hingegen tandem-MS, Edman-Abbau und die
Leitersequenzierung aus. Zur rein massenspektrometrischen Sequenzierung
(tandem-MS) von aktiven Peptiden aus OBOC-Bibliotheken wird das Peptid vor der
Probenvorbereitung von der Kugel gespalten. [18] Während der massenspektro-
metrischen Charakterisierung wird das intakte Peptidion im Massenspektrometer
isoliert und anschließend fragmentiert. Aus den erhaltenen Peptidfragment-
ionsignalen können dann Rückschlüsse auf die Peptidsequenz gezogen werden. Für
die Durchführung solcher Experimente benötigt man jedoch ein speziell zur
Sequenzierung ausgestattetes Massenspektrometer, das die Möglichkeit bietet,
Peptidionen zu isolieren und zu fragmentieren. [19-23] Während meiner Diplomarbeit
konnte ich zeigen, dass harzgebundene Peptide mittels MALDI-FTICR-MS/MS
sequenzierbar sind. [24] Durch den Einsatz eines photolabilen Linkers erfolgte die
Abspaltung des Peptids vom Harz durch den Laserstrahl der MALDI-Quelle, wodurch
ein vorheriges Abspalten vom Harz entfiel. Die Gruppe um Albericio zeigte eine
Sequenzierung mittels MALDI-TOF/TOF-MS. [25] Die Abspaltung des Peptids erfolgte
hierbei direkt auf dem MALDI-Target durch Einwirkung von Ammoniakdampf
(Spaltung des HMBA-Linkers). Zur weiteren Probenpräparation musste lediglich
Matrix addiert werden.
7

1 Einleitung
Eine weitere Möglichkeit der direkten Sequenzierung von Peptiden, die sich auf
Hitbeads aus einem Screening befinden, bietet der Edman-Abbau, auch Mikro-
sequenzierung genannt. Hier wird jede positiv getestete Kugel einzeln der
klassischen Mikrosequenzierung zugeführt. Ein vorheriges Abspalten des Peptids
vom Harz ist nicht erforderlich, da während des Abbaus Aminosäure für Aminosäure
vom Harz gespalten und anschließend mittels RP-HPLC detektiert wird. Mit einer
Sequenzierungsrate von 3-4 Kugeln pro Tag ist diese Methode jedoch sehr zeit-
intensiv und eignet sich dadurch nur bedingt zum Einsatz im Hochdurchsatz-
verfahren.
Die Leitersequenzierung [26] , welche partiellen Edman-Abbau mit anschließender
MALDI-TOF Massenspektrometrie umfasst, wurde ursprünglich als zeitsparende
Methode zur Sequenzierung von Peptiden in Lösung eingeführt. Die Gruppe um Pei
übertrug diese Methode auf festphasengebundene Peptide aus OBOC-
Bibliotheken. [27] Hierzu werden alle Kugeln, die eine positiv getestete Peptidsequenz
tragen, vereinigt und anschließend einem gemeinsamen partiellen Edman-Abbau
unterzogen. Der partielle Abbau wird durch die Behandlung mit einer Mischung aus
PITC (zur Spaltung) und Fmoc-OSu (zum Capping) realisiert. Am Ende erhält man
auch hier eine Fragmentleiter, welche mittels Massenspektrometrie (MALDI-TOF-
MS) nachgewiesen wird.
1.3.2 Sonderfall cyclische Peptide
Möchte man eine rein massenspektrometrische Sequenzanalyse (tandem-MS/
De-novo-Sequenzierung) auf einen kombinatorischen Ansatz anwenden, so ist der
Erhalt aller Fragmentionen zur vollständigen und eindeutigen Sequenzierung
unbedingt notwendig. Demnach muss die Wahrscheinlichkeit eines Bindungsbruchs
zwischen den Aminosäuren im gesamten Peptid gleich groß sein. Wird dieses
Prinzip zur Sequenzierung cyclischer Peptide verwendet, so sollte der Bruch des
peptidischen Rings an jeder beliebigen Stelle gleich wahrscheinlich sein. Die dadurch
erhaltenen linearen Peptidfragmente haben eine gemeinsame Zusammensetzung
der Aminosäuren, somit eine identische Masse, aber eine unterschiedliche
Aminosäuresequenz. Weitere Fragmentierungen führen zu immer komplexeren
Spektren. [28] In der Gruppe von Ghadiri wurde ein Computerprogramm entwickelt,
8

1 Einleitung
welches LC-MS/MS-Spektren automatisiert aus- bzw. bewertet. Das Programm ist
speziell auf cyclische Peptide aus OBOC-Bibliotheken zugeschnitten und
berücksichtigt durch die Split-Mix-Synthese vorhandene Sequenzinformationen, wie
eingesetzte Aminosäuren, sowie die Anzahl und Häufigkeit der Aufspaltungen. Zur
Auswertung können jedoch keine Peaklisten, sondern lediglich die erhaltenen
Rohdaten von Hitachi 3DQ-ion trap Massenspektrometern herangezogen werden. [29]
a
E
A b
D C
B
a
b
A B C D E
B C D E A
C D E A B
D E A B C
E A B C D
Abb. 1.4 Die Isolierung und anschließende Fragmentierung eines cyclischen Peptids im
Massenspektrometer führt zu einer Reihe von Fragmentionen mit identischer
molekularen Masse aber unterschiedlicher Aminosäurensequenz.
Soll zur Sequenzierung eines cyclischen Peptids eine auf Edman-Chemie
basierende Sequenzierungsmethode (Microsequenzierung oder Leitersequen-
zierung) zum Einsatz kommen, ist das Vorhandensein des freien N-Terminus
unbedingt notwendig.
Eine präanalytische, also unmittelbar vor der Sequenzierung stattfindende,
Umwandlung der cyclischen Peptide in lineare Peptide würde einen deutlich
besseren Zugang zur Sequenzinformation mittels massenspektrometrischer und
Edman-basierter Methoden ermöglichen.
9

1 Einleitung
1.4 Fluoreszenzmarkierte Phosphopeptide für SH2-Domänen-Mikroarray
Scr-homology-2-(SH2)-Domänen sind eine von vielen Familien innerhalb der
Proteindomänen, die Protein-Protein-Wechselwirkungen in der Signaltransduktion
vermitteln. Wie andere Domänen auch, sind SH2-Domänen über eine konservierte
Region in der Aminosäuresequenz definiert. Die charakteristische Faltung dieser 100
Aminosäuren umfassenden Domäne ermöglicht eine spezifische Erkennung und
Bindung an Phosphotyrosin-beinhaltende Liganden. Phosphotyrosin (pY) bein-
haltende Protein-Protein Wechselwirkungen, wie zum Beispiel solche, die durch
SH2-Domänen ermöglicht werden, sind eines der primary means, um Signalproteine
zu rekrutieren und spielen daher eine Hauptrolle bei der Signalübermittlung. SH2-
Domänen wurden in Enzymen, Adapterproteinen, Regulationsuntereinheiten von
Signalproteinen, Gerüstproteinen, Transkriptionsfaktoren und onkogenen Proteinen
gefunden. Diese Proteine sind fest eingebunden in den Prozess der Signalüber-
mittlung, da sie als Verbindung zwischen Rezeptor und nachgeordneten Signal-
moleküle fungieren. Sie vermitteln Signale zwischen Zellen und regulieren die
Kinaseaktivität bestimmter Proteine. [30] Die Phosphorylierung von Proteinen ist eine
10
Abb. 1.5 C-terminale Aminosäuresequenz [222-252] des CEACAM3 Proteins. Die
beiden Tyrosine (Y230 und Y241) sind fettgedruckt hervorgehoben.
Ausgehend von diesen beiden Y, sieben Aminosäuren in der Sequenz in
Richtung C- und N-Terminus, ergeben sich die zwei ITAM-ähnlichen
Sequenzen (Peptid Y230 beziehungsweise Y241), die unterstrichen
hervorgehoben sind.

1 Einleitung
der Haupinformationsleitungen der zellulären Verständigung. Eine Störung im SH2-
Domänen-abhängigen Signalweg kann oftmals direkt oder indirekt mit
Humanerkrankungen in Verbindung gebracht werden.
Die Arbeitsgruppe um Prof. Christof Hauck (Fachbereich Biologie, Universität
Konstanz) beschäftigt sich ausführlich mit der Aufklärung der Rolle der ITAM
(immunoreceptor tyrosine based activation motif)-ähnlichen Sequenzen von
CEACAM3 (carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule) in
Signalwegen (Abb. 1.5). Mit Hilfe eines SH2-Domänen-Mikroarrays soll ermittelt
werden, an welche SH2-Domänen die ITAM-ähnlichen Sequenzen von CEACAM3
binden. Hierzu soll eine mit unterschiedlichen SH2-Domänen versehene Glas-
oberfläche mit einem synthetischen Peptid, welches Phosphotyrosin beinhaltet und
mit einem Fluoreszenzlabel versehen wurde, inkubiert werden. Findet eine Ligand-
Proteinwechselwirkung statt, kann diese im Chipreader mittels Fluoreszenz sichtbar
gemacht werden (Abb. 1.6). Durch die Identifikation der SH2-Domänen, an die der zu
erforschende Ligand bindet, kann nachgewiesen werden, an welchem Signalweg
dieser Ligand beteiligt ist. [31]
Abb. 1.6 SH2-Domänen-Mikroarray: a) Der Glasträger wird mit unterschiedlichen SH2-
Domänen versehen. b) Inkubation mit einem Phosphotyrosin beinhaltenden
und fluoreszenzmarkierten Peptid (möglicher Ligand). c) Ligand bindet nur am
passenden Rezeptor und kann über Fluoreszenz nachgewiesen werden.
11

2 Aufgabenstellung
2.1 Analytik von Cyclopeptiden
2 Aufgabenstellung
In der Natur sind cyclische Peptide weit verbreitet. In vielen Fällen weisen sie eine
hohe biologische Aktivität auf und stellen somit eine potentielle Substanzklasse für
Wirkstoffe, Leitstrukturen und molekulare Werkzeuge dar. Die Split-Mix-Synthese [10]
ermöglicht eine effiziente und schnelle Darstellung cyclischer OBOC-
Peptidbibliotheken [13] mit einer großen Mitgliederzahl. Nach dem Screening, dem
Test der Mitglieder auf Aktivität, stößt man jedoch bei der Analytik der Hitbeads auf
den Engpass der Methode. Zur Identifikation der aktiven Komponente steht lediglich
eine einzelne Harzkugel zur Verfügung. An diese sind je nach Beladungsdichte
typischerweise zwischen 100 pmol und 5 nmol der aktiven Verbindung gebunden.
Aufgrund ihrer hohen Sensitivität können Massenspektrometrie und auch auf Edman-
Abbau basierte Methoden zur Analytik solch geringer Peptidmengen herangezogen
werden. Neben der geringen Substanzmenge weisen OBOC-Cyclopeptid-
bibliotheken jedoch noch eine weitere analytische Herausforderung auf. Sie besitzen
oft keinen freien N-Terminus und sind somit für die Chemie des Edman-Abbaus nicht
zugänglich. Auch in der Massenspektrometrie liefern sie aufgrund ihrer cyclischen
Verbrückung meist keine eindeutig auswertbaren Spektren. [28] Eine präanalytische,
also unmittelbar vor der Sequenzierung stattfindende, Transformation der cyclischen
Peptide in lineare Peptide würde einen deutlich besseren Zugang sowohl zu massen-
spektrometrischen, als auch zu Edman-basierten Methoden ermöglichen.
Ziel der Arbeit war die Entwicklung einer effizienten Methode zur Sequenzierung
cyclischer Peptide, die als aktive Substanzen aus einer OBOC-Bibliothek her-
vorgingen. Zunächst sollte die Einführung und Spaltung molekularer Sollbruchstellen
zur gezielten Peptidringöffnung untersucht werden. Die daraus resultierenden,
vormals cyclischen, Peptide sollten anschließend zuverlässig mit in unseren
Laboratorien zur Verfügung stehenden Methoden sequenziert werden. Nach der
Entwicklung der Methode sollte ihr Nutzen anhand einer konkreten Anwendung
gezeigt werden. Die durch die Anwendung gefundenen Cyclopeptide sollten
schließlich auf Ihre Bindungsaktivität hin untersucht werden.
13

2 Aufgabenstellung
2.2 Synthese von fluoreszenzmarkierten Phosphopeptiden
Für den Einsatz im SH2-Domänen-Mikroarray (mehr dazu in Kapitel 1.4) sollten die
in Abb. 2.1 gezeigten Peptide Y241 und Y230 synthetisiert werden. Die Tyrosine
sollten in jeder der beiden Sequenzen als Phosphotyrosin (aktive Peptide: pY241
und pY230) beziehungsweise als Tyrosin (Negativkontrolle: Y241 und Y230)
vorliegen, so dass sich vier synthetische Peptide ergeben. Die Peptide sollten als
Peptidylsäuren erhalten werden. Für den Einsatz im Mikroarray sollten die Peptide
mit einem mit dem Chip-Reader kompatiblen Fluoreszenzlabel versehen werden.
14
Abb. 2.1 Die fluoreszenzmarkierten Peptide (Fl = Fluoreszenzlabel).

3 Sollbruchstellen
3 Sollbruchstellen
Für eine spätere Sequenzierung cyclischer Peptide müssen diese, wie in der
Einleitung beschrieben, in lineare Peptide überführt werden. Zunächst wurden daher
mehrere Herangehensweisen experimentell untersucht, um eine Sollbruchstelle in
den peptidischen Ring einzubringen. Denkbar sind chemische und enzymatische
Sollbruchstellen. Der Ring muss erst geöffnet werden und anschließend das lineare
Peptid von der Kugel gespalten werden. Auf den Einsatz von Disulfidbrücken, eine
Verbrückung über Cysteinseitenketten, wurde bewusst verzichtet, da ein selektives
und stabiles Öffnen bzw. Schließen des peptidischen Rings auf diese Weise als
problematisch eingestuft wird. [32-34]
3.1 Photolabile Sollbruchstelle
Lichtinduzierte Spaltungsreaktionen ermöglichen eine Erweiterung der Orthogonalität
von Linkern und Schutzgruppen in der präparativen organischen und kombi-
natorischen Synthese auf eine weitere Dimension. Die photolytische Spaltung
verläuft unter sehr milden Reaktionsbedingungen und kommt ohne Erwärmen und
ohne Zusatz von Reagenzien aus. Ein erster Ansatz bestand daher im Einbau einer
photolabilen Sollbruchstelle.
Abb. 3.1 Zwei von Holmes et al. entwickelte photolabile Linker. Nach photoinduzierter
Reaktion erhält man eine Peptidylsäure (wenn X=O), beziehungsweise ein
Peptidylamid (wenn X=N).
Die in Abb. 3.1 gezeigte Verbindung 4 enthält einen kommerziell erhältlichen
photolabilen Linker [35, 36] , wie er auch in meiner Diplomarbeit verwendet wurde. Durch
Laserbestrahlung (Stickstofflaser, 337 nm), zum Beispiel während der Laser-
15

3 Sollbruchstellen
induzierten Ionisierung im MALDI-Experiment, kann das Peptid direkt vom Harz
gespalten werden. Ein vorheriges Abspalten zur Probenvorbereitung ist nicht
notwendig. Im Rahmen meiner Diplomarbeit konnte ich jedoch feststellen, dass die
Esterverknüpfung in Verbindung 4 unter Standard-Abspaltbedingungen von
säurelabilen Schutzgruppen (TFA/TIS/Wasser (95:2,5:2,5)) nicht vollständig stabil ist.
Die Amidverknüpfung zwischen Peptid und Linker in Verbindung 5 sollte diese
Säurelabilität hingegen nicht aufweisen. Da es sich bei diesem Linker um eine
Verbindung mit Carboxyl- und Aminogruppe handelt, also eine „Amino-Säure“-
Funktionalität vorliegt, sollte diese Verbindung innerhalb einer Peptidkette auch als
Sollbruchstelle nutzbar sein. Wird die Verbindung als Linker zwischen fester Phase
und Peptid und zugleich im Peptidzyklus verwendet, so sollte eine gleichzeitige
Abspaltung des Peptids von der festen Phase und eine Peptidringöffnung möglich
sein (Abb. 3.2). Der für den Aufbau von Verbindung 5 notwendige Baustein 7 ist
kommerziell nicht erhältlich.
Abb. 3.2 Wird der photolabile Linker zwischen Peptid und Harzkugel und im cyclischen
Peptid verwendet, so sollte durch Bestrahlung der Peptidzyklus gezielt
geöffnet und gleichzeitig das Peptid vom Harz gespalten werden.
Abb. 3.3 zeigt diesen kommerziell nicht erhältlichen Linker 7, der freundlicherweise
im organischen Grundpraktikum unter der Leitung von Herrn Dr. Huhn nach einer
Vorschrift von Holmes et al. dargestellt wurde. [35] Ausgehend von 4-Hydroxy-3-meth-
oxyacetophenon kann dieser in sieben Stufen mit einer Literaturausbeute von 56%
synthetisiert werden.
16

3 Sollbruchstellen
Abb. 3.3 Der Fmoc-geschützte photolabile Linker (Fmoc-Pll-OH) 7 kann ausgehend von
4-Hydroxy-3-methoxy-acetophenon 6 in sieben Schritten synthetisiert werden.
Um zunächst die photolabile Sollbruchstelle untersuchen zu können, wurde eine
kleine Bibliothek von cyclischen Peptiden an SieberAmid-TentaGel-Harz synthetisiert
(Abb. 3.4). Die Verwendung des SieberAmid-Linkers ermöglichte das Abspalten der
cyclischen Peptide, ohne den Ring zu öffnen. So konnte eine anschließende
Charakterisierung und eine Studie der Spaltung der Sollbruchstelle folgen.
Abb. 3.4 Durch parallele Synthese erhaltene Bibliothek von Cyclopeptiden.
Abb. 3.5 zeigt exemplarisch für alle Peptide den Syntheseweg zur Darstellung von
Peptid 8. Die Synthese der linearen Vorläufersequenz erfolgte im
10 µmol Ansatz am Peptidsynthesizer unter Fmoc-Bedingungen. Der Synthese-
verlauf wurde über eine Leitfähigkeitsmessung der Fmoc-Abspaltlösung verfolgt. Die
photolabile Aminosäure 7, welche später als Sollbruchstelle im Ring fungiert, wurde
manuell angeknüpft. Nach vollständiger Elongation der Peptide wurde die
N-terminale Fmoc-Gruppe abgespalten. Anschließend wurde das Peptidylharz mit
Pd(0) und Diaminoboran-Komplex in DCM behandelt, um die Allyl-Schutzgruppe der
Glutaminsäurenseitenkette zu entfernen. Die Cyclisierung erfolgte über eine
17

3 Sollbruchstellen
N-Terminus-zu-Carbonsäureseitenkette-Amidverknüpfung. Dazu wurde die Carboxyl-
gruppe der Glutaminseitenkette mit PyBOP/HOBt und DIPEA aktiviert. Nach jedem
wichtigen Syntheseschritt erfolgte eine Testabspaltung des Peptids von der festen
Phase und eine anschließende Charakterisierung mittels RP-HPLC und offline-MS.
18
Fmoc-Gly-Pro-Gly-Ala-Phe-Glu(OAll)-Lys(Boc)-SieberAmid-
HN
N
O
O
O
O
N
H
NH
O
H
N
1) 20% Piperidin in DMF
2) Fmoc-Pll-OH 7 /HOBt/
HBTU/DIPEA
(4 eq: 6 eq: 4 eq: 8 eq), 19h
Fmoc-Pll-Gly-Pro-Gly-Ala-Phe-Glu(OAll)-Lys(Boc)-SieberAmid-
4) [Pd(PPh 3) 4]/(CH 3) 2NHBH 3(0,8 eq: 15 eq)
5) 20% Piperidin in DMF
H-Pll-Gly-Pro-Gly-Ala-Phe-Glu-Lys(Boc)-SieberAmid-
6) PyBOP/HOBt/DIEA
(5 eq: 5 eq: 10eq), 18,5h
O
MeO
O
N
H
NO 2
O
H
N
NH
O
HN
O
O
N
H
O
SieberAmid
17
TFA/TIS/H20 13 14
TFA/TIS/H20 15 16
TFA/TIS/H 20
TFA/TIS/H20 19 8
Abb. 3.5 Nach automatisierter Elongation des linearen Vorläuferpeptids 13 wurde
manuell die photolabile Aminosäure 7 (Fmoc-Pll-OH) angeknüpft. Nach
Abspaltung der Fmoc- und Allyl-Schutzgruppe erfolgte die Cyclisierung. Nach
jedem wichtigen Syntheseschritt erfolgte eine Testabspaltung mit
anschließender RP-HPLC-offline-MS-Charakterisierung. Den Syntheseweg
durchliefen alle fünf Bibliotheksmitglieder (Peptid 8-12) getrennt nacheinander.
18

3 Sollbruchstellen
Die erhaltenen Chromatogramme sind in Abb. 3.6 dargestellt. Zur
Peptidsequenzierung wurden massenspektrometrische Untersuchungen
vorgenommen, die in Abschnitt 4.1.1 näher beschrieben werden.
Abb. 3.6 RP-HPLC-Diagramm der Testabspaltungen während der Synthese von 8. Die
Peak-Fraktionen wurden aufgesammelt und anschließend massenspektro-
metrisch untersucht.
Säule: C18 Nucleosil 100-5, 4x25 mm; Flussrate = 1 ml/min. Die gewählte
Detektorwellenlänge ist 254 nm. Gradient: 10-85% MeCN in 30 min (MeCN
und H2O mit 0.1% TFA).
In den Chromatogrammen der cyclischen Peptide 8-12 traten immer zwei
Hauptpeaks auf (Abb. 3.6 in grün abgebildet), welche massenspektrometrisch nicht
zu unterscheiden waren. Da die photolabile Aminosäure 7 eine chirale Verbindung
ist, die nicht enantiomerenrein in der SPPS eingesetzt wurde, entstehen
Diastereomere. Möglicherweise sind diese nach der Cyclisierung in ihrer
Konformation soweit eingeschränkt, dass sie sich chromatographisch voneinander
trennen lassen. Zur Bestätigung dieser Hypothese wurde das cyclische Peptid 10
erneut synthetisiert, beide Produkte aufgetrennt und NMR-spektroskopisch
untersucht. Die Synthese erfolgte wie bereits oben beschrieben.
19

3 Sollbruchstellen
Abb. 3.7 RP-HPLC-Diagramm nach einer Testabspaltung des photolabilen cyclischen
Peptids 10 mit 1% TFA. Unter diesen Bedingungen bleibt die Boc-
Schutzgruppe weitestgehend im Peptid erhalten. Deutlich zu erkennen sind
zwei Produktpeaks pro Peptid.
Säule: C-18 Nuclosil 100-5, 4x25 mm; Flussrate = 1 ml/min. Die gewählte
Detektorwellenlänge ist 254 nm. Gradienten: 10-85% MeCN in 20 min. Beiden
Eluenten (Wasser und MeCN) wurde je 0.1% TFA zugesetzt.
Abb. 3.7 zeigt das Chromatogramm eines analytischen RP-HPLC-Laufes nach einer
Testabspaltung des Peptids 10. Unter den bei der Testabspaltung verwendeten
Standard-SieberAmid-Abspaltbedingungen (TFA/TIS/DCM (1:1:98)) bleibt die Boc-
Schutzgruppe weitestgehend auf der Aminogruppe der Lysinseitenkette erhalten. Die
quantitative Abspaltung des Peptids vom Harz erfolgte durch Behandlung mit
TFA/TIS/DCM (95:2,5:2,5), wodurch simultan die Boc-Schutzgruppe entfernt wurde.
Mittels präparativer RP-HPLC wurden die beiden Komponenten voneinander
getrennt. Zur NMR-spektroskopischen Untersuchung wurden von beiden Produkten
COSY-, HSQC-, TOCSY- und ROESY-Experimente durchgeführt. Die Durchführung
eines NOESY-Experiments ist für diese Verbindung nicht sinnvoll, da die Intensität
der erhalten Signale von der molaren Masse abhängt und bei ca. 1000 g/mol gegen
Null geht. Die vollständige Auswertung der erhaltenen Datensätze bestätigt, dass es
sich um zwei cyclische Peptide der gleichen Sequenz mit vermutlich
unterschiedlicher Konfiguration handelt. Abb. 3.8 zeigt exemplarisch einen Ausschnitt
aus einem ROESY-Spektrum, aus dem die Sequenz ausgelesen werden kann. Alle
weiteren NMR-Daten können dem Anhang entnommen werden.
20

3 Sollbruchstellen
Abb. 3.8 Ausschnitt aus dem 600-MHz-ROESY-Spektrum von Peptid 10 (nach prä-
parativer Auftrennung; Fraktion tR = 9,7min). Schematisch eingezeichnet ist
die Zuordnung der Peptidsequenz. Die Kreuzsignale sind mit der in Cara [37]
üblichen Nomenklatur bezeichnet. Die zur Auswertung verwendeten Signale
sind mit gelb hervorgehoben und zur besseren Verständlichkeit mit Nummern
versehen, die sich in der Struktur oben wieder finden.
21

3 Sollbruchstellen
Abb. 3.9 Denkbarer Reaktionsmechanismus der photolytischen Spaltung. [38]
Für eine kinetische Untersuchung der photolytischen Sollbruchstelle wurde Peptid 9
herangezogen. Durch Behandlung des Harzes mit 1% TFA wurde das Boc-
geschützte Peptid 9 von der festen Phase gespalten und anschließend
gefriergetrocknet. Der Rückstand wurde in einem Lösungsmittelgemisch aus Aceto-
nitril (66,6%), Methanol (16,6%), Wasser (16,3%) und Ameisensäure (0,3%) (v/v)
gelöst und in ein HPLC-Probegefäß überführt. Anschließend erfolgte eine
Bestrahlung der Peptidlösung mit UV-Licht (366 nm) für 20, 60, 120, 180, 240 und
360 Sekunden. Ein hypothetischer Reaktionsmechanismus kann Abb. 3.9
entnommen werden. [38] Nach Ablauf der Bestrahlungsdauer wurden RP-HPLC-
Chromatogramme von je 10 µl Peptidlösung aufgenommen. In Abb. 3.10 ist eine
Auswahl der erhaltenen Chromatogramme dargestellt. Vor der Bestrahlung zeigt das
Chromatogramm den Doppelpeak (rot hervorgehoben) des cyclischen Peptids 9 bei
Retentionszeiten von 13,3 und 13,6 min. Im Verlauf der Reaktion nimmt dieser
Eduktpeak, wie erwartet, ab. Synchron zu seinem Verschwinden, wurde die
Entstehung eines Produkts (blau hervorgehoben) bei einer Retentionszeit von 12,6
min beobachtet, dessen UV-Spektrum leicht bathochrom verschoben ist. Das neu
gebildete Produkt zeigte das Phänomen des Doppelpeaks nicht, was nicht weiter
verwunderte, da während der Photoreaktion das Chiralitätszentrum verloren geht. Mit
zunehmendem Reaktionsverlauf ist eine weitere Produktbildung (tR 13,2 min, grün
hervorgehoben) zu erkennen. Da zwischen den einzelnen Bestrahlungszyklen immer
ein HPLC-Lauf erfolgte, lag die Vermutung nahe, dass es sich hierbei nicht um eine
photolytische Reaktion, sondern um eine Zersetzung des photolytischen Spalt-
produktes handeln könnte. Deshalb wurde die Peptidlösung nach der letzten
22

3 Sollbruchstellen
Bestrahlung für 62 Stunden im Kühlschrank gelagert und erneut mittels RP-HPLC
untersucht. Ein Vergleich der Chromatogramme zeigte eine deutliche Abnahme des
photolytischen Spaltproduktes (blau hervorgehoben) und eine Zunahme der neuen
Komponente mit einer Retentionszeit von 13,2 min. Somit konnte die Vermutung
bestätigt werden, dass das gewünschte Produkt der photolytischen Ringöffnung nicht
stabil ist. Durch Ermittlung der Peakflächen bei tR 12,6 min und tR 13,6 min, welche
zu den Stoffmengen proportional sind, und Auftragung dieser gegen die
Bestrahlungsdauer, wurde das Diagramm in Abb. 3.11 erhalten. Auch hier wurde
deutlich, dass es sich zunächst um eine direkte Umwandlung des Edukts zum
Produkt handelte. Die Kinetik der direkten Umwandlung entspricht der einer Reaktion
1. Ordnung. Mit fortschreitendem Reaktionsverlauf wandelt sich das Primärprodukt
zu einer neuen Verbindung um.
Abb. 3.10 RP-HPLC-Diagramme von Peptid 9 nach unterschiedlicher Bestrahlungsdauer
mit 366 nm. Die rot unterlegten Peaks stellen das cyclische Peptid 9 dar. Das
photolytische Spaltprodukt ist in blau unterlegt und wandelt sich ohne
Bestrahlung in eine neue Verbindung um. Diese ist grün unterlegt.
Säule: C-18 Nuclosil 100-5, 4x25 mm; Flussrate = 1 ml/min und einem
Gradienten von 10-85% MeCN in 20 min verwendet. Beiden Eluenten (Wasser
und MeCN) wurden je 0,1% TFA zugesetzt.
23

3 Sollbruchstellen
Abb. 3.11 Die Kinetik zeigt in rot die Abnahme des Edukts. In schwarz ist die Entstehung
des Primärproduktes zu sehen.
Auch andere Arbeitsgruppen haben bei der photolytischen Spaltung dieses Linkers
diverse Nebenreaktionen, wie beispielsweise Dimerisierungen und nucleophile
Angriffe durch primäre Amine oder Thiole, beobachtet. [39, 40] Oftmals konnten die
Nebenprodukte allerdings nicht identifiziert werden. [39, 41] Anhand der erhaltenen
HPLC-, UV- und MS-Daten konnte auch in unserem Fall keine weitere Aussage über
das entstandene Nebenprodukt gemacht werden.
Um weitere Informationen über das durch Photolyse erhaltene Peptidprodukt zu
gewinnen, wurde das cyclische Peptid 10 erneut synthetisiert und mit 1% TFA vom
Harz gespalten. Für die anschließende Photolyse wurde das lyophilisierte Peptid 10
in Acetonitril (66,6%), Methanol (16,6%), Wasser (16,3%) und Ameisensäure (0,3%)
(v/v) gelöst und 420 Sekunden mit UV-Licht bestrahlt. Die bestrahlte Lösung wurde
im Kühlschrank für 24 Stunden verwahrt und anschließend mittels präparativer RP-
HPLC aufgereinigt. Zur NMR-spektroskopischen Charakterisierung wurden COSY-,
24

3 Sollbruchstellen
HSQC-, TOCSY- und ROESY-Experimente durchgeführt. Vergleicht man den
erhaltenen Datensatz mit dem Datensatz des cyclischen Peptids, so bemerkt man
einige Unterschiede: Die Spur der Aminofunktion der Sollbruchstelle (Verknüpfung
zwischen photolabiler Aminosäure und Glutaminsäure) fehlt im TOCSY-Spektrum.
Die Signale der CHCH3-Gruppe am Pll-Aromaten sind weiterhin zu sehen. Der vierte
Substituent am Pll-Aromaten, im Edukt die Nitrogruppe, ist jedoch unklar. Im HSQC-
Spektrum ist eine deutliche Veränderung an der kx-Position der Pll-Kette zu sehen.
Das freie Amin in der Glutaminseitenkette fehlt. Die Signale der Protonen im Pll-
Aromaten verändern sich fast nicht. Eine vollständige Identifizierung der Verbindung
war jedoch leider nicht möglich.
Da man für MS-Identifizierungen der Peptidsequenz auf stabile und eindeutige
Produkte angewiesen ist, ist diese Sollbruchstelle für diesen Zweck nicht geeignet.
25

3 Sollbruchstellen
3.2 Methionin als Sollbruchstelle
Bereits in den 1960er Jahren beschrieben Gross und Witkop die Bromcyan-
vermittelte selektive Spaltung von Peptidbindungen, an denen die Carbonylgruppe
eines Methionins beteiligt ist. [42, 43] Bis heute ist dies die wichtigste nichtenzymatische
Spaltung von Proteinen und Polypeptiden in der Biochemie. Inglis und Edman
befassten sich mit Studien zu Kinetik und Mechanismus dieser Spaltung. [44] Der
heute in Lehrbüchern [45] verbreitete Mechanismus ist in Abb. 3.12 dargestellt.
Die hoch selektive Transformation beginnt mit einer S-Alkylierung des Methioninrests
durch Bromcyan-Behandlung unter wässrig sauren Bedingungen. Die Elektronen des
Cyan-Kohlenstoffs sind in Richtung des elektronegativeren Bromids verschoben.
Dies führt zu einer positiven Teilladung am Kohlenstoff, welche einen nucleophilen
Angriff des Sulfids (Methionin) ermöglicht. Es folgt eine intramolekulare Cyclisierung,
bei der Methylthiocyanat 22 als gute Abgangsgruppe eliminiert wird. Nach saurer
Hydrolyse des entstandenen Iminolactons gelangt man zum C-terminalen
Homoserinlacton (Hsl) 26 und einem freien Amin.
26
Abb. 3.12 Mechanismus der BrCN-Spaltung, wie er üblicherweise in Lehrbüchern zu
finden ist. [45]

3 Sollbruchstellen
Neben der Bromcyanspaltung zur Fragmentierung von Polypeptiden findet man in
der Literatur auch zahlreiche Beispiele, in denen Methionin als Linkergruppe in der
SPPS eingesetzt wurde. [16, 21, 27, 46-50] Nach der Standard-Fmoc-SPPS wird das
Peptid dabei üblicherweise durch Behandlung mit einer Lösung, bestehend aus
BrCN in 70% wässriger TFA (70 mg/ml), vom Harz abgespalten.
Abb. 3.13 Cyclisches Peptid mit Methionin als Linker zum Harz und Sollbruchstelle im
Peptidzyklus. Durch Behandlung mit BrCN wird das Peptid vom Harz
gespalten und der Ring geöffnet. Man erhält ein lineares Peptid in Lösung.
Inspiriert von diesen Arbeiten kam der Gedanke auf, Methionin nicht nur als Linker,
sondern zusätzlich als Sollbruchstelle im cyclischen Peptid zu verwenden. Wird ein
solches System einer BrCN-Behandlung ausgesetzt, so sollte simultan das Peptid
vom Harz gespalten und der peptidische Ring geöffnet werden. Man erhält ein
lineares Peptid in Lösung, welches nun einer Sequenzierung unterzogen werden
kann.
Um das Potential von Methionin als Sollbruchstelle im Zyklus zu überprüfen, wurde
zunächst Peptid 27-33 an SieberAmid-TentaGel-Harz synthetisiert (Abb. 3.14). Im
Hinblick auf eine spätere Sequenzierung des Peptids mittels Massenspektrometrie,
wurde zwischen dem Peptidzyklus und dem Trägerharz eine kurze Massenspacer-
sequenz, bestehend aus -βAla-Pro-Pro-Arg-, synthetisiert. Der Spacer nutzt in
zweierlei Hinsicht. Erstens bringt er die zur Sequenzierung notwendigen Peptid-
fragmente in einen Massenbereich größer 500 m/z und somit über den
Massenbereich der Matrix-Hintergrund-Signale im MALDI-Experiment. Zum Zweiten
wird durch die Anwesenheit von Arginin eine positive Ladung im Peptid gesichert,
welche für die massenspektrometrische Detektion nötig ist.
27

3 Sollbruchstellen
28
Abb. 3.14 Synthese des cyclischen Peptids 33 und anschließende Ringöffnung mit
BrCN-Behandlung.
Abb. 3.15 RP-HPLC von Testabspaltungen während der Synthese von 33. Die Peak-
Fraktionen wurden aufgesammelt und anschließend massenspektrometrisch
untersucht.
Säule: C18 Nucleosil 100-5, ID 4 mm; Flussrate = 1 ml/min. Die gewählte
Detektorwellenlänge war 254 nm. Gradient: 10-85% MeCN in 20 min (MeCN
und H2O mit 0,1% Ameisensäure).

3 Sollbruchstellen
Die Synthese des linearen Vorläuferpeptids 27 erfolgte unter Standard-Fmoc-SPPS
am Peptidsynthesizer. Der Syntheseverlauf wurde mittels Leitfähigkeitsmessung der
Fmoc-Abspaltlösung verfolgt. Nach Entschützung des N-Terminus und der
Carboxylgruppe der Glutaminsäureseitenkette erfolgte zwischen diesen die
Cyclisierung unter Verwendung von PyBOP. Die Reaktionsbedingungen können der
Abb. 3.14 entnommen werden. Zur Untersuchung der Sollbruchstelle wurde das
harzgebundene Cyclopeptid 31 anschließend über Nacht mit Bromcyan in wässrig
saurer Lösung behandelt. Alle Schritte wurden mittels RP-HPLC und nachfolgender
Massenspektrometrie analysiert (Abb. 3.15). In den Chromatogrammen der Peptide
28, 30 und 32 wurden je zwei Hauptpeaks beobachtet. Die massenspektrometrische
offline-Charakterisierung ergab, dass es sich bei den Peaks mit niedrigerer
Retentionszeit (17,921 min, 13,395 min und 13,710 min) jeweils um das
entsprechende Peptid handelte, bei dem Methionin oxidiert vorliegt. Aus den
Chromatogrammen in Abb. 3.15 wird ebenfalls ersichtlich, dass das cyclische Peptid
32 durch Behandlung mit BrCN zum linearen Peptid 33 umgewandelt werden kann.
Methionin ist somit als Sollbruchstelle in cyclischen Peptiden durchaus geeignet.
Die daran anschließenden massenspektrometrischen Sequenzierungsexperimente
sind in Abschnitt 4.1.2 ausführlich beschrieben. Wie dort ausführlich erläutert stellte
sich die rein massenspektometrische Sequenzierung als ungeeignet heraus, somit
erübrigte sich die Anwendung einer simultanen Ringöffnung und Harzspaltung.
Der partielle Edman-Abbau (PED) zeigte sich dagegen als geeigneter zur
Sequenzierung (eine ausführliche Beschreibung hierzu befindet sich in Kapitel 4).
Dies stellt jedoch besondere Anforderungen an den Linker. Ein simultanes
Peptidringöffnen und Abspalten des Peptides vom Harz ist bei dieser Methode nicht
mehr möglich. Alle Schritte müssen festphasengebunden vonstatten gehen und erst
unmittelbar vor der Analytik darf das Peptid vom Harz gespalten werden.
29

3 Sollbruchstellen
3.2.1 Auswahl eines Linkers orthogonal zur Met-Sollbruchstelle
In den oben beschriebenen Experimenten wurde Methionin als Sollbruchstelle und
Linker verwendet. Somit wurde durch die Behandlung mit Bromcyan der Peptidzyklus
geöffnet und gleichzeitig das Peptid vom Harz gespalten. Soll die Bromcyan-
vermittelte Ringöffnung jedoch ohne simultane Abspaltung des Peptids vom Harz
erfolgen, benötigt man einen Linker, der allen verwendeten Bedingungen standhält.
Zur Darstellung des cyclischen Peptids werden folgende Bedingungen verwendet:
Die Standard-Bedingungen der Fmoc-SPPS (20% Piperidin in DMF bzw. NMP),
Entfernung der Allyl- bzw. Alloc-Schutzgruppe (Pd(0) und Nucleophil) und
Abspaltung der säurelabilen Boc-, Trt-, t-Bu- und Pbf-Schutzgruppen (95%TFA aq.).
Zum Öffnen des Peptidzyklus wird eine Bromcyan-Spaltung durchgeführt (BrCN in
70% TFA aq.). Außerdem sollen die festphasengebundenen cyclischen Peptide
einem Screening unterzogen werden (Abschnitt 5.3), welches im wässrigen Milieu
zwischen pH=1-9 verläuft; auch hierbei darf der Linker nicht reagieren. Da sich
herausstellte, dass der partielle Edman-Abbau die geeignetste Methode zur
Sequenzierung ist, muss der Linker schließlich auch zu diesen Bedingungen
kompatibel sein.
Peptid-Synthese
vor dem Screening
30
Abb. 3.16 Ein geeigneter Linker muss zu allen hier aufgeführten Bedingungen
kompatibel sein.

