Hoffentlich endgültige Druckversion 1 - Stiftung Tierärztliche ...

Aus der Klinik für Kleintiere
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
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Knorpelersatz beim Hund – Untersuchungen zur Besiedlung
keramischer Matrices
INAUGURAL - DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
( Dr. med. vet. )
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Nicole Muschter
aus Altdöbern
Hannover 2007

Wissenschaftliche Betreuung: 1. Prof. M. Fehr
2. Dr. G. Hauschild
1. Gutachter: Prof. M. Fehr, Dr. G. Hauschild
2. Gutachter: Prof. Dr. B. Schröder
Tag der mündlichen Prüfung: 29.05.2007

Meinen Lieben

Inhaltsverzeichnis
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Inhaltsverzeichnis
Seite
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen........................................................................-9-
1. Einleitung...........................................................................................................-13-
2. Literaturübersicht.............................................................................................-15-
2.1. Die verschiedenen Knorpelformen ..................................................................-15-
2.2. Aufbau und Funktion des Gelenkknorpels.....................................................-17-
2.2.1. Chondrogenese des Knorpelgewebes ........................................................-17-
2.2.2. Stoffwechselvorgänge des Gelenkknorpels ...............................................-18-
2.2.3. Histologische Morphologie des Gelenkknorpels.......................................-18-
2.2.4. Funktionelle Morphologie des Gelenkknorpels.........................................-19-
2.2.5. Biochemische Zusammensetzung des Gelenkknorpels .............................-20-
2.3. Erkrankungen des Gelenkknorpels.................................................................-21-
2.3.1. Allgemeine Pathogenese............................................................................-21-
2.3.2. Traumatisch bedingte Knorpelschäden......................................................-22-
2.3.3. Osteochondrosis dissecans.........................................................................-23-
2.3.4. Arthrotische Veränderungen des Gelenkknorpels .....................................-24-
2.4. Therapieprinzipien bei chondralen Defekten.................................................-26-
2.4.1. Lavage und Débridement...........................................................................-26-
2.4.2. Nutzung des Selbstheilungspotentials des Knorpels sowie des
subchondralen Knochens durch knochenmarkstimulierende
Therapieverfahren ......................................................................................-26-
2.4.2.1. Knorpel-Knochen-Anbohrung nach PRIDIE.............................................-27-
2.4.2.2. Mikrofrakturierung nach STEADMAN.....................................................-28-
2.4.2.3. Abrasionsarthroplastik nach JOHNSON ...................................................-29-
2.4.3. Transplantation von Geweben und Zellen .................................................-29-
2.4.3.1. Periost-/Perichondriumtransplantation ......................................................-29-
2.4.3.2. Mosaikplastik / osteochondrales autologes Transfersystem......................-31-
2.4.3.3. Posteriorer Femurkondylentransfer ...........................................................-33-

Inhaltsverzeichnis
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2.4.3.4. Autologe Chondrozytentransplantation .....................................................-35-
2.5. Einsatz von Biomaterialien bei der Behandlung von Gelenk-
knorpeldefekten.................................................................................................-37-
2.5.1. Transplantateigenschaften..........................................................................-37-
2.5.2. Natürliche Trägermaterialien.....................................................................-38-
2.5.2.1. Fibrin..........................................................................................................-39-
2.5.2.2. Kollagen.....................................................................................................-39-
2.5.2.3. Hyaluronsäure............................................................................................-41-
2.5.2.4. Alginat, Agarose ........................................................................................-41-
2.5.2.5. Chitosan .....................................................................................................-42-
2.5.3. Synthetische Trägermaterialien .................................................................-43-
2.5.3.1. Polyactid-Säure, Polyglykol-Säure, Polyglykol-Polyactid-Säure-
Kopolymer .................................................................................................-43-
2.5.3.2. Dacron, Teflon, Karbonfasern ...................................................................-45-
2.6. Einsatz von Biomaterialien bei der Behandlung von osteochondralen
Defekten .............................................................................................................-46-
2.6.1. Transplantateigenschaften von Knochenersatzstoffen...............................-46-
2.6.2. Kalzium-Phosphat-Keramiken...................................................................-48-
2.6.2.1. Hydroxylapatit ...........................................................................................-48-
2.6.2.2. Phasenreines Beta-Tricalciumphosphat als keramische Matrix ................-49-
2.7. Kultivierungsverfahren zur Vermehrung artikulärer Chondrozyten.........-51-
2.8. High Mobility Group Proteine.........................................................................-53-
2.8.1. HMGA Proteine.........................................................................................-54-
2.8.2. HMGA 2-Protein .......................................................................................-55-
2.9. Real-Time-Polymerasekettenreaktion in der Diagnostik..............................-56-
2.9.1. Ablauf des Prozesses der Polymerasekettenreaktion.................................-56-
2.9.2. Das Prinzip der Real-Time-Polymeraskettenreaktion ...............................-57-
2.10. Rasterelektronenmikroskopie zur Untersuchung und bildlichen
Darstellung von Oberflächenstrukturen.........................................................-65-
2.10.1. Funktionsweise des Rasterelektronenmikroskops .....................................-65-
2.10.2. Physikalisch-technische Grundlagen der Rasterelektronenmikroskopie...-67-

Inhaltsverzeichnis
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2.10.3. Anwendung der Rasterelektronenmikroskopie im Rahmen des Tissue
Engineering................................................................................................-68-
2.11. Studienspezifische Anwendung der dargestellten Verfahren .......................-68-
3. Material und Methoden....................................................................................-70-
3.1. Geräte und Bezugsquellen................................................................................-70-
3.2. Reagenzien, Verbrauchsmaterialien und Bezugsquellen ..............................-71-
3.3. Versuchsaufbau.................................................................................................-72-
3.4 Isolierung, Expansion und Gewinnung von Knorpelzellen...........................-72-
3.4.1. Knorpelzellenisolierung.............................................................................-72-
3.4.2. Zellkultur....................................................................................................-73-
3.4.3. Ernten der in Zellkultur vermehrten Knorpelzellen...................................-74-
3.5. Besiedlung der Cerasorb ® -Zylinder ................................................................-74-
3.5.1. Besiedlung der Cerasorb ® -Zylinder mit in der Zellkultur vermehrten
Knorpelzellen.............................................................................................-75-
3.5.2. Beschickung der Cerasorb ® -Zylinder mit caninen Knorpelspänen ...........-77-
3.6. Auswertung der Besiedlung und Vitalität der Knorpelzellen.......................-77-
3.6.1. Zellvitalitätstest mit Trypanblau................................................................-77-
3.6.2. Fluoreszenzmikroskopie zur Beurteilung des Zellwachstums...................-78-
3.6.3. Rasterelektronenmikroskopie zur Bestimmung der Zellmorphologie.......-78-
4. Ergebnisse ..........................................................................................................-80-
4.1. Zellkultur-Kontrollen .......................................................................................-80-
4.1.1. Zellvitalitätsnachweis mit Trypanblau.......................................................-80-
4.1.2. Zellwachstumsnachweis durch Fluoreszenzfärbung mit
4´,6-Diamidino-2-phenylindol ...................................................................-80-
4.2. Cerasorb ® -Zylinder mit in der Zellkultur vermehrten caninen
Chondrozyten ....................................................................................................-81-
