Die Untersuchung des immunoliposomalen Targetings von ...

5. Zusammenfassung
Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der Targetierung endothelialer Selektine
mit Liposomen. Durch das zeitlich limitierte Vorkommen innerhalb begrenzter Gefäßabschnitte
stellt das vaskuläre E-Selektin in der Entzündungsphase ein hervorragendes Target
dar. Im ersten Abschnitt dieser Arbeit sollten die Bindungsereignisse der selektingerichteten
Immunoliposomen an HUVEC untersucht werden. HUVEC dienten dabei als Vertreter
humaner Gefäßendothelzellen. Die Bindungsprozesse wurden in vielerlei Hinsicht auf ihre
Abhängigkeit gegenüber verschiedenen Parametern untersucht. So wurden aktivierte
(stimulierte) HUVEC nicht aktivierten Zellen in Bindungsversuchen gegenübergestellt. Zwei
unterschiedliche Arten von Kopplungsankern wurden innerhalb der Bindungsstudien unter
Einbeziehung einer späteren sterischen Stabilisierung durch PEG verglichen. Der Antikörper
sollte sich gegenüber den Polyethylenglykoleinheiten nach der Kopplungsprozedur in einer
exponierten Lage befinden. Der Typ 2 der Immunoliposomen konnte dieser Anforderung
gerecht werden. Die Bindungsversuche zeigten, dass ein Vorhandensein spezifischer E-
Selektin-Antikörper auf der Liposomenoberfläche und ein Entzündungsstatus des Endothels
Voraussetzungen für ein selektingerichtetes Drug Delivery System darstellten. Ein erheblicher
Bindungsvorteil der selektingerichteten Immunoliposomen gegenüber konventionellen
Liposomen (ungekoppelt) bzw. unspezifischen Immunoliposomen konnte ermittelt werden.
Der Bindungsvorteil separat betrachtet steht nicht gleichzeitig für einen Therapieerfolg.
Deshalb wurde im nächsten Schritt die Internalisierung der gebundenen Liposomen in das
Zellinnere der Endothelzellen betrachtet. Der aufgenommene Anteil konnte quantifiziert
werden. Des Weiteren war es möglich, die zellulären Aufnahmemechanismen zu bestimmen.
Mit den Ergebnissen konnte die Anzahl an Liposomen berechnet werden, die für einen
späteren Effekt im Rahmen einer antiinflammatorischen Therapie für die Wirkung verantwortlich
sein werden. Nur ein sehr kleiner Anteil gelangt nach erfolgter Bindung in das
Zellinnere. Um die Liposomen bzw. ihren späteren Inhalt vollkommen intrazellulär zur
Wirkung bringen zu können, sollten weitere Untersuchungen folgen. Der Wirkstoff im
Inneren der Liposomen musste dem Zellstoffwechsel verfügbar gemacht werden.
Internalisierte Vesikel werden nach kurzer Zeit intrazellulär verdaut und würden dem
Metabolismus nicht mehr bereit stehen. In anschließenden in-vitro-Untersuchungen sollte die
Anwendung sterisch stabilisierter pH-sensitiver Immunoliposomen den lysosomalen Abbau
verhindern. Im Vergleich zu pH-insensitiven Liposomen konnte anhand mehrerer
Experimente der Vorteil der pH-sensitiven Immunoliposomen gezeigt werden. Damit wurde
ein späterer Wirkverlust durch lysosomale Degradation verhindert.
Das Gesamtvorhaben dieser Arbeit richtete sich auch auf die erfolgreiche Kombination
der zuvor optimierten Teilschritte des liposomalen Endotheltargetings. Als Ausdruck dessen
wurde die Realisierung einer Gentransfektion der Endothelzellen durch die Liposomen
angestrebt. Die selektingerichteten Immunoliposomen sollten am Ort der späteren
Entzündung intrazellulär Plasmid-DNA freisetzen können. Zur Kontrolle der Freigabe und
des erfolgreichen Einbaus der externen DNA wurden Transfektionsversuche herangezogen.
Da die äußerst geringen Einschlussraten der Liposomen bisher nicht von Belang waren,
mussten die Liposomenpräparationen neu charakterisiert werden. Im Zuge der Untersuchungen
konnte eine neue Herstellungsmethode entwickelt werden, die die Vorteile des
effizienten Plasmideinbaus durch Lipoplexbildung innerhalb einer Detergenzmethode zur
Liposomenherstellung mit der Eigenschaft targetspezifischer pH-sensitiver Immunoliposomen
verknüpft. Erste Versuche an Bakterien zeigten diese Vorteile. In einem letzten Arbeitsteil
sollte die Transfektionsfähigkeit an den sonst schwer transfizierbaren HUVEC gezeigt
werden. Hier wurde deutlich, dass eine erfolgreiche Transfektion nur durch die Kombination
mehrerer liposomaler Eigenschaften gelingt. Die eingesetzten Liposomen müssen das
5. Zusammenfassung
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