3.2.1.1 Der Arylhydrazin-Linker
3 Sollbruchstellen
Die meisten in der Literatur beschriebenen Linker zeichnen sich dadurch aus, dass
sie leicht spaltbar sind. Der von uns gesuchte Linker muss jedoch ein äußerst breites
Spektrum an chemischen Reaktionen (Bedingungen) überstehen. Eine oftmals
erweiterte Stabilität besitzen sogenannte safety-catch Linker. Ihre Besonderheit
besteht darin, dass man sie vor der Abspaltung vom Harz zunächst aktivieren muss.
Das heißt, sie sind zunächst in ihrer Ausgangsform inert und werden erst während
des vorletzten Syntheseschritts unter speziellen Bedingungen chemisch aktiviert.
Diese Aktivierung erlaubt anschließend eine Freisetzung des gewünschten Produkts
unter milden Bedingungen. Ein auf diesem Prinzip beruhender Linker ist der
Arylhydrazin-Linker. Die Hydrazid-Gruppe wurde bereits vor vierzig Jahren als
Carboxyl-Schutzgruppe in der Peptidsynthese eingesetzt [51, 52] und findet heute als
Linker in der SPPS Verwendung. [53] Der Arylhydrazin-Linker ist inert zu den
Abspaltbedingungen der Boc-, Fmoc- und Alloc-Schutzgruppe. Wie in Abb. 3.17
abgebildet, wird das Hydrazid erst durch Oxidation, üblicherweise mit NBS oder
Cu(II)-Acetat, in die hoch reaktive Azoverbindung umgewandelt, welche mit
Nucleophilen unter Spaltung des Linkers abreagiert. Auf diesem Weg können je nach
verwendetem Nucleophil C-terminale Peptidsäuren, [54] -ester, [54, 55] [54, 56]
-amide,
-thioester, [56] -p-nitrophenole, [57] -lipide [58] und cyclische Peptide [59] erhalten werden.
Abb. 3.17 Abspaltung des Arylhydrazin-Linkers. Erst nach oxidativer Aktivierung kann mit
einem Nucleophil das Peptid vom Harz gespalten werden.
31

3 Sollbruchstellen
Um die Eignung des Arylhydrazin-Linkers für unsere Zwecke zu untersuchen, wurde
zunächst nach optimalen Abspaltbedingungen gesucht. Da die Abspaltung der
Peptidleiter (durch partiellen Edman-Abbau an der festen Phase erzeugt) als letzter
Schritt vor der massenspektrometrischen Charakterisierung erfolgen soll, wurde
versucht, über das Nucleophil beim Abspalten ein Bromisotopenlabel einzuführen.
Durch das somit im Molekül enthaltene charakteristische Isotopenverteilungmuster,
wird die Auswertung der Massenspektren erleichtert. Zunächst wurde das
kommerziell erhältliche Fmoc-geschützte Arylhydrazin-Harz 34 mit Fmoc-βAla-OH
beladen. Zum Drosseln der Beladungsdichte wurde eine Mischung aus Fmoc- und
Boc-βAla-OH (1:1) verwendet. Für die zu untersuchende Abspaltung wurde der
Linker durch Behandlung mit einer Lösung aus NBS, Pyridin und DCM aktiviert und
anschließend mit verschiedenen Nucleophilen umgesetzt (Abb. 3.18).
Abb. 3.18 Das kommerziell erhältliche NovaSyn-TG-Harz 34 wurde mit Aminosäure
beladen. Zur Optimierung der Abspalt-Bedingungen wurde das Harz nach
oxidativer Aktivierung mit folgenden Nucleophilen behandelt: Methanol (35), 2-
Brombenzylalkohol (36), 4-Brombenzylalkohol (37) und 4-Bromanilin (38).
Eine RP-HPLC Analyse der NBS-Aktivierungslösung ergab, dass das Harz während
und nach der Aktivierung äußerst hydrolyseempfindlich ist. Bei Verwendung von
nicht ausreichend wasserfreien Reagenzien wurde die Aminosäure bereits vor
Zugabe des Nucleophils als freie Säure vom Harz abgespalten. Unter Verwendung
der Alkohole 35-37 als Nucleophile zeigte die Analyse der Abspaltlösungen neben
32

3 Sollbruchstellen
Aminosäureestern überwiegend die hydrolysierten Aminosäuren. Gründe für die
Entstehung dieser Hydrolyseprodukte könnten wiederum nicht wasserfreie
Reaktionsbedingungen oder wässrig-saure HPLC-Eluenten sein. Bei der
Verwendung von 36 beziehungsweise 37 als Nucleophil ist auch eine erhöhte
Labilität der Benzylposition während der Ionisierung im Massenspektrometer
denkbar. Verwendet man ein Amin als Nucleophil, greifen die beiden zuletzt
genannten Punkte nicht, da man dann ein stabiles Amid entsteht. Wurde 4-Brom-
anilin 38 als Nucleophil eingesetzt, zeigte die RP-HPLC Analyse nur wenig
Aminosäure (Hydrolyse) und viel Aminosäureamid, weshalb in den darauffolgenden
Experimenten 4-Bromanilin als Nucleophil zum Abspalten verwendet wurde. Um die
Stabilität des Linkers in der geplanten Synthese zu testen, wurde das Peptid 39 am
Synthesizer (20 µmol-Ansatz mit Leitfähigkeitsmonitoring) unter Standard-Fmoc-Be-
dingungen synthetisiert. Der weitere, nicht automatisierte Syntheseweg ist in Abb.
3.19 aufgeführt.
Abb. 3.19 Synthese des festphasengebunden Peptids 43.
Zunächst wurde die Allyl-Schutzgruppe, sowie die Fmoc-Schutzgruppe entfernt und
nach Aktivierung der Carboxylgruppe mit PyBOP cyclisiert. Vom nun cyclischen
Peptid 41 wurde die säurelabile Pbf-Schutzgruppe entfernt und anschließend wurde
durch Behandlung mit BrCN-Lösung der Zyklus geöffnet. Zur Überprüfung der
33

3 Sollbruchstellen
Stabilität des Linkers, wurde die saure Pbf-Abspaltlösung und die anschließenden
Waschlösungen, sowie die BrCN-Spaltlösung und alle folgenden Waschlösungen
mittels MALDI-TOF-MS untersucht. In der Pbf-Abspaltlösung wurde kein Peptid
gefunden; der Linker scheint unter diesen Umständen stabil zu sein. In der BrCN-
Lösung wurde jedoch deutlich nachweisbar hydrolysiertes Peptid gefunden. Somit ist
der Arylhydrazin-Linker nicht stabil unter den verwendeten Bedingungen und eignet
sich folglich nicht.
3.2.1.2 Glykolamid- und Benzamidester (HMBA) als Linker
Glykolamid- und Benzamidester-Linker werden in der Literatur in zweifacher Hinsicht
als stabil beschrieben. Einerseits halten sie den basischen Bedingungen der
Standard-Fmoc-SPPS stand. Andererseits gelten sie auch als stabil gegenüber den
säureinduzierten Seitenkettenschutzgruppenabspaltbedingungen. Die Abspaltung
erfolgt unter basischen, nucleophilen Bedingungen. Auf diesem Weg lässt sich eine
Vielzahl C-terminal modifizierter Peptide darstellen (Tabelle 1).
Tabelle 1 Durch Behandlung mit verschiedenen nucleophilen Reagenzien kann eine
Vielzahl unterschiedlicher C-terminal modifizierter Peptide erhalten werden. [60-
63]
Linker Reagenzien -R Ausbeute Lit.
46
i PrOH/H2O/NaOH -OH 93-97%
46 und 45 Puffer pH 7-8,3 -OH 64-79%
46 und 45 NH3/THF -NH2 90%
46 und 45 NH3/MeOH -NH2 95%
46 und 45 NH3/ i PrOH -NH2 58%
45 H2NEt/NMP -NHEt 16%
45 H2NBu/TEA/THF -NHBu 13%
45 MeOH/DIPEA/DMF -OMe 32%
45 PrOH/TEA/THF -OPr 25%
45 H2NNH2/DMF -NHNH2 23%
34
[61]
[63]
[62]
[62]
[62]
[60]
[60]
[60]
[60]
[60]

3 Sollbruchstellen
Beide Linker wurden auf ihre Stabilität in unserem System überprüft (Abb. 3.16). Zur
Bestimmung der Stabilität der Glykolamidestergruppe als Linker wurde ausgehend
von TentaGel-S-NH2-Harz nach Baleux [61] das Bromacetamid-Harz 47 erhalten,
welches anschließend mit der C-terminalen Aminosäure beladen wurde. [64] Zum
Cappen von etwaigen freien Aminen wurde das Harz abschließend mit einer 10%-
igen Essigsäureanhydridlösung behandelt. Nach dem Trocknen wurde die
Beladungsdichte bestimmt (0,332 mmol/g).
Abb. 3.20 Darstellung des Glykolamid-Harzes 48 zur weiteren Verwendung in der SPPS.
Die Beladung des kommerziell erhältlichen HMBA-Harzes (NovaSyn TG) 49 mit der
ersten Aminosäure erfolgte mit der MSNT/MeIm-Methode [32] (Abb. 3.21).
Anschließend wurde mit Benzoylchlorid gecappt. Die ermittelte Beladungsdichte
betrug 0,18 mmol/g.
Abb. 3.21 Beladung des kommerziell erhältlichen HMBA-Harzes 49 mit der ersten
Amniosäure.
An beiden nun vorliegenden mit Fmoc-Alanin vorbeladenen Harzen (48 und 50)
wurde mittels automatisierter Fmoc-SPPS im 20 µmol-Ansatz die kurze
Peptidsequenz 51 bzw. 52 synthetisiert. Bray et al. [63] weisen darauf hin, dass
während der Synthese das Peptid zum Teil vom Harz gespalten wird. In den beiden
von mir durchgeführten Synthesen wurde im UV-Monitoring kein Einbruch
beobachtet; somit scheint der Linker während der Peptidsynthese stabil zu sein. Um
35

3 Sollbruchstellen
Probleme von ungewollter Fmoc-Abspaltung unter basischen Linker-Spalt-
bedingungen zu umgehen, erfolgte eine manuelle Abspaltung der N-terminal
verbliebenen Fmoc-Schutzgruppe (20% Piperidin). Anschließend wurde der
N-Terminus acetyliert, um das freie Amin zu cappen. Zum Abspalten des vollständig
geschützten Peptids wurde ein Teil des Harzes über Nacht mit einer
Propylaminlösung behandelt, gewaschen (DMF, MeOH, Wasser) und die vereinigten
Lösungen eingeengt. Nach Lyophilisieren wurde das Peptid mittels RP-HPLC und
anschließender ESI-Massenspektrometrie charakterisiert. Für darauffolgende
Stabilitätstests und Quantifizierungen wurde eine definierte Menge Harz eingewogen,
die säurelabilen Schutzgruppen abgespalten, das Harz den zu untersuchenden
Reaktionsbedingungen ausgesetzt und das Peptid anschließend abgespalten. Durch
Integration des Produktpeaks im RP-HPLC-Chromatogramm (bei tR=15,4 min)
konnte das Peptid quantifiziert werden.
36
Abb. 3.22 Eichgerade der Glycolamidester-Datenreihe. Für die Datenreihe in magenta
wurden 2,4 mg 52 eingewogen. Die blaue Datenreihe entstammt einer
Einwaage von 1,7 mg 52.

3 Sollbruchstellen
Zur Erstellung der Eichgeraden wurden pro Harz zwei definierte Mengen
Peptidylharz eingewogen, abgespalten und anschließend pro Einwaage eine
Peptidlösung erstellt. Daraus wurden HPLC-Läufe mit 25, 30 und 50 µl
Injektionsvolumen durchgeführt. Dabei wurde angenommen, dass beide Linker
während der säureinduzierten Spaltung der Seitenkettenschutzgruppen stabil sind
und dass die abschließende Spaltung des Peptids vom Harz quantitativ verläuft.
Beim näheren Betrachten der Eichgeraden (Abb. 3.22) fällt auf, dass die ermittelten
Werte, die aus derselben Lösung, aber unterschiedlichen Injektionsvolumina
entstanden sind, sehr gut auf einer Gerade liegen. Zwischen den verschiedenen
Lösungen gibt es jedoch deutliche Unterschiede, vor allem im Fall der beiden
Glycolamidester-Harz Datenreihen. Somit liegt die Vermutung nahe, dass der Fehler
nicht bei der HPLC-Anlage (Präzision der Probeninjektion, Ermittlung der
Peakfläche), sondern bereits zuvor gesucht werden muss. Hier gibt es viele mögliche
Fehlerquellen, wie das ungenaue Einwiegen (verursacht zum Beispiel durch fehlende
Wägepräzision und/oder statische Aufladung), eine nicht hundertprozentig
reproduzierbare Abspaltreaktion und die anschließende Probenpräparation
(Löslichkeit, Pipettieren). Da das Ziel eine Abschätzung der Linkerstabilität bei
verschiedenen Reaktionsbedingungen war, liegen die Messwerte dennoch in einem
verwertbaren Rahmen. Aus den erhaltenen Werten kann abgelesen werden, ob die
Behandlung mit den getesteten Bedingungen problematisch ist. In Folge dessen
kann abgeschätzt werden, ob mit einem Verlust des Peptids von der festen Phase zu
rechnen ist.
Der Blick in Tabelle 2 zeigt, dass beide Linker nicht die gewünschte Stabilität
besitzen. Der größte Verlust des Peptids vom Harz wurde in beiden Fällen bei der
Behandlung mit TBS-Puffer beobachtet. Während eines typsichen Screenings-
prozesses findet unter diesen Bedingungen üblicherweise eine durch AP-katalysierte
enzymatische Anfärbereaktion zum Visualisieren der Rezeptor-Ligand-
Bindungsreaktion statt. Um dieses Problem zu umgehen, könnte man statt eines AP-
Konjugats ein Peroxidase-Konjugat verwenden, wodurch die Änderung des pH-
Wertes ins Alkalische überflüssig werden würde. Neben der Instabilität bei TBS-
Puffer, weisen beide Linker eine Labilität gegenüber TFA auf. Im Einzelnen
37

3 Sollbruchstellen
Zweck
Tabelle 2 Quantifizierung des Peptids 53 nach Behandlung mit den aufgelisteten
Reaktionsbedingungen, zur Ermittlung der Stabilität der Linker.
Reaktions-
bedingung
Reaktions-
zeit
Ausbeute in %
(Mittelwert ± Standardabweichung)
Glycolamidester HMBA
Eichgerade 102 ± 22 101 ± 10
Ringöffnung BrCN in TFA aq. 17,5 h 48 ± 6 67 ± 9
Partieller
Edman-Abbau
(PED)
Screening
Seitenketten-
schutzgruppen
Pyridin 17 h 114 ± 17 91 ± 10
Pyr/Wasser/NEt3 1 h 86 ± 15 91 ± 14
PITC/FmocOSu 1 h 106 ± 18 82 ± 8
TFA 18 h 30 ± 5 15 ± 2
PBS-Puffer (pH 7.4) 19 h 59 ± 7 92 ± 12
TBS-Puffer (pH 9.0) 1 h 9 ± 1 47 ± 3
Guanidinium HCl 15 min 100 ± 17 93 ± 10
TFA/TIS/Wasser 3 h 98 ± 15 73 ± 6
Pd(PPh3)4/DMB 2x30 min 116 ± 18 110 ± 10
betrachtet scheint dies mit einer Stabilität von zwei Dritteln noch vertretbar. Da TFA
aber bei der Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppen, dem partiellen Edman-
Abbau und der Bromcyan-Spaltung verwendet wird, fällt die Labilität in der Summe
zu stark ins Gewicht. Somit werden auch diese beiden Linker als nicht geeignet
betrachtet.
Wie erwartet zeigte sich die Suche nach einem geeigneten Linker als schwierig.
Sowohl der Arylhydrazin-Linker, als auch der Glykolamid- beziehungsweise der
Benzamidester-Linker erwiesen sich als nicht hinreichend stabil unter den von uns
verwendeten Bedingungen. Es konnte kein Linker gefunden werden, der die
Umsetzung der Methionin-Sollbruchstelle und den anschließenden partiellen Edman-
Abbau an der festen Phase ermöglicht.
38

3 Sollbruchstellen
39

3 Sollbruchstellen
3.3 Tryptophan als Sollbruchstelle
Tryptophan besitzt durch seinen reaktiven Indolring in der Seitenkette das Potential
zur chemoselektiven Spaltung der Polypeptidkette. Trotz einer Vielzahl
beschriebener Reagenzien wurden bisher nur wenige praktikable Methoden
publiziert. Das in Abb. 3.23 gezeigte BNPS-Skatol 59 (3-Brom-3-methyl-2-(2-
nitrophenylthio)-3H-indol) ist das gängigste Reagenz zur Spaltung von Trp-Xaa-
Bindungen (C-terminal von Trp). Es ist ein mildes und selektives Oxidationsmittel,
welches unter sauren Bedingungen als Bromoniumionenquelle dient. Durch oxidative
Halogenierung entsteht zunächst eine Oxotryptophan-Zwischenstufe 55. Diese
reagiert zu einem Iminolacton 56. Unter den sauren Reaktionsbedingungen wird
daraufhin die Polypeptidkette C-terminal von Trp gespalten. [65]
40
Abb. 3.23 BNPS-Skatol (59) dient als Bromoniumionenquelle. Über eine oxidative
Halogenierung wird die Trp-Xaa Bindung gespalten.

3 Sollbruchstellen
Die Literaturausbeuten der Spaltung zeigten eine große Variabilität (40-80%).
Sowohl Zeitler et al. [66] als auch Fontana et al. [67] weisen darauf hin, dass der Erfolg
der Spaltung stark vom Reinheitsgrad des Reagenzes abhängt. Es gilt daher stets zu
beachten, dass es sich um ein lichtempfindliches Reagenz handelt, welches sich bei
Raumtemperatur leicht zersetzt.
Häufig beobachtete Nebenreaktionen sind die Oxidation von Methionin (Sulfid zu
Sulfoxid), Disulfidbildung bei Cystein und eine elektrophile Bromierung von
Tyrosin. [68] Durch kurze Reaktionszeiten und Verminderung der Konzentration wurde
versucht, diese möglichst zu eliminieren. [69]
Um die prinzipielle Einsatzmöglichkeit von Tryptophan als Sollbruchstelle in einem
cyclischen Peptid zu untersuchen, wurde das festphasengebundene Peptid 63
herangezogen, welches einen homodeten Zyklus aufweist. (Abb. 3.24) Die Synthese
der linearen Vorläufersequenz 61 erfolgte am Peptidsynthesizer unter Standard-
Fmoc-SPPS-Bedingungen. Der Verlauf der Reaktion wurde mittels UV-Monitoring
überprüft. Als polymerer Träger diente TentaGel, da dieser in einer späteren
Anwendung der Methode aufgrund seiner guten Quelleigenschaften im wässrigen
Milieu der Träger der Wahl ist. Der Linker, der das Peptid mit dem Harz verbindet,
muss so gewählt werden, dass er den basischen Bedingungen während der SPPS
standhält. Außerdem ist eine Stabilität unter den Abspaltbedingungen der
säurelabilen Schutzgruppen und der Allyl-Schutzgruppe, sowie zur BNPS-Skatol-
Spaltung notwendig. Die Wahl des Linkers fiel hierbei auf Methionin. Als Aminosäure
gewährt es die erforderliche Stabilität. Lediglich bei der oxidativen Halogenierung
mittels BNPS-Skatol könnte es zur Sulfoxid-Bildung kommen; dies ist jedoch mit
einer Reduktion, wie in Abschnitt 4.2.3.3 beschrieben, leicht umkehrbar. Zur
Erleichterung der massenspektrometrischen Charakterisierung und Sequenzierung
wurde auch hier eine Massenspacersequenz –ßAla-ßAla-Arg-Phe(4Br)- am
C-Terminus des Peptids aufgebaut. Diese Spacersequenz sorgt für eine molekulare
Masse größer als 500 Da für alle zur Sequenzierung notwendigen Fragmente. Durch
die Anwesenheit von Arginin ist eine positive Ladung im Peptid gewährleistet. Und
schließlich erleichtert para-Bromphenylalanin, durch das charakteristische
Isotopenverteilungsmuster von Brom, die Auswertung der Massenspektren.
41

3 Sollbruchstellen
Abb. 3.24 Die lineare Vorläufersequenz 61 wurde unter Standard-Fmoc-SPPS am
Synthesizer dargestellt. Nach Abspaltung der Fmoc- und Allyl-Schutzgruppe
erfolgte die Cyclisierung. Nach Entfernen der säurelabilen Schutzgruppen
wurde das homodete Cyclopeptid 63 erhalten.
Die Verknüpfung des eigentlichen cyclischen Peptids mit dem Massenspacer erfolgte
über die Carbonsäure in der Seitenkette der Glutaminsäure; die C-terminale
Carbonsäure war mit einer Allyl-Schutzgruppe blockiert. Der automatisierten SPPS
folgte die sequenzielle Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe am N-Terminus und der
Allyl-Schutzgruppe am C-Terminus. Nach Aktivierung der C-terminalen Carbonsäure
wurde das Peptid cyclisiert. Durch eine abschließende Behandlung des Peptidyl-
Harzes mit TFA/TIS/Wasser wurden die säurelabilen Schutzgruppen entfernt und
man erlangte das gewünschte festphasengebundene Peptid 63.
42
Abb. 3.25 Selektive Ringöffnung durch Umsetzung mit BNPS-Skatol.

3 Sollbruchstellen
Zur anschließenden Untersuchung der BNPS-Skatol-vermittelten Trp-Xaa Ring-
öffnung wurden vier gleich große Aliquote des Peptidharzes 63 (~1,4 µmol) unter-
schiedlichen Reaktionsbedingungen ausgesetzt. In allen Fällen wurde das Harz mit
2,8 eq. BNPS-Skatol (3,5 mM Lösung in 88% Essigsäure) behandelt, während
Reaktionszeit und Temperatur jedoch variierten. Nach Reduktion von möglicherweise
oxidierten Methionin-Resten wurde das Peptid durch Behandlung mit saurer BrCN-
Lösung von der festen Phase gespalten (Abb. 3.25). Mittels MALDI-TOF-MS wurde
der Erfolg der Spaltung bewertet. Wie in Tabelle 3 aufgeführt, wurde nach
sechsminütiger Reaktionszeit in beiden Fällen eine Umsetzung zum gewünschten
Produkt (Peptid 65) beobachtet. Jedoch wurde zudem noch Edukt (cyclisches Peptid
64) nachgewiesen. Der jeweils intensivste Peak in beiden Massenspektren konnte
der Oxotryptophan-Zwischenstufe 55 zugeordnet werden. Die Verlängerung der
Reaktionszeit auf 60 Minuten führte leider nicht zur selektiven Umsetzung zum
gewünschten Produkt.
Reaktions-
zeit
6min RT
6min 47°C
Tabelle 3 Untersuchung der BNPS-Skatol-vermittelten Trp-Xaa-Spaltung bei unter-
Temperatur
schiedlichen Reaktionsbedingungen anhand von Peptid 63.
MALDI-TOF-MS
m/z [Int.]
1398,6 m/z [47%]
1414,6 m/z [87%]
1430,6 m/z [54%]
1398,5 m/z [54%]
1414,5 m/z [78%]
1430,5 m/z [36%]
60min RT 1478,5 m/z [52%]] unklar
Beschreibung
cyclo[TrpGlyHisProGlnGlu]βAlaβAlaPhe(4Br)ArgHsl 64
cyclo[Trp(O)GlyHisProGlnGlu]βAlaβAlaPhe(4Br)ArgHsl
GlyHisProGlnGlu(Trp)βAlaβAlaPhe(4Br)ArgHsl 65
cyclo[TrpGlyHisProGlnGlu]βAlaβAlaPhe(4Br)ArgHsl 64
cyclo[Trp(O)GlyHisProGlnGlu]βAlaβAlaPhe(4Br)ArgHsl
GlyHisProGlnGlu(Trp)βAlaβAlaPhe(4Br)ArgHsl 65
60min 47°C 1414,6 m/z [67%] cyclo[Trp(O)GlyHisProGlnGlu]βAlaβAlaPhe(4Br)ArgHsl
In einem weiteren Experiment wurde die Sollbruchstelle/Linker-Strategie umgekehrt
angewandt. Hierzu wurde also ein Peptid 66 synthetisiert, bei dem die Positionen von
Tryptophan -jetzt als Linker- und Methionin -jetzt am N-Terminus- vertauscht wurden.
Leider glückte die BNPS-Skatol-vermittelte Abspaltung des Peptids vom Harz weder
nach einer Reaktionszeit von 6 min, beziehungsweise 60 min, noch nach
Reaktionszeit über Nacht.
43

3 Sollbruchstellen
Da die gewünschte Spaltung der Trp-Xaa-Bindung nicht in zufriedenstellenderweise
erzielt werden konnte, wurde diese Methode der Peptidzyklusöffnung als
unzureichend selektiv bewertet und verworfen.
3.4 Enzymatische Sollbruchstelle
Eine weitere Möglichkeit, Peptide selektiv zu spalten, bietet der enzymatische
Verdau. Ein hierzu häufig genutztes Enzym ist Trypsin. Trypsin gehört zur Gruppe
der Endopeptidasen, also der Gruppe von Enzymen, die bestimmte Aminosäuren
erkennen und innerhalb der Peptidkette selektiv die Peptidbindung spalten. Die
Trypsin-katalysierte Spaltung der Peptidbindung erfolgt C-terminal nach Lysin,
Arginin und modifiziertem Cystein. Aufgrund der strukturellen Anordnung im aktiven
Zentrum, und dem daraus resultierenden Spaltmechanismus, gehört Trypsin in die
Unterfamilie der Serinproteasen, bei denen ein Serin-Rest das Peptid nucleophil in
der katalytischen Spaltung angreift. Unter basischen Bedingungen, pH 7-8, arbeitet
das Enzym am effektivsten.
Trypsin besteht aus 224 Aminosäuren (23,8 kDa) und ist somit ein eher kleines
Protein. Dennoch stellt sich die Frage, ob Trypsin überhaupt in der Lage ist, ins
Innere der TentaGel-Harzkugel vorzudringen. Dieser Frage gingen Quarrell et al.
nach. [70] Anhand ihrer Ergebnisse aus konfokaler Lasermikroskopie und NMR-
Studien treffen sie die Aussage, dass Enzyme in der Lage sind, TentaGel zu
durchdringen und dabei ihre biologische Aktivität nicht verlieren. Einen guten
Überblick zum Thema „enzymatische Reaktionen an der festen Phase“ gibt ein
Übersichtsartikel von Basso. [71]
Zur Überprüfung der Anwendbarkeit einer enzymatischen Sollbruchstelle in unserem
System wurde am Peptidsynthesizer das lineare Vorläuferpeptid 67 unter Standard-
Fmoc-SPPS-Bedingungen an TentaGel-Harz synthetisiert (Abb. 3.26). Als Linker
diente Methionin. Nach Abspaltung der Allyl-Schutzgruppe am C-terminalen Ende
der Glutaminsäure, sowie der Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe am N-Terminus,
44

3 Sollbruchstellen
erfolgte die Cyclisierung des Peptids. Das nun vorliegende rückgratcyclisierte Peptid
71 konnte auf enzymatische Spaltung hin untersucht werden.
Zunächst wurde das cyclische, noch am Harz gebundene Peptid 71 über Nacht mit
Trypsin behandelt. Die anschließende Abspaltung vom Harz und Charakterisierung
mittels HPLC, MALDI und ESI-MS ergaben keine Öffnung des Peptidrings durch
Trypsin. Auch eine Wiederholung des tryptischen Verdaus in Lösung ergab keine
Ringöffnung. Möglicherweise verhilft die Cyclisierung dem Peptid zu einer
enzymatischen Stabilität. Zhao et al. berichten von Peptiden, welche in der linearen
Form einfach mit Trypsin spaltbar sind, jedoch in cyclischer Form vorliegend völlig
stabil sind. [72] Bei den von mir durchgeführten Experimenten handelte es sich um
erste Versuche der prinzipiellen Spaltung. Da jedoch keinerlei Reaktion
nachgewiesen werden konnte, wurde von weiteren Experimenten mit enzymatischem
Verdau abgesehen.
Abb. 3.26 Synthese des festphasengebundenen Cyclopeptids 71, welches durch die
Behandlung mit Trypsin zum linearen Peptid 73 überführt werden soll.
45

3 Sollbruchstellen
3.5 Ringöffnung durch Edman-Abbau
Eine weitere Möglichkeit, cyclische Peptide chemisch zu spalten, bietet die Chemie
des Edman-Abbaus. Diese Art der chemoselektiven Ringöffnung wurde in unserer
Arbeitsgruppe bereits mehrfach angewandt. [73-75] Hierzu werden Peptide verwendet,
bei denen die Cyclisierung über die Seitenketten erfolgte, so dass der N-Terminus
frei zugänglich bleibt. Behandelt man solche Peptide mit den im Edman-Abbau
verwendeten Reagenzien, so erhält man ein lineares Peptid. Das N-terminal
gespaltene Phenylthiohydantoin-Derivat verbleibt über die Seitenkettenverbrückung
im Peptid gebunden (Abb. 3.27).
Abb. 3.27 Erfolgt die Cyclisierung über die Seitenketten, kann ein freier N-Terminus
erhalten werden. Somit ist das cyclische Peptid für den Edman-Abbau
zugänglich.
In unserer Arbeitsgruppe erfolgte die Peptidsequenzierung bisher über Mikro-
sequenzierung, also den klassischen automatisierten Edman-Abbau, der von
externen Laboratorien durchgeführt wurde. Im Rahmen meiner Arbeit gelang es mir,
diese Sollbruchstelle in den partiellen Edman-Abbau zu integrieren. Eine ausführliche
Beschreibung dazu befindet sich in Abschnitt 4.2.
46

4 Analytik
4 Analytik
Wie bereits in der Einleitung erwähnt, müssen cyclische Peptide vor ihrer
Sequenzanalyse in lineare Peptide überführt werden. Im vorhergehenden Kapitel
wurden verschiedene Wege aufgezeigt und diskutiert, um eine solche Umwandlung
zu realisieren. Das nun folgende Kapitel beschäftigt sich mit der Frage: Welche
Aminosäurensequenz hat das cyclische, beziehungsweise vormals cyclische, Peptid,
das auf dem Hitbead gebunden war?
4.1 De-novo-Sequenzierung
Die De-novo-Sequenzierung von Peptiden ist ein Verfahren zur Bestimmung der
Aminosäuresequenz (Primärstruktur). Im Gegensatz zum in der Proteomic weit
verbreiteten Peptid-Mapping stehen diesem Verfahren keinerlei Vorkenntnisse
hinsichtlich der DNA- oder Proteinsequenz zur Verfügung. Das heißt, die
Aminosäurensequenz muss nicht „nur“ bestätigt werden, sondern von Neuem (lat.
De novo) -im Sinne von „von Grund auf“- gefunden werden. Diese Sequenz-
verifizierung wird mittels Massenspektrometrie durchgeführt. [76]
Abb. 4.1 Komponenten eines Massenspektrometers.
47

4 Analytik
Abb. 4.2 a) Fragmentierungsschema mit Nomenklatur nach Roepstorff und Biemann.
b) Schema zur sequenzspezifischen Fragmentierung eines Peptids. Durch
Spaltung der Peptidbindung entstehen b- und y-Fragmente als
Produktionen. [76]
Jedes Massenspektrometer besteht, vereinfacht dargestellt, aus einem Interface,
also einer Aneinanderkopplung von Bauteilen (Abb. 4.1). In der ersten Einheit, der
Ionenquelle, werden die Ionen generiert. In der zweiten Einheit, dem
Massenanalysator, werden die Ionen gesammelt und anschließend entsprechend
ihres Masse-zu-Ladung-Verhältnisses (m/z-Wertes) an die dritte Einheit, den
Detektor, entlassen. Um eine De-novo-Sequenzierung durchführen zu können, muss
das Massenspektrometer die Fähigkeit besitzen, intakte Peptidionen isolieren zu
können, welche anschließend absichtlich in Fragmente gespalten werden. Die
Fragmentierung verläuft hauptsächlich entlang der Peptidkette (Abb. 4.2). Verbleibt
bei der Spaltung die Ladung an den Fragmenten der N-terminalen Serie, so werden
die entsprechenden Fragmente mit a, b, c indiziert. Verbleibt die Ladung dagegen an
den Fragmenten der C-terminalen Serie, werden sie mit x, y, z bezeichnet. Ein
zusätzlicher Index gibt die Zahl der im Fragmention enthaltenen Aminosäurereste an.
Daher läuft dieser Index für die a-, b- und c-Serie in umgekehrter Reihenfolge zur x-,
y- und z-Serie. Diese Benennungsregeln sind als Roepstorff-Fohlman-Biemann-
Nomenklatur bekannt. Bei höherer Fragmentierungsenergie treten noch zusätzliche
48

4 Analytik
Fragmentionen der Seitenketten auf. [77, 78] Aus den Fragmentspektren können dann
Informationen über die Primärstruktur abgeleitet werden. [45]
In der hier vorliegenden Arbeit wurden die MS(n)-Experimente zur De-novo-
Sequenzierung an einem Esquire3000 plus -Massenspektrometer (Bruker Daltonics)
durchgeführt. Das Gerät verfügt über eine API-ESI (atmospheric pressure interface-
electrospray ionization)-Quelle (Abb. 4.3). Hier werden die Ionen generiert, fokussiert
und anschließend zur Ionenfalle transportiert. Die Elektrosprayionisierung findet bei
Atmosphärendruck statt, die anschließende Analyse jedoch im Hochvakuum, was
über eine spezielle Schnittstelle realisiert wird. Das Herzstück des Gerätes bildet die
elektrische Ionenfalle (ion trap, also der Massenanalysator). Hier werden die Ionen in
einem geeigneten elektrischen Feld gefangen gehalten. Die Ionen können für
variable Zeit (Mikrosekunden bis Sekunden) auf stabilen Bahnen gehalten werden.
Zur Aufnahme eines gewöhnlichen Spektrums werden die Ionen schließlich mit Hilfe
von Multipolfeldern nach ansteigendem m/z-Wert aus der Falle ejiziert und mit einer
Konversionsdynode mit Sekundärelektronenvervielfacher (SEV) nachgewiesen.
Möchte man hingegen ein MS(n)-Experiment zur De-novo-Sequenzierung
durchführen, so muss zunächst das gewünschte intakte Peptidion in der Ionenfalle
isoliert werden. Durch Einstrahlung eines breiten Frequenzspektrums, welches eine
Lücke bei der Resonanzfrequenz des gewünschten Ions besitzt, werden alle anderen
Ionen aus der Ionenfalle entfernt, so dass nur noch das gewünschte Ion (precursor-
ion, Mutter-Ion) vorliegt. Anschließend wird das isolierte Mutter-Ion mit seiner
Resonanzfrequenz angeregt. Die Amplitude bleibt dabei jedoch so gering, dass das
Ion nicht aus der Ionenfalle katapultiert wird. Das so angeregte Ion kollidiert mit in der
Falle befindlichen Heliumatomen, was schließlich zur Fragmentierung führt. Diese
Fragmentierung wird als CID (collision induced dissociation) bezeichnet. [79] Durch
anschließende Massenanalyse wird ein Fragment-Spektrum erhalten. Um den Ablauf
aufzuzeigen, bezeichnet man solche Spektren mit MS („Anzahl der
Isolierungsschritte +1“)/ „Masse des isolierten Ions“. Der Prozess aus Isolierung der
gewünschten Ionenspezies, Fragmentierung und anschließender Massenanalyse
kann mehrfach wiederholt werden. MS(3)/ 966,4 ->572,2 m/z steht beispielsweise für
folgenden Ablauf: Das Ion mit 966,4 m/z wurde isoliert und fragmentiert,
anschließend wurde das dabei entstandene Ion mit 572,2 m/z isoliert und ebenfalls
fragmentiert.
49

4 Analytik
Abb. 4.3 Aufbau des Esquire3000 plus -Massenspektrometers.
4.1.1 Massenspektrometrische Untersuchung der Bibliothek von
cyclischen Peptiden mit photolabiler Sollbruchstelle
Zur massenspektrometrischen Charakterisierung der Bibliothek mit photolabiler
Sollbruchstelle (Peptide 8-12, Synthese in Abschnitt 3.1) wurden die cyclischen
Peptide getrennt voneinander einzeln untersucht. Zur Probenpräparation wurden ca.
5 mg Peptidylharz herangezogen und analog einer Testabspaltung verfahren. Die
anschließend durchgeführten MS(n)-Experimente ergaben, dem ersten Anschein
nach, vielversprechende Resultate. Aus den erhaltenen Spektren, mit Ausnahme des
Spektrums von Peptid 12, konnte über die Massendifferenzen die Sequenz-
information ausgelesen werden und die Peptide der Bibliothek somit eindeutig
unterschieden werden. Bei genauerem Auswerten musste jedoch festgestellt
werden, dass die absoluten m/z-Werte keiner Struktur zugeordnet werden konnten.
50

4 Analytik
Abb. 4.4 MS(2) Spektrum von Peptid 9 (cyclo[Pll-Gly-Pro-Ala-Gly-Phe-Glu]-Lys-NH2)
nach Isolierung und Fragmentierung des intakten Mutter-Ions bei 966,4 m/z.
Abb. 4.4 zeigt, exemplarisch für die Bibliothek, ein MS(2)-Spektrum von Peptid 9.
Wie bereits erwähnt, kann man aus den Massendifferenzen die gewünschte Peptid-
sequenzinformation erhalten. Im Spektrum wurden die m/z-Werte 345,2 und 776,3
rot hervorgehoben. Diese stellen in allen erhaltenen Spektren den Start- bzw
Endpunkt der „Differenzleiter“ dar. Eine molekulare Strukturzuweisung dieser Werte
gelang jedoch nicht. Da es sich bei den eingesetzten Analyten immer um cyclische
Peptide mit intakter photolabiler Sollbruchstelle handelte, ist vermutlich mit einer
Modifikation an dieser „labilen“ Stelle zu rechnen. Die anschließende kinetische
Untersuchung der photolytischen Peptidringöffnung und die NMR-Studien zeigten
jedoch, dass dieses photolabile System nicht geeignet ist. Eine ausführliche
Beschreibung hierzu befindet sich in Abschnitt 3.1.
4.1.2 Massenspektrometrische Untersuchung nach Anwendung
der Met-Sollbruchstelle
Wie in Abschnitt 3.2 beschrieben, konnte anhand des an SieberAmid-Harz
gebundenen Cyclopeptids 31 gezeigt werden, dass sich die Bromcyan-vermittelte
Peptidspaltung zur Cyclopeptidringöffnung nutzen lässt. Zur Vorbereitung der
massenspektrometrischen Sequenzierung wurde eine kleine Menge des harz-
gebundenen cyclischen Peptids 31 (Abb. 3.14) mit BrCN-Lösung behandelt, so dass
eine simultane Ringöffnung und Harzabspaltung erfolgte. Für die Messung wurde
51

4 Analytik
eine Lösung des geöffneten Cyclopeptids 33 ohne vorhergehende Aufreinigung
herangezogen. Das Massenspektrum in Abb. 4.5 oben zeigt das einfach und
zweifach geladene Ion des vormals cyclischen Peptids 33. Die Pbf-Schutzgruppe in
der Arginin-Seitenkette blieb trotz der sauren Bedingungen während der BrCN-
Spaltung im Molekül erhalten. Außerdem weist das Spektrum noch einen Peak auf,
der dem cyclischen Peptid 31 mit oxidiertem Methionin (Methioninsulfoxid)
zugeordnet werden kann. Die Oxidation kann ungewollt während der Kettenver-
längerung der SPPS, der Lagerung oder der Behandlung mit Säure vonstatten
gehen. Da Methioninsulfoxid nicht für die BrCN-Spaltung zugänglich ist, bleibt der
Zyklus in diesem Fall bestehen. Die Ringöffnung des nicht oxidierten cyclischen
Peptids verlief vollständig. Um auch den oxidierten Peptidring mit Bromcyan öffnen
zu können, müsste das Methioninsulfoxid zunächst zu Methionin reduziert werden
(mehr dazu in Abschnitt 4.2.3.3).
52
Abb. 4.5 Oben: „Gewöhnliches“ ESI-Massenspektrum des geöffneten Cyclopeptids 33.
Unten: MS(2)-Spektrum nach Isolierung des Mutter-Ions (1333,1 m/z) und
anschließender Fragmentierung.