4.2.1. Zellvitalitätstest mit Trypanblau................................................................-81-

Inhaltsverzeichnis
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4.2.2. Zellwachstumsnachweis durch Flureszenzfärbung mit
4´,6-Diamidino-2-phenylindol nach vorangegangener Trypanblau-
Färbung ......................................................................................................-82-
4.2.3. Zellwachstumsnachweis durch Fluoreszenzfärbung mit
4´,6-Diamidino-2-phenylindol ...................................................................-83-
4.2.4. Bestimmung der Zellmorphologie mittels Rasterelektronenmikroskopie .-84-
4.3. Cerasorb ® -Zylinder mit caninen Knorpelspänen ..........................................-85-
4.3.1. Zellvitalitätsnachweis mit Trypanblau.......................................................-85-
4.3.2. Zellwachstumsnachweis durch Fluoreszenzfärbung mit
4´,6-Diamidino-2-phenylindol ...................................................................-87-
4.3.3. Bestimmung der Zellmorphologie mittels Rasterelektronenmikroskopie .-89-
5. Diskussion ..........................................................................................................-90-
6. Zusammenfassung.............................................................................................-98-
7. Summary..........................................................................................................-100-
8. Literaturverzeichnis........................................................................................-102-
Danksagung .....................................................................................................-135-

Abkürzungsverzeichnis
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Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
A : Adenin
Abb. : Abbildung
ACT : autologe Chondrozytentransplantation
ACTH : adrenocortikotropes Hormon
ADP : Adenosindiphosphat
ATP : Adenosintriphosphat
BMP : Bone Morphogenetic Proteine
bzw. : beziehungsweise
Ca : Calcium
ca. : circa
cm : Zentimeter
cm² : Quadratzentimeter
CO2 : Kohlendioxid
DAPI : 4´,6-Diamidino-2-phenylindol
d. h. : das heißt
DNA : Desoxyribonukleinsäure
ECM : extrazelluläre Matrix
eV : Elektronenvolt
evtl. : eventuell
FRET : Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
GAG : Glykosaminoglykane
ggf. : gegebenenfalls
HMG : High Mobility Group
HMGA : High Mobility Group AT-Hook bindende Proteine
HMGB : High Mobility Group Box bindende Proteine
HMGN : High Mobility Group Nukleosom bindende Proteine
IC50 : Schadstoffkonzentration, bei der 50 % der Zellen tot sind
i. d. R. : in der Regel
I.U. : International Units

Abkürzungsverzeichnis
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keV : Kiloelektronenvolt
MACT : matrixassoziierte autologe Chondrozytentransplantation
Mega-OATS : Mega-osteochondrales autologes Transfersystem
mg : Milligramm
MHz : Mega-Hertz
ml : Milliliter
mm : Millimeter
mm² : Quadratmillimeter
mM/l : Millimol pro Liter
Na : Natrium
nm : Nanometer
OATS : osteochondrales autologes Transfersystem
OCD : Osteochondrosis dissecans
OsO4
: Osmiumtetroxid
PBS : Phosphate Buffered Saline
PCR : Polymerasekettenreaktion (engl. Polymerase Chain Reaction)
PGA : Polyglykol-Säure
PLA : Polyactid-Säure
PLGA : Polyglykol-Polyactid-Säure-Kopolymer
RE : Rückstreuelektronen
REM : Rasterelektronenmikroskop
rpm : rounds per minute
RT-PCR : Real-Time-Polymerasekettenreaktion
SE : Sekundärelektronen
sog. : sogenannt
T : Thymin
u. : und
usw. : und so weiter
v. a. : vor allem
Vit. : Vitamin
z. B. : zum Beispiel

Abkürzungsverzeichnis
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z. T. : zum Teil
α-TCP : Alpha-Tricalciumphosphat
ß-TCP : Beta-Tricalciumphosphat
% : Prozent
> : größer
°C : Grad Celsius
µl : Mikroliter

Abkürzungsverzeichnis
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Einleitung
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1. Einleitung
Knorpelschäden stellen bei Mensch und Hund in zunehmendem Maße ein schwerwiegendes
orthopädisches Problem dar. Reduzierte Gelenkbeweglich- und –belastungsfähigkeit stehen
neben erheblichen Schmerzzuständen im Vordergrund der klinischen Symptomatik. Viele
verschiedene Ursachen, wie z. B. Traumata, Stoffwechselstörungen und generelle
Alterungsprozesse, können beim Hund zu einer Schädigung des Gelenkknorpels führen.
Dieser weist aufgrund seiner Avaskularität, fehlenden Innervation und
Lymphgefäßversorgung sowie der relativ geringen Zellularität nur eine unzureichende
Selbstheilungstendenz auf (METZ 2001). Intrinsische Reparaturmechanismen des hyalinen
Knorpels bewirken keine Heilung im Sinne der Restitutio ad integrum bzw. der Regeneration.
Stattdessen wird meist nur eine Verkleinerung der Läsion oder die Auffüllung durch den
biomechanisch weniger beanspruchbaren Faserknorpel erreicht, der zwar eine ausreichende
Zugfestigkeit aufweist, aber im Vergleich zum hyalinen Knorpel nicht in der Lage ist, die im
Gelenk einwirkenden Druckbelastungen abzufangen (LIEBICH 1999; METZ 2001; ROHEN
u. LÜTJEN-DRECOLL 2001). Die durch diesen Prozeß entstehenden Unebenheiten und
verminderten Druckelastizitäten der Knorpeloberflächen führen häufig zu Folgeerscheinungen
wie Schmerzhaftigkeit oder Einschränkungen in der Beweglichkeit des Gelenkes. Aktuell
entwickelte Therapiekonzepte haben in ihrer Gesamtheit daher die möglichst vollständige
Wiederherstellung der hyalinen Gelenkknorpeloberfläche zum Ziel. Neben rein
symptomatischen Behandlungsverfahren und Methoden, die das Selbstheilungspotential des
Knorpels und des subchondralen Knochens durch Knochenmarkstimulation nutzen, findet
auch die Transplantation von Gewebe und Zellen Anwendung. Eine weitere therapeutische
Option bei Knorpel- oder Knorpel-Knochen-Läsionen stellt die Anwendung von
Biomaterialien natürlichen oder synthetischen Ursprungs mit oder ohne Zellbesiedlung dar.
Der Einsatz des in der vorliegenden Studie verwandten phasenreinen Beta-
Tricalciumphosphates (ß-TCP) erfolgte dabei bisher vor allem als Knochenersatzmaterial
(FOITZIK u. STAMM 1997; HAUSCHILD et al. 2000; MERTEN et al. 2000; ERBE et al.
2001), versuchsweise aber auch als mit mesenchymalen Stammzellen besiedeltes
Ersatzmaterial bei osteochondralen Defekten (GUO et al. 2004). Im Rahmen der eigenen
Studie werden ß-TCP-Keramiken mit caninen Chondrozyten besiedelt. Dafür ist zunächst die
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Einleitung
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Vermehrung von Knorpelzellen in Kulturen notwendig. Nach Beendigung der
Zellvermehrung erfolgt die Besiedlung der keramischen ß-TCP-Matrices mit den
Knorpelzellen. In der Vergleichsgruppe werden die Makroporen der Zylinder mit caninen
Knorpelspänen gespickt.
Im Rahmen der vorliegenden Studie wird das Verhalten der caninen Chondrozyten nach
kultureller Expansion und Besiedlung einer keramischen ß-TCP-Matrix sowie deren
Auswanderungsverhalten auf die Matrix aus einem Knorpelspan untersucht. Bestimmt werden
dabei die Anzahl und Morphologie der Zellen sowie deren Vitalität.
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Literaturübersicht
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2. Literaturübersicht
2.1. Die verschiedenen Knorpelformen
Im Wirbeltierorganismus werden drei Arten von Knorpelgewebe unterschieden: elastischer,
Faser- und hyaliner Knorpel. Der elastische Knorpel enthält in seiner Grundsubstanz ein
reichverzweigtes Netzwerk elastischer Fasern und kann durch diese Einlagerungen vielseitige
mechanische Biegebelastungen abbauen. Die Fasern bestehen vorrangig aus Elastin sowie
Glyzin, Alanin und Prolin. Diese Bindegewebseiweißstoffe sind aus Polypeptidketten mit
hoher Elastizität und mechanischer Widerstandsfähigkeit aufgebaut. Eine zusätzliche
Stabilisierung des Knorpels erfolgt durch Kollagenfasern. Er bildet z. B. die Grundlage für die
Ohrmuschel, Teile des äußeren Gehörganges und den Kehldeckel (WIESNER u. RIBBECK
1991; LIEBICH 1999).
Faserknorpel entwickelt sich aus straffem Bindegewebe, auf das Druck- und v. a. Zugkräfte
ausgeübt werden. Die Anordnung der Faserbündel erfolgt dabei in Hauptzugrichtung. Diese
sehr widerstandsfähige Knorpelform findet sich vor v. a. in den Disci intervertebrales, im
Hufknorpel, in der Beckensymphyse, als Gelenkscheiben (Disci und Menisci articulares) und
als Sehneneinlagerung im Musculus biceps brachii des Pferdes. Im Vergleich zum hyalinen
Knorpel ist der Anteil des Kollagens Typ I hier deutlicher höher als der des Typs II. Eine
zonale Gliederung ist nicht erkennbar. Die Funktion des Faserknorpels, Stöße und
Erschütterungen abzufangen, begründet sich v. a. auf seiner Zugfestigkeit. Die Elastizität und
Druckfestigkeit ist im Vergleich zu den anderen Knorpelformen nur gering ausgeprägt
(LIEBICH 1999; SCHRÖDL 2005). Eine histologische Gegenüberstellung von elastischem
und Faserknorpel erfolgt in Abbildung (Abb.) 1.
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Literaturübersicht
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Abb. 1: Elastischer Knorpel (links) mit dichtem Netz aus elastischen Fasern und
eingelagerten Chondrozyten und Faserknorpel (rechts) mit kollagenen Faserbündeln
und parallel dazu angeordneten Chondrozyten (LIEBICH 1999)
Der hyaline Knorpel (Abb. 2) ist die im Körper am häufigsten vorkommende Knorpelform
und bildet die Gelenkoberflächen, Rippenknorpel, Nasenknorpel und den Knorpel der
mittleren und tiefen Atemwege.
