Die Untersuchung des immunoliposomalen Targetings von ...

erneuter Separation auf. Der Rundkolben mit der Mischung wurde am Vakuumrotationsverdampfer
befestigt und unter milden Bedingungen (200mbar, 20°C, 60 RPM)
weiterbehandelt. Nachdem ein Großteil des Lösungsmittels entfernt wurde, kam es durch die
restlichen Lipide zur Ausbildung eines viskosen klaren Gels und in weiteren 15 Minuten zur
Entstehung einer wässrigen Suspension (Phasenumkehr). Während der gesamten Zeit kam es
zur regelmäßigen intensiven, mechanischen Beanspruchung der Lipide am Vortexer.
Abschließend wurden Reste von Chloroform durch Erhöhung des Vakuums aus der Liposomensuspension
entfernt. Ein reduziertes Endvolumen wurde durch Pufferzugabe auf das
Anfangsvolumen ausgeglichen.
3.2.1.3. Detergenzmethode
Diese Methode eignete sich gut für den Einschluss temperaturempfindlicher Stoffe
(Proteine, DNA etc.) in Liposomen. Die Lipide lagen hierbei in mizellarer Lösung vor. Als
Detergenz kam im Rahmen dieser Arbeit Oktylglykosid in einer Konzentration von 0,2M zum
Einsatz. Durch langsamen Detergenzentzug kam es zur Liposomenbildung. Das zugesetzte
Detergenz konnte durch verschiedene Mechanismen entfernt werden. Zu diesem Zweck kam
sowohl die Dialyseapparatur [Helenius et al. (1977)] als auch die Gelfiltration [Brunner et al.
(1976)] zum Einsatz. Bei der Vesikelbildung durch Dialysieren kam die Dialysemembran
Servapor ® (Serva Electrophoresis, Heidelberg, Deutschland) zur Anwendung. Ein vorhandener
Porendurchmesser innerhalb der Membran von 25Å ließ nur einen Durchtritt von
Stoffen zu, die ein maximales Molekulargewicht von 14000g/mol nicht überschritten.
Eingespannt in eine Dialyseapparatur kam es nun zum Auswaschen der Detergenzlösung.
Dafür wurde die Dialysekammer mit der in ihr befindlichen mizellaren Lösung der Lipide
rundum mit Pufferlösung umspült. Es kam zu einem kontinuierlichen Austausch an
Oktylglykosid. Nach 12 Stunden wurde der Puffer (154mM Natriumchlorid, 5mM HEPES,
pH 7,4) durch frische Dialysierlösung ersetzt. Für die Einschlussmenge und die Partikelgröße
der Liposomen waren die Dialysierzeit (insgesamt 36 Stunden) und die Geschwindigkeit des
umströmenden Puffers (250ml/h) von großer Bedeutung. Für die Abtrennung des Oktylglykosids
durch Gelfiltration kam eine mit Sephadex ® G 50 (Pharmacia Fine Chemicals AB,
Uppsala, Schweden) gefüllte Säule (Länge 12cm, Durchmesser 1cm) zum Einsatz. Die
gebildeten Liposomen wurden in Eppendorfgefäßen aufgefangen.
3.2.2. Kopplung von Antikörpern an Liposomen
Zur Funktionalisierung der Liposomen sollten entsprechende Antikörper an die
Oberfläche der Liposomen gekoppelt werden. Für diesen Zweck wurden zwei verschiedene
Antikörperkopplungsmethoden ausgewählt. Beide Techniken bewirken durch Ausbildung
einer kovalenten Bindung die Anbindung der Antikörper an die Liposomen. Unterschieden
wurde hierbei die Kopplung über eine Carbonsäureamidbindung mit Carbodiimidaktivierung
bei neutralem pH-Wert mit dem Kopplungsanker N-Glut-PE (Typ 1) gegenüber der Kopplung
mit Cyanur-PEG-PE ohne Aktivierung im basischen pH-Bereich (Typ 2). Bei beiden
Kopplungsmethoden wurde ein eingesetztes molares Verhältnis zwischen Lipid und Protein
von 1000:1 beibehalten [Hansen et al. (1995].
3.2. Liposomen
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