4 Analytik
Tabelle 4 Peakliste der erhalten Spektren. Fett hervorgehoben sind die Ionen, die im
MS(n) Isoliert
m/z
nächsten Schritt isoliert und anschließend fragmentiert wurden.
Fragmente
m/z (Int.)
2 1333,1 1316,1 (21%)
1205,0 (100%)
1063,0 (76%)
3 1205,0 1187,9 (36%)
934,8 (100%)
1107,8 (0,4%)
1050,9 (4%)
903,7 (2%)
691,6 (19%)
4 934,8 917,8 (66%)
820,7 (22%)
763,6 (27%)
616,5 (100%)
Beschreibung
H-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu(Hsl)-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)
H-Pro-Gly-Phe-Glu(Hsl)-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-NH2
H-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu(Hsl)-βAla-Pro-Pro-Arg
H-Pro-Gly-Phe-Glu(Hsl)-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)
H-Pro-Gly-Phe-Glu(Hsl)-βAla-Pro-Pro-Arg
H-Gly-Phe-Glu(Hsl)-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-NH2
H-Phe-Glu(Hsl)-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-NH2
H-Glu(Hsl)-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-NH2
H-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-NH2
H-Pro-Gly-Phe-Glu(Hsl)-βAla-Pro-Pro-Arg -17m/z
H-Gly-Phe-Glu(Hsl)-βAla-Pro-Pro-Arg -17m/z
H-Phe-Glu(Hsl)-βAla-Pro-Pro-Arg -17m/z
H-Glu(Hsl)-βAla-Pro-Pro-Arg -17m/z
Ausgehend von einem „gewöhnlichen“ Massenspektrum wurde zunächst immer das
einfachgeladene Ion isoliert und fragmentiert, welches den intensitätsstärksten Peak
im Spektrum lieferte. Dies ergab folgende MS(n)-Reihe: MS -> MS(2)/1333,1 m/z
-> MS(3)/ 1205,0 m/z -> MS(4)/ 934,8 m/z. Auf gleiche Weise wurde mit dem
zweifach geladenen Ion verfahren (MS -> MS(2)/ 667,1 m/z -> MS(3)/603,0 m/z
-> MS(4)/467,9 m/z). Addiert man alle gemessenen MS(n)-Spektren auf, erhält man
das in Abb. 4.6 gezeigte Spektrum. Bei A, B und C handelt es sich um ein Spektrum;
der Übersicht halber wurden die y-Fragmentreihe (A), die b-Fragmentreihe (B), sowie
die Reihe der y-Fragmentionen ohne Pbf-Schutzgruppe und ohne C-terminale
Aminogruppe (C) getrennt voneinander hervorgehoben. Trägt man alle dabei
gefundenen Sequenzinformationen zusammen, so ergibt sich die vollständige
Sequenz. Es sollte jedoch darauf hingewiesen werden, dass eine vollständige
Zuordnung nur deshalb gelang, weil die Sequenz, und somit die gesuchten
Fragmente, aus der Synthese bekannt waren. Eine Sequenzzuordnung aus einem
kombinatorischen Ansatz wäre aus diesen Spektren sicherlich nicht möglich
gewesen, da ein sehr großer Teil der Sequenzinformation auf intensitätsschwachen
Signalen beruht und aus den deutlich erkennbaren Signalen nur wenig Information
gezogen werden kann. Das MS(2)-Spektrum nach Isolierung und Fragmentierung
53

4 Analytik
des intakten Peptidions (in Abb. 4.5 unten) verdeutlicht diese Tatsache. Sieht man
von der Fragmentierung der Pbf-Schutzgruppe und der Aminofunktion am C-
Terminus ab, ist das Mutterion (intaktes Peptid) im Wesentlichen nur an einer Stelle
gebrochen, nämlich N-terminal zu Prolin. Die weitere Fragmentierung dieses Ions
(MS(3)-Spektrum) ergab zwar Informationen über die Sequenz, jedoch handelt es
sich dabei um Signale mit einer Intensität von 0,4-19% (Tabelle 4). Die Information
wurde also mehr gesucht als gefunden. Hiermit sind wir an einer Schwachstelle der
De-novo-Sequenzierung angelangt.
Eine ideale Dissoziationsmethode sollte die Bindungen des Peptidrückgrats wahllos
brechen, unabhängig von Peptidlänge, Ladung, m/z-Verhältnis, sterischer Anord-
nung, Aminosäurenzusammensetzung und –abfolge. Eine solche Methode existiert
jedoch nicht. [80] Während der stoßinduzierten Fragmentierung (CID) wird dem
Mutterion in sehr kurzer Zeit (Pico- bis Mikrosekunden) Energie zugeführt, was zum
Bruch der schwächsten Bindung im Molekül führt. Diese schwächste Bindung ist eine
protonierte Amidbindung. Innerhalb eines Peptids besitzen Amidstickstoffe jedoch
unterschiedliche pKb-Werte; somit unterscheiden sie sich in ihrer Labilität und
verhalten sich nicht ideal. [81] Die N-terminale Seite von Prolin gilt als äußerst labile
Stelle. Diese Beobachtung wird in der Literatur als Prolin-Effekt bezeichnet [82] . Hier
führt nicht, wie früher angenommen, die Protonenaffinität von Prolin zur
Fragmentierung, sondern die sterische Instabilität der Prolin-Bindung. [83-85] Es
existiert eine Vielzahl von zum Teil kontrovers diskutierten massenspektrometrischer
Fragementierungsmechanismen, einige davon wurden von Zhang [81] zusammen-
getragen.
Ein weiterer kritischer Punkt ist die Probenkonzentration und -menge. Alle in der
Arbeit durchgeführten De-novo-Sequenzierungsexperimente erfolgten nach einer
Testabspaltung vom Harz. Hierzu wurde das Peptid von 0,5-10 mg Harz, was in etwa
400-8000 Harzkugeln entspricht, abgespalten und anschließend in 50-100 µl
Lösungsmittel aufgenommen. Bei einem kombinatorischen Ansatz stünde jedoch nur
eine einzige Harzkugel zur Verfügung. Zur erfolgreichen Durchführung der MS(n)-
Experimente am für diese Arbeit zur Verfügung stehenden Massenspektrometer
(Esquire3000 plus ohne Nanoquelle) werden ca. 50 µl Probenlösung benötigt. Dies
würde einer 3 µM-Lösung entsprechen, was unter der Nachweisgrenze des Geräts
liegt.
54

4 Analytik
Abb. 4.6 Summe aller MS(n)-Spektren. A, B und C zeigen jeweils ein und dasselbe
Spektrum. Hervorgehoben sind die unterschiedlichen Fragmentionen-Reihen.
Einfach- und zweifachgeladene Ionen der gleichen molekularen Masse sind
durch gleiche Farbmarkierung gekennzeichnet.
55

4 Analytik
In Anbetracht der Inhomogenität der Fragmentierungsstellen und der geringen
Probenmenge wurde ein rein massenspektrometrischer Ansatz zur Sequenzierung
der Hitbead-gebundenen Peptide verworfen.
4.2 Partieller Edman-Abbau (PED)
4.2.1 Die Mikrosequenzierung – der klassische Edman-Abbau
Ein weiteres Verfahren zur Bestimmung von Peptidsequenzen wurde bereits 1950
von dem schwedischen Wissenschaftler Pehr Edman veröffentlicht. [86, 87] Bei diesem
cyclischen Prozess, der unter dem Namen Edman-Abbau bekannt geworden ist,
handelt es sich um eine Reaktionskaskade, bei der in jedem Reaktionszyklus vom
N-terminalen Ende der Peptidkette eine endständige Aminosäure abgespalten und
identifiziert wird. Die Reaktion besteht aus drei voneinander gut abgegrenzten
Schritten: Kupplung, Spaltung und Konvertierung (Abb. 4.7). Im ersten Schritt, der
Kupplung, wird unter leicht basischen Bedingungen (pH 9) an die freie
N-terminale Aminogruppe der Peptidkette das Edman-Reagenz Phenylisothiocyanat
(PITC) gekoppelt. Es entsteht ein disubstituierter Thioharnstoff, das Phenyl-
carbamoylpeptid (PTC-Peptid). Nach Entfernen des überschüssigen PITC wird das
getrocknete PTC mit wasserfreier Säure, üblicherweise TFA, behandelt. Dabei wird
durch einen nucleophilen Angriff des Schwefelatoms an der Carboxylgruppe der
ersten Peptidbindung die erste Aminosäure als heterocyclisches Derivat, eine
Anilinothiazolinon-(ATZ)-Aminosäure, abgespalten. Befindet sich ein Sauerstoffatom
an der Stelle des Schwefels, wurde also ein Isocyanat anstelle des PITC eingesetzt,
kann das Reagenz zwar auch an die Aminogruppe des Peptids kuppeln, ist aber
nicht zur Ringbildung, und damit auch nicht zur Abspaltung der Aminosäure, fähig.
Im letzten Schritt, der Konvertierung, erfolgt nach der Hydrolyse zur
Phenylthiocarbamoylsäure eine Umlagerung unter Ringschluss zum 3-Phenyl-2-
thiohydantoin (PTH)-Derivat. Die PTH-Aminosäuren können mittels RP-HPLC
identifiziert werden. Durch Optimierung, Automatisierung und technische Weiterent-
wicklungen liegt die Empfindlichkeit heutiger Mikrosequenzierer im femto-molaren
Bereich. [45]
56

N C S
Phenylisothiocyanat
Kupplung
Spaltung
Konvertierung
N
H
S
N
H
R 1
+
H
N
O R 2
H
N
H S O
2-Anilinothiazolin-5-on
N
H
S
N
R 1
H 2O/H
N
H
OH
R 1
O
H 2N
O
OH
+
R 1
N
H
H
N
O R 2
R 3
Peptid
O
H 3N
O
N
H
R 3
O
Phenylthiocarbamat-Addukt
(PTC-Peptid)
R 2
H 2O
Phenylthiocarbamoylsäure 3-Phenyl-2-thiohydantoin
(PTH-Aminosäure)
Abb. 4.7 Reaktionskaskade des Edman-Abbaus.
O
N
H
R 3
O
O
N
S
N
R 1
H
4 Analytik
Peptid mit freiem
N-Terminus,
neue Runde im
Abbauzyklus
Die Mikrosequenzierung ist eine durchaus häufig in der Literatur anzutreffende
Methode zur Sequenzanalyse von Hitbeads, die aus einem Screening einer OBOC-
Peptidbibliothek hervorgingen. [88] Auch in unserer Arbeitsgruppe wurden Hit-
[73, 74]
sequenzen aus OBOC-Peptidbibliotheken mittels Edman-Abbau charakterisiert.
Ein großer Nachteil dieser Methode ist jedoch der relativ hohe Zeitaufwand. Mit einer
Sequenzierungsrate von bestenfalls 3-4 Hitkugeln pro Tag ist die Methode nur
bedingt für einen Einsatz im Hochdurchsatzverfahren geeignet. Die Erfahrungen
unserer Gruppe zeigten sogar, dass man mit nur einer Kugel pro Tag rechnen sollte.
57

4 Analytik
4.2.2 Partieller Edman-Abbau (PED) – die Leitersequenzierung
Bereits 1993 stellten Chait et al. [26] eine Sequenzierungsmethode vor, bei der dem
Edman-Reagenz (PITC) 5% Phenylisocyanat (PIC) zugesetzt wird: Somit wird das
Peptid zu ca. 95% abgebaut, 5% werden jedoch gecappt; der Abbau ist also partiell.
Durch diese Vorgehensweise erzeugt man eine Peptidleiter, weshalb die Methode
auch als Leitersequenzierung bezeichnet wird. Im Gegensatz zum klassischen
Edman-Abbau wird bei der Leitersequenzierung nicht in jedem Zyklus die
abgespaltene PTH-Aminosäure nachgewiesen. Stattdessen wird nach Durchlaufen
aller Abbauschritte die durch den partiellen Abbau erzeugte Peptidleiter massen-
spektrometrisch charakterisiert (PED-MS). Die Leitersequenzierung darf nicht mit der
Leitersynthese [16] verwechselt werden, bei der die Peptidleiter während der Synthese
bereits aufgebaut wird (hierzu siehe 1.3.1).
Die Gruppe um Pei übertrug die Methode der Leitersequenzierung auf
festphasengebundene Peptide aus OBOC-Bibliotheken [27] . Durch die örtliche
Fixierung der Peptide an die feste Phase ist eine sequenzielle Analyse nicht
notwendig. Vielmehr bietet diese Methode eine parallele Abbaumöglichkeit. Das
heißt, es können mehrere Peptide (Harzkugeln) gemeinsam die Chemie des Abbaus
durchlaufen. Am Ende muss lediglich jede Harzkugel separiert werden, die erzeugte
Peptidleiter muss vom Harz gespalten und massenspektrometrisch analysiert
werden. Dieser parallele Ansatz ermöglicht einen immensen Zeitgewinn gegenüber
dem klassischen Edman-Abbau. In einer Weiterentwicklung der Methode zeigte Pei,
dass man unter Verwendung von Fmoc-OSu als Cappingreagenz, an Stelle von PIC,
die Möglichkeit eines spurlosen partiellen Abbaus nutzen kann [89] . Dieses Vorgehen
wird deshalb als spurlos bezeichnet, weil die capping-Gruppe (Fmoc) nach der
Erzeugung der Leiter abgespalten werden kann. Um das Verfahren des PEDs auch
für die Sequenzierung cyclischer Peptide nutzen zu können, bedienten sie sich dem
biphasic approach [17] . Hierzu wird die Harzkugel in einen äußeren und einen inneren
Bereich aufgeteilt. Die äußere Schale präsentiert dem biologischen Target das
cyclische Peptid, während im inneren Bereich der Kugel das lineare Vorläuferpeptid
einen freien N-Terminus für den Edman-Abbau bereithält. [90] Die Gruppe um Pei
konnte bereits einige Cyclopeptidbibliotheken gegen diverse biologische Targets
screenen und die Hitsequenzen anschließend mit dieser Methode ausfindig
58

4 Analytik
machen [91-94] . Mit dem biphasic approach nimmt man jedoch einen entscheidenden
Nachteil auf sich. Man gibt das OBOC-Prinzip auf. Dies ist jedoch nicht sinnvoll; denn
gerade von cyclischen Peptiden erhofft man sich nicht nur eine sequenzspezifische
Selektivität, sondern vor allem auch eine konformative Selektivität. Das heißt durch
ihre konformative Einschränkung passt das Peptid ideal in die Bindungstasche des
Targets, oder aber es passt nicht. Bei der Anwendung des biphasic approachs liegt
die konformative Einschränkung jedoch nur auf der Außenschale der Kugel vor.
Gelingt es dem biologischen Target wider Erwarten ins Innere der Kugel
einzudringen, so handelt es sich nur noch um sequenzspezifische Selektivität (dies
bedeutet falsch positive Antworten). Außerdem kann durch das Aufteilen der Kugel
die Vollständigkeit der Cyclisierung nicht mehr überprüft werden. Die Cyclisierungs
reaktion stellt jedoch oft eine wesentliche Herausforderung während der Synthese
dar. [95] In unseren Augen ist der Verlust des OBOC-Prinzip eine zu große
Einschränkung, weshalb wir uns gegen diesen Kompromiss entschieden haben.
4.2.3 Erweiterung des PEDs auf OBOC-Cyclopeptidbibliotheken
Um auch cyclischen Peptiden einen Zugang zum PED-MS zu geben, haben wir uns
für eine Seitenketten-Cyclisierung entschieden. Die Idee dabei ist, dass somit der
N-Terminus des Peptids für den Edman-Abbau frei zugänglich bleibt, der Ring
sozusagen über eine Sollbruchstelle verfügt (Abschnitt 3.5 und Abb. 4.8). Unterzieht
man solche seitenkettencyclisierte Peptide einem partiellen Edman-Abbau, so erfolgt
im ersten Abbau-Zyklus die Ringöffnung. Man erhält ein lineares Peptid, welches das
N-terminal gespaltene Phenylthiohydantoin-Derivat über die Seitenketten-
verbrückung gebunden mit sich trägt. Das lineare Peptid kann den Abbauzyklus
erneut durchlaufen, so lange bis alle variabel besetzten Positionen bestimmt wurden.
59

4 Analytik
60
Abb. 4.8 Das Prinzip des partiellen Edman-Abbaus von cyclischen Peptiden mit freiem
N-Terminus.

4.2.3.1 Anwendung des Konzepts auf ein Modellpeptid
Boc-Lys(Alloc)-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu(0All)- Ala-Pro-Pro-Arg(Pbf)-Met
1) Pd(PPh 3) 4/BH 3NHMe 2
2) PyBOP/HOBt
Boc-cyclo[Lys-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu]- Ala-Pro-Pro-Arg(Pbf)-Met
BrCN in
70% TFA aq.
75 76
BrCN in
70% TFA aq.
77 78
4 Analytik
Abb. 4.9 Modellpeptid 77. Die Unterstriche zeigen die Aminosäuren, über deren
Seitenkette die Cyclisierung erfolgte.
Zur Überprüfung des Konzepts wurde zunächst ein Modellpeptid 77 synthetisiert
(Abb. 4.9). Im Hinblick auf eine spätere kombinatorische Anwendung erfolgte die
Synthese an TentaGel-Harz, welches optimale Quelleigenschaften in organischen
und wässrigen Lösungen aufweist. Die Anforderungen an eine für das Konzept
geeignete Linkergruppe sind hoch. Der Linker muss sämtlichen Bedingungen der
Cyclopeptidbibliothekssynthese, des Screenings und des partiellen Edman-Abbaus
standhalten (Abb. 4.10). Erst, wenn all diese Schritte durchlaufen wurden, soll eine
quantitative Abspaltung der Peptidleiter von der festen Phase erfolgen.
Abb. 4.10 Ein für das Konzept geeigneter Linker muss den Bedingungen der Synthese,
des Screenings und des partiellen Edman-Abbaus standhalten.
61

4 Analytik
Unsere Wahl für den Linker fiel auf Methionin. (Die Verwendung von Methionin als
Sollbruchstelle wurde in Abschnitt 3.2 ausführlich beschrieben und diskutiert). Auch
in diesem Peptid wurde die bereits erwähnte Massenspacersequenz -βAla-Pro-Pro-
Arg- eingebaut. Die Synthese des linearen Vorläuferpeptids 75 erfolgte nach
Standard-Fmoc-SPPS-Bedingungen am Peptidsynthesizer. Der Syntheseverlauf
wurde mittels Leitfähigkeitsmessung der Fmoc-Abspaltlösung verfolgt. Nach
Abspaltung der Allyl- bzw. Alloc-Schutzgruppe erfolgte die Seitenkettencyclisierung
nach Aktivierung mit PyBOP. Mit der abschließenden Testabspaltung wurde das
Peptid charakterisiert.
Mit dem nun vorliegenden Cyclopeptid 77 wurden erste partielle Edman-Abbau-
Experimente durchgeführt. Zunächst wurde mit einer größeren Menge Harz (2 mg,
ca. 1.600 Harzkugeln) begonnen, um eventuelle Probleme der Nachweisempfindlich-
keit zu umgehen. Im ersten Schritt erfolgte die Abspaltung der noch am Peptid
vorhandenen säurelabilen Schutzgruppen (Boc und Pbf) durch eine ausführliche
TFA-Behandlung der Harzkugeln. Daraufhin wurde das Harz ausgiebig mit
Dichlormethan, Acetonitril und Wasser gewaschen. Das anschließende Waschen der
Kugeln mit Pyridin sowie einer Mischung aus gleichen Teilen Pyridin, Wasser und
0,1% Triethylamin garantierte einen unprotonierten N-Terminus. Nur wenn am
N-Terminus ein freies Elektronenpaar vorliegt, kann der nucleophile Angriff an das
Edman-Reagenz (PITC) erfolgen. Für die Kupplung wurde zum Harz eine unmittelbar
vor dem Gebrauch hergestellte Lösung von PITC und FmocOSu in Pyridin (ca. 30:1)
aufgezogen. Das festphasengebundene Peptid lag nun also als Phenylthiocarbamat-
Derivat bzw. mit Fmoc gecappt vor. Der Kupplung folgten einige Waschschritte mit
Pyridin, Acetonitril und Dichlormethan zum Entfernen der überschüssigen
Reagenzien. Durch Behandlung des Peptidylharzes mit TFA erfolgte die Abspaltung
der N-terminalen Aminosäure, so dass ein „neuer“ freier N-Terminus vorliegt. Beim
ersten Abbauschritt, der Ringöffnung, verbleibt das N-terminale Aminosäurederivat
über die Seitenkettenverbrückung im Molekül erhalten. Bei den darauffolgenden
Zyklen wurde die jeweils entstehende Anilinothiazolinon-(ATZ)-Aminosäure aus dem
Molekül gespalten und anschließend weggewaschen. Durch Waschen der Harz-
kugeln und Einstellen basischer Bedingungen begann ein neuer Abbauzyklus.
62

4 Analytik
Abb. 4.11 MALDI-TOF Massenspektrum der durch partiellen Edman-Abbau erzeugten
Peptidleiter des Modellpeptids 77. Aus den Differenzen der Signale kann die
Peptidsequenz ausgelesen werden.
Der Zyklus wurde so oft wiederholt, bis alle variablen Positionen (deren Anzahl ist
aus der Split-Mix-Synthese bekannt) abgebaut und dadurch die Peptidleiter erzeugt
wurde. Der letzten TFA-Behandlung folgte eine ausgiebige Waschprozedur mit
Dichlormethan, Pyridin und nochmals Dichlormethan. Um den spurlosen Abbau zu
verwirklichen, wurde schließlich das Fmoc-Capping durch Behandlung des Harzes
mit 20% Piperidin in DMF aufgehoben. Zur Abspaltung der Peptidleiter vom Harz
wurde dieses über Nacht mit einer Lösung aus BrCN in 70% TFA aq. behandelt. Das
anschließend erhaltene MALDI-TOF-Massenspektrum der Peptidleiter ist in Abb.
4.11 zu sehen. Aus dem Spektrum kann die vollständige Sequenzinformation
ausgelesen werden. Vergleicht man jedoch die gemessenen m/z-Werte mit den
theoretisch errechneten Werten der Peptidleiter, so fällt auf, dass diese um minus
16 m/z verschoben erhalten wurden. Erst nach dem Abspalten des seitenketten-
verbrückten Glutaminsäure-Lysin-PTH-Derivats stimmen die errechneten und die
ermittelten Massen überein. Diese Beobachtung lässt auf eine Modifikation des im
63

4 Analytik
Peptid gebundenen PTH-Derivats rückschließen. Die Vermutung, dass es sich hier-
bei um einen Schwefel-Sauerstoff-Austausch handeln könnte, konnte durch Hinweise
aus der Literatur bekräftigt werden. So berichtet Edman von folgender
Beobachtung: [96] Eine nicht vollständig umgesetzte Probe von PTC-Leucin wurde im
Luftgegenstrom eingeengt. Das anschließend gemessene UV-Absorptionsspektrum
unterschied sich deutlich von PTC-Leucin und PTH-Leucin. Die Iod-Azid-Reaktion
zum Nachweis von Schwefel zeigte, dass die vorliegende Verbindung keinen
Schwefel mehr enthielt. Ein Vergleich mit dem UV-Absorptionsspektrum von
Phenylcarbamoyl-Leucin zeigte, dass es sich um diese Verbindung handelt.
Innerhalb eines Abbaus bedeutet diese Umwandlung den Abbruch des Zyklus, denn
nur Schwefel ist nucleophil genug für die Spaltung. Da vermutlich alle PTC-
Aminosäuren diese Tendenz zur oxidativen Entschwefelung zu Phenylcarbamyl-
Aminosäuren aufweisen, empfiehlt Edman den Einsatz einer Schutzgasatmosphäre
(Argon). [96]
4.2.3.2 Modellstudie in Lösung zur Aufklärung der Nebenreaktion
H 2N
79
O
OH
PITC in
Pyridin/Wasser
55°C
N
H
S
80
N
H
O
OH
100% TFA
60 min / RT
S
N
Ph
81
H
N
O
TFA
Wasser
Pyridin/Wasser
BrCN in
70% TFA aq.
N
Ph
O
N
Ph
Abb. 4.12 Synthese von PTH-Val für eine anschließende Modellstudie in Lösung.
S
81
82
H
N
H
N
O
O
Bedingungen
während des PED
Bedingungen für
die Abspaltung
vom Harz
Um die Stabilität von PTC-Aminosäuren in unserem System zu überprüfen, wurde
eine Modellstudie in Lösung durchgeführt. Hierfür wurde zunächst ausgehend von
D-Valin 79 durch Umsetzung mit Phenylisothiocyanat Phenylcarbamyl-Valin 80
dargestellt. Der Versuch, das Rohprodukt säulenchromatographisch aufzureinigen
misslang. Deshalb wurde die Reaktionslösung lediglich mit einer Mischung aus
n-Hexan und DCM (9:3) gewaschen, die wässrige Lösung getrocknet und, ohne
Isolierung des Phenylcarbamoyl-Valins, durch Zugabe von TFA zum Phenylthio-
hydantoin-Valin 81 umgesetzt. Phenylthiohydantoin-Valin 81 wurde mittels
64

4 Analytik
präparativer RP-HPLC aufgereinigt und anschließend ausführlich charakterisiert
(NMR, GC, IR, HPLC, MS).
Abb. 4.13 62,5-MHz- 13 C-NMR-Spektren in CDCl3 der Verbindungen 81 (A) und 82 (B).
Man erkannt deutlich das Verschwinden des Thioharnstoff-Signals bei
184,3ppm und das neue Harnstoff-Signal bei 157,2ppm (diese sind gelb
hervorgehoben).
Daraufhin erfolgte die eigentliche Stabilitätsstudie. Hierzu wurden kleine Mengen des
Phenylthiohydantoin-Valins den Bedingungen des partiellen Edman-Abbaus
ausgesetzt und daraufhin mittels RP-HPLC-offline-ESI-MS analysiert. Dabei zeigte
sich, dass 81 während allen Schritten des PEDs unverändert bleibt. Wird die
Verbindung jedoch den Bedingungen ausgesetzt, die zur Abspaltung der Peptidleiter
vom Harz benötigt werden, so erfolgte eine Veränderung im Molekül. Die neu
entstandene Verbindung 82 wurde mittels RP-HPLC in einer Ausbeute von 70%
isoliert. Um die neue Verbindung 82 mit PTH-Val 81 vergleichen zu können, erfolgte
ebenfalls eine ausführliche Charakterisierung. Das ESI-Massenspektrum zeigte
einen Verlust des Molekulargewichts um -16 m/z, wie er auch bei der Peptidleiter
65

4 Analytik
beobachtet werden konnte. Im 13 C-NMR Spektrum verschwand das Signal der
Thiocarbonylgruppe des Thioharnstoffs bei einer chemischen Verschiebung von 184
ppm. Ein neues Signal bei einer chemischen Verschiebung von 157 ppm kam hinzu.
Das neue Signal kann dem Carbonyl-Kohlenstoffatom eines Harnstoffs zugewiesen
werden, welches auf Grund des Schwefel-Sauerstoff-Austauschs zu höherem Feld
verschoben ist. Im IR-Spektrum konnten signifikante Veränderungen der Banden im
Bereich 1800-1000 cm -1 beobachtet werden. Auch das GC-Massenspektrum zeigt
ein Fragmentmuster auf, das für einen Schwefel-Sauerstoff-Austausch spricht. In der
Summe der analytischen Daten konnte 82 somit eindeutig belegt werden. Dies legt
die in Abb. 4.14 gezeigte Nebenreaktion nahe. Der Austausch findet in unserem Fall
nicht wie von Edman beschrieben auf der Stufe des Phenylthiocarbamoyl-Derivates
statt. Der partielle Edman-Abbau verläuft, trotz Anwesenheit von Luftsauerstoff, ohne
Einbruch. Erst die Behandlung mit BrCN-Abspaltlösung führt zum Austausch des
Schwefels durch Sauerstoff. In unserem Fall erfolgte der Austausch beim Phenylthio-
hydantoin-Derivat. Die Literatur kennt Umwandlungen von Phenylthiohydantoin-
Derivaten zu Phenylhydantoin-Derivaten, jedoch sind hierzu drastischere Reaktions-
bedingungen notwendig. Bailey et al. beschreiben eine Entschwefelungsreaktion mit
Quecksilberoxid, weisen aber explizit darauf hin, dass Phenylthiohydantoin-Derivate
erst durch alkalische Hydrolyse in Phenylthiocarbamyl-Derivate überführt werden
müssen, ehe eine erfolgreiche Entschwefelungsreaktion stattfinden kann. [97]
Außerdem wurde die Entschwefelung durch Umsetzung mit Bromwasser, [97] Wasser-
stoffperoxid-Lösung [98] oder einer nucleophilen Substitution mit anschließender
Hydrolyse [99-102] beschrieben. Alle Reaktionen wurden mehrere Stunden unter
Rückfluss erhitzt.
66
Abb. 4.14 Beim Abspalten der Peptidleiter vom Harz wird das Phenylthiohydantoin-
derivat in einer Nebenreaktion zu Phenyhydantoin umgewandelt.

4.2.3.3 Anwendung des Konzepts auf einzelne Kugeln
4 Analytik
Wie in Abschnitt 4.2.3.1 beschrieben, konnte gezeigt werden, dass sich das Konzept
des partiellen Edman-Abbaus erfolgreich auf unser System übertragen lässt. Die
Sequenzierung des Modellpeptids gelang und die dabei beobachtete Nebenreaktion
konnte aufgeklärt werden. Bisher wurde jedoch stets eine größere Menge an
Harzkugeln zur Sequenzierung herangezogen. Nun sollte überprüft werden, ob auch
einzelne Harzkugeln für eine Sequenzbestimmung ausreichen. Der partielle Edman-
Abbau erfolgte wie bereits oben beschrieben. Vor der bromcyanvermittelten
Abspaltung der Peptidleiter von der festen Phase wurden die Harzkugeln unter einer
Stereolupe separiert und einzeln in Eppendorfcaps platziert. Für die Abspaltung
wurde eine unmittelbar zuvor hergestellte Bromcyanlösung in die Caps pipettiert. Die
Kugeln liess man darin über Nacht quellen. Die jetzt in der Lösung vorhandene
Peptidleiter wurde anschließend vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wurde in
MALDI-Lösungsmittel aufgenommen, auf das Target geladen und MALDI-TOF-
Massenspektren gemessen. Zusätzlich zu den Proben wurde immer ein Spot auf
dem Target als Referenz mit MALDI-Solvent/Matrix (α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure,
CHCA) bestückt. Im ersten Versuch wurden für Matrix-Referenz und Probe
(abgespaltene Peptidleiter) analoge Spektren erhalten.
Abb. 4.15 Mechanismus der Reduktion von Sulfoxid mit NH4I in TFA unter Zusatz von
Dimethylsulfid in Peptiden. [103]
67

4 Analytik
Möglicherweise könnte Methionin zu Methioninsulfoxid oxidiert worden sein. Die
Oxidation kann ungewollt während der Kettenverlängerung der SPPS, der Lagerung
oder des partiellen Edman-Abbaus erfolgen. Da Methioninsulfoxid nicht für die BrCN-
Spaltung zugänglich ist, bliebe die Peptidleiter an der festen Phase gebunden. Durch
Behandlung des Harzes mit einer Lösung aus Ammoniumiodid in TFA bei 0°C unter
Zusatz von Dimethylsulfid kann Methioninsulfoxid zu Methionin reduziert werden
(Abb. 4.15). [103-105] Eine solche Behandlung unmittelbar vor der Abspaltung ergab
jedoch keine Verbesserung.
Zur Überprüfung, ob das Peptid vom Harz gespalten werden kann, sich im MALDI-
Lösungsmittel löst und anschließend mittels MALDI-TOF-MS nachgewiesen werden
kann, wurde das intakte Peptid, also ohne vorherigen PED, von einzelnen
Harzkugeln abgespalten. In allen Fällen konnte anschließend ein Massenspektrum
des intakten Peptids erhalten werden. Durch den partiellen Edman-Abbau verringert
sich die Menge des Peptids, welche anschließend zum Nachweis genutzt werden
kann. Vermutlich stößt man dabei an die Nachweisgrenze des verwendeten
Massenspektrometers. Auch bei den hier beschriebenen Messungen wurde als
Referenz eine Messung ohne Peptidprobe (nur Lösungsmittel und Matrix)
durchgeführt. Vergleicht man die Probenspektren mit dem Matrixspektrum, so fällt
auf, dass in den Probenspektren ein sehr hoher Anteil an Matrix-Hintergrund, also
Signale, die von der Matrix bzw. Matrixclustern stammen, enthalten ist.
Keller et al. [106] berichten von solchen Matrix-Hintergrund-Problemen, wenn eine
Analytlösung sehr verdünnt und/oder eine hohe Verunreinigung der Probe durch
Salze vorliegt. Die Matrix- und Matrixcluster-Signale werden deutlich verstärkt,
während die Analytsignale geschwächt werden. Da sich der Matrix-
Hintergrundbereich von α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure (CHCA) bis zu einem
Massebereich von ~2000 m/z erstrecken kann, kann darunter die komplette
Peptidleiter „verborgen“ liegen. Keller weist darauf hin, dass dieses Problem nicht
verhindert werden kann. Eine Umkristallisierung der CHCA aus Ethanol vor dem
Gebrauch als Matrix kann die Erscheinung der Hintergrundsignale etwas dämpfen.
Xu führt mit 3,4-Diaminobenzophenon eine neue Matrix ein, die nach seiner
Beschreibung weniger anfällig ist für dominante Matrix-Hintergrund-Signale. [107]
Schlosser schlägt als Matrix eine Mischung aus gleichen Teilen CHCA und
2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) vor. [108]
68

4 Analytik
Der Vergleich verschiedener Matrices und Lösungsmitteln ergab, dass in unserem
Fall mit folgendem Protokoll zur Probenvorbereitung die besten Ergebnisse erzielt
werden konnten: Der Rückstand im Cap wird in Lösungsmittel A (0,1% TFA in
Wasser/Acetonitril (1:2)) aufgenommen. Anschließend wird die Probenlösung mit der
Matrixlösung (eine gesättigte Lösung aus vor Gebrauch umkristallisierter CHCA/DHB
(1:1) in Lösungsmittel A/Methanol (5:2)) auf dem MALDI-Target gemischt und der
Spot bei Raumtemperatur auskristallisiert.
Um sicher zu stellen, dass Peptide mit verschiedenen Sequenzen richtig unter-
schieden werden können, wurde ein weiteres Peptid 83 (Boc-cyclo[Lys-Ala-Gly-Pro-
Val-Glu]-βAla-Pro-Pro-Arg-Met-TG) analog zu 77 dargestellt. Die festphasen-
gebundenen Peptide 83 und 77 wurden zu gleichen Teilen gemischt und
anschließend einem partiellen Edman-Abbau unterworfen. Die Spektren in Abb. 4.16
zeigen, dass die Peptide erfolgreich sequenziert werden konnten. Somit haben wir
eine Methode zur Hand, die es uns ermöglicht, festphasengebundene cyclische
Peptide, welche als Hitsequenzen aus einer OBOC-Bibliothek hervorgehen, zu
sequenzieren. Eine Anwendung der Methode zur Sequenzanalyse von Hitsequenzen
wird im nächsten Kapitel ausführlich beschrieben.
69

4 Analytik
70
Abb. 4.16 MALDI-TOF-Massenspektren. A) erhalten nach Abspaltung der in 5 Runden
PED erzeugten Peptidleiter von 77. B) erhalten nach Abspaltung der in 5
Runden PED erzeugten Peptidleiter von 83. C) Matrix-Referenz-Spektrum.