Kollagenfaserbündel in
relativer Unordnung
Chondrozyt
elastische Fasern
Grundsubstanz
Knorpelhaut (Perichondrium)
Chondrozyten (in der Peripherie
spindelförmig, in der Tiefe
sphärisch)
Interzellularsubstanz
Abb. 2: Hyaliner Knorpel mit erkennbarer zonaler Gliederung (LIEBICH 1999)
Er unterscheidet sich unter anderem in der Zusammensetzung der Kollagene und im Gehalt an
Elastin von elastischem und Faserknorpel. Alle drei Knorpelformen enthalten in ihrer Matrix
und in der perizellulären Region Kollagen vom Typ II, wobei der Anteil in hyalinem Knorpel
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Literaturübersicht
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mit 90 bis 95 % am höchsten ist. Im Vergleich dazu weist der Faserknorpel einen ähnlich
hohen Gehalt (> 90 %) an Kollagen Typ I auf, während Kollagen Typ II lediglich einen
Anteil von maximal 5 % ausmacht
Die Kollagenfasern des hyalinen Knorpels ordnen sich aufgrund mechanischer Zug- und
Druckbelastungen, so dass deren Verlauf optimal den herrschenden Verhältnissen angepasst
ist. Der bogenförmige Verlauf der Fasern unter der Knorpeloberfläche führt zu einer
Verdichtung des Fasernetzes, so dass der größte Zug und Druck bereits an der Oberfläche
abgefangen wird. Die große Wasserbindungsfähigkeit des Gelenkknorpels sorgt zudem für
druckelastische Eigenschaften. Bei einwirkenden Druckkräften verformt sich der Knorpel bis
zu einem bestimmten Grad. Dann setzen Abstoßungskräfte innerhalb der Zellularsubstanz
dem Vorgang einen gewissen Widerstand entgegen und sorgen außerdem dafür, dass im
Anschluss das Gewebe wieder seine Ausgangsform und -lage zurückfindet (LIEBICH 1999;
NAUMANN et al. 2002; JUNQUEIRA et al. 2005).
2.2. Aufbau und Funktion des Gelenkknorpels
2.2.1. Chondrogenese des Knorpelgewebes
Alle drei Knorpelformen finden ihren Ursprung im mesenchymalen Bindegewebe, welches
nach lamellärer Verdichtung den Knorpel zeitlebens als Perichondrium umgibt und seine
Fähigkeit zur Knorpelbildung behält. Die Mesenchymzellen differenzieren als perichondrale
Fibroblasten zu Chondroblasten und beginnen mit der Ausscheidung von Knorpelmatrix,
bestehend aus Grund- und Interzellularsubstanz. Mit fortschreitender Neubildung von
extrazellulärer Matrix (ECM) weichen die Zellen auseinander. Die noch abgeplatteten
randständigen Chondroblasten runden sich während der weiteren Differenzierung zu
Chondrozyten ab (LIEBICH 1999). Im Unterschied zum elastischen und zum Faserknorpel
wird der hyaline Knorpel im ausdifferenzierten Zustand nicht von Perichondrium umgeben,
so dass seine Fähigkeit zur Selbstregeneration sehr stark eingeschränkt ist (CAMPBELL
1969; BUCKWALTER et al. 1988).
Das Knorpelwachstum kann sowohl von außen (häufigere Form), als auch von innen erfolgen.
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Literaturübersicht
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Durch die Vermehrung und Differenzierung der perichondralen Chondroblasten wächst der
Knorpel appositionell, d. h. von außen. Teilen sich hingegen differenzierte Knorpelzellen
nochmals, wächst der Knorpel interstitiell, d. h. von innen, da diese Zellen neue
Grundsubstanz bilden und dabei auseinanderweichen.
Beeinflusst wird das Knorpelwachstum durch eine Reihe von Vitaminen und Hormonen.
Während Vitamin (Vit.) A das Wachstum anregt, stimuliert Vit. C die Synthese und Erhaltung
von Kollagenfasern und Knorpelmatrix. Wachstumshormone, Thyroxin und
Geschlechtshormone steigern die sekretorische Aktivität der Chondrozyten. Das
adrenokortikotrope Hormon (ACTH) und Kortisol verzögern die Knorpelreifung (LIEBICH
1999; GIERE 2005).
2.2.2. Stoffwechselvorgänge des Gelenkknorpels
Wie der elastische und der Faserknorpel ist auch der Gelenkknorpel nicht innerviert und
findet keinen Anschluss an das Blut- oder Lymphgefäßsystem, der Stoffwechsel verläuft
bradytroph. Die Ernährung erfolgt ausschließlich durch Diffusion vom Gelenkspalt aus und
wird teils durch onkotische Druckunterschiede, teils durch intermittierende
Druckbeanspruchungen maßgeblich gefördert. Die Nährstoffe gelangen von der
Synovialmembran über die Gelenkflüssigkeit durch die Grundsubstanz zu den einzelnen
Knorpelzellen. Im juvenilen Knorpel, d. h. vor Ausbildung der Verkalkungszone, werden die
tiefen Zonen zusätzlich von den Markgefäßen des subchondralen Knochens versorgt (METZ
2001). FRISBIE et al. (2006) konnten in einer histologischen Studie Angaben zur Dicke der
Knorpelschichten in Kniegelenken von Hunden machen, die von 0,6 – 1,3 mm, im Vergleich
zu 1,5 – 2 mm bei Pferden und 2,2 – 2,5 mm bei Menschen, reichten. Dies lässt darauf
schließen, dass die Ernährung des Gelenkknorpels über die Synovia nur über eine begrenzte
Distanz erfolgen kann.
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Literaturübersicht
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2.2.3. Histologische Morphologie des Gelenkknorpels
Im histologischen Schnitt lässt der hyaline Knorpel eine zonale Gliederung mit wechselnder
Dichte, Form und Ausrichtung der Chondrozyten und der extrazellulären Matrix erkennen. In
der gelenkspaltnahen Tangentialfaserzone (= superfiziale Zone), charakterisiert durch einen
hohen Kollagenanteil bei niedrigem Proteoglykangehalt, liegen die Kollagenfasern und die
spindelförmigen, „fibroblastenähnlichen“ Chondrozyten mit ihrer Längsachse parallel zur
Gelenkoberfläche. In der sich anschließenden Intermediärzone mit Kollagenfibrillen größeren
Durchmessers und höherem Gehalt an Proteoglykanen wechselt die Ausrichtung der Fasern
bogenförmig in einen zur Oberfläche senkrechten Verlauf. Die rundlichen Chondrozyten der
folgenden breiten Radiärzone liegen in isogenen Gruppen organisiert. Sie bilden säulenartige
Formationen und sind ebenso wie die parallel dazu angeordneten Kollagenfibrillen senkrecht
zur Gelenkoberfläche ausgerichtet. In dieser Schicht findet sich der höchste Gehalt an
Proteoglykanen und die niedrigste Wasserkonzentration. Die sogenannte Tidemark, eine
dünne Schicht mit einem höheren Calciumgehalt in der ECM, trennt diese Zone von der
folgenden Schicht des mineralisierten Knorpels, von der wiederum zapfenartig der Übergang
in den subchondralen Knochen erfolgt (BRUNS u. STEINHAGEN 2000; MARLOVITS u.
VÉCSEI 2000; REIFENRATH 2005).
2.2.4. Funktionelle Morphologie des Gelenkknorpels
Der Verbund aus Knorpelzellen und hochvisköser Interzellularsubstanz mit Verfestigung und
Verstärkung durch die Ausbildung fadenförmiger Makromoleküle in netz- und bündelartigen
Verbänden gewährleistet eine hohe Druck-, aber nur eine geringe Zugfestigkeit. Ein direkter
Zell-Zell-Kontakt zwischen den Chondrozyten fehlt. Allerdings sind die Zellen durch die
mechanische Anbindung an das Netzwerk der ECM funktionell mit ihrem Stoffwechsel
integriert. Die Vernetzung der kollagenen Fibrillen mit Proteoglykanen und die arkadenartige
Anordnung des Kollagenfasergerüstes gewährleisten einerseits ein gewebstypisches Maß an
Verformbarkeit und Elastizität, andererseits aber auch an Druck- und Stoßfestigkeit.
Druckbelastungen bzw. Belastungsspitzen, die einseitig auf die Knorpeloberfläche einwirken,
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Literaturübersicht
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werden in allseitige hydrostatische Drücke umgewandelt, wodurch ihre gewebsschädigende
Wirkung deutlich gemindert wird (METZ 2001; ROHEN u. LÜTJEN-DRECOLL 2001). Die
wasserreiche Grundsubstanz bildet zusammen mit der Synovialflüssigkeit ein geschlossenes
System, welches einem hydraulischen Stoßdämpfer- und Pumpsystem entspricht und so die
Ernährung der Chondrozyten sicher stellt (STEINBRÜCK et al. 1980; STASHAK 1989;
METZ 2001).
Als Überzug der kongruierenden Flächen echter Gelenke ist der hyaline Knorpel
verantwortlich für die Verteilung der einwirkenden Kräfte und die Reduzierung der
Beanspruchung der am Gelenkaufbau beteiligten Bindegewebe. Er übernimmt die
Lastverteilung und die Herabsetzung der mechanischen Druckbelastung auf den
subchondralen Knochen (BRUNS u. STEINHAGEN 2000; MARLOVITS u. VÉCSEI 2000).
