Die Untersuchung des immunoliposomalen Targetings von ...

4.2.3.2. Einfluss von Äquilibrierungsreagenzien
Um die o.g. Experimente zur pH-Sensitivität direkt auf die Situation in den Endothelzellen
zu übertragen sollten in-vitro-Untersuchungen folgen. Gleichzeitig wurde der
Vergleich ungekoppelter Liposomen und spezifisch gerichteter Immunoliposomen
vorgenommen.
Floureszenz [%]
120
100
80
60
40
20
0
DSPC/CHEMS (blind) DOPE/CHEMS (ungekoppelt)
DOPE/CHEMS (spez. gekoppelt) DOPE/CHEMS 1%PEG (spez. gekoppelt)
DOPE/CHEMS 5%PEG (spez. gekoppelt)
1. Messung nach Inkubation und Spülen 2. Messung nach Zugabe von 50 µl Triton
1. Messung 2. Messung 1.Messung +
NH4Cl
2.Messung +
NH4Cl
Abb. 23: Veränderung der pH-sensitiven Freigabe in HUVEC durch NH4Cl
Als Fluoreszenzmarker kam eine 100mM Calceinlösung zum Einsatz. Innerhalb der
Studien wurde deutlich, dass sich die ermittelte pH-abhängige Freigabe auch auf in-vitro-
Versuche übertragen ließ. In Abbildung 23 sind die Unterschiede zwischen pH-sensitiven und
pH-insensitiven Liposomen durch die gemessene Fluoreszenz nach einer Inkubation bei 37°C
gut zu erkennen. So weisen die Blindliposomen gegenüber den pH-sensitiven Liposomen bei
der ersten Messung nur eine halb so starke Fluoreszenz auf. Das bedeutet nicht sofort, dass sie
schlechter internalisiert wurden, sondern weist vielmehr auf ein Vorhandensein der pHinsensitiven
Liposomen innerhalb endosomaler Vesikel hin. Innerhalb dieser Kompartimente
befinden sich die Liposomen in relativ kleinen Räumen. Durch enzymatischen Abbau werden
diese Liposomen zwar zerstört, können ihre „volle“ Fluoreszenz aber dabei nicht zum
Ausdruck bringen, da die relativ kleinen Volumina keine starke Verdünnung der hoch
konzentrierten Calceinlösung zulassen. Einen weiteren Beweis gleicher Internalisierungstendenzen
lieferte der zweite Messwert. Nach Tritonzugabe wurden Fluoreszenzwerte
gleichen Ausmaßes sichtbar. Dies beweist, dass insgesamt gleich viele Liposomen durch die
Endothelzelle aufgenommen wurden. Das Calcein der pH-sensitiven Liposomen konnte sich
nach erfolgter Internalisierung und Destabilisierung im gesamten Zytosol ausbreiten und
erfuhr dadurch eine starke Verdünnung, was mit dem kompletten Verlust des „self-quench-
Effektes“ verbunden war. Dies wurde anhand der erhöhten Fluoreszenzwerte deutlich. Die
Fluoreszenzunterschiede der ersten Messung innerhalb der pH-sensitiven Liposomen im
Diagramm waren auf das unterschiedliche Ausmaß vorangegangener Bindungsprozesse
4.2. In-vitro-Studien von Liposomen an Endothelzellen
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