Die Untersuchung des immunoliposomalen Targetings von ...

3.6.4.2. Auswirkung von Äquilibrierungsreagenzien
Zur quantitativen Unterscheidung der Markerfreisetzung schlossen sich Versuche in
schwarzen 96-well-Platten an. Dafür wurden Nabelschnurendothelzellen aus Kulturschalen
abtrypsinisiert und in einer Anzahl von je 20000 pro well in Platten ausplattiert. Diese wurden
mit 50nmol pH-sensitiver/pH-insensitiver Immunoliposomen für 90 Minuten im Brutschrank
inkubiert. Nach Spülvorgängen mit PBS wurde die Fluoreszenz des Calceins am Fluostar
bestimmt. Eine erneute Messung folgte nach Detergenzzugabe (Triton-X-100, 1% Endkonzentration),
wobei noch intakte Liposomen innerhalb der Zelle zerstört wurden. Dieser
Versuchsablauf wiederholte sich anschließend mit einer geringen Modifikation. Einem Teil
der Endothelzellen wurde Ammoniumchlorid als Äquilibrierungsreagens hinzugegeben.
Dadurch wurde die Azidifizierung der Endosomen/Lysosomen blockiert [Maxfield (1982)].
Das Ammoniumchlorid wurde zu 20mM in Medium gelöst und den Zellen 30 Minuten als
Präinkubation hinzugegeben. Die Menge der zugesetzten pH-sensitiven/pH-insensitiven
Immunoliposomen blieb unverändert. Auch die Zugabe des Detergenz zur Lyse aller Bestandteile
blieb gleich. Im Anschluss daran wurden diese Ergebnisse mit den Versuchen ohne
Äquilibrierungsreagenz verglichen.
3.6.4.3. Einschluss von 4-Methylumbelliferyl-β-D-Glykosid
Um das intrazelluläre Schicksal der pH-sensitiven Immunoliposomen abschließend
beurteilen zu können, folgte ein Versuch mit lysosomalen Substraten [Yoshimura et al.
(1995)]. Das zu verkapselnde Substrat 4-Methylumbelliferyl-β-D-Glykosid wurde als 10mM
Pufferlösung über die Phasenumkehrmethode in die Liposomen gebracht. Als Blindprobe
wurde wieder die pH-insensitive Lipidmischung ausgewählt (DPPC/CHEMS). Es folgte eine
Kopplung des spezifischen Antikörpers über N-Glut-PE an die Liposomenoberfläche und
anschließend die Abtrennung freier Antikörpermoleküle über eine Sepharose ® -4B-Säule.
In schwarze 96-well-Platten wurden HUVEC ausplattiert (20000 je well) und der IL-1ß-
Stimulation unterzogen. Die Immunoliposomen wurden auf die Zellen gegeben und für 90
Minuten im Brutschrank inkubiert. Während dieser Zeit erfolgte die Fluoreszenzmessung alle
10 Minuten. Da die Hintergrundfluoreszenz relativ hoch war, mussten die betroffenen wells
vor jeder Messung mit PBS gespült und dann vermessen werden. Die Wellenlänge am
Fluostar betrug Ex. 320nm und Em. 390nm.
3.7. Gentransfer mit pH-sensitiven Immunoliposomen
Für einen erfolgreichen selektinvermittelten Gentransfer durch pH-sensitive Immunoliposomen
am entzündeten Endothel stellt die Verkapslungsrate des Genmaterials den
limitierenden Faktor dar. Deshalb müssen die Liposomen in Bezug auf ihre Einschlusseffizienzen
entsprechend der jeweiligen Herstellungsmethode (Kapitel 3.2.1.) näher überprüft
werden. Auf die Hydratationsmethode soll hier nicht weiter eingegangen werden, da die
ermittelten Verkapslungsraten dort nie 4% überschreiten und somit für den Einsatz
hochwertiger Plasmid-DNA inakzeptabel sind. Im Rahmen folgender Untersuchungen sollen
sowohl Detergenz- als auch Phasenumkehrmethode durch Modifizierungen in ihrer
Einschlussrate optimiert und auf ihre Transfektionsfähigkeit hin untersucht werden.
3.7. Gentransfer mit pH-sensitiven Immunoliposomen
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