Die Untersuchung des immunoliposomalen Targetings von ...

Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung............................................................................................................................ 7
2. Theoretischer Teil .............................................................................................................. 9
2.1. Das Endothel.................................................................................................................. 9
2.1.1. Physiologische Barriere, Transportmöglichkeiten ................................................. 9
2.1.2. Besonderheiten im Entzündungsprozess .............................................................. 12
2.2. Selektine als Targetstruktur ......................................................................................... 13
2.2.1. Adhäsionskaskade der Leukozyten ...................................................................... 13
2.2.2. Expression der Selektine ...................................................................................... 16
2.3. Liposomales Targeting ................................................................................................ 19
2.3.1. Liposomen als Arzneistoffträger .......................................................................... 19
2.3.2. Immunoliposomen / Stealth ® -Modifikation / pH-Sensitivität.............................. 22
2.3.3. Zelluläre Aufnahmemechanismen für Liposomen ............................................... 26
2.4. Ziele dieser Arbeit ....................................................................................................... 29
3. Materialien und Methoden ............................................................................................. 30
3.1. Verwendete Substanzen............................................................................................... 30
3.1.1. Chemikalien und Lipide ....................................................................................... 30
3.1.2. Präparative Darstellung der Lipidanker................................................................ 31
3.1.2.1. N-Glut-PE (N-Glutaryl-DPPE) ..................................................................... 31
3.1.2.2. Cyanur-PEG-PE (Cyanur-PEG-DPPE) ......................................................... 31
3.1.3. Präparative Isolierung bakterieller Plasmid-DNA................................................ 32
3.2. Liposomen ................................................................................................................... 34
3.2.1. Liposomenpräparationen ...................................................................................... 34
3.2.1.1. Hydratationsmethode..................................................................................... 34
3.2.1.2. Phasenumkehrmethode.................................................................................. 34
3.2.1.3. Detergenzmethode......................................................................................... 35
3.2.2. Kopplung von Antikörpern an Liposomen........................................................... 35
3.2.2.1. N-Glut-PE als Lipidanker.............................................................................. 36
3.2.2.2. Cyanur-PEG-PE als Lipidanker .................................................................... 36
3.2.3. Charakterisierung.................................................................................................. 36
3.2.3.1. Partikelgrößenbestimmung............................................................................ 36
3.2.3.2. Proteinquantifizierung ................................................................................... 37
3.2.3.3. Phosphatquantifizierung................................................................................ 38
3.2.3.4. Bestimmung der Einschlussrate .................................................................... 38
3.2.4. Fluoreszenzmarkierung ........................................................................................ 39
3.2.4.1. Symmetrische Verteilung .............................................................................. 39
3.2.4.2. Asymmetrische Verteilung............................................................................ 39
3.3. Zellkultivierung ........................................................................................................... 40
3.3.1. Gewinnung humaner Nabelschnurendothelzellen................................................ 40
3.3.2. SRB-Assay zur Bestimmung der Wachstumsraten .............................................. 41
3.4. Bindungsuntersuchungen............................................................................................. 42
3.5. Internalisierungsuntersuchungen ................................................................................. 43
3.5.1. Dithionit-Technik ................................................................................................. 43
3.5.2. Aufklärung der Internalisierungsmechanismen.................................................... 44
3.5.2.1. Passive Aufnahmemechanismen ................................................................... 44
3.5.2.2. Aktive Aufnahmemechanismen .................................................................... 45