5 Anwendung der Methode
5 Anwendung der Methode
Mit der im vorhergehenden Kapitel beschriebenen Erweiterung des partiellen Edman-
Abbaus auf Cyclopeptide steht jetzt eine Methode zur Verfügung, welche eine direkte
Sequenzierung von festphasengebundenen Cyclopeptiden ermöglicht. Nach der
Entwicklung soll nun ihr Nutzen anhand einer konkreten Anwendung gezeigt werden.
5.1 Streptavidin: Ein biologisches Modelltarget
Bei der Suche nach einem geeigneten biologischen Modelltarget fiel die Wahl auf
Streptavidin. Streptavidin ist ein 53 kDa großes Protein, das aus dem Bakterium
Streptomyces avidinii isoliert werden kann. Es handelt sich um ein homotetrameres
Protein, da es aus vier identischen Untereinheiten besteht. Jede dieser
Untereinheiten kann mit sehr hoher Affinität (Ka ~ 10 14 –10 15 M -1 ) ein Biotin-Molekül
binden. Die Streptavidin-Biotin-Bindung ist eine der stärksten bekannten nicht-
kovalenten Bindungen in biologischen Systemen. Im Gegensatz zu Avidin, das
ebenfalls Biotin binden kann, hat Streptavidin wegen seiner geringen Gesamtladung
einen isoelektrischen Punkt im neutralen Bereich. Zudem weist Streptavidin keinerlei
Glycosylierungen auf. Somit sind unspezifische Bindungen in Streptavidin-Systemen
seltener als bei der Verwendung von Avidin. Aufgrund dieser Tatsachen (hohe
Bindungsaffinität und wenige unspezifische Bindungen) findet Streptavidin häufig
Einsatz in verschiedenen Methoden der Biochemie, [109, 110] Immunologie [111] und
Molekularbiologie.
Streptavidin bindet aber nicht nur selektiv an Biotin, sondern erkennt auch selektiv
Peptidsequenzen mit HPQ-Motiv. [112] Schon in der ersten Anwendung der Split-Mix-
Bibliothek wurde von Lam et al. Streptavidin als biologisches Target ausgewählt, [113]
und ist bis heute ein sehr beliebtes Anwendungsmodell. Die HPQ-Peptid/
Streptavidin-Erkennung bildet auch die Grundlage für die heute häufig in der
Biochemie angewandte Strep-tag-Affinitätschromatographie. [114, 115] Bei der
Expression wird dem gewünschten Protein hierzu eine zehn Aminosäuren lange
Peptidsequenz angehängt (Strep tag I = Protein-AWRHPQFGG-OH; Strep tag II =
71

5 Anwendung der Methode
Ac-SNWSHPQFEK-Protein). Beim anschließenden Aufreinigen mittels Affinitäts-
chromatographie bindet das Tag (mit Protein) in der Biotin-Bindetasche des an der
stationären Phase immobilisierten Streptavidins. Peptide ohne Tag werden hingegen
von der Säule gewaschen. Um das Protein abschließend von der Säule zu eluieren,
wird in der Regel mit Desthiobiotin gewaschen (2,5 mM). Prinzipiell könnte das
Protein auch mit Biotin eluiert werden, eine anschließende Regeneration der Säule
wäre dann aber auf Grund der starken Bindung nicht mehr möglich. Durch
Mutationsexperimente wurde eine Streptavidinvariante namens Strep-Tactin
entwickelt, die eine noch bessere Affinität gegenüber Strep-tag zeigt. [116]
Abb. 5.1 Stereogramm eines Streptavidin/Biotin- bzw. Streptavidin/Strep-tag I- Kom-
plexes. In rot zu sehen ist Biotin, welches an Streptavidin (grün) bindet. Strep-
tag I ist in gelb dargestellt und bindet an das in blau dargestellte Strept-
avidin. [115]
Ein Vergleich der Röntgenstruktur vom Streptavidin/Strep-tag I-Komplex mit der vom
Streptavidin/Biotin-Komplex zeigte, dass Strep-tag I in der gleichen Bindungstasche
wie Biotin bindet (Abb. 5.1). Das Peptid ist jedoch nicht in der Lage, so tief in die
72

5 Anwendung der Methode
Bindungstasche einzudringen. Oder aus Sicht des Biotins ausgedrückt, der
Imidazolidinonring des Biotins passt perfekt in die Bindungtasche. Strep-tag ist aber
in der Lage, Biotin nachzuahmen. Das Carboxylamid aus der Seitenkette von
Glutaminsäure (Gln/Q) an Position 6 nimmt dabei den Platz des Biotin-
Schwefelatoms ein. Der Imidazolring in der Seitenkette von Histidin (His/H) an
Position 4 übernimmt die Position des biotinylischen Valerylcarboxylats. Außerdem
konnte gezeigt werden, dass zwischen der peptidischen Carboxylatgruppe und der
Guanidiniumgruppe des Arginins an Position 84 im Streptavidin eine Salzbrücke
ausgebildet wird.
In Tabelle 5 sind Literaturwerte der Bindungskonstanten verschiedener HPQ-Peptide
zu Streptavidin aufgelistet. Den Daten liegen unterschiedliche Experimente zu
Grunde.
Weber [117] und auch die Gruppe um Skerra [115] führten Isotherme-Titrations-
kalorimetrie (ITC) Experimente zur Bestimmung der Bindungskonstanten durch. Die
von Weber untersuchten Peptide wurden von Devlin [112] aus phage-display-
Bibliotheken selektiert. Die in der Gruppe von Skerra untersuchten strep-tagI Peptid-
sequenz gingen ebenfalls durch Selektion aus einer phage-display-Bibliothek
hervor. [114] Von deren Sequenz abgeleitet erfolgte eine Spot-Peptidbibliotheks-
Synthese mit anschließendem kompetitivem Screening, daraus ging Strep-tag II
[114, 115]
hervor.
Gieble [118] und Chang [119] führten zur Bestimmung der Bindungskonstanten SPR-
Experimente durch. Auch die von Giebel untersuchten Peptidsequenzen wurden
mittels phage-display-Verfahren ausfindig gemacht. Bei den SPR-Experimenten
wurden die zu untersuchenden Peptide immobilisiert und Streptavidin als Analyt
verwendet. Die SPR-Experimente gestalteten sich jedoch schwierig; von sechs der
acht untersuchten Peptide konnte keine Bindungskonstante bestimmt werden. Als
Grund hierfür nennen die Autoren eine zu geringe Bindungsaffinität der Peptide. Die
von Chang untersuchte Peptidsequenz wurde aus einer iterativen Dekonvolutions-
Bibliothek mit einem an ELISA angelehnten Screening ermittelt. [120] Für die
Bestimmung der Bindungskonstante immobilisierte Chang Streptavidin auf dem
SPR-Sensorchip und verwendete die zu untersuchenden Peptide als Analyt. Die von
ihm erhaltenen Ergebnisse verdeutlichen evident den Zusammenhang von Struktur
73

5 Anwendung der Methode
und Affinität. Bei gleicher Peptidsequenz bindet das lineare Peptid 1000fach
schlechter als die durch Cyclisierung strukturell eingeschränkten Gegenspieler.
Peptidsequenz
Tabelle 5 Literaturwerte von Streptavidin-„HPQ-Peptid“-Bindungskonstanten. *:für
Werte, die mittels SPR bestimmt wurden, wird zwischen steady-state-affinity
(ssa) und kinetischer (kin) Auswertung unterschieden. ND: aufgrund zu
geringer Affinität konnten keine Bindungskonstanten bestimmt werden.
K D (µM)
*ssa./kin.
Methode Lit
AECHPQGPPCIEGRK --/0,23 SPR (Pept. Immob.) [118]
AESHPQGPPSIEGRK ND SPR (Pept. Immob.) [118]
AEC(Acm)HPQRPPC(Acm)IEGRK ND SPR (Pept. Immob.) [118]
AECHPQFSNCIEGRK ND SPR (Pept. Immob.) [118]
AECHPQFPCIEGRK ND SPR (Pept. Immob.) [118]
AECHPQFSNCIEGRK ND SPR (Pept. Immob.) [118]
AECHPQFNCIEGRK ND SPR (Pept. Immob.) [118]
AECHPQFCIEGRK --/0,66 SPR (Pept. Immob.) [118]
FSHPQNT 125,0 ITC [117]
HDHPQNL 282,0 ITC [117]
Ac-AHPQFPAEK-CONH 2 357,0/ -- SPR (SA Immob.) [119]
Cyclo[AHPQFPAE]K-NH 2 0,270/0,257 SPR (SA Immob.) [119]
Cyclo[AHPQFPAE(K-NH 2)] 0,435/0,355 SPR (SA Immob.) [119]
H 2 N-AWRHPQFGG-OH (pStrep tag) 36,79 ITC [115]
F V -Strep-Tag (exprim.Protein+tag) 18,38 ITC [115]
Ac-WSHPQFEK-OH (pStrepTagII) 72,0 ITC
H2N-CWHPQAGC-OH 13,0 ITC
Es bleibt aber zu erwähnen, dass in der Literatur auch mehrfach Hitsequenzen
gefunden wurden, deren Bindung zu Streptavidin so schwach war, dass die
dazugehörigen KD-Werte nicht bestimmt werden konnten. [90, 118] Meist wurden
ersatzweise IC50-Werte bestimmt.
74
[115]
[115]

5.2 Aufbau einer OBOC-Cyclopeptidbibliothek
5 Anwendung der Methode
Da es sich hier um eine Anwendung der im Rahmen dieser Arbeit entwickelten
Methode handeln sollte, wurde die Synthesestrategie analog zu Abschnitt 4.2.3.
verfolgt. Um die Zahl der als aktiv zu erwartenden Peptidsequenzen zu limitieren,
wurde beim Design der Bibliothek darauf geachtet, dass ein Vorkommen des HPQ-
Motivs nicht an allen Positionen möglich ist (Abb. 5.2).
Abb. 5.2 Syntheseweg der OBOC-Cyclopeptidbibliothek 86.
Das HPQ-Motiv ist in Position 2-4 (das heißt, es verbleiben zwei variable Positionen,
die 7x7=49 verschiedene Peptidsequenzen ermöglichen) und Position 4-6 (5x5=25
mögliche Peptidsequenzen) möglich, in Position 3-5 hingegen nicht. Betrachtet man
die Verbrückung von Lysin und Glutaminsäure auf Grund der amidischen Struktur als
„quasi“-Glutamin, so ist außerdem ein HP“Q“-Motiv in Position 5-7 denkbar (dies
ergibt 5x5x8=200 mögliche Peptidsequenzen). Für weitere Designüberlegungen
dienten die bereits vorhandenen Erkenntnisse über Strep-tag in der Literatur.
75

5 Anwendung der Methode
So wurde beispielsweise in der Röntgenstrukturanalyse von Strep-tag I eine
Salzbrücke zwischen GlyGly-OH (C-terminus Strep-tag) und Arg 84 (Streptavidin)
nachgewiesen. Der Einsatz von Glutaminsäure in zweiter Position Richtung
C-Terminus nach HPQ sollte diese Salzbrücke nachahmen können. [115] In beiden
Strep-tag-Sequenzen folgt C-terminal zum HPQ-Motiv ein Phenylalanin und N-
terminal zwei Positionen vor HPQ ein Tryptophan. Dies sollte auch in der Bibliothek
berücksichtigt werden. Außerdem wurde neben Phenylalanin auch noch
Thienylalanin eingesetzt, welches als unnatürliche Aminosäure Phenylalanin
ersetzen kann. [121] Es wurden sechs variable Positionen mit zweimal sieben, einmal
acht und zweimal fünf möglichen Aminosäuren erzeugt. Daraus ergibt sich eine
Mitgliederzahl von 9800 (=5x5x8x7x7) für diese Bibliothek.
Zum Aufbau der OBOC-Cyclopeptidbibliothek wurden 2 g aminofunktionalisiertes
TentaGel (130 µm/ ca. 1,5 Mio. Kugeln) mit Methionin versehen. Mit Standard-Fmoc-
Chemie wurde manuell die Massenspacerpeptidsequenz (βAPPRM-TG) aufgebaut.
Nach Anknüpfung der geschützten Glutaminsäure erfolgte die Synthese der
variablen Bibliothekspeptide nach dem Protokoll der Split-Mix-Synthese. Die
Anknüpfung von Boc-Lys(Alloc)-OH stellte den letzten Schritt im Aufbau der
Peptidkette dar. Die Syntheseeffizienz wurde durch UV-Messung aller Fmoc-
Entschützungsschritte verfolgt. Von der nun vorliegenden Vorläuferbibliothek aus
linearen Peptiden wurden die Allyl- und Alloc-Schutzgruppen entfernt. Daran
anschließend erfolgte die Cyclisierung der Peptidbibliothek bis im Kaiser-Test und
TNBS-Test keine freien Amine mehr nachzuweisen waren. Die Entschützung der
säurelabilen Schutzgruppen mit TFA/TIS/Wasser erfolgte immer unmittelbar vor dem
Einsatz im biologischen Test. Zur Lagerung wurde die mit Peptidylharz bestückte
Einwegspritze in einem mit Argon gefluteten Schraubdeckelglas im Kühlschrank
aufbewahrt. Da es zu unerwarteten Problemen bei der post-Screening Peptidsequen-
zierung kam, wurde eine identische Bibliothek nochmals auf größeren Harzkugeln
synthetisiert (TentaGel MB300 / 280-320 µm / 65500 Kugeln pro Gramm).
76

5.3 Das Screening
5 Anwendung der Methode
Für den Nachweis der synthetisierten Bibliothek auf biologische Aktivität (Rezeptor-
Ligand-Erkennung) wurde ein Enzym-verknüpfter Farbreaktionstest [122] durchgeführt.
Abb. 5.3: Durchführung eines on-bead-assays mit Rezeptor-Protein/Alkalische
Phosphatase- Konjugat.
Der Ligand ist bei diesem sogenannten on-bead-assay kovalent an die feste Phase
gebunden. Die Umgebung muss zunächst den idealen Bindungsbedingungen des
Rezeptors angepasst werden. Beispielsweise sollte der pH-Wert dem pI-Wert des
Rezeptors entsprechen. Das heißt, die Gesamtladung des Rezeptors ist neutral,
somit sind Bindungen nicht auf statische Wechselwirkungen, sondern auf Erkennung
zurückzuführen. Um unspezifische Wechselwirkungen zwischen Harzkugeln und
Rezeptor zu vermeiden, wird die feste Phase beispielsweise mit BSA, Gelatine oder
Milchpulver geblockt. Nun sind die Harzkugeln für die eigentliche Ligand-Rezeptor-
Erkennung vorbereitet, die Inkubation mit dem Rezeptor kann durchgeführt werden.
Nach ausführlichem Wegwaschen des ungebundenen Rezeptors erfolgt eine
Änderung des pH-Wertes zur Aktivierung des am Rezeptor konjugierten Enzyms.
Dieses Enzym agiert in der anschließenden Farbreaktion als Katalysator. Bei der
Farbreaktion (Abb. 5.4) fungiert die Alkalische Phosphatase als Katalysator bei der
Hydrolyse von 5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat (BCIP) 87 zu 5-Brom-4-
chlorindoxyl 88. Das entstandene Indoxyl fällt nach anschließender Oxidation (durch
Luftsauerstoff bzw. NBT) als tiefblauer Indigo-Farbstoff 89 aus. Nitroblau-
Tetrazoliumchlorid (NBT) 90 wird durch Reduktion zunächst zum roten
Formazanfarbstoff, der durch eine weitere Reduktion zum blauen
Di-Formazanfarbstoff 91 wird und ebenfalls ausfällt. Die beiden ausgefallenen Farb-
77

5 Anwendung der Methode
stoffe bilden einen schwerlöslichen, violett-blauen bis schwarzen Überzug auf den
Harzkugeln.
Alkalische
Phosphatase
Abb. 5.4: Die durch Alkalische Phosphatase katalysierte Farbreaktion mit BCIP/NBT.
5.3.1 Etablierung des Screenings
Für die Optimierung des Testsystems wurden zunächst am Peptidsynthesizer zwei
Kontrollpeptide synthetisiert. Zur eindeutigen Identifizierung der erfolgreichen
Synthese wurde von einer kleinen Menge Harz eine Testabspaltung vorgenommen.
Die abgespaltenen Peptide wurden anschließend mittels RP-HPLC und ESI-MS
charakterisiert. Als Positivkontrolle wurde GHPQG-βAARM-TentaGel, als Negativ-
kontrolle APARG-βAARM-TentaGel dargestellt. Für eine zusätzliche Positivkontrolle
wurde aminofunktionalisiertes TentaGel durch basische Umsetzung mit Biotin-NHS
biotinyliert. Außerdem wurde aminofunktionalisiertes TentaGel als zweite Negativ-
kontrolle herangezogen. Jede dieser vier Kontrollen wurde parallel unter gleichen
Screeningbedingungen behandelt (
Tabelle 6).
78

5 Anwendung der Methode
Tabelle 6 Übersicht der Versuchsbedingungen zur Optimierung des enzymkatalysierten
Farbreaktionstests. Die wichtigen Unterschiede in den Bedingungen sind fett
hervorgehoben.
Zweck Puffer Versuch 1 Versuch 2 Versuch 3 Versuch 4 Versuch 5
Waschen
Wasser 5x1 min 5x1 min 5x1 min 5x1 min 5x1 min
PBS 1x10 min
4x1 min
2x5 min
7x1 min
2x5 min
4x 1min
2x5 min
4x1 min
2x5 min
4x1 min
Blocken 0,1% Gelatine Über Nacht Über Nacht Über Nacht Über Nacht Über Nacht
Waschen
(pH 7,4)
0,1% Tween in
PBS
*: 0,1% Tween,
0,1% Gelatine
in PBS
4x1 min
1x15 min
Anlagern SA-AP in * 2,5 h
Waschen 0,1% Tween in
PBS
6x1 min 1x15 min
4x1 min
1x15 min
4x1 min
1x15 min
4x1 min
5x1 min 5x1 min 5x1 min 5x1 min 5x1 min
0,1 µg/ml
Umpuffern TBS 2x3 min
3,5 h
1 µg/ml
3,5 h
1 µg/ml
3,5 h
1 µg/ml
3,5 h
1 µg/ml
neu gekauft
10x1 min 9x1 min 15x1 min 15x1 min 15x1min
8x1 min
pH 8,0
8x1 min
1x5 min
pH 8,0
15x1 min
pH 8,0
15x1 min
pH 9,5
15x1 min
pH 9,0
Farbreaktion BCIP/NBT 1 h 5 min 30 min 30 min 30 min
quenchen 0,1 M HCl 1x 0,5 min 1x 0,5 min 1x 0,5 min 1x 0,5 min 1x 0,5 min
Im ersten Versuch erfolgte die Inkubation mit einer Streptavidin/Alkalische-
Phosphatase-Konjugat (SA-AP-Konjugat)-Lösung der Konzentration 0,1 µg/ml.
Selbst nach 1h Farbreaktionszeit war jedoch keine Anfärbung der Kugeln zu
beobachten (Abb. 5.5 Bild h). Daraufhin wurde im zweiten Versuch die SA-AP-
Konjugatkonzentration auf 1 µg/ml erhöht. Bereits nach 5 Minuten konnte eine
deutliche Anfärbung der Harzkugeln in beiden Positivkontrollen beobachtet werden.
79

5 Anwendung der Methode
Abb. 5.5: Mikroskopausschnitte während der Optimierung des Screenings.
Die erste Reihe zeigt optimale Bedingungen (Versuch 5): a) Positivkontroll-
peptid, b) Biotin, c) Negativkontrollpeptid, d) TentaGel.
Die untere Reihe zeigt: e) Positivkontrollpeptid mit altem SA-AP-Konjugat
(Versuch 4), f) Biotin mit altem SA-AP-Konjugat (Versuch 4), g) Negativ-
kontrollpeptid mit zu wenigen Waschschritten (Versuch 2), h) Positivkontroll-
peptid mit zu geringer SA-AP-Konjugatkonzentration.
Beim genaueren Betrachten der Kugeln unter dem Stereomikroskop fiel auf, dass die
beiden Positivkontrollen mit einem hellvioletten Niederschlag überzogen waren;
erwartet wurde jedoch ein tiefviolettschwarzer Überzug. Ein möglicher Grund dafür
könnte eine zu kurze Reaktionszeit der Farbreaktion sein. Desweiteren fielen bei
beiden Negativkontrollen lokale Ablagerungen auf den Kugeln auf, was auf
unspezifische Bindungen hinweisen könnte (Abb. 5.5 Bild g). Diese sollten durch
eine Erhöhung der Waschschritte nach der Inkubation mit SA-AP-Konjugat behoben
werden können. Folglich wurde im dritten Versuch die Farbreaktionszeit auf
30 Minuten erhöht und die Waschschritte nach der SA-AP-Konjugatinkubation je
fünfzehnmal wiederholt. Die lokalen Ablagerungen bei beiden Negativkontrollen
wurden mit der Erhöhung der Waschschritte behoben. Die Anfärbung der
Positivkontrolle nahm zu, war aber immer noch nicht zufriedenstellend. Ein weiterer
Grund für eine nicht optimal verlaufende Farbreaktion könnte der pH-Wert während
der enzymkatalysierten Reaktion sein. Im Versuch 4 wurde deshalb der pH-Wert auf
9,5 erhöht. Dies erbrachte jedoch keine Verbesserung. Im fünften Versuch wurde
neu gekauftes SA-AP-Konjugat verwendet. Der pH-Wert des TBS-Puffers wurde auf
pH 9.0 gesenkt, da ein pH-Wert von 9,5 über der Grenze des Pufferbereichs
80

5 Anwendung der Methode
(pH 7-9.2) liegt. Wie die Fotos in Abb. 5.5 (obere Reihe) zeigen, konnten jetzt
optimale Ergebnisse erzielt werden. Sowohl das Harz, welches das positive
Kontrollpeptid trägt (Abb. 5.5 a) als auch das biotinylierte Harz (Abb. 5.5 b) sind
gleichmäßig von einem tiefschwarzvioletten „Lack“ überzogen. Das Harz welches
das Negativkontrollpeptid trägt (Abb. 5.5 c), sowie das unbeladene TentaGel-Harz
(Abb. 5.5 d) sind hingegen farblos.
5.3.2 Screening der OBOC-Cyclopeptidbibliothek 86
Abb. 5.6 Das Screening. A) Vorbereitung der OBOC-Cyclopeptidbibliothek. B) Strept-
avidinbindung. C) Auslösung der Farbreaktion.
Das Screening der OBOC-Cyclopeptidbibliothek 86 erfolgte nach den oben
beschriebenen optimierten Bedingungen (Abschnitt 5.3.1). Hierzu wurden zunächst
durch Zugabe von TFA/TIS/Wasser alle säurelabilen Schutzgruppen entfernt.
Daraufhin wurde das Peptidylharz ausführlich mit Wasser und PBS-Puffer
gewaschen. Das Harz wird dabei auf pH 7,4 eingestellt. In diesem Bereich liegt der
pI-Wert des Streptavidins. Das heißt, hier ist das Protein in der Gesamtladung
neutral und somit sind Bindungen nicht auf statische Wechselwirkungen, sondern auf
Erkennung zurückzuführen. Um unspezifische Wechselwirkungen zwischen
Harzkugeln und Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Komplex (SA-AP-Komplex) zu
vermeiden, wurden die Harzkugeln über Nacht durch Inkubation mit Gelatine
geblockt. Nach gründlichem Waschen mit PBS-Puffer (+ 0,1% Tween + 0.1%
Gelatine) erfolgte dann eine dreistündige Inkubation mit SA-AP Konjugat, die
eigentliche Rezeptor-Ligand Screening-„Reaktion“. Anschließend wurden nicht
gebundene SA-AP-Komplexe durch Waschen mit PBS-Puffer (+ 0,1% Tween)
entfernt. Zur Aktivierung der Alkalischen Phosphatase erfolgt nun eine pH-
81

5 Anwendung der Methode
Wertänderung von 7,4 auf 9,0 durch den Wechsel auf TBS-Puffer. Schließlich
wurden in einer 30 minütigen enzymkatalysierten Farbreaktion die aktiven
Harzkugeln angefärbt. Zum Abstoppen der Reaktion wurde der pH-Wert durch
Waschen mit HCl (0,1 N) abgesenkt. Abschließend wurde das Harz mit Wasser
gewaschen. Zum Aussortieren der Hitbeads wurden alle Harzkugeln in eine
Petrischale überführt. Unter dem Mikroskop wurden mit Hilfe einer Glaskapillare alle
angefärbten Kugeln aufgenommen und gemeinsam in einer Einwegspritze mit PE-
Fritte für den anschließenden partiellen Edman-Abbau gesammelt.
Abb. 5.7: Bild der OBOC-Cyclopeptidbibliothek nach dem Screening mit SA-AP-
Konjugat. Im Ausschnitt sind deutlich sieben Hitbeads erkennbar.
Vor der Sequenzierung wurden die aussortierten Hitbeads mit Guanidiniumlösung
(6 M, pH 1,0) behandelt. Dies dient zur Denaturierung und zum Abstreifen des SA-
AP-Konjugats. Der Farblack wurde durch Waschen mit TFA entfernt. Der
anschließende partielle Edman-Abbau erfolgte wie in Abschnitt 4.2.3. beschrieben.
82

5.4 Die Hitbead-Peptidsequenzen
5 Anwendung der Methode
Ca. 12.700 Harzkugeln (195 mg Peptidylharz 86) wurden dem oben beschriebenem
Screening unterzogen, wobei 48 Kugeln eine Aktivität zeigten. 23 dieser Kugeln
wurden aussortiert und mittels PED-MS eindeutig sequenziert. Unter der Annahme,
dass alle Mitglieder gleichmäßig verteilt in der Bibliothek vorhanden sind und alle
Peptidsequenzen mit HPQ-Motiv binden, wäre zu erwarten, dass 63 Harzkugeln mit
HPQXX-, 32 Harzkugeln mit XXHPQ- und 259 Harzkugeln mit XXXHP“Q“-Sequenz
gefunden werden. Berücksichtigt man nur HPQXX- und XXHPQ-Sequenzen, so
sollten 33,8% der gefundenen Peptide ein HPQXX-Motiv und 66,2% ein XXHPQ-
Motiv aufweisen. Nach den statistischen Verteilungstheorien von Burgess [14, 15] und
Zhao [15] empfiehlt es sich, zur vollständigen Abdeckung der Bibliothek weit mehr
Harzkugeln als die absolute Zahl der Bibliotheksmitglieder für das Screening heran-
zuziehen, da eine gleichmäßige Verteilung aller Bibliotheksmitglieder nicht realistisch
ist.
In Tabelle 7 sind alle ermittelten Peptidsequenzen aufgelistet. Alle 23 gefundenen
Peptide tragen ein HPQXX-Sequenzmotiv. Es wurde kein Peptid mit XXHPQ-Motiv
gefunden. Obwohl die Anzahl der im Screening eingesetzten Kugeln nur knapp das
1,3-Fache der Anzahl aller möglichen Bibliotheksmitglieder betrug, konnten drei der
zwanzig Peptide doppelt gefunden werden. Durch die konformative Einschränkung
der cyclischen Peptide scheint das HPQ-Motiv an Position 2-4 bevorzugt zu sein.
Abb. 5.8 zeigt die prozentuale Häufigkeit (als Balken) der eingesetzten Aminosäuren
(durch Farbe hervorgehoben) an den variablen Positionen. Eine deutliche Selektivität
liegt bei Position 2 mit 100% Histidin, an Position 3 mit 100% Glutamin und bei
Position 4 mit 100% Prolin vor. In Position 5 wurde Glycin (33%) am häufigsten
vorgefunden. Alanin, Histidin, Phenylalanin und Thienylalanin wurden zu je 17%
gefunden. Glutaminsäure und Prolin wurden an Position 5 gar nicht gefunden. An
Position 6 konnte keine bevorzugte Aminosäure mehr gefunden werden.
Literaturbekannte Sequenzen zeigten eine Selektivität zu Glycin bzw.
Phenylalanin [120] C-terminal zum HPQ-Motiv. Glycin war auch in unserer Bibliothek
an dieser Stelle am häufigsten anzutreffen, und auch Phenylalanin und das Phe-
83

5 Anwendung der Methode
Mimetikum Thienylalanin wurden gefunden. Eine wie in der Literatur beschriebene
Bevorzugung von Glutaminsäure zwei Positionen C-terminal zum HPQ-Motiv [115]
konnte in unserem Fall nicht beobachtet werden.
Tabelle 7 Nach dem Screening der Bibliothek cyclo[KX2X3X4X5X6E]-βAPPRM-TG
wurden folgende Peptide gefunden.
Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Häufigkeit
H P Q A A 1
H P Q A G 1
H P Q A P 1
H P Q A Thi 1
H P Q F A 2
H P Q F E 1
H P Q F G 1
H P Q G A 1
H P Q G E 1
H P Q G F 1
H P Q G G 1
H P Q G P 1
H P Q G Q 1
H P Q G Thi 1
H P Q H G 2
H P Q H P 2
H P Q Thi A 1
H P Q Thi E 1
H P Q Thi G 1
H P Q Thi Q 1
84

Xaa2
Position
Xaa3
Xaa4
Xaa5
Xaa6
Ala
Gln
Glu
Gly
His
Phe
Pro
Aminosäure
Ser
5 Anwendung der Methode
Abb. 5.8: Screening der Bibliothek K-X2X3X4X5X6E-βAPPRM-TG. Das Diagramm zeigt
die möglichen Aminosäuren an unterschiedlichen Positionen der
Peptidsequenz (farbige Markierung). Die Höhe der Balken gibt den
prozentualen Anteil an, mit der die Aminosäure an der entsprechenden
Position in den Hitbead-Peptidsequenzen gefunden werden konnte.
Thi
Trp
10
0
40
30
20
70
60
50
100
90
80
%
85

5 Anwendung der Methode
5.5 Bestimmung der Bindungskonstanten
Um die Affinität der gefundenen Peptide zu Streptavidin einordnen zu können,
wurden Bindungsstudien durchgeführt. Die dafür ausgesuchten Peptidsequenzen
sind in Abb. 5.9 aufgeführt.
Abb. 5.9 Die für die Bindungsstudien ausgewählten Peptidsequenzen. Es handelt sich
immer um über die seitenkettencyclisierte Peptide und ihre linearen Analoga.
Über die mit Unterstrich hervorgehobenen Aminosäuren Lysin und
Glutaminsäure erfolgte die Cyclisierung.
Aus den im Streptavidin-Screening positiv getesteten Sequenzen (Hitbead-
sequenzen) wurde eine Peptidsequenz ausgewählt. Die ausgewählte Peptidsequenz
92 ist eine der drei doppelt gefundenen Hitsequenzen. Aufgrund ihrer Aminosäuren-
zusammensetzung erhoffte ich mir von ihr eine besonders gute Löslichkeit im
wässrigen Puffersystem der Bindungsstudie. Verbindung 94 war ebenfalls ein
Mitglied der OBOC-Peptidbibliothek. Dieses Peptid enthält ebenfalls ein HPQ-Motiv
und wurde somit als potentieller Binder eingestuft. Im Screening wurde dieses Peptid
jedoch nicht gefunden. Es stellt sich also die Frage, ob dieses Peptid trotz
vorhandenen HPQ-Motiv eine nur sehr geringe Bindung zu Streptavidin aufweist. Bei
Verbindung 96 wurde das HPQ-Motiv der Hitsequenz invertiert. Das Peptid war kein
Mitglied der Bibliothek. Die Aminosäurenzusammensetzung ist bei allen drei
Peptidsequenzen gleich; sie unterscheiden sich lediglich in der Abfolge der
Aminosäuren (unterschiedliche Sequenz). Somit haben alle drei Sequenzen ein
nahezu gleiches äußeres elektrostatisches Potential. Dadurch können Unterschiede
in der Bindungsaffinität auf molekular-spezifische Selektivität zurückgeführt werden.
Um den Einfluss der konformativen Einschränkung durch die Cyclisierung zu
untersuchen und daraufhin eine Aussage über eine Struktur-Aktivitätsbeziehung
treffen zu können, wurde von allen drei ausgewählten Peptiden die entsprechenden
linearen Analoga hergestellt und ebenfalls experimentell untersucht.
86

5.5.1 Synthese der ausgesuchten Peptidsequenzen
5 Anwendung der Methode
Abb. 5.10 Syntheseweg des cyclischen Peptids 92 und des linearen Gegenspielers 93.
Die Synthese der Peptide 95/94 und 97/96 erfolgten analog dazu.
Exemplarisch für die Synthese der sechs zu untersuchenden Peptide ist in Abb. 5.10
der Syntheseweg der Peptide 93/92 aufgezeigt. Die Synthese erfolgte an RinkAmid-
Research-TentaGel-Harz, welches durch seine niedrige Beladungsdichte (0,18
mmol/g) besonders für die Synthese cyclischer Peptide geeignet ist. Die Elongation
der Peptidkette erfolgte am Peptidsynthesizer. Der Syntheseverlauf wurde über UV-
Messungen der Fmoc-Abspaltlösungen verfolgt. Nach der automatisierten Synthese
der Peptidsequenz erfolgte die Abspaltung der Alloc- und Allyl-Schutzgruppe durch
Behandlung mit Pd(0) und Dimethylbarbitursäure. [123] Daraufhin wurde der Ansatz
halbiert. Eine Hälfte des Harzes wurde mit TFA/TIS/Wasser behandelt, wodurch die
linearen Peptide erhalten wurde. Die andere Hälfte wurde unter Zuhilfenahme von
PyBOP/HOBt cyclisiert und anschließend ebenfalls durch Behandlung mit Säure vom
Harz gespalten. Alle sechs Peptide wurden abschließend mittels präparativer RP-
HPLC aufgereinigt. Da die Spaltung der Peptide mit 95% TFA-Lösung durchgeführt
wurde und auch den verwendeten HPLC-Eluenten TFA zugesetzt wurde, kann davon
ausgegangen werden, dass die Peptide als TFA-Salz vorliegen.
87

5 Anwendung der Methode
5.5.2 SPR-Experimente
Die Oberflächen-Plasmonen-Resonanzspektroskopie [124, 125] (SPR-Spektroskopie) ist
eine wichtige Methode zur Messung von Bindungskonstanten der Interaktion zweier
Biomoleküle. [45]
Kommerziell erhältliche Systeme werden von der Firma Biacore (Uppsala,
Schweden) hergestellt. Kernstück der Anlage ist eine Fließkammer mit optischer
Einheit und angrenzendem austauschbarem Sensor-Chip. Zur Messung der
Bindungskonstante ist einer der Bindungspartner auf der Oberfläche des Sensor-
chips immobilisiert (Ligand), während eine Probe des anderen Bindungspartners
über ein Mikrofluidik-Kanalsystem geleitet wird. Ändert sich durch Bindung von
Molekülen die Massen-Konzentration und damit der Brechungsindex an der
Oberfläche, wird dies als SPR-Antwort gemessen und graphisch als Funktion der
Zeit in einem Sensorgramm dargestellt. Ein Vorteil dieser Methode ist, dass die
Messung der Interaktion von Biomolekülen ohne Markierung, wie zum Beispiel
Fluoreszenz-Label, in Real-Zeit erfolgen kann. Die Biacore-Technik erlaubt dabei
nicht nur Messungen von Affinitäten im Gleichgewicht (KD- bzw. KA), sondern auch
die Messung von Geschwindigkeitskonstanten für den Assoziations- bzw. Dis-
soziationsschritt (koff bzw kon). Ein weiterer Vorteil der Methode ist ihre hohe
Sensitivität, womit für eine Messung nur geringe Mengen an Probe benötigt
werden. [126]
88
Abb. 5.11 a) Aufbau des SPR-Systems. b) Abfall der Intensität des reflektierten Lichts
durch SPR-Anregung in Abhängigkeit des Einfallswinkels. [126]

5 Anwendung der Methode
Oberflächen-Plasmonen-Resonanz (SPR) entsteht durch die Interaktion von Licht mit
einer geeigneten Metall- oder Halbleiteroberfläche, durch die ein quantenoptischer
Effekt ausgelöst wird. Unter bestimmten Bedingungen kann die Energie von
Photonen auf Elektronen-Pakete der Metalloberfläche, Plasmonen genannt,
übertragen werden. Dieser Energie-Transfer erfolgt bei Einstrahlung mono-
chromatischen Lichts bei einem spezifischen Einfallswinkel. Jede Änderung der
Zusammensetzung der Oberfläche und somit des Brechungsindex ändert den
Einfallswinkel bei dem eine maximale Absorption auftritt, dem sogenannten SPR-
Winkel. Dieser Zusammenhang zwischen Änderung des Brechungsindex der
Oberfläche und dem SPR-Winkel ist linear proportional. Die Maßeinheit für das SPR-
Signal ist die Resonanz-Einheit (resonance unit, RU), wobei 1000 RU einer Ver-
änderung des Resonanzwinkels um 0,1° entsprechen. [126]
Abb. 5.12 Der Sensorchip a) Aufbau eines CM5 Sensorchips. b) Der Ligand ist an der
Sensoroberfläche immobilisiert. Der in der mobilen Phase enthaltene Analyt
tritt mit dem immobilisierten Liganden in Interaktion.
Die SPR-Messungen wurden an einem BiacoreT100-Gerät durchgeführt. Beim zu
untersuchenden Bindungssystem stellt sich die Frage, welcher der beiden Bindungs-
partner immobilisiert und welcher als Analyt über die Oberfläche geleitet werden soll.
Betrachtet man dies aus rein physikalischer Sicht des experimentellen Aufbaus, so
wird idealerweise das kleinere Molekül, also das Peptid, immobilisiert. Durch
Interaktion mit dem deutlich größeren Analyt (Protein) kommt es zu einer deutlichen
Veränderung des Brechungsindex und folglich zu einer stärkeren SPR-Antwort. Für
die Bestimmung der Bindungskonstanten wird der Analyt in verschiedenen
89

5 Anwendung der Methode
Konzentrationen als mobile Phase verwendet, wodurch relativ große Mengen an
Substanz benötigt werden. Im Vergleich dazu wird für die Immobilisierung des
Liganden nur sehr wenig Substanz benötigt. Aus Kostengründen ist es somit oftmals
besser, das teuere Protein zu immobilisieren und das Peptid als Analyt zu
verwenden. Zudem hat das Immobilisieren des Proteins den Vorteil, dass mit einem
Chip mehrere Peptide auf ihre Interaktion hin getestet werden können. Wie bei allen
Immobilisierungen ist auch bei der Beladung der Sensorchipoberfläche mit dem
Liganden darauf zu achten, dass der Ligand durch die Immobilisierung nicht an
Aktivität verliert. Ein solcher Verlust könnte beispielsweise erfolgen, wenn eine für die
Interaktion wichtige Stelle des Moleküls (Bindungsdomäne) zur Immobilisierung
verwendet würde oder die dreidimensionale Struktur des Liganden beeinträchtigt
würde. Ich habe mich für die Immobilisierung des Proteins (Streptavidin) auf einem
CM5-Sensorchip entschieden. Der Aufbau eines solchen CM5-Sensorchips ist in
Abb. 5.12 a) dargestellt. Bei allen Sensorchips der CM-Serie ist eine Carboxylmethyl-
dextranmatrix kovalent an die Goldoberfläche gebunden. Die Dextranmatrix ist
flexibel und erlaubt dem daran fixierten Liganden relativ freie Bewegungen. Der
CM5-Sensorchip ist der am häufigsten eingesetzte Chip der CM-Serie. Er zeichnet
sich dadurch aus, dass sowohl kleine als auch sehr große Moleküle daran
immobilisiert werden können. Anstelle von CM5-Sensorchips wäre auch die
Verwendung von Streptavidin- Sensorchips denkbar. Zwei Gründe sprechen jedoch
gegen deren Einsatz: Zum Ersten sind diese erheblich teurer als CM5-Sensorchips,
und zum Zweiten hat man keinen Einfluß auf deren Beladung. Belädt man die CM5-
Sensorchipoberfläche jedoch selbst mit Streptavidin, kann die Beladung gesteuert
werden.
N
HN N
O N O Ligand
HO O EDC O O NHS O O
O
90
Abb. 5.13 Immobilisierungsstrategie auf CM 5 Sensor-Chip.
H
NH 2
Ligand
NH

5 Anwendung der Methode
Die Immobilisierung des Streptavidins auf dem Chip erfolgte nach dem von Biacore
empfohlenen Standardprotokoll [126] durch Aktivierung der Carboxylgruppe auf der
Dextranoberfläche mit N-Ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) und
N-Hydroxysuccinimid (NHS). Durch die Aktivierung bildet sich ein Aktivester, der
dann mit primären Aminofunktionen des Streptavidins (ε-Aminofunktion der Lysin-
seitenkette) reagieren kann (Abb. 5.13). Nach der Belegung der Oberfläche mit
Streptavidin wurden noch aktive Carboxylfunktionen durch Injektion von Ethanolamin
gecappt. Eine der vier Messzellen des CM5-Chips wurde als Referenzzelle
verwendet. Ihre Behandlung erfolgte analog zur Messzelle, jedoch ohne Streptavidin-
injektion.
Die Bindungsstudien erfolgten mit den oben beschriebenen Peptiden (93/92, 97/96,
95/94). Zunächst wurden die Messungen mit Peptidlösungen in einem
Konzentrationsbereich von 0,33-677 µM im Falle der linearen bzw. 0,36-731 µM im
Falle der cyclischen Peptide durchgeführt. Die Lösungen wurden als 1:1 Verdün-
nungsreihe hergestellt. Zur Regenerierung der Chipoberfläche musste lediglich mit
Laufpuffer gespült werden. Die Auswertung erfolgte als Differenzmessung, hierfür
wurde das Signal der Referenzzelle vom Signal der eigentlichen Bindungsmesszelle
subtrahiert. Somit kann sichergestellt werden, dass ausschließlich die tatsächlich
auftretende Interaktion zwischen Streptavidin (Ligand) und Peptid (Analyt) untersucht
wird. Die erhalten Sensorgramme wurden durch Anwendung der Steady-State-
Affinity-Methode mit der Herstellersoftware ausgewertet.
91

5 Anwendung der Methode
Abb. 5.14 Sensorgramm der Bindung des cyclischen Peptids 92 und die Steady-State-
Affinity-Auswertung zur Ermittlung der Bindungskonstanten. Die Auswertung
ergab KD=323 ± 24 µM.
Abb. 5.14 zeigt ein Sensorgramm, das aus der Messung der Interaktion des
cyclischen Peptids 92 erhalten wurde. Aus dem Sensorgramm wird ersichtlich, dass
die Assoziation und Dissoziation des Protein-Peptid-Komplexes sehr schnell
vonstatten gehen. Eine Ermittlung der Bindungskonstanten über kinetische Werte ist
somit nicht möglich. Die Auswertung erfolgte deshalb ausschließlich über die
Anwendung der Steady-State-Affinity-Methode, welche Messwerte nach Einstellung
des Gleichgewichts für die Berechnung von KD-Werten heranzieht. Eine Darstellung
zur Ermittlung der Bindungskonstante ist ebenfalls in Abb. 5.14 zu sehen. Für das
aus dem Screening positiv hervorgegangene cyclische Peptid 92 wurde eine
Bindungskonstante von 323 ± 24 µM bestimmt. Für alle anderen Peptide ergaben
sich Bindungskonstanten, die außerhalb des gemessenen Konzentrationsbereiches
lagen. Um auch von ihnen brauchbare Werte zu erhalten, wurde die Messung mit
einer Peptidkonzentration von 0,01-10 mM wiederholt. Die ermittelten Bindungs-
konstanten können Tabelle 8 entnommen werden.
92

Verbindungsnr.
Linear/Cyclisch
5 Anwendung der Methode
Tabelle 8 Die aus dem SPR-Experiment erhaltenen Bindungskonstanten. Experimente,
die keine brauchbaren Werte ergaben, wurden mit ND (no data) gekenn-
zeichnet.
Sequenz KD (mM)
des linearen Peptids
KD (mM)
des cyclischen Peptids
93/92 H-KHPQHGEβAPPR-NH2 2,76 ± 0,46 0,323 ± 0,024
95/94 H-KHGHPQEβAPPR-NH2 1,80 ± 0,24 8,6 ± 2,7
97/96 H-KQPHHGEβAPPR-NH2 ND ND
Im Falle der Peptide 93/92 mit Hitsequenz zeigte das cyclische Peptid eine
Bindungsaffinität zu Streptavidin von KD = 323 ± 24 µM, während das lineare Peptid
um einen Faktor von 8,5 schlechter band. Dies belegt, dass durch die Cyclisierung
ein Peptid in einer für die Bindung günstigen Konformation fixiert werden kann. Der
umgekehrte Fall zeigt sich bei den Peptiden 94/95 mit HPQ-Motiv in den Positionen
4-6. Hier wurde für die cyclische Form ein KD von 8,6 ± 2,7 mM bestimmt, der
offensichtlich zu hoch war, um die Verbindung beim Bibliotheksscreening
anzufärben. Das (nicht in der Bibliothek enthaltene) lineare Peptid zeigte eine fast
fünffach bessere Bindung. In diesem Fall wird durch die Cyclisierung eine für die
Bindung ungünstige Konformation fixiert. Diese Beobachtung unterstreicht die
Bedeutung der in dieser Arbeit entwickelten Methode zur Analyse von Cyclopeptid-
bibliotheken, bei der die harzgebundenen Cyclopeptide nicht mit linearen Peptid-
fragmenten verunreinigt sind, die zu falschpositiven Ergebnissen führen können.
Mit den durchgeführten SPR-Experimenten konnte gezeigt werden, dass die mit der
neu entwickelten Methode identifizierten Peptide tatsächlich Hitsequenzen sind.
Durch diesen tag-freien Ansatz kann die Kombination von PED und massenspektro-
metrischer Analyse einzelner Harzkugeln jetzt auch auf OBOC-Cyclopeptid-
bibliotheken zur Untersuchung biologisch relevanter Fragestellungen angewandt
werden.
93