2.2.5. Biochemische Zusammensetzung des Gelenkknorpels
Mit 70-80 % macht gebundenes Wasser den größten Anteil der extrazellulären Matrix aus.
Das Zellvolumen beträgt je nach Gelenk und Lokalisation 1-10 % vom Gesamtvolumen.
Organische und anorganische Bestandteile (20-30 % der ECM) bilden v. a. Kollagene und
Proteoglykane, aber auch Proteine, Glykoproteine und Lipide.
Die Kollagene stellen den Hauptbestandteil der Trockenmasse der ECM dar, verleihen dem
Knorpelgewebe seine Struktur und garantieren dessen Festigkeit. Proteoglykane und andere
Bestandteile der ECM werden darin wie in einer Art Maschenkonstruktion chemisch oder
mechanisch eingeschlossen. Mit 90-95 % stellt das Kollagen Typ II den Hauptanteil der
Kollagene des hyalinen Knorpels dar. Quantitativ gering hingegen sind die übrigen Typen VI,
IX, X und XI repräsentiert. In direkter Umgebung der Chondrozyten findet sich das Kollagen
Typ VI und ist beteiligt an der Verbindung zwischen den Zellen und der ECM. Die Typen IX
und XI haben durch die Bildung von Quervernetzungen eine stabilisierende Funktion für das
Kollagengerüst. Ausschließlich in der Zone des mineralisierten Knochens findet sich
Kollagen vom Typ X.
Die Proteoglykanmonomere bestehen aus einem zentralen Proteinanteil, an den in
unterschiedlicher Zusammensetzung Polysaccharide geknüpft sind. Im hyalinen Knorpel
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Literaturübersicht
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können mehrere Proteoglykanmonomere über Verbindungsproteine an Hyaluronsäure
gebunden werden und so komplexe Proteoglykanpolymere bilden. Das Aggrecan gilt als
knorpelspezifisches Proteoglykan des hyalinen Knorpels im Vergleich zum Versican beim
Faserknorpel. Der Polysaccharidanteil besteht im Gelenkknorpel überwiegend aus den
Glykosaminoglykanen Chondroitin-4-Sulfat, Chondroitin-6-Sulfat, Keratansulfat und
Hyaluronsäure. Diese Glykosaminoglykane verfügen im physiologischen Milieu über
ionisierte Carboxyl- und Sulfatgruppen. Um eine Elektronenneutralität zu gewährleisten,
werden Bindungen mit Ionen (Calcium [Ca ++ ] und Natrium [Na + ]) aus der interstitiellen
Flüssigkeit eingegangen. Dies führt über einen osmotischen Gradienten zur hohen
Wasserbindungsfähigkeit der Glykosaminoglykane (GAG).
Die Glykoproteine, bestehend aus Eiweißen und kovalent daran gebundenen
Kohlenhydratketten, vermitteln im Gewebe Bindungen zwischen Adhäsionsproteinen der
ECM und Integrinen der Zellmembranen. Dazu zählen Vitronektin, Laminin, Thromospondin
und Fibronektin, von denen letzteres für die Verankerung der Zellen in der ECM und für den
Zusammenhalt der Proteoglykane und Fasern innerhalb der ECM sorgt (BUCKWALTER u.
MANKIN 1997a; LIEBICH 1999; BRUNS u. STEINHAGEN 2000; MARLOVITS u.
VÉCSEI 2000; GIERE 2005; REIFENRATH 2005).
2.3. Erkrankungen des Gelenkknorpels
2.3.1. Allgemeine Pathogenese
Die beschriebenen morphologischen Grundlagen des Knorpelgewebes bezüglich der
Avaskularität, fehlenden Innervation und Lymphgefäßversorgung sowie die relativ geringe
Zellularität bedingen als biologische Besonderheiten im Wesentlichen die mangelnde
Selbstheilungspotenz des hyalinen Knorpels. Bei Verletzungen anderer Bindegewebe kommt
es zu einer kaskadenartigen Entzündungsreaktion mit Migration von Zellen mit regenerativer
Potenz, die aber beim Knorpel aufgrund der fehlenden Blutgefäßversorgung nicht möglich ist.
Die Abgrenzung der Chondrozyten von der Defektzone durch die ECM begründet zusätzlich
die mangelnde Regenerationstendenz (HARDINGHAM et al. 1992).
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Literaturübersicht
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Traumatisch bedingte Knorpelschäden müssen von denen, die systemisch ausgelöst werden
oder Folge normaler Alterungsprozesse sind, abgegrenzt werden. Intrinsische
Reparaturmechanismen bewirken keine Heilung im Sinne der Restitutio ad integrum bzw. der
Regeneration. Als Reparaturphänomene werden gesteigerte Chondrozytenaktivitäten und ggf.
sogenannte Zellclusterbildungen am Defektrand beobachtet. Durch Abrundung der Ränder
und „Einfließen“ von Knorpelgewebe („Cartilage-flow-Phänomen“) in den Defekt wird eine
Verkleinerung der Läsionen erreicht, aber keine vollständige Auffüllung (BRUNS et al.
1997). Ist der subchondrale Knochen eröffnet, kommt es zusätzlich zur Auswanderung von
mesenchymalen Zellen in den Defekt. Dies führt zu einer Narbenbildung und bestenfalls zur
Defektauffüllung mit dem mechanisch weniger beanspruchbaren Faserknorpel (BRUNS u.
STEINHAGEN 2000).
Mögliche Ursachen, die zur Schädigung des Gelenksknorpels führen können, werden im
Folgenden beschrieben.
2.3.2. Traumatisch bedingte Knorpelschäden
Knorpelschäden können sowohl Folge verschiedener makro- und mikrotraumatischer als auch
nichttraumatischer oder nicht sicher geklärter Ursachen sein. Traumatische Läsionen
entstehen entweder durch direkte Kontusionen oder indirekt durch Distorsionen oder
Luxationen. Eine umschriebene Läsion kann auch durch Mikrotraumen im Sinne von
Impulsbelastungen entstehen, die nicht einzeln, aber durch eine hohe Repetition zu einem
Defekt führen. Histomorphologisch erfolgt die Unterscheidung von chondralen und
osteochondralen Defekten.
Der Initialschaden besteht in der Eröffnung der oberflächlichen Tangentialfaserschicht.
Soweit kein makrotraumatischer Defekt mit Substanzverlust vorliegt, weist die
Knorpelschicht zunächst einen erhöhten Flüssigkeitsgehalt auf, wodurch die Kollagenfasern
auseinandergedrückt werden und ihre Belastbarkeit verlieren. Am Defektrand bilden sich sog.
Brutkapseln bzw. Chondrozytencluster sowie azelluläre Bereiche. Diese Cluster sind nicht in
der Lage, eine regelrechte und mikromorphologisch korrekte Defektauffüllung im Sinne der
Regeneration zu gewährleisten. Die Chondrozyten weisen eine erhöhte Stoffwechselaktivität
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Literaturübersicht
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auf und bewirken eine Steigerung der Grundsubstanzproduktion, um die zerstörte Matrix
damit zu ersetzen. Nicht möglich ist es ihnen aber, an den Ort des Geschehens zu gelangen
(MARLOVITS u. VÉCSEI 2000). Dies führt zu einer Reparatur, nicht aber zu einer
Regeneration. Bei fortschreitender Ausdehnung des oberflächlichen Defektes werden tiefere
Schichten eröffnet und die Kollagenfaserarchitektur bis auf die Basalschicht zerstört (MOHR
1983; BUCKWALTER u. MANKIN 1997b). Die durch den Detritus initiierte Synovialitis
führt über entzündliche Reaktionen, unter anderem infolge der Aktivität lysosomaler Enzyme
und der Verschlechterung der Knorpelernährung durch reduzierte Diffusion, zusätzlich zur
Destruktion. Die Chondrozyten weisen in dieser Phase eine verminderte Stoffwechselaktivität
auf. Parallel dazu treten Veränderungen am subchondralen Knochen auf, er verliert seine
ursprüngliche Elastizität und wird steifer (RADIN u. ROSE 1986).
2.3.3. Osteochondrosis dissecans
Die Osteochondrosis dissecans (OCD) ist eine häufig auftretende Skelettentwicklungsstörung
rasch wachsender Hunde mittelgroßer und großer Rassen (Deutsche Dogge, Labrador und
Golden Retriever, Neufundländer, Deutscher Schäferhund, Akita, Chow Chow, Boxer, Bull
Terrier, Mastiff) im Alter von fünf bis acht Monaten, die sich v. a. an den konvexen
Gelenkflächen des Schulter-, Ellbogen-, Sprung- und Kniegelenkes manifestiert. Seltener
betroffen sind die Cavitas glenoidalis, der dorsale Azetabulumrand, die distale
Radiusgelenkfläche und die Terminalflächen der Wirbelkörper (SLATER et al. 1991;
OLSSON 1993; HARARI 1998; KÁSA et al. 2001).
