Die Untersuchung des immunoliposomalen Targetings von ...

internalisierten Liposomenmenge durch die Zelle sind essentiell, da nur mit ihnen belegbare
Aussagen über eine spätere Wirkung erstellt werden können. Wirksam ist immer nur der
erfolgreich aufgenommene Liposomenanteil, da nur er dem zellulären Stoffwechsel zur Verfügung
stehen kann.
4.2.2.1. Quantitative Studien
Für die Quantifizierung des Internalisierungsvorganges wurde die Dithionit-Methode
angewendet. Diese im Kapitel 3.5.1. vorgestellte Technik erlaubt es, nur den tatsächlich im
Zellinneren vorliegenden Liposomenanteil zu erfassen. Basis dieses Assays ist der Fluoreszenzfarbstoff
NBD (7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl). In dieser Form vorliegend stellt er ein
starkes Fluorophor dar. Mit Natriumdithionit reagiert das NBD und wird dabei zum nichtfluoreszierenden
ABD (7-Amino-2,1,3-benoxadiazol-4-yl) reduziert. Da das NBD in Form
eines Phosphatidylethanolamins erhältlich ist (NBD-PE), konnte es ohne Schwierigkeiten in
die Liposomenmembran eingebaut werden. Die chemische Grundlage der Methode ist die in
Abbildung 11 dargestellte Reduktion der Nitroverbindung zur korrespondierenden
Aminoverbindung.
R NH NO2 2SO2
N
O
N
S2O 4
NH NH2
Abb. 11: Dithionit-vermittelte Reduktion des 7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl zum 7-
Amino-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl
Dabei wird deutlich, dass die elektronenziehenden Effekte der Nitrogruppe während der
Reaktion verloren gehen. Diese Eigenschaft fördert aber die Delokalisierung der π-Elektronen
im konjugierten Ringsystem und ist für ein Fluoreszenzsignal unentbehrlich. Dies hat zur
Folge, dass die gebildete Aminoverbindung keine Fluoreszenzeigenschaft mehr aufweist.
Während der Reaktion liegt das Dithionit–Ion (S2O4 2- ) im Gleichgewicht mit dem SO2 - -
Radikal vor. Das Radikal ist ein Reaktionszwischenprodukt innerhalb dieser Nitroreduktion
[Wasmuth et al. (1964), Gutch et al. (1966)]. Da sowohl das Ion als auch das Radikal eine
Ladung tragen, sind beide nicht in der Lage durch die Lipidbilayer und damit durch
Membranen zu permeieren [McIntyre et al. (1991)].
Die hier vorgestellte Technik findet breiten Einsatz in der Erforschung von
asymmetrischen Membranverteilungen innerhalb der Phospholipide der Lipidbilayer. Erwähnt
werden muss auch die Tatsache, dass die Reduktion durch Dithionit nicht die Strukturen und
damit die Eigenschaften von vorhandenen Proteinen beeinflusst [McIntyre et al. (1990)]. Eine
Differenzierung zwischen zellinternalisierten und oberflächig gebundenen Liposomen ist
aufgrund der Ladung des Dithionits und der asymmetrisch fluoreszenzgelabelten Liposomen
möglich. Dafür mussten die Liposomen nach einer gesonderten Herstellungsvorschrift mit
dem Fluoreszenzfarbstoff versetzt werden. Mit Hilfe der Ethanolinjektionsmethode (Kapitel
3.2.4.2.) entstanden so genannte „outside only“-gelabelte Vesikel, wobei der Fluorophor nur
4.2. In-vitro-Studien von Liposomen an Endothelzellen
R
N
O
N
65