6 Synthese fluoreszenzmarkierter Phosphopeptide
6 Synthese fluoreszenzmarkierter Phosphopeptide
6.1 Darstellung von Phosphopeptiden
Prinzipiell gibt es zwei unterschiedliche Ansätze zur Darstellung phosphorylierter
Peptide, die globale Phosphorylierung der Peptide und den Einbau von bereits
[32, 127]
phosphorylierten Aminosäuren während der Peptidelongation.
Abb. 6.1 Globale Phosphorylierung: A) mit Phosphorchloridat B) mit Phosphoramidit.
Bei der globalen Phosphorylierung wird die Phosphatgruppe nach der
Peptidsynthese (post-synthetisch) durch Behandlung mit Phosphorylierungsrea-
genzien, wie zum Beispiel Phosphorchloridat 99 oder Phosphoramidit 103, eingeführt
(Abb. 6.1). Diese Methode bedarf keinerlei Veränderungen bei der Synthese des
Peptids. Für eine gezielte Phosphorylierung ist jedoch eine speziell abgestimmte
Schutzgruppenstrategie notwendig. Bedient man sich des Phosphorchloridats 99 als
Phosphorylierungsreagenz, so greifen unter basischen Bedingungen alle frei vor-
liegenden Hydroxylgruppen des Peptids am Phosphoratom von 99 an und man
gelangt zum Phosphorsäuretriester 100 (Abb. 6.1 A). Bei der Verwendung von
95

6 Synthese fluoreszenzmarkierter Phosphopeptide
Phosphoramidit 103 bildet sich unter leicht sauren Bedingungen (Tetrazol) zunächst
ein Phosphittriester-Intermediat 104. Das Phosphoratom liegt hierbei als P III vor und
muss im nächsten Schritt zum Phosphorsäuretriester 105 mit P V oxidiert werden.
Gebräuchliche Oxidierungsmittel hierfür sind meta-Chlorperbenzoesäure (mCPBA),
tert-Butylhydroxyperoxid und wässrige Jodlösung. Während der Oxidation kann es
leicht zu Nebenreaktionen, wie der Oxidation in den Seitenketten von Cystein,
Methionin und Tryptophan, kommen. Phosphoramidite sind reaktiver als
Phosphorchloridate und werden bei Weitem häufiger verwendet. [127]
Abb. 6.2 Fmoc-Tyr[PO(OBzl)OH]OH 107, der gebräuchlichste Baustein für
Phosphotyrosin beinhaltende Peptide in der Standard-Fmoc-SPPS.
Bedient man sich bereits phosphorylierter Aminosäurederivate, welche mit Schutz-
gruppen versehen sind als Bausteine in der Peptidsynthese, so umgeht man die
Problematik der Oxidation und der Phosphorylierung aller freien Hydroxygruppen.
Die Phosphat-Gruppe wird durch den Gebrauch von Schutzgruppen maskiert, um die
Bildung von Pyrophosphat und Dephosphorylierungen zu verhindern. [128] Bei der
Darstellung von Phosphotyrosin beinhaltenden Peptiden ist der Einsatz von Fmoc-
Tyr[PO(OBzl)OH)]-OH am gebräuchlichsten (Abb. 6.2). Die Benzylgruppe lässt sich
leicht einführen und kann durch Behandlung mit TFA, parallel mit den anderen
säurelabilen Schutzgruppen, schnell entfernt werden. Gewöhnlich finden nur
Monobenzylester Verwendung in der Fmoc/t-Bu SPPS. Dibenzylester bringen keinen
Vorteil, da sie bei der Behandlung mit Piperidin (Fmoc-Entschützen) zu
Monobenzylester umgewandelt werden. [129] Das Einbringen einer
Phosphoaminosäure ist eine schwerwiegende Veränderung in der Sequenz des
Peptids. Peptidsequenzen, die ohne Phosphorylierung leicht zu synthetisieren waren,
96

6 Synthese fluoreszenzmarkierter Phosphopeptide
können mit Phoshorylierung durchaus nur schwer zugänglich sein. In diesem Fall
wäre die post-synthetische Phosphorylierung gegebenenfalls die bessere Wahl.
Phosphotyrosin beinhaltende Peptide zeigen ein charakteristisches UV-Spektrum,
die aromatische Hydroxyl-Gruppe des Tyrosins ist hypsochrom verschoben (von 275
zu 266 nm). [32]
97

6 Synthese fluoreszenzmarkierter Phosphopeptide
6.2 Auswahl des Fluoreszenzlabels
Die Auswahl des Fluoreszenzlabels wird vor allem von der späteren Anwendung
bestimmt. Wie bereits erwähnt, sollen die hier beschriebenen Peptide in einem SH2-
Domänen-Mikroarray angewendet werden. Das Fluoreszenzlabel muss also in erster
Linie an den Chipreader angepasst sein. Der in der Gruppe von Prof. Hauck
verwendete Chipreader ist für die Verwendung der Fluoreszenzfarbstoffe Cy3 und
Cy5 ausgestattet. Möchte man kostengünstigere Farbstoffe als Label verwenden, so
muss man darauf achten, dass diese ähnliche spektroskopische Eigenschaften
aufweisen. Sulforhodamin-B-sulfonylchlorid ist ein geeigneter Farbstoff und wurde in
unserer Gruppe bereits als Fluoreszenzlabel verwendet (Tabelle 9). [130]
Tabelle 9 Vergleich der spektralen Eigenschaften von Sulforhodamin-B-sulfonylchlorid
Farbstoff Farbe des
(SRBS chlorid) mit Cy3.
Fluoreszenzlichtes
λ max, abs.
[nm]
λ max, em.
[nm]
ε max
[10 5 M -1 cm -1 ]
SRBS-OH Orange 564 583 7,2 0,33
Cy3 Orange 550 570 15,0 >0,15
98
φF

6 Synthese fluoreszenzmarkierter Phosphopeptide
6.3 Synthese der beiden Peptide Y241 und pY241
Da die Peptide als Peptidylsäure erhalten werden sollten, erfolgte die SPPS am dafür
gängigen Polystyrol-basierten Wang-Harz 108 (Abb. 6.3). Das kommerziell
erhältliche Harz 108 wurde nach der MSNT/MeIm-Methode [32] mit der C-terminalen
Aminosäure (hier Fmoc-Ala-OH) beladen. Es ergab sich eine Beladungsdichte von
0,2 mmol/g.
HO
Fmoc-SPPS
am ABI433A
O
Fmoc
N
H
O
Wang
1) 20% Piperidin
2) 5eq. Xaa,
5eq. HOBt/HBTU-Lsg,
20eq. DIPEA
Fmoc-Leu-Lys(Boc)-His(Trt)-Asp(O t Bu)-Thr( t Bu)-Asn(Trt)-Ile-Tyr( t Bu)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Met-Asp(O t Bu)-His(Trt)-Lys(Boc)-Ala
N
O
N
SO 3
Wang-Linker
SRBS
O
S
O
108
1) 5eq. MSNT,
3,75eq. MeIm,
5eq. Fmoc-Ala-OH
2) 13eq. BzOH,
2,6eq. Pyridine
1) 20% Piperidin
2) 4eq. SRBS-Chlorid
6eq. DIPEA
3) Reagenz K
109
Wang
Leu-Lys-His-Asp-Thr-Asn-Ile-Tyr-Cys-Arg-Met-Asp-His-Lys-Ala-OH SRBS-Y241
Abb. 6.3 Syntheseweg des fluoreszenzmarkierten Peptids SRBS-Y241.
110
99

6 Synthese fluoreszenzmarkierter Phosphopeptide
Abb. 6.4 UV-Monitoring der Fmoc-Abspaltung während der automatisierten SPPS von
110.
Der Syntheseweg des Peptids SRBS-Y241 ist in Abb. 6.3 aufgezeigt. Der Aufbau der
Peptidkette erfolgte nach Standard-Fmoc-SPPS-Bedingungen am Peptidsynthesizer
im 20 µmol Ansatz. Der Verlauf der Synthese wurde mittels UV-Monitoring verfolgt
(Abb. 6.4). Eine Testabspaltung direkt nach der automatisierten Synthese mit
anschließender RP-HPLC-offline-ESI-MS-Analyse bestätigte den Erfolg der
Synthese. Es folgte eine manuelle Behandlung des Harzes mit 20% Piperidin in DMF
zur Entfernung der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe. Deren Vollständigkeit wurde
ebenfalls durch UV-Messung überprüft. Nach ausführlichem Waschen und Trocknen
des Peptidylharzes erfolgte die Anknüpfung der Fluoreszenzmarkierung. Hierzu
wurde das Harz über Nacht mit einer Lösung aus 4 eq. Sulforhodamin-B-
sulfonylchlorid (SRBS-Chlorid) und 6eq. DIPEA in DMF behandelt. Daraufhin wurde
das fluoreszenzmarkierte Peptid mit Reagenz K vom Harz gespalten. Unter diesen
Bedingungen werden simultan alle säurelabilen Seitenkettenschutzgruppen entfernt.
Das Peptid SRBS-Y241 wurde ausgefällt, mittels präparativer RP-HLPC aufgereinigt
und konnte mit einer Ausbeute von 34% (bezogen auf 20 µmol) erhalten werden.
100

6 Synthese fluoreszenzmarkierter Phosphopeptide
Abb. 6.5 Syntheseweg des fluoreszenzmarkierten Phosphopeptids SRBS-pY241.
Der Syntheseweg des Phosphopeptids SRBS-pY241 ist in Abb. 6.5 aufgeführt. Die
Elongation der ersten sieben Aminosäuren erfolgte analog zum Aufbau von Y241 am
Peptidsynthesizer. Die Anknüpfung des Phosphotyrosinbausteins, sowie die des
darauffolgenden Isoleucins wurden manuell durchgeführt. Als Kupplungsreagenz
wurde PyBOP/HOBt verwendet. Die weitere Verlängerung der Peptidkette erfolgte
wiederum am Peptidsynthesizer. Auch das anschließende Labeln mit SRBS, sowie
die Abspaltung und Aufreinigung erfolgten analog zum Aufbau von Y241. Das
fluoreszenzmarkierte Phosphopeptid SRBS-pY241 konnte mit einer Gesamt-
ausbeute von 13% (bezogen auf 20 µmol) erhalten werden.
101

6 Synthese fluoreszenzmarkierter Phosphopeptide
6.4 Synthese der beiden Peptide Y230 und pY230
Für die Synthese der beiden Peptide Y230 und pY230 wurde das Wang-Harz mit der
MSNT/MeIm-Methode [32] mit Fmoc-Asp(O t Bu)-OH beladen. Die Beladungsdichte
betrug 0,7 mmol/g.
Ausgehend von Fmoc-Asp(OtBu)-Wang-Harz erfolgte die automatisierte Synthese im
20 µmol Ansatz am Peptidsynthesizer (Abb. 6.6). Auch hier wurde der
Syntheseverlauf über die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe mittels UV-Messung
verfolgt. Das UV-Monitoring der Synthese ist in Abb. 6.7 gezeigt. Die Synthese verlief
bei weitem nicht optimal. Es konnten zwei deutliche Einbrüche der Synthese
detektiert werden. Die Testabspaltung im Anschluss an die SPPS mit
darauffolgender RP-HPLC-offline-ESI-MS-Analyse bestätigte den Syntheseeinbruch.
Es wurde eine acetylierte Fragmentreihe der Peptidsequenz gefunden, die Fmoc-
geschützte vollständige Peptidsequenz 115 konnte nur in geringen Mengen erhalten
werden (Abb. 6.10).
102
Abb. 6.6 Automatisierte Synthese des Peptids 115 am Peptidsynthesizer.

Abb. 6.7 UV-Monitoring der automatisierten SPPS von 115.
6 Synthese fluoreszenzmarkierter Phosphopeptide
Ein häufiger Grund für den Sytheseeinbruch bei der SPPS ist die Ausbildung von
Sekundarstrukturelementen (vor allem β-Faltblatt-Strukturen) während des
Peptidaufbaus. [131, 132] Prolin beziehungsweise N-alkylierte Aminosäuren weisen eine
natürliche Neigung als Sekundärstrukturbrecher auf. Nach deren Vorbild wurden
Aminosäurederivate entwickelt, mit deren Hilfe auch schwer zugängliche
Peptidsequenzen synthetisierbar gemacht werden können. Vertreter hierfür sind, wie
in Abb. 6.8 zusehen, Pseudoprolin, [133, 134] Hmb-, [135, 136] Dmb-, [137] Tmob [138] -
Aminosäuren und O-Isoacyldipeptide [139, 140] . Sie werden als Strukturbrecher in die
Peptidsequenz eingebaut. Nach vollständigem Aufbau der Peptidkette werden sie
gemeinsam mit den säurelabilen Seitenkettenschutzgruppen in die entsprechenden
Aminosäuren überführt. Der Vollständigkeit halber bleibt zu erwähnen, dass
O-Isoacylpeptide hierbei eine Sonderrolle einnehmen, da sie erst durch eine
abschließende Änderung des pH-Werts vom Depsipeptid zum Peptid umgelagert
werden.
103

6 Synthese fluoreszenzmarkierter Phosphopeptide
Pseudoprolin
N
H
R 1
O
N
O
R 3
O
NH
R 2
O
R 2 : H = Ser
CH 3 = Thr
116 117
O-Isoacylpeptid
N
H
R 1
O
BocHN
O R 2
118
O
H
N
R 3
O
R 2 : H = Ser
CH 3 = Thr
N-Alkyl-Aminosäure
N
H
R 1
R ' O OMe
N
O
O
R 3
R 2
NH
R''
O
R' R''
Dmb: CH 3 H
Hmb: H H
Tmob: CH 3 OCH 3
Abb. 6.8 Peptide mit eingebauten Sekundärstruktur-brechenden Amniosäurederivaten.
Mutters Pseudoprolin-Dipeptide sind zweifelsfrei die effektivsten und am einfachsten
einzuführenden Vertreter. [64, 141] Sie setzen jedoch einen Serin- bzw. Threoninrest in
der Peptidsequenz voraus, welche als Prolin-ähnliche TFA-labile Oxazolidine
geschützt eingesetzt werden. Üblicherweise werden Pseudoproline zusammen mit
ihrer N-terminal benachbarten Aminosäure als Dipeptid eingeführt. Somit muss der
sterisch gehinderte Oxazolidin-Stickstoff nicht acyliert werden. Solche Pseudoprolin-
Dipeptide sind als gebrauchsfertige Bausteine für die Fmoc-SPPS kommerziell
erhältlich. Um einen optimalen Nutzen zu erzielen, sollten folgende Punkte beachtet
werden: Der optimale Abstand zum N- bzw. C-Terminus, sowie zu einem Prolinrest,
beträgt 5-6 Aminosäuren. Der Mindestabstand zwischen zwei Pseudoprolin-
Dipeptiden bzw. zu Prolin sollte zwei Aminosäuren sein. Pseudoprolin-Dipeptide
sollten möglichst vor einem hydrophoben Sequenzbereich eingeführt werden. [134]
Da das in der automatisierten Standard-Synthese fehlgeschlagene Peptid 115 ein
Serin-Rest enthält, habe auch ich mich für den Einsatz eines Pseudoprolin-Dipeptid-
Baussteins entschieden. Kritische Syntheseschritte wurden zur besseren Kontrolle
manuell durchgeführt.
104

Fmoc-SPPS
am ABI433A
Fmoc
N
H
O
6 Synthese fluoreszenzmarkierter Phosphopeptide
Wang
1) 20% Piperidin
2) 5eq. Xaa,
5eq. HOBt/HBTU-Lsg,
20eq. DIPEA
3) Ac 2O/HOBt und DIPEA
Fmoc-Ile-Tyr( t Bu)-Glu(O t Bu)-Glu(O t Bu)-Leu-Leu-Lys(Boc)-His(Trt)-Asp(O t Bu)
Fmoc NH
O
N
O
O
t BuO
O
manuelle
Fmoc-SPPS
Fmoc-Pro-Arg(Pbf)-Thr( Wang
tBu)-Ala-Ala-Ser( Me,MePro)-Ile-Tyr( tBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Lys(Boc)-His(Trt)-Asp(OtBu) 121
114
Wang
1) 20% Piperidin
2) 5eq. Fmoc-Ala-Ser( Me,Me Pro)-OH
5eq. PyBOP/HOBt-Lsg,
10eq. DIPEA
3) 10% Ac 2OinDMF
Ile-Tyr( Wang
tBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Lys(Boc)-His(Trt)-Asp(OtBu) 120
Fmoc-SPPS
am ABI433A
1) 20% Piperidin
2) 5eq. Xaa,
5eq. HOBt/HBTU-Lsg,
20eq. DIPEA
3) Ac 2O/HOBt und DIPEA
1) 20% Piperidin
2) 4eq. SRBS-Chlorid
6eq. DIPEA
3) Reagenz K
SRBS-Pro-Arg-Thr-Ala-Ala-Ser-Ile-Tyr-Glu-Glu-Leu-Leu-Lys-His-Asp-OH SRBS-Y230
Abb. 6.9 Synthese des fluoreszenzmarkierten Peptids SRBS-Y230 unter Verwendung
eines Pseudoprolin-Dipeptids. Zur besseren Steuerung der Synthese wurde
das Peptid teilweise manuell synthetisiert.
Der Syntheseweg ist in Abb. 6.9 aufgeführt. Die ersten neun Aminosäuren der
Peptidkette wurden, wie bereits beschrieben, am Synthesizer verknüpft. Die
darauffolgende Abspaltung der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe von Peptid 119
erfolgte manuell. Die Vollständigkeit der Entschützungsreaktion wurde mittels UV-
Spektroskopie überprüft. Anschließend wurde, ebenfalls manuell, das Pseudoprolin-
Dipeptid durch PyBOP/HOBt-Aktivierung gekuppelt. Auch dieser Reaktionsschritt
wurde auf seine Vollständigkeit hin überprüft. Hierzu wurden der Kaiser [142] - und
TNBS [143] -Test durchgeführt. Nach zusätzlicher Acetylierung wurde die Synthese in
automatisierter Form fortgesetzt. Leider zeigt sich im UV-Monitoring erneut ein
Syntheseeinbruch zwischen Thr und Arg (ähnlich wie in Abb. 6.7 Einbruch II).
Unmittelbar nach der Synthese am Synthesizer wurde eine Testabspaltung von 121
119
105

6 Synthese fluoreszenzmarkierter Phosphopeptide
mit anschließender RP-HPLC-offline-MS-Analyse durchgeführt (Abb. 6.10 unten).
Dabei wurde deutlich, dass auch in diesem Ansatz ein Teil als Abbruchsequenz
erhalten wurde. Der Anteil des gewünschten Peptids ist jedoch deutlich höher als
beim vollständig automatisierten Vorgehen. Der weitere manuelle Syntheseverlauf
erfolgte analog zu SRBS-Y241 und SRBS-pY241. Nach präparativer RP-HPLC
konnte das Peptid SRBS-Y230 in 6% Ausbeute erhalten werden. Da die erhaltene
Menge des Peptids für den Einsatz in den Mikroarray-Experimenten ausreichte,
wurde auf eine weitere Optimierung der Synthese verzichtet.
106
Abb. 6.10 RP-HPLC-Chromatogramme im Vergleich (Detektion bei 214 nm). Das obere
Chromatogramm zeigt die Testabspaltung von 115, welches vollständig
automatisiert dargestellt wurde. Das untere Chromatogramm zeigt die
Testabspaltung von 121, das unter Verwendung von Pseudoprolin und nicht
vollständig automatisiert synthetisiert wurde.

6 Synthese fluoreszenzmarkierter Phosphopeptide
In Abb. 6.11 ist der Syntheseweg des fluoreszenzmarkierten Phosphopeptids
SRBS-pY230 dargestellt. Aufgrund der Erfahrungen bei der Synthese von Peptid
115 und SRBS-Y230 wurden nur die ersten fünf Aminosäuren der Peptidkette am
Synthesizer verknüpft. Die weitere Synthese wurde manuell durchgeführt. Dabei
wurden alle Fmoc-Abspaltschritte mittels UV-Spektroskopie und alle
Kupplungschritte mittels Kaiser [142] - und TNBS [143] -Test auf ihre Vollständigkeit hin
überprüft. Da sich in den vorhergehenden Synthesen die letzten beiden
Kettenverlängerungsschritte (Arg und Pro) als problematisch erwiesen, wurde bei
deren Kupplung das reaktivere PyAOP als Aktivierungsreagenz verwendet. [144] Die
Einführung des Fluoreszenzlabels, die Abspaltung vom Harz, sowie die weitere
Aufarbeitung erfolgte analog zu den bereits beschriebenen Peptiden SRBS-Y230,
SRBS-pY241 und SRBS-Y241. Das fluoreszenzmarkierte Peptid SRBS-pY230
wurde nach präparativer RP-HPLC mit einer Ausbeute von 14% erhalten.
Fmoc-SPPS
am ABI433A
Fmoc
N
H
O
Wang
1) 20% Piperidin
2) 5eq. Xaa,
5eq. HOBt/HBTU-Lsg,
20eq. DIPEA
3) Ac 2O/HOBt und DIPEA
Fmoc-Glu(O t Bu)-Glu(O t Bu)-Leu-Leu-Lys(Boc)-His(Trt)-Asp(O t Bu)
manuelle
Fmoc-SPPS
t BuO
O
114
1) 20% Piperidin
2) 5eq. Xaa
5eq. PyBOP/HOBt-Lsg,
10eq. DIPEA
3) 10% Ac 2OinDMF
Fmoc-Thr( Wang
tBu)-Ala-Ala-Ser( Me,MePro)-Ile-Tyr[PO(OBzl)]-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Lys(Boc)-His(Trt)-Asp(OtBu) 123
manuelle
Fmoc-SPPS
1) 20% Piperidin
2) 5eq. Fmoc-Arg(Pbf)-OH
5eq. PyAOP/HOAt-Lsg,
10eq. DIPEA
3) 10% Ac 2OinDMF
Fmoc-Pro-Arg(Pbf)-Thr( Wang
tBu)-Ala-Ala-Ser( Me,MePro)-Ile-Tyr[PO(OBzl)]-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Lys(Boc)-His(Trt)-Asp(OtBu) 124
1) 20% Piperidin
2) 4eq. SRBS-Chlorid
6eq. DIPEA
3) Reagenz K
Wang
122
SRBS-Pro-Arg-Thr-Ala-Ala-Ser-Ile-Tyr[PO(OH) 2]-Glu-Glu-Leu-Leu-Lys-His-Asp-OH
SRBS-pY230
Abb. 6.11 Syntheseweg des fluoreszenzmarkierten Phosphopeptids SRBS-pY230.
107

6 Synthese fluoreszenzmarkierter Phosphopeptide
Alle vier gewünschten Peptide konnten somit erfolgreich dargestellt und in
ausreichender Menge an die Arbeitsgruppe von Prof. Hauck übergeben werden. Sie
wurden als Liganden in SH2-Domänen-Mikroarrays eingesetzt und es gelang,
verschiedene SH2-Domänen als spezifische Interaktionspartner zu identifizieren.
108

7 Zusammenfassung und Ausblick
7.1 Analytik von Cyclopeptiden
7 Zusammenfassung und Ausblick
Cyclische Peptide zeigen eine vielfältige biologische Aktivität und haben ein enormes
Potential als Modell bei der Erforschung des Zusammenhangs von Aktivität und
chemischer Struktur. Mit der Split-Mix-Methode steht ein wertvolles Verfahren zur
effizienten Synthese von großen cyclischen Peptidbibliotheken zur Verfügung. Durch
ihre besondere strukturelle Beschaffenheit sind cyclische Peptide jedoch schwer zu
analysieren.
Der in dieser Arbeit vorgestellte Ansatz besteht darin, cylische Peptide zur
Sequenzbestimmung gezielt in lineare Peptide zu überführen, um sie dann
massenspektrometrisch zu identifizieren. Dies erfordert ein enges Zusammenspiel
von chemischer Synthese und massenspektrometrischer Analyse.
In der vorliegenden Arbeit wurden fünf verschiedene Konzepte zur gezielten
Ringöffnung, mit Hilfe sogenannter Sollbruchstellen, auf Ihre Anwendbarkeit hin
untersucht.
Abb. 7.1 Photolabile Sollbruchstelle
Mit dem Einbau der photoaktiven Verbindung 7 in den Peptidzyklus sollte es möglich
sein, den Ring durch Bestrahlung mit UV-Licht zu öffnen (Abb. 7.1). Zur Überprüfung
des Konzeptes wurde eine kleine Bibliothek aus fünf Peptiden synthetisiert. Es zeigte
109

7 Zusammenfassung und Ausblick
sich, dass die cyclischen Peptide durch Bestrahlung eine Reaktion eingehen. Es
stellte sich jedoch heraus, dass das primär gebildete Produkt nicht stabil war. Da die
Isolierung beziehungsweise die Identifizierung eines finalen Produktes nicht möglich
war, ist dieses Konzept für eine Anwendung als Sollbruchstelle nicht geeignet.
Abb. 7.2 Methionin als Sollbruchstelle
Durch den Einsatz von Methionin im peptidischen Ring sollte eine Bromcyan-
vermittelte Ringöffnung durchführbar sein (Abb. 7.2). Die gezielte Ringöffnung konnte
mit Peptid 31/33 erfolgreich gezeigt werden.
Abb. 7.3 Trypthophan als Sollbruchstelle
Eine weitere denkbare Ringöffnung ist die oxidative Halogenierung von Tryptophan
mit anschließender Hydrolyse (Abb. 7.3). Die Überprüfung des Konzeptes anhand
des rückgratcyclisierten Peptids 63 zeigte, dass die Spaltung des Peptids auf diese
Weise möglich ist. Da die Spaltung jedoch nicht vollständig verlief, ist diese
chemoselektive Spaltung für unsere Anwendung ungeeignet.
110

7 Zusammenfassung und Ausblick
Desweiteren wurde ein nicht-chemischer Ansatz verfolgt. Hierzu wurde das
rückgratcyclische Peptid 71 einem tryptischen Verdau unterworfen. Der Peptidzyklus
blieb von dieser Behandlung völlig unbeeinflusst, womit diese Methode ungeeignet
ist.
Abb. 7.4 Phenylisothiocyanat vermittelte Ringöffnung
Schließlich wurde die bereits in unserer Gruppe verwendete Phenylisothiocyanat
vermittelte Ringöffnung mit ins Konzept aufgenommen (Abb. 7.4). Hierzu wurden
Peptide verwendet, bei denen die Cyclisierung über die Seitenketten erfolgte, so
dass der N-Terminus frei zugänglich bleibt. Behandelt man solche Peptide mit den im
Edman-Abbau verwendeten Reagenzien, so erhält man ein lineares Peptid, welches
für die anschließende Sequenzierung zur Verfügung steht. Das N-terminal
gespaltene Phenylthiohydantoin-Derivat verbleibt über Seitenkettenverbrückung im
Peptid gebunden.
Die rein massenspektrometrischen ESI-MS(n)-Experimente an einem ESI-IT-
Massenspektrometer waren zunächst recht vielversprechend. Jedoch zeigte sich im
Verlauf der Arbeit, dass die Substanzmenge, welche auf einer einzelnen Harzkugel
gebunden vorliegt, nicht ausreicht, um zuverlässige und aussagekräftige Spektren zu
erhalten. Desweiteren stellte sich heraus, dass der Erfolg der Primärstrukturanalyse
stark sequenzabhängig ist.
Mit dem Einsatz des Partiellen Edman-Abbaus (PED) und dessen Kombination mit
chemischen Sollbruchstellen konnte eine Methode gefunden werden, die es erlaubt
cyclische Peptide ohne den Verlust des OBOC-Prinzips zu sequenzieren. Das
111

7 Zusammenfassung und Ausblick
Konzept wurde erfolgreich auf seitenkettencyclisierte Peptide angewendet. Eine
Erweiterung des Ansatzes auf rückgratcyclisierte Peptide wäre mit Methionin als
Sollbruchstelle gegeben. Bei der Untersuchung als Sollbruchstelle erwies sich
Methionin als sehr geeignet. Da alle Schritte festphasengebunden ablaufen, müsste
für die Anwendung ein geeigneter Linker entwickelt werden, der bei den
erforderlichen Bedingungen stabil ist und dennoch im Anschluss quantitativ
abgespalten werden kann.
Das Zusammenspiel von PED und selektiver Sollbruchstelle ermöglicht eine
gemeinsame Behandlung aller Hitbeads, eignet sich also im High-Throughput-
Einsatz und ist somit dem klassischen Edman-Abbau überlegen. Zudem ist für die
Durchführung keine spezielle Laborausstattung notwendig.
Bei der Ausarbeitung des Konzeptes wurde eine Nebenreaktion beobachtet, welche
erfolgreich aufgeklärt werden konnte.
Abb. 7.5 Die mit Split-Mix-Synthese hergestellte Cyclopeptidbibliothek 86.
Die Anwendbarkeit der Methode konnte anhand der synthetisierten OBOC-Bibliothek
86 gezeigt werden (Abb. 7.5). Diese wurde nach dem Split-Mix-Protokoll dargestellt
und mit einem on-bead-assay auf ihre Streptavidin-Bindungsaktivität hin überprüft.
Durch Anwendung des PED-Konzeptes konnten 20 Hitsequenzen identifiziert
werden. Neben der bereits bekannten Selektivität zum HPQ-Motiv zeigte sich auch
eine Präferenz dieses Motivs in den Position 2-4 (Abb. 7.6).
112

Xaa2
Position
Xaa3
Xaa4
Xaa5
Xaa6
Ala
Gln
Glu
Gly
His
Phe
7 Zusammenfassung und Ausblick
Pro
Aminosäure
Abb. 7.6 Screening der Bibliothek K-X2X3X4X5X6E-βAPPRM-TG. Das Diagramm zeigt
die möglichen Aminosäuren an unterschiedlichen Positionen der
Peptidsequenz (farbige Markierung). Die Höhe der Balken gibt den
prozentualen Anteil an, mit der die Aminosäure an der entsprechenden
Position in den Hitbead-Peptidsequenzen gefunden werden konnte.
Zur Bestätigung der Selektivität wurden SPR-Experimente durchgeführt. Hierzu
wurden eine ausgesuchte Hitsequenz, eine Sequenz mit dem HPQ-Motiv in den
Positionen 4-6, die sich nicht unter den Hits befand, sowie als Negativkontrolle eine
modifizierte Hitsequenz mit QPH-Motiv in je linearer und cyclischer Form präparativ
dargestellt. Im Falle der Hitsequenz zeigte das cyclische Peptid eine
Bindungsaffinität zu Streptavidin von KD = 323 ± 24 µM, während das lineare Peptid
um einen Faktor von 8,5 schlechter band. Dies belegt, dass durch die Cyclisierung
ein Peptid in einer für die Bindung günstigen Konformation fixiert werden kann. Der
umgekehrte Fall zeigt sich bei den Peptiden 94/95 mit HPQ-Motiv in den Positionen
4-6. Hier wurde für die cyclische Form ein KD von 8,6 ± 2,7 mM bestimmt, der
offensichtlich zu hoch war, um die Verbindung beim Bibliotheksscreening
anzufärben. Das (nicht in der Bibliothek enthaltene) lineare Peptid zeigte eine fast
fünffach bessere Bindung. In diesem Fall wird durch die Cyclisierung eine für die
Ser
Thi
Trp
10
0
40
30
20
70
60
50
100
90
80
%
113

7 Zusammenfassung und Ausblick
Bindung abträgliche Konformation fixiert. Diese Beobachtung unterstreicht die
Bedeutung der in dieser Arbeit entwickelten Methode zur Analyse von Cyclopeptid-
Bbibliotheken, bei der die harzgebundenen Cyclopeptide nicht mit linearen Peptid-
fragmenten verunreinigt sind.
In der vorliegenden Arbeit konnte eine Methode zur effizienten Sequenzierung
cyclischer Peptide aus OBOC-Bibliotheken vorgestellt werden. Das Konzept kommt
ohne tags aus und benötigt kein Edman-Sequenzer oder High-end-Massenspektro-
meter. Damit steht nun eine High-throughput-Methode zur Verfügung, die es
ermöglicht, eine Vielzahl an Hitsequenzen zu identifizieren.
7.2 Fluoreszenzmarkierte Phosphopeptide
Die selektive Erkennung spezifischer Phosphopeptide durch SH-2-Domänen spielt
eine wichtige Rolle innerhalb der zellulären Verständigung. Mit Hilfe von SH-2-
Domänen-Mikroarrays lassen sich wichtige Interaktionspartner identifizieren. Im
Rahmen der hier vorliegenden Arbeit sollten vier fluoreszenzmarkierte Peptide
synthetisiert werden, die anschließend in der Arbeitsgruppe von Prof. C. Hauck als
Liganden im SH-2-Domänen-Mikroarray eingesetzt werden sollten.
Abb. 7.7 Fluoreszenzmarkiertes Peptid SRBS-Y241.
Der Aufbau der Peptidkette des Peptids SRBS-Y241 konnte vollständig automatisiert
am Peptidsynthesizer durchgeführt werden. Die Einführung des SRBS-Fluoreszenz-
labels erfolgte ebenfalls an der festen Phase, wurde jedoch manuell durchgeführt.
Nach Abspaltung und Aufreinigung wurde SRBS-Y241 mit einer Gesamtausbeute
von 34% erhalten.
114

Abb. 7.8 Fluoreszenzmarkiertes Phosphopeptid SRBS-pY241.
7 Zusammenfassung und Ausblick
Auch Peptid SRBS-Y241 konnte weitestgehend am Peptidsynthesizer dargestellt
werden. Für eine kontrollierbarere Reaktionsführung wurden Phophotyrosin,
Isoleucin und das SRBS-Label manuell eingeführt. SRBS-Y241 wurde mit einer
Gesamtausbeute von 13% erhalten.
N
SRBS-
Fluoreszenzlabel
O
N
H
H 2N
NH
H
N
O
HO
NH
O
N
H
O
H
N
O
N
H
Abb. 7.9 Fluoreszenzmarkiertes Peptid SRBS-Y230.
OH
O
H
N
O
N
H
O
H
N
HO
OH
O
HO
N
H
O
O
O
H
N
O
N
H
O
H
N
O
N
H
NH 2
HN
O
N
H
N
HO
O
OH
O
SRBS-Y230
Die Synthese von SRBS-Y230 erwies sich als schwierig. Unter vollständiger
Automatisierung am Peptidsynthesizer konnte die Peptidkette nicht aufgebaut
werden. Durch teilweise manuelle Synthese und den Einsatz eines Pseudoprolin-
Dipeptid-Bausteins an Stelle von Serin (Position 6) und Alanin (Position 5) gelang es
jedoch, das Peptid mit einer Ausbaute von 6% darzustellen.
Abb. 7.10 Fluoreszenzmarkiertes Phosphopeptid SRBS-pY230.
115

7 Zusammenfassung und Ausblick
Auch Peptid SRBS-pY230 wurde nur teilweise automatisiert dargestellt. Ab der
Anknüpfung von Phosphotyrosin wurde das Peptid manuell synthetisiert. Da der
Einbau des Pseudoprolin-Dipeptid-Bausteins bei der Synthese von SRBS-Y230 nur
eine stückweise Verbesserung der Synthese erbrachte, wurde die Peptidkette von
SRBS-pY230 zudem bis zum Ende manuell synthetisiert. Dabei wurde für die
Kupplung der letzten beiden Aminosäuren PyAOP/HOAt zur Aktivierung verwendet.
Die Gesamtausbeute betrug 14% und konnte somit im Vergleich zum nicht
phosphorylierten Peptid SRBS-Y230 gesteigert werden.
Alle vier Peptide konnten erfolgreich synthetisiert werden und in ausreichender
Menge für den Einsatz in SH2-Domänen-Mikroarrays an die Arbeitsgruppe von Prof.
C. Hauck übergeben werden, wo sie bereits erfolgreich als spezifische
Interaktionspartner verschiedener SH2-Domänen identifiziert werden konnten.
116

8 Experimenteller Teil
8.1 Allgemeine Angaben zur Analytik
8.1.1 HPLC
8 Experimenteller Teil
Analytische und präparative RP-HPLC erfolgte an einem modularen HPLC-System
LC-20A prominence ausgestattet mit zwei seriellen Tandemkolbenpumpen LC-20AT,
automatischem Probengeber SIL-20A, Säulenofen CTO-20AC, Photodiodenarray-
detektor SPD-M20A und Datenbus CBM-20A (Shimadzu).
Folgende Säulen kamen zum Einsatz (alle von Knauer):
Nucleosil 100-5 C18, 250x4 mm (analytische Trennung)
Eurosphere 100-5 C18, 250x4 mm (analytische Trennung)
Eurosphere 100-10 C18, 250x16 mm (präparative Trennung)
Die verwendeten Eluenten setzten sich aus den folgenden Lösungen zusammen:
A: 0,1% TFA in Wasser B: 0,1% TFA in Acetonitril
A°:0,1% Ameisensäure in B°: 0,1% Ameisensäure in Acetonitril
Wasser
8.1.2 Massenspektrometrie
Die MALDI-TOF-Massenspektren wurden an einem Bruker Biflex III Spektrometer
mit einem gepulsten Stickstofflaser (337 nm) im positiven reflektron Modus
aufgenommen.
Als Matrix wurde, wenn nicht anders beschrieben, eine gesättigte Lösung aus
α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA) in Acetonitril / 0,1% TFA (aq.) (2:1) verwendet.
Zur Probenpräparation wurden je 0,8 µl der Matrix- und Probenlösung auf das target
aufgetragen, gemischt und bei Raumtemperatur kristallisiert. Die Kalibrierung mittels
linearer Regression wurde mit einer Mischung aus folgenden Peptiden vorge-
nommen: Neurotensin 1672,92 m/z, Angiotensin I 1296,69 m/z, Angiotensin II
117

8 Experimenteller Teil
1046,54 m/z, Bradikinin Fragment [1-7] 757,40 m/z und Bradikinin Fragment [1-5]
573,31 m/z.
ESI-IT-Massenspektren wurden an einem Esquire 3000 plus der Firma Bruker
Daltonics im positiven oder negativen Modus gemessen. Die Proben (ca. 10-
100 µg/mL in Acetonitril / 0,1% wässrige Ameisensäure (2:1)) wurden dabei mit einer
Flussrate von 3 µL/min injiziert.
Die hochaufgelösten Massenspektren wurden an einem Bruker ESI-QTOF-
Massenspektrometer aufgenommen.
GC-MS Analysen wurden an einem Gaschromatographen vom Typ HP 6890 Series
GC System der Firma HP mit Helium als Trägergas durchgeführt. Für die Massen-
detektion wurde ein Mass Selective Detector HP 5973 verwendet.
8.1.3 Kernresonanzspektroskopie
Die gemessenen eindimensionalen Kernresonanzspektren wurden an den Geräten
AC 250 (Bruker), Avance III 400 (Bruker) beziehungsweise Lambda 400 (Jeol)
aufgenommen. Die chemische Verschiebung δ (ppm) wurde auf das jeweilige
Lösungsmittelsignal geeicht. Soweit nicht anders vermerkt, wurden die Spektren in
CDCl3 bei einer Temperatur von 300 K aufgenommen.
Für die Angabe der Multiplizität wurden folgende Abkürzungen verwendet: s =
Singulett, d = Dublett, t = Triplett, q = Quartett, m = Multiplett, br = breit, dd = dublet-
tiertes Dublett, tt = triplettiertes Triplett. Die Integrale der Signale wurden auf ein
Signal des Spektrums normiert.
Die zweidimensionalen NMR-Spektren (COSY, HSQC, TOCSY und ROESY) zur
Untersuchung von Peptiden wurden an einem Bruker Avance DRX 600 Spektrometer
bei einer Temperatur von 300 K aufgenommen.
Zur Präparation der Probe wurde etwa 1 mg Peptid in 200 µl D2O/H2O (5:95) gelöst.
Desweiteren wurden 4 µl NaN3-Lösung (400 mM in D2O) zur Konservierung der
118

8 Experimenteller Teil
Probe und 20 µl TSP (10 mM) als Kalibrierstandard zugeben. Anschließend wurde
der pH-Wert durch Zugabe von HCl (1,0 und 0,1 M) auf pH 3 eingestellt.
Die Auswertung der Peptidspektren erfolgte mit dem Programm Cara [37] . Es ist
kostenlos downloadbar unter URL: http://www.nmr.ch.
8.1.4 Infrarotspektroskopie
Zur Aufnahme von IR-Spektren wurde ein Perkin Elmer 1600 Series FT-IR-Gerät
verwendet. Es wurden KBr-Presslinge angefertigt. Pro Pressling wurden 72 mg des
fein gemahlenen KBr-Substanz-Gemisches verwendet. Als zweites Gerät stand ein
Perkin Elmer 100 Series FT-IR-Gerät zur Verfügung. Bei diesem wurden die
Substanzen als Pulver in Totalreflexion mittels einer ATR (= Abgeschwachte Total-
reflexion) Einheit gemessen.
Die relativen Bandenintensitäten wurden wie folgt bezeichnet: br = breit (broad ), s =
stark (strong), m = mittel (medium), w = schwach (weak).
8.1.5 UV-Vis-Absorptionsspektroskopie
UV-Vis-Absorptionsmessungen zur Bestimmung der Beladungsdichte und Unter-
suchung der photolabilen Sollbruchstelle wurden mit einem Cary 50 - Einstrahl-
spektrometer (Varian) in Präzisions-Küvetten aus Quarzglas Suprasil aufgenommen.
Zur Beobachtung des Syntheseverlaufs in der manuellen SPPS wurde die Fmoc-
Abspaltlösung mit einem Perkin-Elmer Lambda 5 – Zweistrahlspektrophotometer
verwendet.
Als Bestrahlungsapparatur zur photochemischen Abspaltung der Peptide vom Harz
diente eine Lumatec-Lampe (Typ: Superlite-SUV-DC-P) mit einer Wellenlänge von
366 nm und einer Leistungsaufnahme von max. 360 VA.
119