Sie stellt eine multifaktorielle Erkrankung dar, die in fokalen Fehlern beim Prozess der
enchondralen Ossifikation begründet ist und zu degenerativen Veränderungen am Knorpel
und subchondralen Knochen führt (GRÖNDALEN 1979; BOUDRIEAU et al. 1983).
Mögliche Ursachen stellen Traumata, genetische Faktoren, schnelles Wachstum, Ischämien,
Entzündungen oder Ernährungsfehler dar (EKMAN u. CARLSON 1998; HARARI 1998;
RICHARDSON u. ZENTEK 1998; HANKEMEIER et al. 2003). Chronische Fehl- und
Überbelastungen konvexer Gelenkflächen bei Jungtieren führen zu einem
Anpassungswachstum der Chondrozyten in den oberflächlichen Schichten des
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Literaturübersicht
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Gelenkknorpels und bedingen dessen Dickenzunahme. Die damit einhergehende
Verlängerung der Transitstrecke zu den tiefer liegenden Chondrozyten führt zu deren
Unterversorgung und Degeneration mit nachfolgender Lösung der Verbindungen zwischen
den Zellen und der ECM (OLSSON 1993). Dadurch entstehen lockere Bereiche der Knorpel-
Knochengrenze, die sich bei mechanischer Belastung zu Zusammenhangstrennungen
weiterentwicklen können, so dass sich der Gelenkknorpel flächig von seiner knöchernen
Unterlage löst (DÄMMRICH u. LOPPNOW 1990; KÁSA et al. 2001).
Grundsätzlich ist es möglich, den Verlauf der OCD in vier Stadien zu unterteilen. Das
Initialstadium (Stadium I) ist durch eine subchondrale Osteonekrose bei noch intaktem
Gelenkknorpel gekennzeichnet. Im Stadium II zeigt sich eine sklerotische Abgrenzung des
gesunden Knochens zur Nekrosezone, so dass Sklerose und Nekrose unmittelbar
nebeneinander zu liegen kommen. Das Eintreten einer spontanen Regeneration ist in diesem
Stadium bereits unwahrscheinlich. Das Fortschreiten der Demarkation führt zum Stadium III,
der Phase des „Dissekates in situ“. Der integrative Verbund mit dem Knorpel-Knochen-
Gewebe der Gelenkfläche geht zunehmend verloren. Löst sich das Dissekat von der
knöchernen Unterlage, ist das Stadium IV (Dissekation) der OCD erreicht (STEINHAGEN et
al. 2001).
Bei einer sekundären Schädigung des subchondralen Knochens tritt zusätzlich durch den
Kontakt mit der Synovia eine Entzündungsreaktion auf (FOX u. WALKER 1993; KÁSA et
al. 2001), die sich klinisch in Schmerzen, Lahmheiten und Funktionseinschränkungen des
Gelenkes äußert. Die Lösung der Knorpelschuppe verursacht zeitnah arthrotische
Veränderungen im Gelenk, so dass nur eine schnelle chirurgische Versorgung zu einer
Besserung führen kann (DENNY 1996).
2.3.4. Arthrotische Veränderungen des Gelenkknorpels
Ätiologisch lassen sich zwei Arthroseformen unterscheiden. Die primäre oder idiopathische
Arthrose entsteht durch direkte Überanstrengungsschäden, wie intensive Belastung, Sport,
hohes Körpergewicht, oder indirekte, relative Überlastung des Knorpels bei endogenen
Knorpelveränderungen wie Alterung oder Stoffwechselstörungen. Die sekundäre Arthrose
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Literaturübersicht
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findet sich bei kongenitalen Dysplasien, nach Luxationen, Osteochondrosen und anderen
Entwicklungsstörungen sowie als Folgezustände entzündlicher und nichtentzündlicher
Arthropathien wie Fehlstellungen nach Gelenktraumata (KÁSA et al. 2001). Symptome
reichen von anfänglich intermittierenden bis später progressiven permanenten Lahmheiten,
bishin zur Steifigkeit, die sich im Verlauf einer Belastung, bei kaltem Wetter oder nach
längerer Ruhezeit verstärken.
Der Verlauf der Arthroseentwicklung gliedert sich in drei Phasen. Zunächst entsteht durch die
Einwirkung akuter oder chronischer Traumata eine Eröffnung der oberflächlichen
Tangentialfaserschicht (BRUNS u. STEINHAGEN 2000). Aufgrund der Destabilisierung
dieses Netzwerkes kommt es zu einem Verlust von Proteoglykanen mit nachfolgender
Verschiebung der Osmolarität und steigendem Wassergehalt. Das Gewebe verliert an
Stabilität und Elastizität, es kommt zur Erhöhung der Reibungswiderstände und die
Oberfläche rauht auf. Bis zu diesem Punkt ist der Vorgang reversibel, wenn das betroffene
Gelenk geschont und die traumatisierende Ursache behoben wird. Geschieht dies nicht,
werden in Phase zwei die Chondrozyten aufgrund entzündlicher Prozesse aktiviert.
Einhergehend mit einer Dedifferenzierung der Chondrozyten entstehen Zellcluster durch
Proliferation und gesteigerte anabolische Aktivitäten rund um die Fissuren. Es werden
vermehrt minderwertige Matrixbausteine und unkontrolliert Knorpel-lysierende Enzyme
produziert. Dieser Zustand kann über Jahre andauern und zeigt das Bild einer aktivierten
Arthrose. In Phase drei werden die Chondrozyten apoptotisch und das Gewebe geht zugrunde.
Die komplette Knorpelschicht löst sich vom subchondralen Knochen, welcher aufgrund der
hohen Reibungswiderstände sklerosiert. Kompensatorisch kommt es zu einer überschießenden
Kallusbildung, knöchernen Auswüchsen (Osteophyten) und osteogener Zystenbildung. Die
Gelenkflächen werden zunehmend inkongruent (www.endoportal.de).
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Literaturübersicht
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2.4. Therapieprinzipien
2.4.1. Lavage und Débridement
Diese rein symptomatischen Therapieverfahren (JUBEL et al. 2002) bringen nur sehr
kurzfristige Erfolgsraten. Instabile oder freie Knorpelstückchen können mechanische
Probleme wie Einklemmung oder Krepitation verursachen. Außerdem induzieren
Knorpelverletzungen oft eine Synovitis mit nachfolgendem Gelenkerguss. Nach der
arthroskopischen Entfernung instabiler oder abgescherter Knorpelteile erfolgt die Glättung der
Knorpelränder und -oberflächen mit Hilfe von scharfen Löffeln oder Messern. Im Anschluss
wird das Gelenk von Detritus und Entzündungsmediatoren freigespült. Zwar können Lavage
und Débridement die mechanischen und inflammatorischen Symptome zuächst reduzieren,
hinsichtlich der langfristigen Wiederherstellung der Gelenkfunktion stellen sie aber
insuffiziente therapeutische Maßnahmen dar. Sie führen weder zu einer Stimulation der
Regeneration der Gelenkflächen noch halten sie das Fortschreiten des degenerativen
Prozesses auf (MARLOVITS u. VÉCSEI 2000; BURKART et al. 2001; GAISSMAIER et al.
2003).
