Die Untersuchung des immunoliposomalen Targetings von ...

Liposomen (Fluoreszenzmarkierung 1 mol% DiO). Entsprechend der zu untersuchenden
Parameter wurden unterschiedliche Versuchsbedingungen gewählt. Es fanden alle Bindungsuntersuchungen
bei Inkubationstemperaturen von 4°C statt. Als Blindwerte dienten Zellen
ohne Liposomenbehandlung. Nach erfolgter Inkubation wurde vorsichtig mit PBS gespült, um
die nicht gebundenen Liposomenanteile zu entfernen. Anschließend wurde die Fluoreszenz
(Ex. 485nm/Em. 520nm) am Plattenreader gemessen.
3.5. Internalisierungsuntersuchungen
3.5.1. Dithionit-Technik
Mit dieser Methode lässt sich der internalisierte Liposomenanteil quantitativ erfassen.
Um später genaue Interpretationen vornehmen zu können, musste im Vorfeld die Technik an
Liposomen näher charakterisiert werden.
Reduktion von NBD-PE in Liposomen:
Basisierend auf der Fluoreszenzlöschung des NBD durch Reduktion der Nitro- zur
Aminogruppe durch Dithionitzusatz musste gezeigt werden, dass das molare Verhältnis des
Dithionits gegenüber dem NBD für eine erfolgreiche komplette Reduktion aller Nitrogruppen
ausreichend ist. Dazu wurden über die Hydratationsmethode Liposomen der
Zusammensetzung SPC/CHOL im Verhältnis 7:3 hergestellt. Die Fluoreszenzmarkierung mit
2mol% NBD erfolgte durch die Ethanolinjektionsmethode asymmetrisch (Kapitel
3.2.4.2.).Die Liposomen wurden mit verschiedenen Mengen Dithionit versetzt. Folgende
Verhältnisse zwischen NBD und Dithionit wurden untersucht: 1:50000, 1:100000, 1:150000.
Die Fluoreszenzauslöschung innerhalb der schwarzen 96-well-Platten wurde über 5 Minuten
am Fluostar in Abständen von 30 Sekunden verfolgt. Um eine Lyse der Liposomen zu
erreichen, wurde anschließend in jedes well Triton-X-100 gegeben (1% Endkonzentration).
Eine letzte Fluoreszenzmessung schloss sich an.
Anwendung der Methode als Zellinternalisierungsassay:
Für die Internalisierungsversuche kamen HUVEC der 2. und 3. Passage zum Einsatz.
Sie wurden nach einem konfluenten Wachstum mittels Trypsinbehandlung geerntet und in
schwarze 96-well Platten mit einer Zellanzahl von 20000 HUVEC je well ausplattiert. Zum
Anwachsen und Ausbreiten der HUVEC auf dem Plattenboden blieben die Zellen über Nacht
in den Platten im Brutschrank. Je nach Versuchsdurchführung wurde ein entsprechender Teil
der Zellen mit IL-1β stimuliert. Die Inkubationsparameter wurden wie in den
Bindungsuntersuchungen entsprechend variabel gestaltet und auf ihre Bedeutung hin später
näher untersucht. Zur Erfassung der Internalisierungsrate musste sich nach Liposomenzugabe
und Abwarten der Inkubationszeit für die Bindung und dem darauf folgenden Spülen ein
weiterer Inkubationsvorgang anschließen. Während dieser Zeit hatten die gebundenen
Liposomen die Möglichkeit, durch die Zellmembran hindurch in das Zytosol zu
internalisieren. Danach wurde die Aufnahme durch Lagerung bei 4°C abgestoppt und die
Zellen fluorimetrisch am Fluostar vermessen. Der erste Messwert symbolisierte sowohl
gebundene als auch internalisierte Liposomen. Die Unterscheidung war nach Zugabe der
Dithionitlösung (1,5M Dithionit, 1M TRIS, pH 10) möglich. Die zweite Fluoreszenzmessung
3.5. Internalisierungsuntersuchungen
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