8 Experimenteller Teil
8.2 Allgemeine Arbeitsvorschriften für die SPPS
AAV 1 Darstellung von Fmoc-Met-TG
In eine Einwegspritze mit eingesetzter PE-Fritte wiegt man das Harz (TG-S-NH2) ein
und lässt es für 10 min in NMP (5 ml für 1 g) quellen. Fmoc-Met-OH (3 eq.), Boc-Met-
OH (3 eq.), HBTU (5.9 eq.), HOBt (6 eq.) und DIPEA (12 eq.) werden in NMP (5 ml
für 1 g Harz) gelöst und aufgezogen. Man schüttelt 18 h, saugt ab und wäscht zehn-
mal mit DMF, sowie zweimal mit DCM. Die Vollständigkeit der Reaktion wird mit
Kaisertest (AAV 4a) und TNBS-Test (AAV 4b) überprüft. Nach dem Capping (AAV 5)
wird das Harz im Vakuum getrocknet und die Beladungsdichte nach AAV 6 bestimmt.
AAV 2 Beladung von Hydroxyharz mit MSNT-Methode
In eine Einwegspritze mit eingesetzter PE-Fritte wiegt man das Harz (TG-S-NH2) ein
und lässt es für 10 min in DCM quellen (5 ml für 1 g). In ein Becherglas wiegt man
die mit Fmoc-geschützte Aminosäure (5 eq.), löst diese in DCM (1 ml/ 0.1 mmol) und
gibt Methylimidazol (3,75 eq.) zu. Falls sich die Aminosäure nicht vollständig löst, gibt
man vorsichtig einige Tropfen THF dazu. Die klare Lösung wird nun zu MSNT (5 eq.)
gegeben und einige Minuten gerührt. Wenn alles gelöst ist, zieht man die
Kupplungslösung zum Harz auf und schüttelt 1-18 h. Anschließend wäscht man
zehnmal mit DCM, fünfmal mit DMF und trocknet das Harz am Vakuum. Die
Beladungsdichte wird nach AAV 6 bestimmt und gegebenenfalls wird die Kupplung
wiederholt. Schließlich behandelt man das Harz eine Stunde mit einer
Cappinglösung aus 0,4 ml Benzoylchlorid, 55 µl Pyridin und 4 ml DMF, wäscht mit
DMF (5x) und DCM (10x) und trocknet erneut. Abschließend wird die
Beladungsdichte nach AAV 6 erneut bestimmt.
AAV 3 Anknüpfung einer Aminosäure
Die Peptidkupplung erfolgt mit HOBt/HBTU in NMP. Hierzu werden 4 eq. (bezogen
auf die Harzbelegung) der jeweiligen Aminosäure zusammen mit 6 eq. HOBt und
4 eq. HBTU in möglichst wenig NMP gelöst und 8 eq. DIPEA zugegeben. Nach einer
kurzen Durchmischung wird die Lösung zu dem gequollenen Harz gegeben und die
120

8 Experimenteller Teil
Kupplung durchgeführt. Die Vollständigkeit der Reaktion wird durch Test auf freie
Amine (AAV 4) überprüft. Abschließend wird das Harz zehnmal mit DMF und dreimal
mit DCM gewaschen.
Das Vorgehen zur Aktivierung mit PyBOP/HOBt erfolgt analog.
AAV 4 Vollständigkeit der Kupplungsschritte – Test auf primäre Amine
Nach unvollständiger Kupplung verbleibende primäre Amine werden mittels
Kaisertest und/oder TNBS-Test detektiert.
Kaisertest [142]
Hierzu entnimmt man eine Spatelspitze Harz und überführt diese in ein Eppendorf-
Cap. Man gibt je drei bis fünf Tropfen der Lösungen1 bis 3 zum Harz und erwärmt für
fünf Minuten auf 100°C im Wasserbad. Färben sich die Kugeln bzw. die Lösung blau,
sind noch primäre Amine vorhanden.
Lösung 1: 5 g Ninhydrin in 100 ml Ethanol
Lösung 2: 2 ml 0.1 mM KCNaq. in 98 ml Pyridin
Lösung 3: 80 g Phenol in 20 ml Ethanol
TNBS Test [143]
Einige wenige Harzkugeln werden auf einer Petrischale platziert. Nun werden die
Kugeln mit je einem Tropfen 10% DIPEA in DMF und 1% TNBS in DMF bedeckt.
Nach fünf Minuten wird die Lösung mit einem Wischtuch vorsichtig entfernt und die
Kugeln unter der Stereolupe betrachtet. Bei Anwesenheit von primären Aminen
färben sich die Kugeln gelb bis orange.
AAV 5 Capping der freien Aminofunktionen
In einer Einwegspritze mit eingesetzter PE-Fritte lässt man das Harz in DMF (5 ml für
1 g Harz) quellen. Man saugt ab und behandelt das Harz mit 10% Acetanhydrid in
DMF (1x10 min und 2x5 min). Anschließend wird zehnmal mit DMF und zweimal mit
DCM gewaschen.
121

8 Experimenteller Teil
AAV 6 Bestimmung der Beladungsdichte
Zur Bestimmung der Beladungsdichte wird eine kleine Menge Harz (3-5 mg) mit 20%
Piperidin in DMF (10 ml) für 15 Minuten behandelt. Von der Lösung werden
verschiedene Verdünnungen hergestellt und die UV-Absorption bei 301 nm in
Küvetten mit einem Durchmesser von 1 cm gemessen. Über die Gleichung der
Eichgeraden
E = 0,0077·c
mit E = Extinktion, c = Konzentration in µmol/l, wird die Konzentration der
Abspaltlösung und darüber die Beladung berechnet.
AAV 7 Festphasen-Peptidsynthese am Peptidsynthesizer ABI 433A
Für den 20 µmol Ansatz werden folgende Lösungen verwendet. Die Zahlen geben
die jeweiligen Flaschennummer am Synthesizer an; nicht erwähnte Flaschen-
nummern bleiben leer:
1) abs. Piperidin
4) Cappinglösung:
115 mg HOBt wird in ca. 40 ml NMP gelöst. 2,4 ml Acetanhydrid und
1,1 ml DIPEA werden zugegeben. Anschließend wird die Lösung
mit NMP auf 50 ml aufgefüllt.
6) MeOH HPLC grade
7) 1,6 M DIPEA in NMP:
13,7 ml DIPEA werden mit 36,6 ml NMP gemischt.
8) 0,38 M HOBt/HBTU in NMP:
In einem Messzylinder werden 7,58 g (20 mmol) HBTU und 3,06 g (20 mmol) HOBt
eingewogen und auf 50 ml mit NMP aufgefüllt. Anschließend wird solange gerührt,
bis sich alles aufgelöst hat (ungefähr 10 Minuten).
9) DCM, peptide grade
10 und 11) NMP, peptide grade
Die gleichen Lösungen werden auch für den 10 µmol Ansatz verwendet, lediglich in
Flasche 7 befindet sich eine 0,8 M Lösung von DIPEA in NMP.
122

8 Experimenteller Teil
Vor der Synthese werden die entsprechenden Flow-Tests durchgeführt. Zur
Vorbereitung der Synthese wird ein chemistry-file ausgewählt (meist „20µmol
spezial.kem“) und auf den Synthesizer geladen. Dann werden das sequence- und
das run-file erstellt und vom Rechner an den Synthesizer übertragen. Außerdem
werden die Aminosäuren in NMP gelöst (125 mmol in 0,5 ml; falls sich die
Aminosäure nicht vollständig durch vortexen löst, wird sie kurz mit Ultraschall
behandelt), in die Kartuschen pipettiert und in den Synthesizer geladen. Das mit Harz
befüllte 3 ml Reaktionsgefäß wird eingespannt und die Synthese wird gestartet.
Für den 0,1 mmol Ansatz werden folgende Lösungen verwendet. Die Zahlen geben
die Flaschennummer am Synthesizer an; nicht erwähnte Flaschennummern bleiben
leer:
1) abs. Piperidin
4) Cappinglösung:
0,8 g HOBt wird in ca. 100 ml NMP gelöst. 19 ml Acetanhydrid und 9 ml
DIPEA werden zu gegeben und anschließend wird die Lösung mit NMP
auf 400 ml aufgefüllt.
5) 0,45 M HOBt/HBTU in DMF:
In einem Messzylinder werden 37,9 g (100 mmol) HBTU und 15,3 g
(100 mmol) HOBt eingewogen und auf 200 ml mit DMF aufgefüllt.
Anschließend wird solange gerührt, bis sich alles aufgelöst hat (ungefähr
10 Minuten).
6) MeOH HPLC grade
7) 2 M DIPEA in NMP:
69,6 ml DIPEA werden mit 130,4 ml NMP gemischt.
9) DCM, peptide grade
10 und 11) NMP, peptide grade
Vor der Synthese werden die entsprechenden Flow-Tests durchgeführt. Zur
Vorbereitung der Synthese wird ein chemistry-file ausgewählt und auf den
Synthesizer geladen. Dann werden das sequence- und das run-file erstellt und vom
Rechner an den Synthesizer übertragen. Außerdem werden die Aminosäuren in die
Kartuschen eingewogen (10 eq. für FastMoc 1,0 mmol) und in den Synthesizer
123

8 Experimenteller Teil
geladen. Das mit Harz befüllte 8 ml Reaktionsgefäß wird eingespannt und die
Synthese wird gestartet.
UV-Monitoring des Syntheseverlaufs
Zur Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird das Harz je 8 min mit einer 20%
Piperidin in NMP-Abspaltlösung behandelt. Von der Abspaltlösung erfolgt eine
Absorptionsmessung bei 301 nm. Ist die Abweichung der Absorption größer 4% der
vorherigen Messung, so erfolgt ein erneuter Fmoc-Abspaltschritt. Es erfolgen jedoch
maximal sechs Fmoc-Abspaltschritte. Für jeden Aminosäurekupplungschritt werden
6,25 eq. Aminosäure mit 4,75 eq. HBTU/HOBt und 10 eq. DIPEA aktiviert und 40 min
gekuppelt. Zum Capping wird das Harz 1 min mit Cappinglösung behandelt. Waren
zur vorherigen Fmoc-Abspaltung mehr als drei Piperidinbehandlungsschritte
notwendig, so wird die Reaktionszeit beim Capping um 5 min verlängert.
Nach der Synthese wird das Harz in eine mit einer Fritte versehene Einwegspritze
umgefüllt.
Leitfähigkeitsmessung zum Überprüfen des Syntheseverlaufs
Die Synthese erfolgt analog zum oben beschriebenen Verlauf (UV-Monitoring).
Jedoch wird von der Fmoc-Abspaltlösung anstelle einer Absorptionsmessung die
Leitfähigkeitsmessung durchgeführt. Bei der PreviousPeak-Methode wird die Fmoc-
Abspaltung solange wiederholt, bis sich die Leitfähigkeitswerte zweier aufeinander
folgender Messungen um weniger als 5% unterscheiden. Bei Verwendung der
FirstPeak-Methode wird immer der Messwert der ersten Abspaltung als
Vergleichswert herangezogen.
AAV 8 Cyclisierung
Zum in NMP vorgequollenen Harz wird eine Mischung aus 4 eq. PyBOP, 6 eq. HOBt
und 8 eq. DIPEA in NMP aufgezogen und über Nacht geschüttelt. Anschließend wird
zehnmal mit DMF und fünfmal mit DCM gewaschen. Die Vollständigkeit der
Cyclisierung wird mit Kaiser- und TNBS-Test überprüft. Die Cyclisierungsreaktion
wird bis zur Vollständigkeit wiederholt, wobei die Aktivierungsreagenzien täglich
erneuert wurden. Nach erfolgreicher Cyclisierung wird das Harz im Vakuum
getrocknet. Die Cyclisierung mit PyAOP/HOAt erfolgt analog.
124

AAV 9 Einführung des Fluoreszenzlabels
8 Experimenteller Teil
Zur Vorbereitung der Reaktion wird das Harz zunächst ausführlich gewaschen und
anschließend am Vakkuum getrocknet. Unmittelbar vor Gebrauch wird eine Lösung
aus 4 eq. Sulforhodamin-B-sulfonylchlorid (SRBS-Chlorid), 6eq. DIPEA in DMF
hergestellt, zum mit Stickstoff geflutetem Harz aufgezogen und über Nacht
ge¬schüttelt. Anschließend wird das Harz zuerst mit DMF(10x1 min) und dann mit
DCM (10x1 min) gewaschen. Daraufhin wird es durch Waschen mit Methanol (2x4
min) geschrumpft und abschließend am Vakuum getrocknet.
AAV 10 Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe
Das Harz wird in eine Einwegspritze mit eingesetzter PE-Fritte eingewogen, mit DMF
gequollen und abgesaugt. Daraufhin folgt eine Behandlung der Harzkugeln mit 20%
Piperidin in DMF (1x3 min und 3x5 min). Die abgetrennte Abspaltlösung wird
aufbewahrt. Das Harz wird noch fünfmal mit DMF gewaschen und die Waschlösung
mit der Abspaltlösung vereinigt. Schließlich wird noch fünfmal mit DMF und fünfmal
mit DCM gewaschen.
Bei bekanntem Volumen der Abspaltlösung kann mittels UV-Spektroskopie die
abgespaltene Fmoc-Gruppe quantifiziert werden.
AAV 11 Abspaltung der Allyl- bzw. Alloc-Gruppe
Das Harz wird in eine Einwegspritze mit eingesetzter PE-Fritte eingewogen, dreimal
mit DCM gewaschen und anschließend an der Line getrocknet (dazu gibt man die
Spritze mit Harz in einen Schlenkkolben). Das getrocknete Harz wird direkt vor der
Abspaltung mit Stickstoff geflutet.
Variante A – unter Einsatz eines Boran-Dimethylamino Komplexes:
Aus 0,4 eq. Pd(PPh3)4 und 7,5 eq. Boran-Dimethylamino Komplex (bezogen auf die
Anzahl der Allyl- bzw. Alloc-Gruppen im Peptid) und DCM wird eine Suspension
hergestellt, diese zum Harz aufgezogen und geschüttelt. Nach 20 min wird die
Lösung erneuert und weitere 20 min geschüttelt. Nach Absaugen der Lösung wird
zehnmal mit DMF und zehnmal mit DCM gewaschen.
Variante B – durch Zugabe von N,N’-Dimethylbarbitursäure (DMB): [123]
Zum mit Stickstoff gefluteten Harz gibt man eine 0,2 M Lösung aus DMB in
trockenem DCM (8,3 eq bezogen auf die zu entschützende Allyl- bzw. Alloc-Gruppe.)
125

8 Experimenteller Teil
sowie eine 0,02 M Lösung aus Pd(PPh3)4 in trockenem DCM (1 eq. pro Allyl- bzw.
Alloc-Gruppe). Nach 30 min wird die Lösung erneuert und weitere 30 min geschüttelt.
Anschließend wird das Harz fünfmal mit DCM, fünfmal mit DMF, zweimal mit
Dioxan/Wasser (9:1), einmal mit Methanol, fünfmal mit DMF und fünfmal mit DCM
gewaschen.
AAV 12 Spaltung der säurelabilen Schutzgruppen an fester Phase
Zum Entfernen der säurelabilen Schutzgruppen (Boc, Pbf, Trt, t Bu) wird das
Peptidylharz in eine Einwegspritze mit PE-Fritte eingewogen. Das Harz wird 3 h bei
RT mit einer Lösung aus TFA/TIS/Wasser (95:2.5:2.5) behandelt. Anschließend wird
zweimal je 5 Minuten mit TFA, fünfmal je 2 Minuten mit DMF und fünfmal je 1 Minute
mit DCM gewaschen. Danach wird das Harz am Vakuum getrocknet.
AAV 13 Met(O)-Reduktion
Während der Synthese, dem Screening, der Aufbewahrung und dem partiellen
Edman-Abbau besteht die Möglichkeit, dass der Thioether im Methionin unter Einfluß
von Luftsauerstoff und TFA zum Sulfoxid oxidiert wird. Um diese Oxidation
umzukehren (reduzieren), wird eine Lösung aus 9,6 mg Ammoniumiodid in 0,5 ml
TFA (0,132 M, gesättigt violette Lösung) und 20 µl Dimethylsulfid (0,545 M, dann ist
die Lösung gelb) hergestellt. Mit dieser Lösung werden die Harzkugeln in einer
Einwegspritze mit PE-Fritte für 20 min bei 0°C behandelt. Anschließend wird
ausgiebig mit Wasser gewaschen (25x1 min). Nun kann nach AAV 14 die Bromcyan-
Spaltung erfolgen.
AAV 14 Bromcyan-Spaltung
Hierzu werden unmittelbar vor Gebrauch 40 mg BrCN in 1 ml 70% TFA in Wasser
gelöst.
Peptidabspaltung von einzelnen Kugeln für anschließende MALDI-TOF-
Analyse
Die Kugeln werden in Eppendorf-Caps (500 µl / transparent) überführt, wobei in
jedem Cap immer nur eine Kugel sein darf (unter der Stereolupe überprüfen). Nach
einem kurzen spindown in der Zentrifuge fügt man je 10 µl Bromcyan-Lösung hinzu
126

8 Experimenteller Teil
und lässt über Nacht einwirken. Nach Trocknen am Vakuum wird das vom Harz
abgespaltene Peptid in 5 µl Solvent A (0.1% TFA in Wasser/Acetonitril (1:2))
aufgenommen. 0,5 µl der Peptidlösung und 0,5 µl Matrixlösung (gesättigte α-Cyano-
4-hydroxyzimtsäure in Solvent A/MeOH (5:2)) werden auf dem MALDI-Target
gemischt und können nach Kristallisation analysiert werden.
Abspaltung von mehreren Harzkugeln
In einer Einwegspritze mit eingesetzter PE-Fritte wird die gewünschte Menge Harz
eingewogen, die wie oben beschrieben hergestellte Bromcyan-Lösung wird
aufgezogen und wirkt über Nacht ein. Das in der Lösung enthaltene abgespaltene
Peptid wird aus der Spritze gedrückt. Das Harz wird noch zweimal mit 70% TFA in
Wasser nachgespült. Im Stickstoff-Gegenstrom wird die TFA abgedampft. Der
Rückstand wird in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Das so erhaltene Peptid
kann anschließend mittels RP-HPLC aufgereinigt und charakterisiert werden.
AAV 15 BNPS-Skatol / Trp–Xaa Spaltung
Unmittelbar vor Gebrauch werden 1,3 mg BNPS in 1 ml Essigsäure (88% aq.) gelöst.
Trp-Xaa Spaltung: Sollbruchstelle im cyclischen Peptid
Zur selektiven Spaltung der Trp-Xaa Bindung (also C-terminal von Trp) wird das
Peptidylharz (ohne Seitenkettenschutzgruppen) mit zuvor frisch zubereiteter BNPS-
Lösung (2,8 eq. in Bezug auf die zu spaltende Trp-Xaa Bindung) behandelt. Danach
wird das Harz dreimal mit 88% Essigsäure, einmal mit Methanol und zehnmal mit
DCM gewaschen. Anschließend wird das Harz am Vakuum getrocknet.
Trp-TG Spaltung: Linker
Das Vorgehen der Reaktion erfolgt analog zur Trp-Xaa Spaltung. Nur wird hier die
BNPS-Lösung, die das abgespaltene Peptid enthält, aufbewahrt. Das Harz wird
viermal mit 88% Essigsäure und zweimal mit Methanol gewaschen. Die
Waschlösung wird mit der BNPS-Peptidlösung vereint. Anschließend wird das
Volumen durch Zugabe von Wasser verdoppelt und lyophilisiert. Das so erhaltene
Lyophilisat wird erneut in Wasser aufgenommen und nochmals lyophilisiert. Das
Peptid kann nun mittels RP-HPLC und Massenspektrometrie charakterisiert werden.
127

8 Experimenteller Teil
AAV 16 Basisches Spalten von HMBA-bzw. Glykolamidester-Harz
Zur basischen Abspaltung des Peptids vom HMBA- bzw. Glykolamidester-Harz wird
die gewünschte Menge Peptidylharz in eine Einwegspritze mit eingesetzter PE-Fritte
eingewogen. Das Harz wird 5 min mit DMF vorgequollen. Man stellt eine Lösung aus
Propylamin, DMF und Triethylamin (5:5:1) her und behandelt das Harz bei RT mit
dieser Lösung (50 ml/g). Nach 18 h wird die Lösung abgetrennt. Das Harz wird mit
DMF (7x1 min), Methanol (2x1 min), Wasser (2x1 min) und Methanol (2x1 min)
gewaschen. Die aufgefangene Waschlösung wird mit der basischen Abspaltlösung
vereinigt und am Stickstoff-Rotationsverdampfer bis zur vollständigen Trockne
eingeengt. Der Rückstand wird in Wasser aufgenommen (eventuell zuerst einige
Tropfen Acetonitril zum Lösen), mit flüssigem Stickstoff ausgefroren und lyophilisiert.
Das Peptid kann anschließend mittels RP-HPLC und Massenspektrometrie
charakterisiert werden.
AAV 17 Peptidabspaltung vom SieberAmid-Harz
Unmittelbar vor Gebrauch wird eine Lösung aus TFA/TIS/Wasser (1:1:98) hergestellt.
Peptidabspaltung von einzelnen Kugeln für anschließende MALDI-TOF-
Analyse
Die Kugeln werden in Eppendorf-Caps (500 µl / transparent) überführt, wobei in
jedem Cap immer nur eine Kugel sein darf (unter der Stereolupe überprüfen). Nach
einem kurzen spindown in der Zentrifuge werden je 100 µl TFA/TIS/DCM (1:1:98)
hinzugefügt. Nach einer Stunde wird die Lösung am Stickstoffgegenstrom eingeengt.
Zum Rückstand werden 5 µl 0.1% TFA in Wasser/ Acetonitril (1:1) addiert, um das
vom Harz abgespaltene Peptid aufzunehmen. 0,5 µl der Peptidlösung und 0,5 µl
Matrixlösung (gesättigte 4-Hydroxy-α-cyanozimtsäure in 0,1% TFA in Wasser/
Acetonitril (1:1) werden auf dem MALDI-target gemischt und können nach
Kristallisation analysiert werden.
Abspaltung von mehreren Harzkugeln
Zum Abspalten des Peptids vom Harz wird das Peptidylharz in eine Einwegspritze
mit PE-Fritte eingewogen und mit DCM quellen lassen. Das Harz wird bei RT mit
einer Lösung aus TFA/TIS/DCM (1:1:98) behandelt (2x15 min, 1x 30 min).
Anschließend wird zehnmal je 1 Minute mit DCM, zweimal je 4 Minuten mit Methanol
128

8 Experimenteller Teil
und zweimal je 2 Minuten mit Wasser gewaschen. Die vereinigte Abspalt- und
Waschlösung wird am Stickstoff-Rotationsverdampfer bis zur vollständigen Trockne
eingeengt. Der Rückstand wird in Wasser aufgenommen (eventuell zuerst einige
Tropfen Acetonitril zum Lösen), mit flüssigem Stickstoff ausgefroren und lyophilisiert.
AAV 18 Peptidabspaltung vom Arylhydrazid-Harz
Zum Abspalten des Peptids vom Harz wird das Peptidylharz in eine Einwegspritze
mit PE-Fritte eingewogen und mit DCM quellen lassen. Es werden je 2 eq (bezogen
auf das Harz) einer äquimolaren Lösung aus NBS und Pyridin in DCM (0,017 M) zum
Harz gegeben und 10 Minuten damit behandelt. Anschließend wird das Harz mit
DCM gewaschen (10x1 min). Daraufhin werden 5 eq. des Nucleophils (am besten 4-
Bromanilin) in DCM gelöst, so dass sich eine 0,03 M Lösung ergab. Das Harz wird
über Nacht damit behandelt. Anschließend wird je viermal für 1 Minute mit DCM,
Acetonitril und Methanol gewaschen. Die vereinigte Abspalt- und Waschlösung
werden am Vakuum eingeengt, in Wasser aufgenommen und lyophilisiert.
AAV 19 Peptidabspaltung vom RinkAmid-Harz
Die Abspaltung des Peptids verläuft simultan mit der Abspaltung der säurelabilen
Schutzgruppen.
Testabspaltung für anschließende MALDI-TOF Analyse
Die Kugeln werden in Eppendorf-Caps (1 ml) überführt und mit 100% TFA behandelt.
Nach ca. 20 Minuten wird die Lösung unter Stickstoffgegenstrom eingeengt.
Anschließend erfolgt ein kurzer spindown in der Zentrifuge. Zum Rückstand werden
5 µl 0,1% TFA in Wasser/Acetonitril (1:1) addiert, um das vom Harz abgespaltene
Peptid aufzunehmen. 0,5 µl der Peptidlösung und 0,5 µl Matrixlösung (gesättigte α-
Cyano-4-hydroxyzimtsäure in 0,1% TFA in Wasser/Acetonitril (1:1)) werden auf dem
MALDI-target gemischt und können nach Kristallisation analysiert werden.
Abspaltung von mehreren Harzkugeln
Zum Abspalten des Peptids vom Harz wird das Peptidylharz in eine Einwegspritze
mit PE-Fritte eingewogen. Das Harz wird für drei Stunden mit einer Lösung aus
TFA/TIS/Wasser (95:2.5:2.5) (0.5 ml für 100 mg Harz) geschüttelt. Die Lösung wird
dann in das 10-15 fache Volumen eiskalten tert-Butylmethylether getropft, wobei das
Peptid ausfällt. Man behandelt das Harz noch ein weiteres Mal mit der Abspaltlösung
129

8 Experimenteller Teil
für eine Stunde. Dann wäscht man mit TFA nach und stellt das Gefäß über Nacht in
den Eisschrank. Man zentrifugiert bei 1000 g bei 4°C für 45 min, dekandiert die
überstehende Lösung ab, resuspendiert das Pellet in tert -Butylmethylether und
zentrifugiert erneut. Diese Prozedur wird noch einmal wiederholt. Dann wird das
Pellet in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Anschließend wird das Produkt
mittels RP-HPLC präparativ aufgereinigt.
AAV 20 Peptidabspaltung mit Reagenz K
Zum Abspalten des Peptids vom Harz und der simultanen Entfernung der
säurelabilen Schutzgruppen mit Reagenz K, wird das Peptidylharz in eine
Einwegspritze eingewogen. Unmittelbar vor Gebrauch wird die Abspaltlösung
(Reagenz K) hergestellt. Diese besteht aus TFA/Thioanisol/Wasser/Phenol/EDT
(82,5:5:5:5:2,5). Das Harz wird zweimal je 3 h mit Reagenz K behandelt. Das Peptid
wird, wie bereits in AAV 19 beschrieben, ausgefällt und aufgereinigt.
130

8.3 Synthetisierte Peptide
8.3.1 Synthese der photolabilen cyclischen Peptide 8-12
8 Experimenteller Teil
Die Synthese der Peptide erfolgte an SieberAmid-TentaGel. Die linearen
Vorläufersequenzen (ohne die photolabile Aminosäure) wurden am Peptid-
synthesizer nach AAV 7 dargestellt. Als chemistry file wurde 10µmol(3ml)2.1.0.kem
ausgewählt. Die Elongation der Peptidkette erfolgte unter Verwendung der Module
HhDAFiiiCidD (PrPk Fmoc Depro/Single/cap). Die verwendeten Aminosäuren waren
die folgenden: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OAll)-OH,
Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH.
Das Syntheseharz wurde vom reaction vessel des Synthesizers in eine
Einwegspritze mit PE-Fritte überführt. Die N-terminale Fmoc-Schutzgruppe wurde
nach AAV 10 gespalten und anschließend erfolgte die Anknüpfung der photolabilen
Aminosäure (Fmoc-Pll-OH) 4 nach AAV 3.
Zur Entschützung der mit Allyl geschützten Carbonsäure wurde das Harz wie in AAV
11a beschrieben behandelt. Die Fmoc-Schutzgruppe wurde nach AAV 10 entfernt.
Schließlich wurde wie in AAV 8 aufgeführt cyclisiert.
Zur Analytik wurden kleine Mengen des Peptids entnommen und sauer nach AAV 17
gespalten.
Peptid 8
Fmoc-Gly-Pro-Gly-Ala-Phe-Glu(OAll)-Lys(Boc)-NH2 (13→14)
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B in 30 min, 1 ml/min)
RP-HPLC / tR MALDI-TOF-MS gemessen [M+X] + berechnet
24,8 min 1089,1 m/z [M+Na] + 1088,50 m/z (C55H71N9NaO13 + )
20,8 min 966,7 m/z [(M-Boc)+H] + 966,47 m/z (C50H64N9O11 + )
Fmoc-Pll-Gly-Pro-Gly-Ala-Phe-Glu(OAll)-Lys-NH2 (15→16)
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B in 30 min, 1 ml/min)
RP-HPLC / tR MALDI-TOF-MS gemessen [M+X] + berechnet
22,4 min 1246,8 m/z [M+H] +
1246,57 m/z (C63H80N11O16 + )
131

8 Experimenteller Teil
Cyclo[Pll-Gly-Pro-Gly-Ala-Phe-Glu]-Lys-NH2 (19→8)
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B in 30 min, 1ml/min)
RP-HPLC / tR ESI-MS gemessen [M+X] + berechnet
22,4 min 1246,8 m/z [M+H] +
Peptid 9
Fmoc-Gly-Pro-Ala-Gly-Phe-Glu(OAll)-Lys(Boc)-NH2
1246,57 m/z (C63H80N11O16 + )
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B in 30 min, 1 ml/min)
RP-HPLC / tR MALDI-TOF-MS gemessen [M+X] + berechnet
24,6 min 1089,1 m/z [M+Na] + 1088,50 m/z (C55H71N9NaO13 + )
20,4 min 966,7 m/z [(M-Boc)+H] + 966,47 m/z (C50H64N9O11 + )
Fmoc-Pll-Gly-Pro-Ala-Gly-Phe-Glu(OAll)-Lys-NH2
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B in 30 min, 1 ml/min)
RP-HPLC / tR MALDI-TOF-MS gemessen [M+X] + berechnet
22,4 min 1247,7 m/z [M+H] + 1246,57 m/z (C63H80N11O16 + )
Cyclo[Pll-Gly-Pro-Ala-Gly-Phe-Glu]-Lys(Boc)-NH2 (9)
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B in 30 min, 1 ml/min)
RP-HPLC / tR ESI-MS gemessen [M+X] + berechnet
13,7-14,2 min 966,4 m/z [(M-Boc)+H] + 966,46 m/z (C45H71N11O13 + )
Peptid 10
Fmoc-Pll-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu(OAll)-Lys-NH2
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B in 30 min, 1 ml/min)
RP-HPLC / tR MALDI-TOF-MS gemessen [M+X] + berechnet
25,5 min 1247,2 m/z [M+H] + 1246,57m/z (C63H80N11O16 + )
Cyclo[Pll-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu]-Lys(Boc)-NH2 (10)
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B in 30 min, 1 ml/min)
RP-HPLC / tR ESI-MS gemessen [M+X] + berechnet
18,2-18,3 min 1066,4 m/z [M+H] + 1066,52 m/z (C50H72N11O15 + )
14,1-14,7 min 966,4 m/z [(M-Boc)+H] + 966,46 m/z (C45H71N11O13 + )
132

Peptid 11
Fmoc-Ala-Gly-Pro-Gly-Phe-Glu(OAll)-Lys(Boc)-NH2
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B in 30 min, 1 ml/min)
RP-HPLC / tR MALDI-TOF-MS gemessen [M+X] + berechnet
8 Experimenteller Teil
24,1 min 1088,8 m/z [M+Na] + 1088,50 m/z (C55H71N9NaO13 + )
20,0 min 966,9 m/z [(M-Boc)+H] + 966,47 m/z (C50H64N9O11 + )
Fmoc-Pll-Ala-Gly-Pro-Gly-Phe-Glu(OAll)-Lys-NH2
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B in 30 min, 1 ml/min)
RP-HPLC / tR MALDI-TOF-MS gemessen [M+X] + berechnet
19,9 min 1247,0 m/z [(M+H] + 1246,57 m/z (C63H80N11O16 + )
Cyclo[Pll-Ala-Gly-Pro-Gly-Phe-Glu]-Lys(Boc)-NH2 (11)
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B in 30 min, 1 ml/min)
RP-HPLC / tR ESI-MS gemessen [M+X] + berechnet
18,2-18,4 min 1088,4 m/z [M+Na] + 1088,50 m/z (C50H71N11NaO15 + )
14,2-14,8 min 966,4 m/z [(M-Boc)+H] + 966,46 m/z (C45H71N11O13 + )
Peptid 12
Fmoc-Gly-Ala-Phe-Gly-Pro-Glu(OAll)-Lys(Boc)-NH2
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B in 30 min, 1 ml/min)
RP-HPLC / tR MALDI-TOF-MS gemessen [M+X] + berechnet
24,0 min 1088,6 m/z [M+Na] + 1088,50 m/z (C55H71N9NaO13 + )
19,9 min 966,8 m/z [(M-Boc)+H] + 966,47 m/z (C50H64N9O11 + )
Fmoc-Pll-Gly-Ala-Phe-Gly-Pro-Glu(OAll)-Lys-NH2
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B in 30 min, 1 ml/min)
RP-HPLC / tR MALDI-TOF-MS gemessen [M+X] + berechnet
20,1 min 1246,5 m/z [M+H] + 1246,57 m/z (C63H80N11O16 + )
Cyclo[Pll-Gly-Ala-Phe-Gly-Pro-Glu]-Lys(Boc)-NH2 (12)
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B in 30 min, 1 ml/min)
RP-HPLC / tR ESI-MS gemessen [M+X] + berechnet
18,1-18,3 min 1088,4 m/z [M+Na] + 1088,50 m/z (C50H71N11NaO15 + )
14,1-14,7 min 966,4 m/z [(M-Boc)+H] + 966,46 m/z (C45H71N11O13 + )
133

8 Experimenteller Teil
8.3.2 Synthese des cyclischen Peptids 31 zur Untersuchung von
Methionin als Sollbruchstelle
Die Synthese der Peptide erfolgte an SieberAmid-TentaGel (0,12 mmol/g). Die
linearen Vorläufersequenzen wurden am Peptidsynthesizer nach AAV 7 dargestellt.
Als chemistry file wurde 10µmol(3ml)2.1.0.kem ausgewählt. Die Elongation der
Peptidkette erfolgte unter Verwendung der Module HhDAFiiidD (PrPk Fmoc
Depro/Single). Die verwendeten Aminosäuren waren die folgenden: Fmoc-Ala-OH,
Fmoc-βAla-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OAll)-OH,
Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH und Fmoc-Pro-OH.
Das Syntheseharz wurde vom reaction vessel des Synthesizers in eine
Einwegspritze mit PE-Fritte überführt. Die N-terminale Fmoc-Schutzgruppe wurde
nach AAV 10 gespalten. Zur Entschützung der mit Allyl geschützten Carbonsäure
wurde das Harz wie in AAV 11a beschrieben behandelt. Anschließend wurde wie in
AAV 8 aufgeführt cyclisiert.
Zur Analytik wurden kleine Mengen des Peptids entnommen und sauer nach AAV 17
gespalten.
Peptid 28
Fmoc-Met-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu(OAll)-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-NH2 (27→28)
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B° in 20 min, 1 ml/min)
RP-HPLC / tR ESI-MS gemessen [M+X] + berechnet
19,2 min 1644,5 m/z [M+H] + 1642,743 m/z (C81H108N15O18S2 + )
17,9 min 1660,4 m/z [M(ox.)+H] + 1658,738 m/z (C81H108N15O19S2 + )
Peptid 30
H-Met-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-NH2 (29→30)
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B° in 20 min, 1 ml/min)
RP-HPLC / tR ESI-MS gemessen [M+X] + berechnet
13,9 min 1380,9 m/z [M+H] + 1380,6439 m/z (C63H94N15O16S2 + )
13,4 min 1397,4 m/z [M(ox.)+H] + 1396,6388 m/z (C63H94N15O17S2 + )
134

Peptid 32
Cyclo[Met-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu]-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-NH2 (31→32)
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B° in 20 min, 1 ml/min)
RP-HPLC / tR ESI-MS gemessen [M+X] + berechnet
8 Experimenteller Teil
14,7 min 1363,6 m/z [M+H] + 1362,6333 m/z (C63H92N15O15S2 + )
13,7 min 1379,7 m/z [M(ox.)+H] + 1378,6282 m/z (C63H92N15O16S2 + )
8.3.2.1 Spaltung der Sollbruchstelle des cyclischen Peptids 31
Das festphasengebundene cyclische Peptid 79a wurde nach AAV 14 mit BrCN-
Lösung behandelt.
Die Charakterisierung erfolgte mittels RP-HPLC offline MALDI-TOF-MS.
Peptid 33
H-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu(Hsl)-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-NH2 (31→33)
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (10-85% B° in 20 min, 1 ml/min)
RP-HPLC / tR MALDI-TOF-MS gemessen [M+X] + berechnet
14,1 min 1332,5 m/z [M+H] + 1332,6405 m/z (C62H90N15O16S + )
13,7 min 1378,5 m/z [M(ox.)+H] + 1378,6282 m/z (C63H92N15O16S2 + )
Für weitere Tandem-MS Experimente wurde das Rohprodukt, also ohne HPLC-
Aufreinigung, verwendet.
135

8 Experimenteller Teil
8.3.3 Synthese des cyclischen Peptids 41 zur Untersuchung von
Methionin als Sollbruchstelle
Die Synthese der Peptide erfolgte am 4-Fmoc-Hydrazinobenzoyl Am NovaGel TM
(01-64-0377) Harz. Zur Reduktion der Beladungsdichte wurde das Harz nach AAV 1
mit der ersten Aminosäure (Fmoc-βAla-OH/ Boc-βAla-OH) beladen. Es wurden
jedoch je 5 eq. Xaa verwendet. Die linearen Vorläufersequenzen wurden am Peptid-
synthesizer nach AAV 7 dargestellt. Als chemistry file wurde 20µmol(3ml)2.1.0.kem
ausgewählt. Die Elongation der Peptidkette erfolgte unter Verwendung der Module
HhDAFiiidD (PrPk Fmoc Depro/Single). Die verwendeten Aminosäuren waren die
folgenden: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-βAla-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Gly-OH,
Fmoc-Glu-OAll, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH und Fmoc-Pro-OH.
Nach der automatisierten Synthese wurde das Syntheseharz vom reaction vessel
des Synthesizers in eine Einwegspritze mit PE-Fritte überführt. Zur Entschützung der
mit Allyl geschützten Carbonsäure wurde das Harz wie in AAV 11a beschrieben
behandelt. Die N-terminale Fmoc-Schutzgruppe wurde nach AAV 10 gespalten. An-
schließend wurde wie in AAV 8 aufgeführt cyclisiert.
Zur Analytik wurden kleine Mengen des Peptids entnommen und nach AAV 18 vom
Harz gespalten.
Zur Spaltung der Met-Sollbruchstelle wurde das Harz nach AAV 14 behandelt.
Peptid (39→40)
Fmoc-Met(O)-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu(-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-OH)-OAll
MALDI-TOF-MS: 1479,0 m/z [M+H] +
Berechnet: C71H96N15O18S + (1478,6773 m/z)
amid))-OAll
Fmoc-Met(O)-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu(-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-N-(4-Bromphenyl-
MALDI-TOF-MS: 1632,1 m/z [M+H] +
Berechnet: C77H100BrN16O17S + (1631,6351 m/z)
Peptid (41→42)
Cyclo[Met(O)-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu(-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-OH)]
MALDI-TOF-MS: 1198,9 m/z [M+H] +
Berechnet: C53H80N15O15S + (1198,5674 m/z)
136

amid))]
8 Experimenteller Teil
Cyclo[Met(O)-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu(-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-N-(4-Bromphenyl-
MALDI-TOF-MS: 1351,9 m/z [M+H] +
Berechnet: C59H84BrN16O18S + (1351,5252 m/z)
Peptid (43→44)
H-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu(-βAla-Pro-Pro-Arg-OH)-Hsl
MALDI-TOF-MS: 1152,9 m/z [M+H] +
Berechnet: C52H78N15O15 + (1152,5796 m/z)
H-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu(-βAla-Pro-Pro-Arg-N-(4-Bromphenylamid))-Hsl
MALDI-TOF-MS: 1305,9 m/z [M+H] +
Berechnet: C58H82BrN16O14 + (1305,5374 m/z)
137