2.4.2. Nutzung des Selbstheilungspotentials des Knorpels sowie des subchondralen
Knochens durch knochenmarkstimulierende Therapieverfahren
Um eine Regeneration des Gelenkknorpels und damit die Wiederherstellung der
Gelenkoberflächen zu erreichen, gibt es eine Reihe von Therapieverfahren, die sich das
Selbstheilungspotential der betroffenen Gewebe zu Nutze machen. Die grundlegende Idee
stellt die Nutzung pluripotenter Knochenmarkstammzellen dar, die als primäre
undifferenzierte Zellen die Fähigkeit besitzen, sich unter dem Einfluss biologischer und
mechanischer Faktoren unter anderem in Knochen oder Knorpel umzuwandeln. Durch die
chirurgische Penetration des subchondralen Knochens wird die Vaskularisationszone erreicht
und die Bildung eines Fibrinpfropfens hervorgerufen, der die erwünschten pluripotenten
Stammzellen enthält. Diese Zellen differenzieren zu faserknorpeligem Ersatzgewebe
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Literaturübersicht
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(BURKART et al. 2001), das im Sinne eines Regenerates die Funktion des hyalinen Knorpels
übernimmt. Folgende Therapieverfahren stehen in diesem Zusammenhang gegenwärtig zur
Verfügung:
2.4.2.1. Knorpel-Knochen-Anbohrung nach PRIDIE
Durch das Anbohren des geschädigten Knorpels sowie des sklerosierten subchondralen
Knochens bis in die gut durchbluteten spongiösen Areale wird die Ausbildung einer glatten
Faserknorpeloberfläche angeregt (PRIDIE 1959). Auf der Oberfläche des Defektes bildet sich
durch die Anbohrung ein Fibringerinnsel, das unter anderem pluripotente Stammzellen
enthält. Nach der Differenzierung der Zellen beginnen diese, ein knorpelartiges Ersatzgewebe
zu bilden, das v. a. Kollagen vom Typ I und – im Gegensatz zum hyalinen Knorpel – deutlich
weniger Proteoglykane (1 % im Vergleich zu 7 % Nassgewicht) enthält (ADAMS u. MUIR
1981; ADAMS u. HO 1987). Zudem sind die Proteoglykane durch andere GAG
gekennzeichnet. So weist das Ersatzgewebe beispielsweise einen deutlich höheren Gehalt an
Dermatansulfat auf (HABUCHI et al. 1973). Dadurch fehlen diesem Gewebe die
mechanischen Eigenschaften und die Haltbarkeit des eigentlichen Gelenkknorpels, so dass es
nach geraumer Zeit zum Verschleiß kommt und erneute Beschwerden auftreten. Der Nachteil
der Anbohrung liegt in der bei fehlender oder ineffizienter Spülung häufig entstehenden
Hitzenekrose, die zu einer zusätzlichen Schädigung des subchondralen Knochens führen
kann. Als Indikationen für die Anwendung dieses Therapiekonzeptes gelten die OCD und die
Osteoarthrose. Von Vorteil ist die einfache Durchführbarkeit ohne aufwendige
Zusatzinstrumente. Zudem kann das Verfahren an großen Gelenken arthroskopisch
durchgeführt werden. Weitere Folgeeingriffe sind später uneingeschränkt durchführbar
(MÜLLER u. KOHN 1999; MARLOVITS u. VÉCSEI 2000; GAISSMAIER et al. 2003;
HANKEMEIER et al. 2003). Die zunächst erreichte Verminderung der Schmerzhaftigkeit
sowie die Verbesserung der Gelenkfunktion (SCUDERI et al. 1997) sind jedoch in den
meisten Fällen nur von kurzer Dauer (SCHMIDT u. HASSE 1989).
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Literaturübersicht
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2.4.2.2. Mikrofrakturierung nach STEADMAN
Bei der Mikrofrakturierung werden mit Hilfe einer dornbesetzten Ahle zahlreiche
Perforationen in den freiliegenden subchondralen Knochen eingebracht. Durch die konische
Form des Dorns entstehen randständig an den Löchern feine Fissuren, aus denen zusätzlich
Blut aus dem Knochenmark treten kann. Im Gegensatz zur PRIDIE-Bohrung besteht bei
diesem Verfahren nicht das Risiko einer zusätzlichen Hitzenekrose (STEADMAN et al. 1997;
PÄSSLER 2000). Nach MARLOVITS u. VÉCSEI (2000) sowie BURKART et al. (2001)
sind drei bis vier Perforationen pro Quadratzentimeter (cm²) nötig, die eine Tiefe bis vier
Millimeter (mm) erreichen. Dadurch sollen lediglich Mikrofrakturen der Trabekel auftreten,
ohne eine weitere Knochenzerstörung hervorzurufen. Das entstehende Blutkoagel bleibt an
der rauhen Oberfläche des subchondralen Knochens hängen. Die darin befindlichen
unspezifischen Zellen differenzieren sich und bilden ein fibröses Narbengewebe, das auch
hier überwiegend aus Kollagen Typ I-haltiger Matrix besteht. Als Indikation gelten alle bis
auf den Knochen reichenden Knorpeldefekte, v. a. in der Belastungszone der Femurkondylen
oder im Bereich der femoropatellaren Kontaktzone (PÄSSLER 2000; BERNHOLT u.
HÖHER 2003). Bei Vorliegen einer OCD bei noch offenen Wachstumsfugen werden deutlich
bessere Ergebnisse erreicht als nach der Skelettreife (GAISSMAIER et al. 2003).
Die kurz- und mittelfristigen Ergebnisse zeigen eine verbesserte Schmerzsituation und
Beweglichkeit des betroffenen Gelenkes. In Abhängigkeit von der einwirkenden Belastung
und v. a. bei größeren Knorpelschäden wird der entstehende Faserknorpel aber aufgrund
seiner deutlich schlechteren biomechanischen Eigenschaften wieder abgetragen und die
Knorpeldegeneration schreitet fort. In Nachuntersuchungsstudien über einen Zeitraum von
zwei bis fünf Jahre post operationem zeigten etwa ein Viertel der Patienten eine erneute
Verschlechterung der klinischen Situation (STEADMAN et al. 1999; PÄSSLER 2000;
GAISSMAIER et al. 2003).
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Literaturübersicht
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2.4.2.3. Abrasionsarthroplastik nach JOHNSON
Bei der Abrasionsarthroplastik nach JOHNSON (1986) wird der Knorpeldefekt bis zum
angrenzenden gesunden Knorpel débridiert und der subchondrale Knochen mit Hilfe eines
Bohrers oberflächlich abgetragen bis breitflächig punktförmige Blutungen aus dem vitalen
Knochen hervortreten. Das anfänglich fibröse Ersatzgewebe wandelt sich nach ca. vier bis
sechs Monaten in faserknorpeliges Gewebe um (JOHNSON 1986; GOYMANN 1999;
BURKART et al. 2001; HANKEMEIER et al. 2003). Eine Verbesserung der klinischen
Ausgangssituation wird je nach Studie bei 60 (FRIEDMAN et al. 1984) bis 75 % der
Patienten angegeben (JOHNSON 1986).
Die Gesamtheit der knochenmarkstimulierenden Therapieverfahren führen zur Ausbildung
eines faserknorpeligen Ersatzgewebes, dass aufgrund seiner schlechter ausgeprägten
druckelastischen Eigenschaften im Vergleich zum hyalinen Knorpel den einwirkenden
Kräften im Gelenk weniger standhalten kann. Zusammenfassend zeigen etwa ein Viertel der
Patienten nach geraumer Zeit keine Verbesserung der Problematik, so dass andere
Therapieverfahren, die die Fähigkeit zur Regeneration eines hyalinen Knorpelgewebes
aufweisen sollen, entwickelt wurden.
2.4.3. Transplantation von Geweben und Zellen
2.4.3.1. Periost- / Perichondriumtransplantation
Periostales oder perichondrales Gewebe kann aufgrund seines chrondrogenen Potentials,
welches die Regeneration von Gelenkknorpelschäden prinzipiell möglich macht, zur
Behandlung von Knorpeldefekten verwendet werden (O´DRISCOLL 1999). Dieses Potential
beruht auf der Fähigkeit der mesenchymalen Stammzelle, die die Vorläuferzelle bei der
Entwicklung des Skelettsystems bildet, sich unter bestimmten physikalischen und
biochemischen Bedingungen in Knorpel oder Knochen umzuwandeln (MARLOVITS u.
VÉCSEI 2000). Folglich kann der hyaline Knorpel sowohl aus perichondralen als auch aus
periostalen Gewebselementen entstehen. Die Richtung der Differenzierung zu Knorpel oder
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Literaturübersicht
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Knochen hängt dabei wesentlich mehr von der Umgebung als vom Phänotyp der Zelle ab
(RITSILÄ et al. 1994).
Als Periostentnahmestelle eignet sich v. a. die mediale Tibiafläche. Die Kambiumschicht
weist neben der osteogenen auch eine chondrogene Potenz auf. Bisher gibt es allerdings nur
wenige Berichte über eine klinische Anwendung (NIEDERMANN et al. 1985; KORKALA u.
KUOKKANEN 1991). Die Entnahme von Perichondrium erfolgt an der sternumnahen
kaudalen Rippe. Bestehend aus Stratum fibrosum und Stratum cellulare, besitzt dieses
Gewebe die Fähigkeit, unter speziellen Bedingungen Knorpelgewebe zu synthetisieren und
Kollagen Typ II zu produzieren (BRUNS et al. 1992; COUTTS et al. 1992). Die Fixierung
der Periost- bzw. Perichondriumtransplantate im Defekt erfolgt mit Hilfe von Fibrinkleber
oder Fixationsnähten. Post operationem erfolgt zunächst die Auffüllung des Defektes mit
einem aus einer Mischung von faserigem und hyalinem Knorpel bestehenden Ersatzgewebe
(MARLOVITS u. VÉCSEI 2000).
O´DRISCOLL u. SALTER (1986) wiesen nach, dass mit autologen Periostlappen behandelte
osteochondrale Defekte in Kniegelenken von Hasen unter Bildung von hyalinem Knorpel
ausheilten. Dieser bestand zu über 90 % aus Kollagen Typ II, physiologischem Wassergehalt,
Proteoglykanen, Chondroitin und Keratansulfat. Im Vergleich zu einer Kontrollgruppe ohne
passive Mobilisierung zeigten dabei Gelenke, die mit einer passiven Bewegungsschiene
bewegt wurden, eine deutlich gesteigerte Chondrogenese. Auch nach der Einbringung von
Rippenperichondrium in einen Knorpeldefekt konnten sowohl HOMMINGA et al. (1990) als
auch RITSILÄ et al. (1994) eine Differenzierung zu hyalinem Knorpel nachweisen.
