Die Untersuchung des immunoliposomalen Targetings von ...

und Cyanur-PEG-PE als Mantellipide eingesetzt. Die Effizienz des DNA-Einschlusses ist in
der Kombination aus Herstellungsmethode und vorherigen Lipoplexbildung begründet. Die
Plasmid-DNA wurde zuvor in Wasser gelöst und mit dem kationischen Lipid DOTAP zur
Komplexierung gebracht. Um diesen Vorgang gewährleisten zu können, musste aus dem
Zwei-Phasen-System ein Ein-Phasen-System gebildet werden. Durch Methanolzugabe
entstand eine Monophase. Durch eine anschließende Bligh- und Dyer-Extraktion konnten sich
zwischen kationischem Lipid und Plasmid-DNA hydrophobe Komplexe ausbilden [Reimer et
al. (1995)]. Innerhalb einer entsprechenden Inkubationszeit kam es zur Reifung dieser
Komplexe. Nach Phasenseparation durch Zugabe von Wasser und Chloroform, welches die
späteren Mantellipide der Liposomen enthielt, schloss sich die Durchführung der Phasenumkehrmethode
an (Kapitel 3.7.1.). Innerhalb der 100nm großen Vesikel konnten durchschnittlich
40% der eingesetzten Plasmidmenge quantifiziert werden (Hoechst-Assay). Die
Funktionalisierung mit Antikörpern gestaltete sich in den beschriebenen Kopplungsausbeuten
als unproblematisch. Sie lagen im Bereich von 40µg Protein/µmol Phospholipid
und waren mit den Kopplungsergebnissen aus Kap. 4.2.1. vergleichbar. Die pH-sensitiven
Eigenschaften der hergestellten CCL wurden anhand von Freisetzungsversuchen nachgewiesen
und bestätigten die Ergebnisse aus Kapitel 4.2.3.1.. Die prozentual freigesetzten
Mengen des vorher eingeschlossenen Calceins in den unterschiedlichen pH-Bereichen sind in
der Abb. 28 dargestellt und werden gemeinsam mit dem Freisetzungsverhalten der SPLP
erläutert. Für die Anwendung der CCL als erfolgreiches pH-sensitives Transfersystem musste
zusätzlich noch die erforderliche Serumstabilität nachgewiesen werden. Man musste davon
ausgehen, dass die Stabilität der Lipidbilayer durch die verkapselten Lipoplexe gestört sein
könnte. Eine zusätzliche Wechselwirkung mit Serumproteinen könnte eine komplette
Instabilität herbeiführen. Dies würde zu einem vollständigen extrazellulären Austritt des
Liposomeninhaltes führen. Ein gezielter Transport von Genmaterial in die entzündungsrelevanten
Endothelzellen wäre somit nicht möglich und würde einem Therapieansatz
entgegenstehen. Bei den Untersuchungen der CCL konnten jedoch keine Instabilitäten
festgestellt werden. Sowohl die leeren als auch die plasmidhaltigen Liposomen zeigten die
schon in Kap. 4.2.3.2. ermittelten Serumstabilitäten der pH-sensitiven Immunoliposomen.
SPLP:
Eine weitere Präparation, die die Vorteile der Lipoplexbildung mit denen der Liposomenbildung
vereint, war die der SPLP (stabilized plasmid lipid particles) [Wheeler et al.
(1999)]. In den Untersuchungen von Wheeler wurde zusätzlich zum DOPE auch noch PEG-
Ceramid als Grundlipid eingesetzt. Erklärbar ist dies durch die Kontraindikation des reinen
PEG-PE innerhalb der Lipidmischung in Beisein von Lipoplexen. Es würde zu Aggregationserscheinungen
innerhalb der Herstellungsprozedur kommen, da die PEG-PE-Einheiten mit
ihren negativen Ladungen das Ladungsverhältnis zwischen DOTAP und Plasmid-DNA stark
verändern und sich an die positiv geladenen DOTAP-Moleküle anlagern würden. Dadurch
fehlen die positiven Lipidanteile auf der Plasmidoberfläche, was sich in einer gestörten
Lipoplexbildung äußert. Der Einsatz des reinen PEG-PE zeigt somit nicht nur deutliche
Nachteile in Bezug auf das Bindungsverhalten von Liposomen gegenüber zellulärer
Oberflächenstrukturen (Kap. 4.2.1. Abb. 6), sondern auch abnehmende Transfektionsraten bei
in-vivo-Untersuchungen [Hong et al. (1997)]. Bei den SPLP handelt es sich im engeren Sinne
um eine Art Liposomenherstellung durch Detergenzentzug. Die Komplexbildung und –
reifung zwischen DOTAP und Plasmid-DNA wurde auch hier durch eine Inkubationszeit
unterstützt. Zur Anwendung kamen DOPE und CHEMS als pH-sensitive Lipidmischung. Mit
dem Einsatz von Cyanur-PEG-PE als Kopplungsanker konnten sowohl die von Wheeler
beschriebenen Schwierigkeiten während der Präparation als auch die absinkenden Bindungs-
4.3. Sterisch stabilisierte pH-sensitive Immunoliposomen als Transfektionssystem
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