8 Experimenteller Teil
8.3.4 Synthese des Peptids 51/52 zur Stabilitätsuntersuchung des
Glykolamid-Linkers und des HMBA-Linkers
Zur Herstellung von 0,1 mmol Fmoc-Ala-Acetamid (oder besser Glykolamidester)-
Harz wurden 312,5 mg (0,1 mmol/ 0,32 mmol/g) TG-S-NH2-Harz in eine
Einwegspritze mit PE-Fritte eingewogen. Zunächst wurde das Harz viermal 2
Minuten mit DCM, zweimal 5 Minuten mit 5% DIPEA in DCM und viermal 2 Minuten
mit DCM vorbehandelt. Bromessigsäure (83,4 g, 0,6 mmol) wurde in 1 ml DCM
gelöst und auf 0°C gekühlt. DCC (61,9 mg, 0,3 mmol) wurde in 0,4 ml DCM gelöst,
zur eiskalten Bromessigsäurelösung gegeben und 15 Minuten bei 0°C gerührt. Der
ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wurde abfiltriert, die Lösung zum vorbehandelten
Harz aufgezogen und 15 Minuten bei RT geschüttelt. Anschließend wurde die
Lösung in ein Becherglas gedrückt, mit 17,4 µl DIPEA (0,1 mmol) versetzt und erneut
zum Harz aufgezogen. Nach 75 Minuten wurde das Harz wie folgt gewaschen: DCM
(4x2 min), DMF (4x2 min), DCM (5x2 min), DMF (1x2 min, 2x10 min). Fmoc-Ala-OH
(93,4 mg/ 0,3 mmol) und CsI (7,8 mg/ 0,03 mmol) wurden in ein Becherglas
eingewogen und in 2 ml DMF und DIPEA (52,2 µl/ 0,3 mmol) gelöst. Nachdem sich
alles vollständig gelöst hatte (ca. 5 Minuten), wurde die aktivierte Aminosäure-
Lösung zum Bromacetamid-Harz aufgezogen und bei RT über Nacht geschüttelt.
Nach dem Waschen (10x1 Minute mit DMF, 5x1 Minute mit DCM) wurde das Harz
am Vakuum getrocknet und nach AAV 6 die Beladungsdichte bestimmt. Es ergab
sich eine Beladungsdichte von 0,322 mmol/g.
Das HMBA Harz wurde mit der MSNT-Methode nach AAV 2 beladen (Beladungs-
dichte 0,18 mmol/g).
Die Synthese der Peptide erfolgte nacheinander, aber analog zueinander, am
Peptidsynthesizer nach AAV 7 im 20 µmol Ansatz unter Verwendung des UV-
Monitorings. Nach der automatisierten Elongation erfolgte die Abspaltung der
N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe nach AAV 10, bevor nach AAV 5 der N-Terminus
acetyliert wurde. Die Abspaltung der säurelabilen Schutzgruppen der Seitenketten
erfolgte nach AAV 12. Die Abspaltung des Peptids vom Harz erfolgte schließlich
nach AAV 16.
138

Peptid (53)
Ac-Phe-Trp-Arg-Ala-NHPropyl
8 Experimenteller Teil
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (55-100% B° in 30 min, 1 ml/min) tR = 15,2 min
ESI-MS: 662,0 m/z [M+H] +
Berechnet: C34H48N9O5 + (662,3773 m/z)
139

8 Experimenteller Teil
8.3.5 Synthese des festphasengebundenen Peptids 63 zur
Untersuchung der Trp-Xaa Sollbruchstelle
Standard aminofunktionalisiertes TentaGel wurde nach AAV 1 mit Fmoc-Met-OH
beladen. Es ergab sich eine Beladungsdichte von 0,13 mmol/g. Die Festphasen-
synthese des linearen Peptids 23 erfolgte am Peptidsynthesizer nach AAV 7. 20µM
spezial.kem wurde als chemistry file ausgewählt. Für den ersten Zyklus wurde die
Modulfolge eDG (Initial Wash) verwendet. Zyklus zwei bis zwölf verlief mit der
Modulfolge BbDAFiiihd (Single Couple, Cond Cap/5eq.) und als abschließender
Zyklus folgten die Module Dc (Final Wash). Folgende Aminosäurebausteine wurden
verwendet: Fmoc-βAla-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH,
Fmoc-Glu-OAll, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Phe(4Br)-OH, Fmoc-Pro-OH und Fmoc-
Trp(Boc)-OH. Nach der automatisierten SPPS erfolgte die Abspaltung der Fmoc-
Schutzgruppe (AAV 10), die Abspaltung der Allyl-Schutzgruppe (AAV 11b) und
schließlich die Cyclisierung mit PyAOP nach AAV 8.
Zur Analytik wurden kleine Mengen des Peptids entnommen und mit BrCN nach AAV
14 gespalten.
Fmoc-Trp-Gly-His-Pro-Gln-Glu[βAla-βAla-Phe(4Br)-Arg(Pbf)-Hsl]-OAll (61→ 62)
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (20-100% B in 20 min, 1 ml/min) tR = 18,9 min
ESI-MS: 1930,6 m/z [M+H] + , 1678,7 m/z [(M-Pbf)+H] +
Berechnet: C92H113BrN19O21S + (1930,72 m/z)
H-Trp-Gly-His-Pro-Gln-Glu[βAla-βAla-Phe(4Br)-Arg(Pbf)-Hsl]-OH
ESI-MS: 1668,8 m/z [M+H] + , 1416,0 m/z [(M-Pbf)+H] +
Berechnet: C74H99BrN19O19S + (1668,62 m/z)
Cyclo[Trp-Gly-His-Pro-Gln-Glu(βAla-βAla-Phe(4Br)-Arg-Hsl)] (63→ 64)
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (45-100% B in 20 min, 1 ml/min) tR = 11,1 min
ESI-MS: 1397,9 m/z [M+H] +
Berechnet: C61H83BrN19O16 + (1398,53 m/z)
140

8 Experimenteller Teil
8.3.6 Synthese des festphasengebundenen Peptids 66 zur
Untersuchung von Trp als Linker
Standard aminofunktionalisiertes TentaGel wurde nach AAV 1 mit Fmoc-Trp(Boc)-
OH beladen. Es ergab sich eine Beladungsdichte von 0,18 mmol/g. Die Festphasen-
synthese des Peptids erfolgte am Peptidsynthesizer nach AAV 7. 20µM spezial.kem
wurde als chemistry file ausgewählt. Für den ersten Zyklus wurde die Modulfolge
eDG (Initial Wash) verwendet. Zyklus zwei bis zwölf verlief mit der Modulfolge
BbDAFiiihd (Single Couple, Cond Cap/5eq.) und als abschließender Zyklus folgten
die Module Dc (Final Wash). Folgende Aminosäurebausteine wurden verwendet:
Fmoc-βAla-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu-
OAll, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Phe(4Br)-OH, Fmoc-Pro-OH und Fmoc-Trp(Boc)-OH.
Fmoc-Met−Gly-His-Pro-Gln-Glu −[βAla-βAla-Phe(4Br)-Arg(Pbf)-Trp-TG]-OAll (66)
Leider konnte das Peptid nicht vom Harz abgespalten werden.
141

8 Experimenteller Teil
8.3.7 Synthese des festphasengebundenen Peptids 77 als
Modellpeptid zur Etablierung des Partiellen Edman-Abbaus
(PED)
Standard aminofunktionalisiertes TentaGel wurde nach AAV 1 mit Fmoc-Met-OH
beladen. Es ergab sich eine Beladungsdichte von 0,112 mmol/g. Die Festphasen-
synthese des Peptids erfolgte am Peptidsynthesizer nach AAV 7. Mon20µM
(3mlRV).kem wurde als chemistry file ausgewählt. Für den ersten Zyklus wurde
Modul D (NMP Wash) verwendet. Zyklus zwei bis zwölf verlief mit der Modulfolge
HhDAFiidD (PrPk Fmoc Depro/Singel) und als abschließender Zyklus folgte Modul c
(Final DCM Wash). Folgende Aminosäurebausteine wurden verwendet: Fmoc-Ala-
OH, Fmoc-βAla-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OAll)-OH, Fmoc-
Phe-OH, Fmoc-Pro-OH und Boc-Lys(Alloc)-OH. Nach der automatisierten SPPS
erfolgte die Abspaltung der Alloc- und Allyl-Schutzgruppen (AAV 11a) und schließlich
die Cyclisierung mit PyBOP nach AAV 8.
Zur Analytik wurden kleine Mengen des Peptids entnommen und mit BrCN nach AAV
14 gespalten.
H-Lys(Alloc)-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu(OAll)-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-Hsl (75→76)
Analytische RP-HPLC (Nucleosil-Säule): (10-85% B° in 20 min, 0,1 ml/min)
RP-HPLC / tR ESI-MS gemessen [M+X] + berechnet
17,8 min 1571,3 m/z [M+H] + 1571,7563 m/z (C74H104N16O20S + )
15,9 min 1531,2 m/z [(M-All)+H] + 1531,7250 m/z (C71H103N16O20S2 + )
H-Lys-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-Hsl
Analytische RP-HPLC (Nucleosil-Säule): (10-85% B° in 20 min) tR = 15,6 min
ESI-MS: 1462,6 m/z
Berechnet: C68H101N16O18S + (1461,7195 m/z)
H-cyclo[Lys-Gly-Ala-Pro-Gly-Phe-Glu]-βAla-Pro-Pro-Arg(Pbf)-Hsl (77→78)
Analytische RP-HPLC (Nucleosil-Säule): (10-85% B° in 20 min) tR = 15,0 min
MALDI-TOF-MS: 1444,7 m/z
Berechnet: C68H99N16O17S + (1443,7089 m/z)
142

8 Experimenteller Teil
8.3.8 Synthese des Peptids 71 zur Untersuchung einer
enzymatischen Ringöffnung
Wie in AAV 1 beschrieben, wurde TentaGel mit Fmoc-Met-OH beladen
(Beladungsdichte: 0,12 mmol/g). Anschließend erfolgte nach AAV 7 die Synthese
des linearen Vorläuferpeptids unter Verwendung des 20µM 3ml.kem chemistry files.
Im ersten Zyklus wurde das Harz gewaschen (Modulfolge: eGD). Die Modulfolge der
darauffolgenden Zyklen lautete BbDAFiiihd (Single Couple, Cond Cap./5eq.). Mit
einem abschließenden final DCM wash (Modul: c) wurde die automatisierte SPPS
beendet. Folgende Aminosäurebausteine wurden verwendet: Fmoc-βAla-OH,
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu-OAll, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH,
Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser( t Bu)-OH und Fmoc-Tyr( t Bu)-OH. Nach der
automatisierten SPPS erfolgte die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe (AAV 10), die
Abspaltung der Allyl-Schutzgruppe (AAV 11a) und schließlich die Cyclisierung mit
PyBOP nach AAV 8.
Zur Analytik wurden kleine Mengen des Peptids entnommen und mit BrCN nach AAV
14 gespalten.
Fmoc-Lys-Ala-Tyr-Phe-Ser-Ala-Gly-Glu(βAla-Pro-Pro-βAla-Hsl)-OAll (67→68)
Analytische RP-HPLC (Eurosphere Säule): (10-100% B° in 20 min, 1ml/min) tR = 15,47 min
MALDI-MS: 1554,3 m/z [M+H] +
Berechnet: C78H101N14O20 + (1553,7311 m/z)
H-Lys-Ala-Tyr-Phe-Ser-Ala-Gly-Glu(βAla-Pro-Pro-βAla-Hsl)-OH (69→70)
Analytische RP-HPLC (Eurosphere Säule): (10-100% B° in 20 min, 1 ml/min) tR = 10,6 min
MALDI-MS: 1291,7 m/z [M+H] +
Berechnet: C60H87N14O18 + (1291,6317 m/z)
cyclo-[Lys-Ala-Tyr-Phe-Ser-Ala-Gly-Glu(βAla-Pro-Pro-βAla-Hsl)] (71→72)
Analytische RP-HPLC (Eurosphere Säule): (10-100% B° in 20 min, 1 ml/min) tR = 12,1 min
MALDI-MS: 1274,5 m/z [M+H] +
Berechnet: C60H85N14O17 + (1273,6212 m/z)
143

8 Experimenteller Teil
8.3.8.1 Tryptischer Verdau an der festen Phase
Eine Einwegspritze mit PE-Fritte wurde mit etwa 5 mg Harz as152 (cyclisch ohne
PGs) bestückt. Zum Einstellen des pH-Wertes wurde das Harz einmal 20 min und
fünfmal 2 min mit Ammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH 8, 50 mM) gewaschen.
1,46 mg Trypsin wurden in 500 µl Puffer gelöst (0,124 mM), zum Harz aufgezogen
und über Nacht geschüttelt. Am nächsten Tag wurde siebenmal je eine Minute mit
Puffer und sechsmal je eine Minute mit Methanol gewaschen. Zum Abspalten des
Peptids vom Harz wurde nach AAV 14 vorgegangen.
8.3.8.2 Tryptischer Verdau in Lösung
1 mg des vollständig entschützten cyclischen Peptids wurde in 150 µl Ammonium-
hydrogencarbonat-Puffer (pH 8, 50 mM) gelöst, so dass eine 5,2 mM Lösung
entstand. 0,3 mg Trypsin wurden in 200 µl Puffer gelöst, so dass eine 0,064 mM
Lösung entstand. Nun wurden 10 µl der Trypsinlösung zur Peptidlösung pipettiert.
Anschließend wurden 10 µl dieser Lösung in die Trypsinlösung pipettiert. Somit
wurden zwei Lösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen an Trypsin und Peptid
erhalten. Nach sieben Stunden wurde die Reaktion durch Zugabe von Methanol
(ca. 3 Tropfen) gestoppt und die Lösung anschließend lyophilisiert.
144

8 Experimenteller Teil
8.3.8.3 Synthese der Kontrollpeptide zur Optimierung des on-beadassays
Standard aminofunktionalisiertes TentaGel wurde nach AAV 1 mit Fmoc-Met-OH
beladen. Es ergab sich eine Beladungsdichte von 0,13 mmol/g. Die Festphasen-
synthese des Peptids erfolgte am Peptidsynthesizer nach AAV 7. 20µMspezial.kem
wurde als chemistry file ausgewählt. Für den ersten Zyklus wurde die Modulfolge
eGD (initial Wash) verwendet. Zyklus zwei bis zehn verlief mit der Modulfolge
BbDAFiiihD (Single Couple, Cond Cap/5 eq.) und als abschließender Zyklus folgte
Dc (Final Wash). Folgende Aminosäurebausteine wurden verwendet: Fmoc-Ala-OH,
Fmoc-βAla-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-
His(Trt)-OH und Fmoc-Pro-OH. Nach der automatisierten SPPS erfolgte die
Abspaltung der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe nach AAV 10, sowie die
Entfernung der säurelabilen Schutzgruppen nach AAV 12.
Zur Analytik wurden kleine Mengen des Peptids entnommen und mit BrCN nach AAV
14 gespalten.
Positivkontrolle
H-Gly-His-Pro-Gln-Gly-βAla-Pro-Pro-Arg-Hsl
Analytische RP-HPLC (Eurosphere-Säule): (10-85% B in 20 min, 0,9 ml/min), tR = 9,0 min
MALDI-TOF-MS: 999,6 m/z [M+H] +
C43H67N16O12 (999,5119) m/z
Negativkontrolle
H-Ala-Pro-Ala-Arg-Gly-βAla-Pro-Pro-Arg-Hsl
Analytische RP-HPLC (Eurosphere-Säule): (10-85% B in 20 min, 0.9 ml/min), tR = 9,2 min
MALDI-TOF-MS: 975,4 m/z[M+H] +
C42H71N16O12 (975,5483) m/z
145

8 Experimenteller Teil
8.3.8.4 Synthese der Bibliothek 86
Die Festphasensynthese der Bibliothek 86 erfolgte an aminofunktionalisiertem
TentaGel-Harz (MB 300 bzw S-NH2). Zur ersten Aminosäurenkupplung wurden 5 eq.
Fmoc-Met-OH, 3 eq. Boc-Met-OH, 7,8 eq. HBTU, 8 eq. HOBt und 16 eq. DIPEA
verwendet und entsprechend AAV 1 verfahren. Es ergab sich eine Beladungsdichte
von 0,16 mmol/g. Für die anschließende Synthese der Massenspacer-Sequenz
wurden die folgenden Aminosäurebausteine verwendet: Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-
Pro-OH, Fmoc-βAla-OH und Fmoc-Glu(OAll)-OH. Zur Anknüpfung der Aminosäuren
wurde AAV 3 verwendet. Das anschließende capping erfolgte nach AAV 5. Die
Abspaltung der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe verlief wie in AAV 10 beschrieben.
Die Vollständigkeit der Fmoc-Abspaltung wurde mittels UV-Spektroskopie überprüft
und gegebenenfalls wiederholt. Für die anschließenden kombinatorischen
Kupplungsschritte wurde das Harz vor der Aminosäurenkupplung entsprechend der
Anzahl an Kupplungen in PE-Spritzen aliquotiert. Die separaten Kupplungen
erfolgten ebenfalls wie in AAV 3 beschrieben. Nach erfolgreicher Umsetzung wurden
die aliquoten Harzmengen vereinigt und nach AAV 5 gecappt. Es folgte die Fmoc-
Entschützung nach AAV 10; auch hierbei wurde die Abspaltlösung mittels UV-
Spektroskopie untersucht. Nach erfolgreicher Freisetzung des N-Terminus wurde
das Harz erneut aufgeteilt. In der kombinatorischen Synthese kamen folgende
Aminosäuren zum Einsatz: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(O t Bu)-OH,
Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser( t Bu)-OH,
Fmoc-Thi-OH und Fmoc-Trp(Boc)-OH. Nach der letzten Kupplung mit Boc-
Lys(Alloc)-OH wurde das Harz gut mit DMF und DCM gewaschen und im Vakuum
getrocknet. Die Abspaltung der Alloc- und Allyl-Schutzgruppe erfolgte nach AAV 11.
Daraufhin wurde wie in AAV 8 beschrieben unter Verwendung von PyBOP cyclisiert.
Zur Lagerung wurde die mit Peptidylharz bestückte Einwegspritze in einem mit Argon
gefluteten Schraubdeckelglas im Kühlschrank aufbewahrt. Die Entfernung der
säurelabilen Schutzgruppen erfolgte unmittelbar vor dem Einsatz im biologischen
Test nach AAV 12.
146

8 Experimenteller Teil
8.3.9 Synthese der Peptide (92-97) zur Bestimmung der KD-Werte
Die Festphasensynthese der Peptide erfolgte an RinkAmid-Research-Harz (R-RAM-
TG, Rapp Polymer) am Peptidsynthesizer nach AAV 7. UV FastMoc0.10,S200.kem
wurde als chemistry file ausgewählt. Für den ersten Zyklus wurde die Modulfolge
ecDBgADEFd (Zyklus1: Amid) verwendet. Zyklus zwei bis elf verlief mit der
Modulfolge BbADEFfhd (SingCoup,CondCap.) und als abschließender Zyklus folgten
die Module ecD (Complete wash). Folgende Aminosäurebausteine wurden
verwendet: Fmoc-βAla-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH,
Fmoc-Glu(OAll)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Pro-OH und Fmoc-Lys(Alloc)-OH bzw.
Boc-Lys(Alloc)-OH.
Die Abspaltung der Alloc- und Allyl-Schutzgruppe erfolgte nach AAV 11 Variante B.
Nach ausführlichem Waschen des Harzes, einer Testabspaltung und MALDI-TOF-
MS Analyse wurde das Harz in zwei gleich große Aliquote aufgeteilt. Eine Hälfte
wurde als lineares Peptid direkt nach AAV 19 vom Harz gespalten.
Die zweite Hälfte wurde wie AAV 8 beschrieben cyclisiert, und anschließend nach
AAV 19 vom Harz gespalten.
Hitsequenz: 93/92
H-Lys-His-Pro-Gln-His-Gly-Glu-βAla-Pro-Pro-Arg-NH2 (93)
Roh MALDI-TOF-MS: 1252,1 m/z
Präparative RP-HPLC (Eurosphere Säule): (11-15% B° in 20 min, 9,8 ml/min) tR = 7,0 min
Ausbeute nach HPLC: 17% (10,7 mg)
Analytische RP-HPLC (Eurosphere Säule): (8-30% B° in 45 min, 0,9 ml/min) tR = 12,4 min
ESI-QTOF: 1252,6653 m/z (±0,4 ppm)
Berechnet: C54H86N21O14 + (1252,6658 m/z)
H-cyclo[Lys-His-Pro-Gln-His-Gly-Glu]-βAla-Pro-Pro-Arg-NH2 (92)
Roh MALDI-TOF-MS: 1234,3 m/z
Präparative RP-HPLC (Eurosphere Säule): (12-18,5% B° in 20 min, 9,8 ml/min) tR = 6,6 min
Ausbeute nach HPLC: 22% (13,5 mg)
Analytische RP-HPLC (Eurosphere Säule): (8-30% B° in 45 min, 0,9 ml/min) tR = 13,1 min
ESI-QTOF: 1234,6576 m/z (±1,9 ppm)
Berechnet: C54H84N21O13 + (1234,6552 m/z)
147

8 Experimenteller Teil
HPQ-Motiv, aber nicht Hit: Peptide 95/94
H-Lys(Alloc)-His-Gly-His-Pro-Gln-Glu(OAll)-βAla-Pro-Pro-Arg-NH2
Roh MALDI-TOF-MS: 1376,5 m/z
Berechnet: C61H94N21O16 + (1376,7182 m/z)
H-Lys-His-Gly-His-Pro-Gln-Glu-βAla-Pro-Pro-Arg-NH2 (95)
Roh MALDI-TOF-MS: 1252,4 m/z
Präparative RP-HPLC (Eurosphere Säule): (12-18,5% B° in 20 min, 9,8 ml/min) tR = 6,5 min
Ausbeute nach HPLC: 26% (16,3 mg)
Analytische RP-HPLC (Eurosphere Säule): (8-30% B° in 45 min, 0,9 ml/min) tR = 13,2 min
ESI-QTOF:1252,6679 m/z (± 1,7 ppm)
Berechnet: C54H86N21O14 + (1252,6658 m/z)
H-cyclo[Lys-His-Gly-His-Pro-Gln-Glu]-βAla-Pro-Pro-Arg-NH2 (94)
Roh MALDI-TOF-MS:1234,6 m/z
Präparative RP-HPLC (Eurosphere Säule): (12-18,5% B° in 20 min, 9,8 ml/min) tR = 6,9 min
Ausbeute nach HPLC: 32% (19,6 mg)
Analytische RP-HPLC (Eurosphere Säule): (8-30% B° in 45 min, 0,9 ml/min) tR = 13,2 min
ESI-QTOF:1234,6557 m/z (± 0,4 ppm)
Berechnet: C54H84N21O13 + (1234,6552 m/z)
Negativ-Kontrolle: Peptide 97/98
H-Lys(Alloc)-Gln-Pro-His-His-Gly-Glu(OAll)-βAla-Pro-Pro-Arg-NH2
Roh MALDI-TOF-MS: 1376,4 m/z
Berechnet: C61H94N21O16 + (1372,7182 m/z)
H-Lys-Gln-Pro-His-His-Gly-Glu-βAla-Pro-Pro-Arg-NH2 (97)
Roh MALDI-TOF-MS: 1252,4 m/z
Präparative RP-HPLC (Eurosphere Säule): (12-18,5% B° in 20 min, 9,8 ml/min) tR = 6,8 min
Ausbeute nach HPLC: 6% (3,9 mg)
Analytische RP-HPLC (Eurosphere Säule): (8-30% B° in 45 min, 0,9 ml/min) tR = 12,3 min
ESI-QTOF: 1252,6663 m/z (± 0,4 ppm)
Berechnet: C54H86N21O14 + (1252,6658 m/z)
148

H-cyclo[Lys-Gln-Pro-His-His-Gly-Glu]-βAla-Pro-Pro-Arg-NH2 (96)
Roh MALDI-TOF-MS: 1234,3 m/z
8 Experimenteller Teil
Präparative RP-HPLC (Eurosphere Säule): (12-18,5% B° in 20 min, 9,8 ml/min) tR = 6,6 min
Ausbeute nach HPLC: 33% (20,2 mg)
Analytische RP-HPLC (Eurosphere Säule): (8-30% B° in 45 min, 0,9 ml/min) tR = 13,5 min
ESI-QTOF: 1234,6558 m/z (± 0,5 ppm)
Berechnet: C54H84N21O13 + (1234,6552 m/z)
149

8 Experimenteller Teil
8.3.10 Synthese der fluoreszenzmarkierten Peptide
8.3.10.1 Synthese des fluoreszenzmarkierten Peptids SRBS-Y241
Wie in AAV 2 beschrieben wurde das Wang-Harz mit Fmoc-Ala-OH beladen
(Beladungsdichte 0,2 mmol/g). Anschließend erfolgte nach AAV 7 die Synthese des
Peptids am Synthesizer unter Verwendung des 20µM spezial.kem chemistry files. Im
ersten Modul wurde das Harz gewaschen (Modulfolge: eGD). Die Modulfolge der
darauffolgenden Zyklen lautete BbDAFiiiCid (Single Couple, Cap./5eq.). Mit einem
abschließenden final wash (Modulfolge: Dc) wurde die automatisierte SPPS beendet.
Folgende Aminosäurebausteine wurden verwendet: Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-
Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ile-
OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH und
Fmoc-Tyr(tBu)-OH.
Zur Überprüfung der Synthese wurden Testabspaltungen durchgeführt. Hierzu
wurden kleine Mengen des Peptids entnommen und nach AAV 19 vorgegangen.
Fmoc-Leu-Lys-His-Asp-Thr-Asn-Ile-Tyr-Cys-Arg-His-Asp-His-Lys-Ala-OH (110→)
Analytische RP-HPLC (Eurosphere Säule): (15-100% B in 30 min, 0,9 ml/min) tR = 12,9 min
ESI-MS: 2068,5 m/z [M+H] 1+ , 1035,0 m/z [M+2H] 2+ , 690,5 m/z [M+3H] 3+ , 518,0 m/z [M+4H] 4+
Berechnet: C93H136N25O25S2 + (avarage 2068,35 m/z)
Der automatisierten SPPS folgte eine manuelle Abspaltung der N-terminalen Fmoc-
Schutzgruppe nach AAV 10. Daraufhin wurde nach AAV 9 das Fluoreszenzlabel
eingeführt und schließlich wurde das Peptid durch Behandlung mit Reagenz K (nach
AAV 20) vom Harz gespalten und aufgereinigt.
SRBS-Leu-Lys-His-Asp-Thr-Asn-Ile-Tyr-Cys-Arg-His-Asp-His-Lys-Ala-OH SRBS-Y241
Präparative RP-HPLC (Eurosphere Säule): (27-53% B in 20 min, 9,8 ml/min) tR = 11,4 min
ESI-MS: 2387,7 m/z
Ausbeute: 34% (16 mg)
Berechnet: C105H154N27O29S4 + (exacte 2385,0283 m/z, avarage 2386,7692 m/z)
150

8 Experimenteller Teil
8.3.10.2 Synthese des fluoreszenzmarkierten Phosphopeptids
SRBS-pY241
Wie in AAV 2 beschrieben wurde das Wang-Harz mit Fmoc-Ala-OH beladen
(Beladungsdichte 0,2 mmol/g). Anschließend erfolgte nach AAV 7 die Elongation der
ersten sieben Aminosäuren am Synthesizer unter Verwendung des 20µM
spezial.kem chemistry files. Im ersten Modul wurde das Harz gewaschen
(Modulfolge: eGD). Die Modulfolge der darauffolgenden Zyklen lautete BbDAFiiiCid
(Single Couple, Cap./5eq.). Mit einem abschließenden final wash (Modulfolge: Dc)
wurde die automatisierte SPPS beendet. Folgende Aminosäurebausteine wurden
verwendet: Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-
His(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH und Fmoc-Met-OH.
Zur Überprüfung der Synthese wurden Testabspaltungen durchgeführt. Hierzu
wurden kleine Mengen des Peptids entnommen und nach AAV 19 vorgegangen.
Fmoc -Cys-Arg-His-Asp-His-Lys-Ala-OH (111→)
MALDI-TOF-MS: 1082,4 m/z
Berechnet: C48H68N13O12S2 + (exacte 1082,4546 m/z)
Der automatisierten SPPS folgte eine manuelle Abspaltung der N-terminalen Fmoc-
Schutzgruppe nach AAV 10. Daraufhin wurde Fmoc-Tyr[PO(OBzl)OH]-OH (5 eq.)
unter Aktivierung mit 5 eq. PyBOP, 5 eq. HOBt und 10 eq. DIPEA. angeknüpft. Es
wurde wie in AAV 3 beschrieben vorgegangen. Auch die Anknüpfung der nächsten
Aminosäure (Fmoc-Ile-OH) erfolgte wie eben beschrieben manuell.
Die weitere Verlängerung der Peptidkette erfolgte wiederum am Peptidsynthesizer.
Hierzu wurde wie bereits zu Beginn der Synthese beschreiben vorgegangen.
Folgende Aminosäurebausteine kamen zum Einsatz: Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-
Asp(O t Bu)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc) und Fmoc-
Thr(tBu)-OH.
Der automatisierten SPPS folgte eine manuelle Abspaltung der N-terminalen Fmoc-
Schutzgruppe nach AAV 10. Daraufhin wurde nach AAV 9 das Fluoreszenzlabel
eingeführt und schließlich wurde das Peptid durch Behandlung mit Reagenz K (nach
AAV 20) vom Harz gespalten und aufgereinigt.
151

8 Experimenteller Teil
SRBS-pY241
SRBS-Leu-Lys-His-Asp-Thr-Asn-Ile-Tyr[PO(OH)2]-Cys-Arg-His-Asp-His-Lys-Ala-OH
Präparative RP-HPLC (Eurosphere Säule): 30-45% B in 20 min, 9,8 ml/min) tR = 11,1 min
ESI-MS: 2464,5 m/z [M+H] 1+ , 1233,3 m/z [M+2H] 2+ und 822,5 m/z [M+3H] 3+
Ausbeute: 13% (6,3 mg)
Berechnet: C105H155N27O32PS4 + (exacte 2464,9946m/z, avarage 2466,7491 m/z)
152

8 Experimenteller Teil
8.3.10.3 Synthese des fluoreszenzmarkierten Peptids SRBS-Y230
Wie in AAV 2 beschrieben wurde das Wang-Harz mit Fmoc-Asp(O t Bu)-OH beladen
(Beladungsdichte 0,7 mmol/g). Anschließend erfolgte nach AAV 7 die Elongation der
ersten neun Aminosäuren am Synthesizer unter Verwendung des 20µM spezial.kem
chemistry files. Im ersten Modul wurde das Harz gewaschen (Modulfolge: eGD). Die
Modulfolge der darauffolgenden Zyklen lautete BbDAFiiiCid (Single Couple,
Cap./5eq.). Mit einem abschließenden final wash (Modulfolge: Dc) wurde die
vorläufige automatisierte SPPS beendet. Folgende Aminosäurebausteine wurden
verwendet: Fmoc-Glu(O t Bu)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Lys(Boc)-OH und Fmoc-Tyr( t Bu).
Zur Überprüfung der Synthese wurden Testabspaltungen durchgeführt. Hierzu
wurden kleine Mengen des Peptids entnommen und nach AAV 19 vorgegangen.
Fmoc-Ile-Tyr-Glu-Glu-Leu-Leu-Lys-His-Asp-OH (119→)
MALDI-TOF-MS: (roh)
[M+H] + gemessen Intensität Beschreibung [M+H] + berechnet
1381,5 m/z 100% Fmoc-Ile…-OH 1381,6674 m/z (C68H93N12O19 + )
1088,3 m/z 13% Ac-Tyr...-OH 1088,5259 m/z (C49H74N11O17 + )
925,2 m/z 21% Ac-Glu 2 …-OH 925,4625 m/z (C40H65N10O15 + )
796,2 m/z 9% Ac-Glu 1 ..-OH 796,4199 m/z (C35H58N9O12 + )
Der automatisierten SPPS folgte eine manuelle Abspaltung der N-terminalen Fmoc-
Schutzgruppe nach AAV 10. Daraufhin wurde Fmoc-Ala-Ser(Ψ MeMe Pro)-OH (5 eq.)
unter Aktivierung mit 5 eq. PyBOP, 5 eq. HOBt und 10 eq. DIPEA angeknüpft. Es
wurde wie in AAV 3 beschrieben vorgegangen.
Die weitere Verlängerung der Peptidkette erfolgte wiederum am Peptidsynthesizer.
Hierzu wurde wie bereits zu Beginn der Synthese beschrieben vorgegangen.
Folgende Aminosäurebausteine kamen zum Einsatz: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-
OH, Fmoc-Pro-OH und Fmoc-Thr( t Bu)-OH.
Zur Überprüfung der Synthese wurden Testabspaltungen durchgeführt. Hierzu
wurden kleine Mengen des Peptids entnommen und nach AAV 19 vorgegangen.
153

8 Experimenteller Teil
Fmoc-Pro-Arg-Thr-Ala-Ala-Ser-Ile-Tyr-Glu-Glu-Leu-Leu-Lys-His-Asp-OH (121→)
Analytische RP-HPLC (Eurosphere Säule): (10-100% B in 20 min, 0,9 ml/min) tR = 17,2 min
MALDI-TOF-MS: 1966,2 m/z [M+H] +
Berechnet: C92H134N21O27 + (exacte 1964,9753 m/z, avarage 1966,1723 m/z)
Der automatisierten SPPS folgte eine manuelle Abspaltung der N-terminalen Fmoc-
Schutzgruppe nach AAV 10. Daraufhin wurde nach AAV 9 das Fluoreszenzlabel
eingeführt und schließlich wurde das Peptid durch Behandlung mit Reagenz K (nach
AAV 20) vom Harz gespalten und aufgereinigt.
SRBS-Pro-Arg-Thr-Ala-Ala-Ser-Ile-Tyr-Glu-Glu-Leu-Leu-Lys-His-Asp-OH SRBS-Y230
Präparative RP-HPLC (Eurosphere Säule): 30-75% B in 30 min, 9,8 ml/min) tR = 14,9 min
MALDI-TOF-MS: 2284,4 m/z [M+H] 1+
Ausbeute: 6% (2,5 mg)
Berechnet: C104H152N23O31S2 + (exacte 2283,0461 m/z, avarage 2284,5846 m/z)
154

8 Experimenteller Teil
8.3.10.4 Synthese des fluoreszenzmarkierten Phosphopeptids
SRBS-pY230
Wie in AAV 2 beschrieben wurde das Wang-Harz mit Fmoc-Asp(O t Bu)-OH beladen
(Beladungsdichte 0,7 mmol/g). Anschließend erfolgte nach AAV 7 die Elongation der
ersten sieben Aminosäuren am Synthesizer unter Verwendung des 20µM 15 min
länger UV.kem chemistry files. Im ersten Modul wurde das Harz gewaschen
(Modulfolge: eGD). Die Modulfolge der darauffolgenden Zyklen lautete BbDAFiiiCid
(Single Couple, Cap./5eq.). Mit einem abschließenden final wash (Modulfolge: Dc)
wurde die vorläufige automatisierte SPPS beendet. Folgende Aminosäurebausteine
wurden verwendet: Fmoc-Glu(O t Bu)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH und
Fmoc-Lys(Boc)-OH.
Zur Überprüfung der Synthese wurden Testabspaltungen durchgeführt. Hierzu
wurden kleine Mengen des Peptids entnommen und nach AAV 19 vorgegangen.
Fmoc-Glu-Glu-Leu-Leu-Lys-His-Asp-OH (122→)
MALDI-TOF-MS: 1105,3 [M+H] +
Berechnet: C53H73N10O16 + (exacte 1105,5201 m/z, avarage 1106,2036 m/z)
Die weitere Verlängerung der Peptidkette erfolgte manuell. Die Abspaltung der
N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe erfolgte nach AAV 10, wobei deren Erfolg stets
mittels UV-Quantifizierung überprüft wurde. Die Anknüpfung der Aminosäure-
bausteine wurde wie in AAV 3 beschrieben durchgeführt. Zur Aktivierung wurde
PyBOP/ HOBt verwendet. Die letzten beiden Aminosäuren (Arg und Pro) wurden mit
PyAOP/ HOAt aktiviert. Nach dem Aufbau der Peptidkette wurde nach AAV 9 das
Fluoreszenzlabel eingeführt und schließlich wurde das Peptid durch Behandlung mit
Reagenz K (nach AAV 20) vom Harz gespalten und aufgereinigt.
SRBS-pY230
SRBS-Pro-Arg-Thr-Ala-Ala-Ser-Ile-Tyr[PO(OH)2]-Glu-Glu-Leu-Leu-Lys-His-Asp-OH
Präparative RP-HPLC (Eurosphere Säule): 35-60% B in 20 min, 9,8 ml/min) tR = 10,9 min
ESI-MS: 2364,4 m/z [M+H] 1+
Ausbeute: 14% (6,4 mg)
Berechnet: C104H152N23O34PS2 + (exacte 2363,0124 m/z, avarage 2364,5645 m/z)
155

8 Experimenteller Teil
8.4 Modell in Lösung zur Aufklärung der Nebenreaktion im
PED
8.4.1 Synthese von 5-Isopropyl-3-phenyl-2-thiohydantoin (PTH-Val)
81
Zu einer Lösung aus 100 mg D-Valin (1 eq., 0,85 mmol) in 14 ml Pyridin/Wasser (4:3)
wurde 1 ml (10 eq., 8,54 mmol) Phenylisothiocyanat addiert und auf 55°C erhitzt.
Nach 18 h wurde dreimal mit n-Hexan/DCM (9:1) gewaschen, um überschüssige
Reagenzien und Nebenprodukte zu entfernen. Die wässrige Phase wurde am
Vakuum getrocknet.
Aus dem Rohprodukt (80) wurden folgende analytische Daten erhalten.
1 H-NMR (250 MHz, CDCl3): δ = 9,05 (br, 1H), 8,07 (d, J = 8,0 Hz, 1H; NH(Val)), 7,30-6,91
(m, 5H, ar.), 3,39-3,28 (m, 1H; CH(β)), 2,82-2,73 (m, 1H; CH(α)), 1,15-1,09 (m, 6H; CH3(γ/γ’))
ppm.
13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 180,13 (CS), 175,92 (CO), 138,72, 128,63, 124,80, 124,42
(ar.), 64,27 (CH(α)), 31,36 (CH(β)), 18,90, 17,88 (CH3(γ/γ’) ppm.
Der Rückstand wurde in TFA aufgenommen und 1 h bei Raumtemperatur gerührt.
Anschließend wurde die Säure im Stickstoffgegenstrom verdampft und der
Rückstand am Vakuum getrocknet. PTH-Val (81)wurde als farbloser Feststoff in
quantitativer Ausbeute erhalten.
analytische RP-HPLC (Eurosphere-Säule): (45-100% B in 20 min TFA) tR = 9,0 min,
ESI-QTOF (pos. Modus): 235,0894 m/z (±2,5 ppm), berechnet: C12H15N2OS + (235,0900 m/z).
ESI-QTOF (neg. Modus): 233.0766 m/z (±5.1 ppm), berechnet: C12H13N2OS - (233,0754 m/z).
1 H-NMR (250 MHz, CDCl3): δ = 7,90 (s, 1H, NH), 7,27-7,54 (m, 5H, ar.), 4,18 [dd, J = 3,82,
1.25 Hz, 1H, CH(α)], 2,32-2,44 [m, 1H, CH(β)],1,05 und 1,14 [d+d, 3+3H, J = 6,90 Hz,
CH3(γ/γ’)] ppm.
13 C-NMR (62,5 MHz, CDCl3): δ =184,3 (CS), 172,8 (CO), 128,2, 129,1, 129,2 und 132,6 (ar.),
64,9 [CH(α’)], 31,1[CH(β)], 18,7 and 16,2 [CH3(γ/γ’)] ppm.
156