Schwierigkeiten bei der Anwendung von perichondralem Gewebe stellen die nur sehr
begrenzt zur Verfügung stehenden Mengen dar, ein möglicherweise überschießendes
Transplantatwachstum, die mangelhafte Bindung zwischen Knorpel und subchondralem
Knochen sowie die Ossifikationstendenz des Transplantates (BURKART et al. 2001).
Nachdem sowohl nach der Transplantation von Periost als auch von Perichondrium
postoperativ zunächst gute Ergebnisse erzielt werden konnten, erbrachten Langzeitergebnisse
deutlich schlechtere Befunde, z. B. in Form von Transplantatverkalkungen und
Osteoarthrosen (MARLOVITS u. VÉCSEI 2000). GAISSMAIER et al. (2003) beschrieben
im weiteren Verlauf häufig die Entstehung von enchondralen Ossifikationen in den
Transplantaten und vermuteten die Ursache in der ursprünglich osteoblastär geprägten
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Literaturübersicht
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Differenzierungsneigung von Vorläuferzellen dieser Herkunft. Im Rahmen ihrer
Nachuntersuchungen konnten sie keine Bildung von hyalinem Knorpel nachweisen. Ebenso
konnten BOUWMEESTER et al. (1997) nach Anwendung von Perichondrium und
ANGERMANN et al. (1998) nach Anwendung von Periost zwar eine kurzfristige Besserung
der Beschwerden bei den Patienten erreichen, nicht aber die Bildung von hyalinem oder
hyalinähnlichem Knorpel.
2.4.3.2. Mosaikplastik / osteochondrales autologes Transfersystem
Anstelle der Transplantation von Geweben mit chondrogenem Potential, wie Periost oder
Perichondrium, wird bei der Mosaikplastik bzw. dem osteochondralen autologen
Transfersystem (OATS) intakter hyaliner Knorpel transplantiert. Dafür werden Knorpel-
Knochen-Zylinder aus gering belasteten Knorpelarealen des Gelenkes entnommen und
anschließend in die Knorpeldefekte der Belastungszonen transplantiert. So wird eine
vollständig ausgebildete und funktionell intakte Knorpelmatrix zur Verfügung gestellt.
Die gewonnenen Knorpel-Knochen-Spenderzylinder sollten in ihrem Durchmesser etwa 0,3
mm größer als dass entsprechende Aufnahmebett sein, da nur so der Sitz des Transplantates
im Sinne einer „Press fit“-Technik ohne zusätzliche Fixation gewährleistet werden kann. Um
die Gefahr der Zylindernekrose zu vermeiden, sollte eine Mindestlänge von 8 mm für die
Spenderzylinder nicht unterschritten werden.
Die zylindrische Form der Transplantate erlaubt keine 100 %ige Auffüllung des Defektes.
Durch die Kombination unterschiedlich großer Spenderzylinder konnten HANGODY et al.
(2004) aber eine 90 bis nahezu 100 %ige Defektauffüllung erreichen (Abb. 3).
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Literaturübersicht
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Abb. 3: Schematische Darstellung der Mosaikplastik mit Knorpel-Knochen-
Spenderzylindern unterschiedlichen Durchmessers
Während im Bereich des spongiösen und subchondralen Knochens die Einheilung stattfindet,
bleibt diese auf Knorpelniveau aus. Stattdessen wird der verbleibende Hohlraum zwischen
transplantiertem und ortsständigem Knorpel mit Faserknorpel aufgefüllt, der einen geringen
Gehalt an Proteoglykanen aufweist und auch nach der Inkorporation deutlich abgrenzbar
bleibt.
Knorpeldefekt
Die Mosaikplastik findet v. a. Anwendung am Knie-, Ellbogen- und Schultergelenk sowie am
Talus. Als Indikationen gelten dabei bis zu drei mal zwei Zentimeter (cm) große Defekte und
subchondrale Nekrosen mit einer maximalen Tiefe von 10 mm, die infolge Trauma, OCD
oder Osteonekrosen entstehen können (BURKART et al. 2001; BENTLEY et al. 2003;
HANGODY et al. 2004). Für Defekte größeren Ausmaßes steht in der Regel kein
Spendermaterial in ausreichender Menge zur Verfügung.
Spenderzylinder mit unterschiedlichen
Durchmessern
Als absolute Kontraindikationen gelten Neoplasien, Infektionen, rheumatoide oder
generalisierte Arthritiden, Defektgrößen von mehr als 6 cm² und 10 mm Tiefe, intraartikuläre
Frakturen oder multiple Läsionen. Eventuell vorhandene Band- oder Meniskusschäden sollten
gleichzeitig korrigiert werden (HANGODY et al. 2004; COONS u. BARBER 2005).
Als Hauptproblem der Mosaikplastik gilt die Inkongruenz der Knorpeloberfläche, da die zu
transplantierenden Zylinder aus einem Bereich des Gelenkes mit einer anderen
Oberflächenkontur stammen. Weitere Schwierigkeiten ergeben sich bezüglich der
Langzeitstabilität und Integration des Spendermaterials im Empfängerbett. Die
Lebensfähigkeit der Chondrozyten an den Rändern der Knorpel-Knochen-Zylinder ist wichtig
für den Langzeiterfolg, denn die Abwesenheit von Matrix-produzierenden Zellen im Bereich
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Literaturübersicht
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der Knorpel-Knorpel-Berührung macht eine Integration des implantierten Knorpels
unwahrscheinlich. Das Fehlen einer natürlichen Einheilung führt über nutritive und
funktionelle Limitierungen zur fortschreitenden Gewebedegeneration (MARLOVITS u.
VÉCSEI 2000; GAISSMAIER et al. 2003; HUNTLEY et al. 2005). Weiterhin muss in
Langzeitstudien noch bewiesen werden, ob Knorpelgewebe aus weniger belasteten Arealen
den hohen mechanischen Ansprüchen der Hauptbelastungszonen der Gelenke standhalten
kann. Im Bereich der Hauptlastzone kann es nach FRANK (2003) durch die stärkeren und
ungewohnten Krafteinwirkungen zur Auffaserung des transplantierten Knorpels und
nachfolgend zum Verlust an hyalinem Gelenkknorpel kommen.
In der von BURKART et al. (2001) durchgeführten Studie zeigten die Patienten eine
vollständige Inkorporation und Vitalität sowie eine gute Oberflächenkongruenz der
Transplantate. Deutlich schlechtere Ergebnisse erzielten BENTLEY et al. (2003) bei
Langzeituntersuchungen, die nach einem Jahr eine Verschlechterung bei über 30 % der
Patienten nachwiesen. SZERB et al. (2005) berichteten in ihrer Langzeitstudie ebenfalls über
zunächst gute bis exzellente Ergebnisse, die sich aber im Laufe der Zeit verschlechterten.
2.4.3.3. Posteriorer Femurkondylentransfer / Mega-osteochondrales autologes
Transfersystem
Indikationen für den posterioren Femurkondylentransfer bzw. das Mega-osteochondrale
autologe Transfersystem (Mega-OATS) stellen ausgedehnte Knorpeldefekte im
gewichtstragenden Bereich des lateralen oder medialen Femurkondylus dar, bei denen das
OATS-Verfahren nicht mehr möglich ist, weil die Größe der zur Verfügung stehenden
Spenderareale unzureichend ist. Der posteriore Femurkondylus wird dafür entlang der
Femurlängsachse scharf abgetrennt (Abb. 4) und auf die Größe des Knorpeldefektbettes
zurechtpräpariert. Nachdem zunächst eine provisorische Fixation des Transplantates im
Knorpeldefekt mit Hilfe von Kirschner-Bohr-Drähten stattfindet (Abb. 5), erfolgt die
eigentliche Befestigung mittels Kleinfragmentschrauben (Abb. 6), die in einer zweiten
Sitzung nach ca. sechs Wochen wieder entfernt werden müssen.
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Literaturübersicht
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Abb. 4 Abb. 5 Abb. 6
Abb. 4: In Beugestellung des Kniegelenkes Entnahme des posterioren Kondylus parallel
zur Femurlängsachse (IMHOFF et al. 1999).
Abb. 5: Temporäre Fixation des zu transplantierenden posterioren Kondylus mit Hilfe
eines Kirschner-Bohr-Drahtes (IMHOFF et al. 1999).
Abb. 6: Fixation des Kondylustransplantates mit Kleinfragmentschrauben (IMHOFF et
al. 1999).
Im Rahmen der Weiterentwicklung zum Mega-OATS-Verfahren wird der posteriore
Femurkondylus in einer sog. „work station“ auf die zuvor mit einer speziellen runden
Größenschablone ausgemessene Defektgröße zurechtgefräst, so dass das Transplantat press-fit
und somit ohne zusätzliche Fixation eingesetzt werden kann (IMHOFF et al. 1999). Die
Einheilung des Transplantates erfolgt in der Regel problemlos (BURKART et al. 2001;
HANKEMEIER 2003). In der 1964 veröffentlichten Studie konnte WAGNER über gute
Ergebnisse bei 70 % der Patienten in den ersten zwei bis fünf Jahren berichten. BRUCKER et
al. (2002) erreichte drei Monate post operationem eine Verbesserung der
Schmerzsymptomatik bei 90 % der Patienten.