8 Experimenteller Teil
GC-MS m/z (%) = 234 (100) [M + ], 206 (16.8), 192 (40.2) [M + -CS], 135 (59,8), 77 (29,9)
[C6H5 + ].
IR (KBr pellet, cm -1 ): ν ∼ =3205,5 (br), 2959,8 (w), 2875,1 (w), 1759,8 (s), 1499,5 (s), 1409,7
(m), 1351,4 (w), 1329,7 (w), 1272,6 (m), 1195,2 (m), 1147,4 (w), 1073,4 (w), 1028,3 (w),
973,6 (w).
8.4.2 Synthese von 5-Isopropyl-3-phenyl-2-hydantoin 82
66 mg PTH-Val wurden in 5,7 ml einer BrCN-Lösung (40 mg/ml, in 70% TFA aq.)
aufgenommen und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung
wurde getrocknet. Der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert.
Das Rohprodukt wurde mittels präparativer RP-HPLC (45-60 % B in 20 min, tR = 7,6-
7,8 min) aufgereinigt. Nach chromatographischer Reinigung wurden 43 mg
(0,197 mmol, 70%) erhalten.
Analytische RP-HPLC (Eurosphere-Säule): (45-100% B in 20 min) tR = 6,2 min,
ESI-QTOF (pos. Modus): 219,1128 m/z (± 5,0 ppm), berechnet: C12H15N2O2 + (219,1128 m/z)
1 H-NMR (250 MHz, CDCl3): δ = 7,34-7,50 (m, 5H, ar.), 6,74 (s, 1H, NH), 4,07 [dd, J = 1,18,
3,65 Hz, 1H, CH(α)], 2,26-2,38 [m, 1H, CH(β)], 1,00 und 1,08 [d+d, 3+3H, J = 6.98 Hz,
CH3(γ/γ’)] ppm.
13 C-NMR (62,5 MHz, CDCl3): δ = 172,3 (CO), 157,2 (CO-urea), 126,1, 1282, 129,0 und
131,4 (ar.), 62,1 [CH(α’)], 30,6[CH(β)],18,6, 16,0 [CH3(γ/γ’)] ppm.
GC-MS m/z (%) = 218 (55,6) [M + ], 176 (100) [PhNCO i Pr + ], 119 (90,7) [PhNCO + ], 91 (17,6)
[PhN + ], 77 (10,2) [Ph + ], 56 (4,6) [ i Pr + ].
IR (ATR, cm -1 ): ν ∼ = 3261,6 (br), 2961,8 (w), 2872,7 (w), 1784,2 (w), 1706,6 (vs), 1598,3 (w),
1500,8 (m), 1466,1 (w), 1456,0 (w), 1419,7 (s), 1390,9 (w), 1303,9 (w), 1348,8 (m), 1303,9
(w), 1264,1 (w), 1235,9 (w), 1172,2 (m), 1134,1 (w), 1092,8 (w), 1069,5 (w), 1034,8 (w),
987,8 (w), 925,3 (w).
157

8 Experimenteller Teil
8.5 On-bead-Screening
Verwendete Reagenzien
AP-Streptavidin-Konjugat Sigma S 2890
BCIP/NBT-Färbetabletten Sigma B 5655
Biotin-N-Hydroxysuccinimidoester ICN 150048
Tween 20 Fluka 93773
Gelatine K-classic (Kaufland)/ Haushaltsgelatine
Geräte
Stereolupe Olympus SZ 4045 TR
Kamera Olympus Camedia C-7070 wide zoom
8.5.1 Zusammensetzung der Puffer und Lösungen für das
Screening:
TBS-Puffer (Tris-gepufferte Salzlösung)
Zur Herstellung des TBS-Puffers wurden 3,94 g Tris·HCl (100 mM), 1,46 g NaCl
(100 mM) und 254,1 mg MgCl2·6 H2O (5 mM) in 150 ml Wasser gelöst, durch Zugabe
von 1 N NaOH (20 ml) auf pH 9,0 eingestellt und anschließend im einem
Messzylinder auf 250 ml mit Wasser aufgefüllt.
PBS-Puffer (Phosphat-gepufferte Salzlösung)
Zur Herstellung des PBS-Puffers wurden 2,865 g Na2HPO4·12 H2O (8 mM), 234,6
mg NaH2PO4·2 H2O (1,5 mM) und 8,164 g NaCl (139,7 mM) in ca. 900 ml Wasser
gelöst. Durch Zugabe von NaOH wurde der pH-Wert auf 7,4 eingestellt und
anschließend im 1 l Messkolben mit Wasser bis zur Markierung aufgefüllt.
158

Gelatine Blocking-Puffer
8 Experimenteller Teil
10 mg Gelatine wurden in einem Messzylinder eingewogen und in 8 ml Wasser auf
einem Wasserbad 10 min gerührt. Anschließend wurde mit Wasser auf 10 ml
aufgefüllt. Die Lösung wurde für jedes Screening frisch hergestellt.
Färbelösung
Zum Anfärben der Harzkugeln wurde eine BCIP/NBT-Färbetablette in 10 ml Wasser
aufgelöst und die entstandene Lösung direkt eingesetzt.
Streptavidin-Alkalische Phosphatase Konjugat
Das gekaufte Streptavidin-Alkalische Phosphatase Konjugat Lyophilisat (1mg) wurde
in 1 ml Wasser gelöst, in 20 aliquoten Teilen auf Caps verteilt und lyophilisiert. Die
gewünschte Verdünnung (1:10000 bzw. 1:1000 bezogen auf 1 mg/ml) wurde
unmittelbar vor den Versuchen durch Verdünnung mit 0,1% Tween, 0,1% Gelatine in
PBS-Puffer hergestellt und nicht verwendete Lösungen wurden verworfen.
Guanidinium-Lösung
57,32 g Guanidinium*HCl (6 M) wurden in 80 ml Wasser gelöst und mit 1N HCl auf
pH 1,0 eingestellt. Anschließend wurde mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt.
8.5.2 Biotinyliertes TentaGel S-NH2
200 mg TentaGel (130 µm, 0.32 mmol/g, 64 µmol) wurden in einer 5 ml-Spritze mit
PE-Fritte eingewogen und mit 3 ml DMF 10 min quellen lassen. 4 eq. Biotin-N-
Hydroxysuccinimidoester (Biotin-NHS) (87,4 mg, 256 µmol) und 8 eq. DIPEA (87,6
µl, 512 µmol) wurden in 2 ml DMF gelöst, zum Harz aufgezogen und 4 h gekuppelt.
Die Vollständigkeit der Reaktion wurde mit Kaiser- und TNBS-Test (siehe AAV 4)
überprüft. Nach dem Waschen mit DMF (5x1 min) erfolgte ein Capping mit
Essigsäureanhydrid (10% in DMF). Nach erneutem Waschen mit DMF (10x1 min)
und DCM (5x1 min) wurde das Harz im Ölpumpenvakuum getrocknet.
159

8 Experimenteller Teil
8.5.3 Enzymgekoppelter Farbreaktionstest
Kontrollversuche
Jeweils 10 mg (ca. 7800 Kugeln) TentaGel S-NH2 (neg. Kontrolle), sowie an
TentaGel gebundene Peptide [as231 pos und as232 neg] und Biotin (pos. Kontrolle)
wurden in jeweils einer 5 ml-Spritze mit PE-Fritte eingewogen. Falls nicht anders
beschrieben, wurde das Harz 2x5 min und 4x1 min mit PBS und anschließend 5x1
min mit Wasser gewaschen. Zum Blocken von unspezifischen Bindungen wurden die
Harzkugeln über Nacht mit 0,1% Gelatine (w/v) in Wasser behandelt. Das Harz
wurde anschließend 1x15 min und 4x1 min mit 0,1% Tween in PBS und 4x1min mit
0,1% Tween, 0,1% Gelatine in PBS gewaschen. Nun folgte eine 3.5 h Inkubation mit
der Streptavidin-Alkalische Phosphatase Konjugat Lösung. Das nicht gebundene
überschüssige SA-AP Konjugat wurde mit 0,1% Tween in PBS (15x1 min) weg-
gewaschen. Anschließend wurde das Harz mit TBS umgepuffert (15x1 min).
Daraufhin wurden die Harzkugeln mit Färbelösung versetzt. Nach 30 min wurde die
enzymatische Reaktion durch Zugabe von 0,1 N HCl gestoppt. Schließlich wurden
die Harzkugeln 5x1 min mit Wasser gewaschen, in Petrischalen überführt und unter
dem Mikroskop betrachtet.
Screening der Bibliothek 86
In einer 5 ml-Spritze mit PE-Fritte wurden 195 mg (ca. 12.700 Harzkugeln) der
festphasengebundenen Bibliothek eingewogen. Nach Entfernen der säurelabilen
Schutzgruppen wurde das Harz ausführlich mit Wasser und PBS gewaschen und
schließlich wie im voran stehenden Abschnitt (Kontrollversuche) beschrieben
behandelt. Die Identifizierung der Hitsequenzen wird im nachfolgenden Abschnitt
beschrieben.
160

8.5.4 Partielle Edman-Sequenzierung
8 Experimenteller Teil
Die positiv getesteten violetten Harzkugeln (Hitbeads) wurden mit einer Glaskapillare
separiert und in einer 2 ml–Spritze mit PE-Fritte vereinigt (der PED erfolgte für alle
Hitbeads gemeinsam). Zum Abstreifen des Streptavidin-Alkalische Phosphatase-
Konjugats wurden die Kugeln 1x5 min und 4x1 min mit 6 M Guanidin-HCl Lösung
(pH 1,0) behandelt. Anschließend wurde je 5x1 min mit Wasser und Acetonitril
gewaschen und am Ölpumpen-Vakuum getrocknet. Zum Waschen und pH-Wert-
Einstellen wurden die Kugeln der Reihe nach mit DCM (3x1 min), Acetonitril (3x1
min), Wasser (3x1 min), Pyridin (3x1 min) und 0,1% Triethylamin in Pyridin/Wasser
(2:1) behandelt. 480 µl FmocOSu-Lösung (5,4 mg in 480 µl Pyridin / 0,03 M) und
54 µl Phenylisothiocyanat (0,45 mmol) wurden unmittelbar vor Gebrauch gemischt,
zum vorbehandelten Harz aufgezogen und 8 min reagieren lassen. Daraufhin wurde
je 3x1 min mit Pyridin, Acetonitril und DCM gewaschen. Nach saurer Spaltung mit
TFA (1x1 min und 2x6 min) erfolgte ein erneuter Durchgang des PED. Die PED-
Zyklen wurden (n+1) mal wiederholt, wobei n die Anzahl der zu sequenzierenden
Aminosäuren darstellt. Beim letzten PED-Durchlauf wurde nach der sauren Spaltung
mit TFA je 3x1 min mit DCM, Pyridin und DCM gewaschen. Mit 20% Piperidin in DMF
(1x1 min, 3x5 min) wurde das Fmoc-Capping aufgehoben und 10x1 min mit DMF
und 5x1 min mit DCM gewaschen. Für die MALDI-TOF Analyse wurden die Kugeln
nun in Eppendorf-Caps (500 µl / transparent) überführt, wobei in jeden Cap immer
nur eine Kugel sein durfte (unter der Stereolupe überprüfen). Nach einem kurzen
spindown in der Zentrifuge wurden je 10 µl Bromcyan-Lösung (40 mg BrCN in 1 ml
70% TFA aq.) hinzugefügt und über Nacht einwirken lassen. Nach Trocknen am
Vakuum wurde das vom Harz abgespaltene Peptid in 5 µl Solvent A (0.1% TFA in
Wasser/Acetonitril (1:2)) aufgenommen. 0,5 µl der Peptidlösung und 0,5 µl
Matrixlösung (gesättigte 4-Hydroxy-α-cyanozimtsäure in Solvent A/MeOH (5:2)
wurden auf dem MALDI target gemischt.
161

8 Experimenteller Teil
8.6 SPR-Experimente zur Bestimmung der KD-Werte
8.6.1 Zusammensetzung der Puffer und Lösungen für die SPR-
Experimente
Acetat-Puffer (pH 4,5)
Zunächst wurden zwei 0,2 M Stammlösungen hergestellt. Für die saure Stamm-
lösung wurden 1,14 ml Eisessig in 100 ml Wasser gemischt. Für die basische
Stammlösung wurden 1,64 mg Natriumacetat in 100 ml Wasser gelöst. Zur
Herstellung des Puffers wurden 50 ml der basischen Stammlösung vorgelegt und
durch Zugabe der sauren Stammlösung auf pH 4,6 eingestellt. Anschließend wurden
50 ml dieser Pufferlösung entnommen und mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt.
HBS-N Puffer (pH 7,2)
Zur Herstellung von 2 l HBS-N Puffer wurden 4,766 g (10 mM) Hepes und 17,532 g
NaCl (150 mM) in ca. 1,6 l Wasser gelöst, durch Zugabe von 1 N NaOH (ca. 10 ml)
auf pH 7,2 eingestellt und anschließend auf 2 l mit Wasser aufgefüllt.
Aktivierungslösung
Unmittelbar vor Gebrauch wurden folgende drei Lösungen als Aktivierungs-„Kit“
hergestellt.
1) 76,6 mg EDC wurden in 1 ml Wasser gelöst (0,4 M)
2) 11,5 mg NHS wurden in 1 ml Wasser gelöst (0,1 M)
3) 60 µl Ethanolamin wurden mit 940 µl Wasser gemischt und durch vorsichtige
Zugabe von konz. HCl auf pH 8,5 eingestellt.
Streptavidin (50 µg/ml)
0,1 mg Streptavidin wurden in 2 ml NaOAc-Puffer gelöst.
Verdünnungsreihe der Peptide
Die zu untersuchenden Peptide (92-97) wurden in Eppendorf-Caps eingewogen und
in HBS-N Puffer gelöst. Anschließend wurden in Mikrotitterplatten 1:1
Verdünnungsreihen hergestellt.
162

8.6.2 Durchführung der SPR-Experimente
8 Experimenteller Teil
Die SPR-Messungen erfolgten an einem Biacore T100 Gerät (Biacore, Uppsala,
Schweden) unter Verwendung eines CM5-Sensorchips (ebenfalls von Biacore). Alle
Messungen erfolgten bei 25°C. Die Streptavidin-Immobilisierung erfolgte mittels
EDC/NHS-Aktivierung unter Verwendung der oben beschriebenen Lösungen analog
der im Handbuch [126] beschriebenen Vorgehensweise. Die Flussrate betrug
10 µl/min. Zur Immobilisierung des Liganden wurde eine Injektionszeit von 900
Sekunden gewählt. Zusätzlich zur Messzelle wurde eine Referenzzelle hergestellt.
Diese wurde analog der Bindungsmesszelle beladen, jedoch ohne Injektion des
Liganden. Nach erfolgreicher Streptavidin-Immobilisierung wurden mit einer
Flussrate von 40 µl/min und einer Injektionszeit von 90 Sekunden die
Verdünnungsreihen (0,3-700 µM bzw. 0,01-10 mM) der einzelnen Peptide
vermessen. Nach jeder Peptidinjektion erfolgte eine Regeneration der Oberfläche
durch Behandlung mit HBS-N Puffer für 300 Sekunden bei einer Flussrate von 40
µl/min. Zur Auswertung wurde das zum Gerät gehörende Programm Biacore T100
Evaluation Software (Version 1.1) verwendet. Bei allen herangezogenen Daten
handelt es sich um Differenzmesswerte (Signal der Referenzzelle subtrahiert vom
Signal der Bindungsmesszelle). Die erhaltenen Sensorgramme wurden durch
Anwendung der steady-state-affinity ausgewertet.
163

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169

9 Literaturverzeichnis
170

10 Anhang
10.1 HPLC-offline-MS-Charakterisierung
10.1.1 Modellpeptid 77
1250
1000
750
500
250
0
-250
mAU
214nm,4nm (1.00)
H 2N
O
HN
H
N
O
N
H
O
N
O
N
H
O
H
N
O
N
H
O
O
H
N
Chemical Formula: C 68H99N16O17S +
Exact Mass: 1443,7089
Molecular Weight: 1444,6751
O
N
O
O
N
O
H
N
O
N
H
HN
NH2
O
S NH
O
O
O
13.404
15.014
%
B.Conc.(Method)
0
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 min
16.948
10 Anhang
90
80
70
60
50
40
30
20
10
171

10 Anhang
10.1.2 Peptid 63 (Trp-Xaa Sollbruchstelle)
Cyclo[Trp-Gly-His-Pro-Gln-Glu(bAla-bAla-Phe(4Br)-Arg-Hsl)] (63→ 64)
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (45-100% B in 20 min, 1 ml/min) tR = 11,1 min
ESI-MS: 1397,9 m/z [M+H] +
Berechnet: C61H83BrN19O16 + (1398,53 m/z)
250
200
150
100
50
0
-50
-100
HPLC-Chromatogramm
mAU
300
214nm,4nm (1.00)
172
0
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 min
ESI-IT-Massenspektrum
10.965 11.133
H 2N
13.672
O
HN
O
O
N
H
N
N
O
H
N
O
N
H
NH O
O
NH
18.054
HN
NH
O
O
H
N
O
H
N
O
H
N
+
Chemical Formula: C61H81BrN19O15 Exact Mass: 1398,5337
Molecular Weight: 1400,3176
O
N
H
H 2N NH 2
O
Br
NH
H
N
%
B.Conc.(Method)
O
O
90
80
70
60
50
40
30
20
10

10.1.3 Peptid 71 (enzymatische Ringöffnung)
cyclo-[Lys-Ala-Tyr-Phe-Ser-Ala-Gly-Glu(bAla-Pro-Pro-bAla-Hsl)] (71→72)
10 Anhang
Analytische RP-HPLC (Eurospher Säule): (10-100% B° in 20 min, 1 ml/min) tR = 12,1 min
MALDI-MS: 1274,5 m/z [M+H] +
Berechnet: C60H85N14O17 + (1273,6212 m/z)
2500
2000
1500
1000
500
0
HPLC-Chromatogramm
mAU
214nm,4nm (1.00)
%
B.Conc.(Method)
-500
0
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 min
MALDI-TOF-Massenspektrum
12.112
HO
O
NH 3
NH
NH
N O
H
O HN
O
O O
O NH
HN
O
O
HN O
O NH
NH
O
H
N
HN
O
O
HO
O
+
Chemical Formula: C60H85N 14O17 Exact Mass: 1273,6212
Molecular Weight: 1274,4000
N
N
90
80
70
60
50
40
30
20
10
173

10 Anhang
10.1.4 Peptid 53 (HMBA- bzw. Glykolamid-Linker)
Ac-Phe-Trp-Arg-Ala-NHPropyl
Analytische RP-HPLC (Nucleosil Säule): (55-100% B° in 30 min, 1 ml/min) tR = 15,2 min
ESI-MS: 662,0 m/z [M+H] +
Berechnet: C34H48N9O5 + (662,3773 m/z)
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
HPLC-Chromatogramm
mAU
2500 220nm,4nm (1.00)
-500
0
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min
174
ESI-Massenspektrum
15.213
O
H
N
O
N
H
O
H
N
NH
H 2 N
O
Chemical Formula: C 34H 48N 9O 5 +
Exact Mass: 662,3773
Molecular Weight: 662,8017
N
H
NH
NH 2
O
H
N
%
B.Conc.(Method)
90
80
70
60
50
40
30
20
10

10.1.5 SPR Peptide 92-97
H-Lys-His-Gly-His-Pro-Gln-Glu-βAla-Pro-Pro-Arg-NH2 (95)
Analytische RP-HPLC: (8-30% B in 45 min) tR= 13,2 min
ESI-QTOF: 1252,6679 m/z (±1,7 ppm)
Berechnet: C54H86N21O14 + (1252,6658 m/z)
1250
1000
750
500
250
mAU
214nm,4nm (1.00)
0
-250
0
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 min
Intens.
x105
1.5
1.0
0.5
0.0
Intens.
x105
1.5
1.0
0.5
0.0
1252.6679
13.156
%
B.Conc.(Method)
10 Anhang
90
80
70
60
50
40
30
20
10
+MS, 1.9min #113
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000m/z
1252.6679
1272.1458
1274.6499
1290.6182
1296.6313
+MS, 1.9min #113
1250 1260 1270 1280 1290 1300 m/z
175

10 Anhang
H-cyclo[Lys-His-Gly-His-Pro-Gln-Glu]-βAla-Pro-Pro-Arg-NH2 (94)
Analytische RP-HPLC: (8-30% B in 45 min) tR = 13.2 min
ESI-QTOF:1234,6557 m/z (±0,4 ppm)
Berechnet: C54H84N21O13 + (1234,6552 m/z)
mAU
214nm,4nm (1.00)
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
Intens.
x104
6
5
4
3
2
1
0
Intens.
x104
6
5
4
3
2
1
0
176
13.239
%
B.Conc.(Method)
0
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 min
1234.6557
90
80
70
60
50
40
30
20
10
+MS, 0.8-0.8min #(47-48)
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000m/z
1234.6557
1256.6359
+MS, 0.8-0.8min #(47-48)
1230 1240 1250 1260 1270 1280 m/z

H-Lys-Gln-Pro-His-His-Gly-Glu-βAla-Pro-Pro-Arg-NH2 (97)
Analytische RP-HPLC: (8-30% B in 45 min) tR = 12,3 min
ESI-QTOF: 1252,6663 m/z (±0,4 ppm)
Berechnet: C54H86N21O14 + (1252,6658 m/z)
mAU
400
214nm,4nm (1.00)
350
300
250
200
150
100
50
0
-50
-100
0
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 min
Intens.
x104
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
Intens.
x104
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
1097.5973
1234.6558
12.286
%
B.Conc.(Method)
10 Anhang
90
80
70
60
50
40
30
20
10
+MS, 1.7min #103
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000m/z
1234.6558
1250.6365
1256.6369
1272.6121
+MS, 1.7min #103
1230 1240 1250 1260 1270 1280 m/z
177

10 Anhang
H-cyclo[Lys-Gln-Pro-His-His-Gly-Glu]-βAla-Pro-Pro-Arg-NH2 (96)
Analytische RP-HPLC: (8-30% B in 45 min) tR =13,5 min
ESI-QTOF: 1234,6558 m/z (±0,5 ppm)
Berechnet: C54H84N21O13 + (1234,6552 m/z)
mAU
400
214nm,4nm (1.00)
350
300
250
200
150
100
50
0
-50
-100
0
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 min
Intens.
x104
4
3
2
1
0
Intens.
x104
4
3
2
1
0
178
996.5123
1252.6663
13.506
%
B.Conc.(Method)
90
80
70
60
50
40
30
20
10
+MS, 1.8min #108
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000m/z
1252.6663
1274.6501
1290.6325
1296.6302
+MS, 1.8min #108
1250 1260 1270 1280 1290 1300 m/z

H-Lys-His-Pro-Gln-His-Gly-Glu-βAla-Pro-Pro-Arg-NH2 (93)
Analytische RP-HPLC: (8-30% B in 45 min) tR = 12,4 min
ESI-QTOF: 1252,6653 m/z (±0,4 ppm)
Berechnet: C54H86N21O14 + (1252,6658 m/z)
mAU
800 214nm,4nm (1.00)
700
600
500
400
300
200
100
0
-100
-200
0
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 min
Intens.
8000
6000
4000
2000
0
Intens.
8000
6000
4000
2000
0
1110.7854
1252.6653
12.365
%
B.Conc.(Method)
10 Anhang
90
80
70
60
50
40
30
20
10
+MS, 1.7-1.9min #(100-112)
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000m/z
1246.7652
1252.6653
1264.6479
1274.6490
1286.6632 1290.6378
1296.6296
+MS, 1.7-1.9min #(100-112)
1250 1260 1270 1280 1290 1300 m/z
1304.7154
179

10 Anhang
H-cyclo[Lys-His-Pro-Gln-His-Gly-Glu]-βAla-Pro-Pro-Arg-NH2 (92)
Analytische RP-HPLC: (8-30% B in 45 min) tR = 13,1 min
ESI-QTOF: 1234,6576 m/z (±1,9 ppm)
Berechnet: C54H84N21O13 + (1234,6552 m/z)
mAU
214nm,4nm (1.00)
800
700
600
500
400
300
200
100
0
-100
-200
0
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 min
Intens.
x105
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
Intens.
x105
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
180
1021.3025
1234.6576
13.123
%
B.Conc.(Method)
90
80
70
60
50
40
30
20
10
+MS, 1.7min #100
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000m/z
1234.6576
1256.6400
1292.6183
1314.5974
+MS, 1.7min #100
1200 1220 1240 1260 1280 1300 1320 m/z

10.2 Massenspektren der fluoreszenzmarkierten
Phosphopeptide
Intens.
1500
1000
500
0
(pY230)
Intens.
x105
3
2
1
0
10 Anhang
SRBA-Pro-Arg-Thr-Ala-Ala-Ser-Ile-Tyr-Glu-Glu-Leu-Leu-Lys-His-Asp-OH (Y230)
478.0
615.1
893.6
1082.6
1248.0
1433.4
1744.0
2036.7
2285.4
2580.4 2733.1 2938.4 3092.9 3242.6 3370.4 3500.1
500 1000 1500 2000 2500 3000 m/z
SRBA-Pro-Arg-Thr-Ala-Ala-Ser-Ile-Tyr[PO(OH)2]-Glu-Glu-Leu-Leu-Lys-His-Asp-OH
303.2
439.4
601.4
789.2
1183.4
2364.4
+MS, 0.1-0.8min #(4-20)
500 1000 1500 2000 2500 m/z
SRBA-Leu-Lys-His-Asp-Thr-Asn-Ile-Tyr-Cys-Arg-Met-Asp-His-Lys-Ala-OH (Y241)
181

10 Anhang
Intens.
x106
6
5
4
3
2
1
0
231.2
(pY241)
Intens.
x104
8
6
4
2
0
182
478.3
671.4
796.2
958.2
1193.9
1591.6
2387.7
+MS, 0.5-0.6min #(11-14)
500 1000 1500 2000 2500 m/z
SRBA-Leu-Lys-His-Asp-Thr-Asn-Ile-Tyr[PO(OH)2]-Cys-Arg-Met-Asp-His-Lys-Ala-OH
231.3
355.4
478.3
1+
559.3
617.3
1+
671.3
822.8
2+
1233.8
1644.7
1+
2467.6
±MS, 0.0-1.1min #(2-23)
500 1000 1500 2000 2500 m/z

10.3 MALDI-TOF-Massenspektren nach PED
10.3.1 Model peptide:
Intens.
6000
4000
2000
0
418.5
449.7
485.1
524.0
Na - 1.1
545.9
563.9
585.9
621.9
EKPed(ox) + 1.9
656.9
722.0
757.8
827.1
800.0
884.1
Na - 1.0
906.1
926.1
F
981.1
1031.2
Na - 1.0
G
1057.2
1088.2
Na - 1.0
P + 0.1
Na - 1.0 Na - 1.0
1185.3
A + 0.1
10 Anhang
121.1
1256.5
G + 0.1
400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 m/z
10.3.2 Hitbeads aus der Bibliothek:
Intens.
1500
1250
1000
750
500
250
727.3
787.3 809.3
832.3
854.3
18.0
883.4
903.4 925.4
Z
951.4 986.4
1008.4
1036.4
18.0
1054.4
A Q - 0.1 P H
1107.4
18.0
1125.4
1154.4
1202.4
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z
1235.4
18.0
1303.4
1332.4
119.0
1469.5
18.0
1489.4
Na + 1.0
1313.5
1598.5
183

10 Anhang
Intens.
1500
1000
500
Intens.
800
600
400
200
184
715.3
736.4
758.4
784.4
807.4
770.4 797.3
829.4
861.0
877.0
G
912.4
940.4
958.4
A
983.5
1011.4
1029.5
1054.5
Q
1119.4
1139.4
1157.5
P
1191.5
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z
861.1
877.1
931.5
F
966.5
988.5
1011.6
1030.5
G
1066.1
1087.5
1105.5
Q
1150.6
1186.5
1215.6
1236.5
1233.6
1274.5
P
1283.6
H
119.0
1308.5
1337.5
1328.6
1355.5
1350.7
1373.5
H
1393.5
119.0
1385.7
1431.7
1402.7
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z
1449.7
1486.5
1531.6
1526.7
1562.7

Intens.
800
600
400
200
Intens.
2000
1500
1000
500
0
721.6
750.5 776.6
807.6
861.3
877.3
A
908.6
935.7
954.6
G
983.7
1011.7
Q
1033.7 1066.3
1110.7
1139.7
P
1207.8
H
119.0
1236.7 1308.8
1355.8
1373.8
1433.0
10 Anhang
1532.0 1559.9
1504.9
1592.1
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z
767.7 840.8
883.8
901.8
A
925.9
954.9
972.9
Z
1031.9
1107.9
Q
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z
1236.0
P
1304.1
1333.1
1375.1
H
119.1
1470.2
1530.2
1599.3
185

10 Anhang
Intens.
2000
1500
1000
500
0
Intens.
600
400
200
186
727.7
739.6
761.7
819.9 842.8
883.8
Q + 0.1
966.0
994.9
1012.0
G
1069.0
Q
1197.0
P
1265.2
1294.1
H + 0.1
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z
808.7830.8 845.5
861.4
877.4
910.9
928.8
E
955.9
997.8
977.8
1012.8
1038.9
F
1066.91092.9
1110.0
1137.0
1159.9
Q
1237.0
1267.0
1288.0
P
119.1
1395.2
1385.1
1413.2
1431.3
1423.1
H + 0.1
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z
119.1
1491.3
1500.2
1522.2
1559.4

Intens.
x104
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Intens.
1500
1000
500
0
743.6
734.9
774.9
791.0
861.4
831.1
18.0
883.7
925.8
E
959.8
994.8
18.0
1012.8
G
1030.8
18.0
1069.8
1102.7
Q
1197.9
18.0
P
1295.0
1336.6
H + 0.1
119.1
1396.0
1414.1
18.0
1432.1
10 Anhang
1561.2
1590.2
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z
817.0
861.4
877.4
G
911.8
925.8
940.8
958.8 982.8
H
1077.9
1095.9
Q
1137.9
1176.9
1205.9
P
1274.0
1303.0
H + 0.1
119.1
1393.1
1375.1
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z
1440.1
1500.2
1569.3
187

10 Anhang
Intens.
700
600
500
400
300
200
100
Intens.
1500
1000
500
188
723.6
724.7
750.6
750.8
769.5 797.5
767.7
818.3
839.3
861.3
877.3
897.7
A
920.7
940.7
954.7
972.7
F
1025.8
1066.3
1101.8
1119.8
Q
1178.8
1200.9
1229.8
P
1267.9
1297.9
1326.9
H
119.1
1399.0 1417.0
22.0
18.0
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z
794.8
821.8
847.9
883.8
901.8
A
925.9
954.9
972.9
A
996.9
1025.9
1043.9
1073.0
Q
1125.0
1154.0
1192.0
P H
1222.1
1249.1
1267.1
1293.1
119.1
1368.1
1386.2
1442.0
1462.0
1465.2
1483.2
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z
1541.0
1546.3
1572.3
1595.0

Intens.
1000
800
600
400
200
Intens.
3000
2000
1000
0
720.9
731.6
748.9
762.9
791.0
776.7 802.7
817.0
839.4
861.4
877.4
G
909.9
940.9
966.9
F
1011.9
1038.0
1088.0
1120.9
Q
1216.0
P + 0.1
1254.1
1284.1
1329.2
H
119.2
1410.2
1448.3
10 Anhang
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z
883.8
P H Q P + 0.1 H
951.9
980.9
18.0
998.9
1099.9
1117.9
18.0
1165.0
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z
1246.0
18.0
1314.1
16.1
1343.1
119.1
18.0
1415.2
18.0
18.1
1462.2
1480.2
1527.4
1546.5
1540.2
1581.3
189

10 Anhang
Intens.
600
500
400
300
200
100
0
Intens.
1200
1000
800
600
400
200
0
190
736.3
788.4
788.4
758.3
883.4
G
921.5
940.4
G
958.4
997.4
1030.5
Q
1048.5
1125.5
P
1193.5
1222.5
1264.5
H
1283.6
119.0
1341.5
1359.5
1488.6 1517.6
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z
825.0
860.9
883.4
G
911.3
940.4
958.4
972.4
998.4
Z
1017.4
1043.4
1093.4
1111.4
Q
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z
1221.4
P
1259.4
1289.4
1318.5
1356.5
H
119.1
1415.5
1433.5
1453.5
1532.5
1569.6

Intens.
1000
800
600
400
200
0
Intens.
800
600
400
200
721.2 769.1
721.4
760.5
788.4
807.2
824.9
838.8
860.8
883.2
Q Z - 0.1 Q - 0.1 P H
960.2
1011.2
1065.8
1114.3
1164.2
1227.2
1292.2
1360.3
1389.2
1427.3
119.0
10 Anhang
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z
823.5
861.0
885.4
G
901.3
917.2
940.4
958.4
H
1027.4
1077.5
1095.4
1119.4
Q - 0.1
1205.5
1225.5
P H
1273.5
1302.5
1344.5
119.1
1399.5
1439.6
1498.6
1526.3
1567.7 1599.5
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z
191

10 Anhang
Intens.
800
600
400
200
0
Intens.
1200
1000
800
600
400
200
0
192
732.8
747.3
748.5
720.5 734.5
763.3
788.4
774.6790.6
823.5
861.0 883.4
901.3
916.3
934.3
E Z Q P H
961.4
987.4
1012.4
1044.4
1072.4
1089.4
1115.4
1141.4
1165.4
1212.5
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z
832.3
861.0
18.0
883.3
901.3
972.3
1036.3
1054.3
1093.3
1111.3
1170.3
1188.4
1221.4
1259.4
1293.4
1289.4
1323.5
Z G Q P H
18.0
1316.4
1334.4
119.1
1406.5
1415.5
1432.5
1433.5
18.0
22.0
1453.5
119.0
1527.5
1532.6 1569.6
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z
1604.6

Intens.
6000
4000
2000
0
Intens.
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
731.4
723.4
750.5
776.5 802.5 847.5
820.5
18.0
883.5
P A Q P H
930.5
980.6
18.0
1022.6
1051.6
17.0
1099.6
1162.7
1179.7
18.0
17.0
1247.7
1276.7
119.0
18.0
18.0
1395.8
1413.8
10 Anhang
1490.9 1526.9
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z
776.5 852.5
883.6
A F Q P H
923.6
954.6
1008.7
1025.7
1051.7
1101.7
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z
1229.7
1297.8
1326.8
119.1
1398.9
1427.9
1445.9
1523.0
1572.0
193

10 Anhang
Intens.
1200
1000
800
600
400
200
0
Intens.
1200
1000
800
600
400
200
0
194
731.5
883.4
P H Q P H
980.5
1117.5
18.0 18.0 18.0
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z
882.6
916.6 961.7
980.7
998.7
1037.7
1165.7
1245.6
18.0
1262.8
1304.8
1342.7
P G Q P H + 0.1
119.1
1363.9
1381.9
1399.9
119.1
1429.0
18.0
1443.7
18.0
1461.7
1479.8
1477.0
1514.0
1585.1
1559.0
1602.1
800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 m/z

10.4 PTH-Val
10.4.1 1 H-NMR-Spektren (250 MHz, CDCl3)
Verbindung 81
Verbindung 82
10 Anhang
195

10 Anhang
10.4.2 IR-Spektren
ATR-FTIR:
O
N
Ph
H
N
O
FTIR (KBr-Pressling):
Identisch zu: SDBS Hit-No. 4318
10.4.3 GC-Massenspektren
196

10 Anhang
197

10 Anhang
10.5 NMR-Daten ermittelt aus ROESY-, COESY-, HSQC- und TOCSY-Spektren
Tabelle 1
Xaa
Pll
198
1 H- und 13 C-NMR chemische Verschiebungen [ppm] des cyclischen Peptides 10, sowie des Peptids nach Photolyse.
Peptid 10
tR = 9,7 min
Peptid 10
tR = 10.1 min
Nach Photolyse
Position δ(H) δ(C) δ(H) δ(C) Position δ(H) δ(C)
NH2 8,545 x 8,53 x NH2 x
C α H
C β H
5,51 47,912 5,478 48,748 C α H
1,528 22,71 1,537 23,191 C β H
arom oNO2 7,683 112,335 7,649 112,779 arom oNO2 7,733 109,676
arom mNO2 7,156 112,322 7,124 112,474 arom mNO2 7,235 109,45
arom OMe 4,003 59,093 3,984 59,502 arom OMe 3,992 56,212
kx 4,176 4,153 71,415 kx 4,172 68,436
4,057 _
ky 2,378 34,746 2,037 27,195 ky 2,1 24,146

Peptid 10
tR = 9,7 min
Peptid 10
tR = 10.1 min
Nach Photolyse
Xaa Position δ(H) δ(C) δ(H) δ(C) Position δ(H) δ(C)
Pll
Gly 1
Ala 2
Pro 3
kz 2,08 2,387 34,958 kz 2,465 31,771
NH
H α 2
H α 3
NH
H α
H β
H α
H β
H δ 2
H δ 3
7,767 x 7,959 x NH 8,196 x
3,82 44,936 3,734 H α 2 3,873 42,329
3,517 x 3,654 H α 3 _
7,951 x 7,921 x NH 8,12 x
4,536 50,292 4,512 50,988 H α
1,247 17,936 1,218 18,41 H β
4,302 63,681 4,338 H α
2,122 2,23 H β
4,616 47,583
1,33 15,462
4,385 60,781
2,266 29,067
1,8 1,878 x
3,721 50,34 3,769 50,83 H δ 2 3,807 47,532
3,528 3,594 _ H δ 3 3,657 _
10 Anhang
199

10 Anhang
Peptid 10
tR = 9,7 min
Peptid 10
tR = 10.1 min
Nach Photolyse
Xaa Position δ(H) δ(C) δ(H) δ(C) Position δ(H) δ(C)
Pro 3
Gly 4
Phe 5
Gln 6
200
H γ
NH
H α 2
H α 3
NH
H α
H β
H δ
H ε
H ζ
NH
H α
1,893 27,41 1,994 27,957 H γ
2,035 24,609
8,464 x 8,449 x NH 8,429 x
4,026 3,932 H α 2 3,916 42,297
3,722 3,733 H α 3 3,853 _
8,056 x 8,052 NH 8,01 x
4,434 58,623 4,443 58,89 H α
3,109 38,639 3,114 H β
7,162 131,918 H δ
7,072 129,844 H ε
7,328 131,349 H ζ
4,558 55,159
3,085 36,825
7,215 129,064
7,31 128,613
7,266 127,045
8,11 x 8,035 x NH 8,205 x
4,079 56,019 4,167 56,339 H α
4,26 52,838

Peptid 10
tR = 9,7 min
Peptid 10
tR = 10.1 min
Nach Photolyse
Xaa Position δ(H) δ(C) δ(H) δ(C) Position δ(H) δ(C)
Gln 6
Lys 7
H β 2
H β 3
H γ 2
H γ 3
NH
H α
H β 2
H β 3
H δ
H ε
H γ
H ζ
1,893 29,561 1,93 H β 2 1,994 26,783
1,754 x 1,669 _ H β 3 1,868 _
2,217 2,205 34,497 H γ 2 2,422
1,979 2,144 _ H γ 3 2,338 _
7,984 x 8,116 x NH 8,147 x
4,178 56,168 4,19 56,709 H α
4,166 53,571
1,83 33,038 1,819 33,455 H β 2 1,795 30,561
1,741 x 1,754 _ H β 3 1,701 _
1,679 29,093 1,689 29,518 H δ
2,993 42,171 3,002 42,566 H ε
1,419 24,853 1,433 25,278 H γ
7,523 x 7,521 x H ζ
1,487 28,311
3,054 39,606
1,345
x
10 Anhang
201

10 Anhang
202
Peptid 10
tR = 9,7 min
Peptid 10
tR = 10.1 min
Nach Photolyse
Xaa Position δ(H) δ(C) δ(H) δ(C) Position δ(H) δ(C)
C-Terminus
Boc 1,383 27,555
NH2 7,102 x 7,116 x NH2 7,569 x
7,452 x 7,602 x 7,042 x

10.6 SPR-Experimente
Steady state affinity
Response
RU
600
500
400
300
200
100
0
H-cyclo[KHPQHGE]βAPPR-NH2 (92)
10 Anhang
0 1e-4 2e-4 3e-4 4e-4 5e-4 6e-4 7e-4 8e-4
KD = 0.323 ± 0.024 mM
Response
RU
1200
1000
800
600
400
200
0
H-KHPQHGEβAPPR-NH2 (93)
Concentration M
0 1e-3 2e-3 3e-3 4e-3 5e-3
KD = 2.76 ± 0.46 mM
Concentration M
203

10 Anhang
Response
RU
300
250
200
150
100
50
0
-50
H-cyclo[KHGHPQE]βAPPR-NH2 (94)
0 1e-3 2e-3 3e-3 4e-3 5e-3 6e-3 7e-3 8e-3 9e-3
KD = 8,6 ± 2,7 mM
Response
RU
1200
1000
800
600
400
200
0
H-KHGHPQEβAPPR-NH2 (95)
Concentration M
0 2e-3 4e-3 6e-3 8e-3 0,01
KD = 1.80 ± 0.24 mM
204
Concentration M