Aufgrund der erheblichen Komorbidität an der Entnahmestelle und der Gefahr der
Gelenkinstabilität durch den Verlust des posterioren Femurkondylus sollte die Anwendung
dieses Verfahrens jedoch nur erfolgen, wenn alternative Techniken aufgrund der Größe und
Tiefe des Defektes nicht möglich sind (BRUCKER et al. 2002; GAISSMAIER et al. 2003).
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Literaturübersicht
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2.4.3.4. Autologe Chondrozytentransplantation
Nach MARLOVITS et al. (2004b) gelten als Grundvoraussetzungen für die autologe
Chondrozytentransplantation (ACT) eine erhaltene Knorpelschulter, ein unverletzter
Umgebungsknorpel, eine intakte korrespondierende Gelenkfläche, unbeschädigte Menisken,
maximal zwei voneinander unabhängige Defekte, eine intakte Bandführung und
physiologische Gliedmaßenachse sowie die freie Beweglichkeit des Gelenkes. Die ACT
besteht im Wesentlichen aus drei Einzelschritten. Zunächst wird dem Patienten
Knorpelgewebe aus einem Gelenkareal außerhalb der Belastungszone entnommen. Die
Freisetzung der Chondrozyten aus der Biopsie erfolgt durch mechanische Zerkleinerung und
enzymatische Andauung der ECM. Anschließend werden die Zellen in In-vitro-Verfahren
expandiert und nach Erreichen einer definierten Anzahl in eine Zellsuspension überführt. Im
Rahmen eines Zweiteingriffs erfolgt über eine Arthrotomie die Präparation des
Knorpeldefektgrundes, ohne eine Verletzung des subchondralen Knochens hervorzurufen,
und die Glättung der Knorpelränder bis zu den intakten angrenzenden Knorpelarealen.
Anschließend wird der Defekt mit Hilfe eines Periostlappens abgedeckt, der meist von der
proximalen medialen Tibiafläche gewonnen wird. Die Chondrozytensuspension wird durch
die Abdeckung hindurch in die Defektzone injiziert. Im Anschluss wird für einen Zeitraum
von ca. sechs Wochen maximal eine Teilbelastung für das betroffene Gelenk empfohlen
(BURKART et al. 2001; PETERSON et al. 2002; DOROTKA et al. 2004; MARLOVITS et
al. 2004; REDMAN et al. 2005).
Mögliche Komplikationen stellen Adhäsionen oder Arthrofibrosen, hypertrophe
Veränderungen oder das Versagen des Transplantates sowie Entzündungen dar (BURKART
et al. 2001; DOROTKA et al. 2004; MARLOVITS et al. 2004). Die Transplantathypertrophie
tritt dabei am häufigsten auf, ist in der Regel aber arthroskopisch gut korrigierbar
(GAISSMAIER et al. 2003).
Die In-vitro-Zellvermehrung führt nachweislich nach einem gewissen Zeitraum zu einer
Dedifferenzierung der Chondrozyten (STARK et al. 1998). Unklar ist somit, ob die
chondrogene Potenz des Implantates den kultivierten Knorpelzellen oder dem Periost
zugeschrieben werden muss (BRITTBERG et al. 1994). Verschiedene Studien zeigten, dass
die Transplantation von Periost ebenfalls zu einer Defektauffüllung führt, auch ohne
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Literaturübersicht
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vorherige Beimpfung mit kultivierten autologen Chondrozyten (O´DRISCOLL u. SALTER
1986; MARLOVITS u. VÉCSEI 2000).
Der klinische Vergleich von ACT und Mosaikplastik ein Jahr post operationem erbrachte
nach BENTLEY et al. (2003) in beiden Fällen gute bis exzellente klinische Ergebnisse ohne
signifikante Unterschiede. Kontrollarthroskopien nach dem gleichen Zeitraum zeigten
allerdings, dass 82 % der Patienten mit durchgeführter ACT eine sehr gute Defektauffüllung
aufwiesen, im Vergleich zu 34 % bei der Mosaikplastik. BRITTBERG et al. (1999) konnten
in 73 % der Fälle nach durchgeführter ACT die Ausbildung von hyalinem Knorpel
nachweisen. Im Gegensatz dazu zeigten die zwei Jahre nach der Transplantation autologer
Chondrozyten entnommenen Gelenkknorpelbiopsien in der Studie von HORAS et al. (2003)
Faserknorpel auf.
Nachteile der ACT sind die hohen Kosten des Verfahrens, die notwendigen zweizeitigen
Eingriffe, die lange Entlastungsphase post operationem, die eine erhebliche Belastung für den
Patienten darstellt, und die mögliche Schädigung des umliegenden gesunden Knorpelgewebes
durch die Fixationsnähte des Periostflaps.
Alle diese Transplantatverfahren führen oftmals zur Auffüllung der Knorpeldefekte durch den
deutlich weniger druckbelastbaren Faserknorpel anstelle des erwünschten hyalinen Knorpels.
Die häufig notwendigen Fixationsnähte, die das Anheften des Transplantates am umliegenden
gesunden Knorpelgewebe sicherstellen sollen, führen oft zu einer zusätzlichen Schädigung.
Weiterhin bewirkt die autologe Transplantation von Knorpel-Knochen-Stanzen, Periost oder
Perichondrium eine erhebliche Komorbidität an der Entnahmestelle und bedeutet eine
zusätzliche Belastung für den Patienten. Daher geht man dazu über, die autologen
Transplantate durch biologische Materialien zu ersetzen. Als eine Modifikation z. B. der ACT
wurde der Periostflap durch resorbierbare Biomaterialien ersetzt, wobei gegenwärtig
hauptsächlich Kollagenmembranen Anwendung finden (MARLOVITS et al. 2004;
BARTLETT et al. 2005). Dadurch konnten sowohl die Inzidenz der Komorbidität an der
Entnahmestelle des Periostflaps als auch die der Transplantathypertrophie gesenkt werden. In
einer weiteren Abwandlung werden Biomaterialien eingesetzt, die als Trägersubstanzen für
Zellen dienen können, und direkt und ohne weitere Abdeckung in den Knorpeldefekt
eingebracht werden. Diese werden im Folgenden beschrieben.
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Literaturübersicht
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2.5. Einsatz von Biomaterialien bei der Behandlung von Gelenkknorpeldefekten
2.5.1. Transplantateigenschaften
Für den Einsatz eines Stoffes als Biomaterial, das als Transplantat zur Behandlung
chondrogener Defekte eingesetzt werden soll, gelten verschiedene Eigenschaften als
Grundvoraussetzung (RUDERT u. WIRTH 1998; SOLCHAGA et al. 2000; HUNZIKER
2002; PARK et al. 2005; REDMAN et al. 2005; STARK et al. 2006). Dazu zählen:
1) Interkonnektierende Porosität
Um die Migration von Zellen in das Biomaterial zu ermöglichen, ist ein hohes Maß an
interkonnektierender Porosität nötig. So werden eine ausreichend große Oberfläche für
die Interaktion zwischen den Zellen und dem Biomaterial geschaffen, genügend
Zwischenräume für die Regeneration von ECM bereitgestellt und eine minimale
Diffusionsbarriere während der In-vitro-Kultur gebildet.
2) Biodegradierbarkeit
Idealerweise dient das Trägermaterial als Startermatrix, die solange erhalten bleibt, bis
die Zellen die eigene und somit autologe extrazelluläre Matrix deponiert haben. Bis zu
diesem Zeitpunkt soll die Matrix die gewünschte Organstruktur vorgeben und
aufrechterhalten. Die Biodegradierbarkeit des Trägermaterials kann u. a. durch seine
Dichte bzw. durch die Art seiner Quervernetzung bestimmt werden (REICHMANN et
al. 2005). Durch die Steuerbarkeit der Degradationsrate egalisiert sich die
Regenerationsrate des gewünschten Gewebes.
3) Biokompatibilität
Die Verträglichkeit zum körpereigenen Gewebe stellt sicher, dass keine
Abstoßungsreaktionen stattfinden. Weder das Transplantatmaterial noch dessen
Degradationsprodukte sollten eine entzündliche Reaktion oder Toxizität in vivo
erzeugen.
4) Verfügbarkeit
Das Material sollte reproduzierbar in eine dreidimensionale Struktur gebracht werden
können.
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Literaturübersicht
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5) Biomechanische Stabilität
Nur eine gewisse strukturelle und biomechanische Stabilität erlaubt den Einsatz eines
Biomaterials zur Behandlung chondraler Defekte in vivo. Einwirkende Kräfte sollten
nicht zur unmittelbaren Zerstörung des Materials führen.
6) Strukturelle Eigenschaften der Oberfläche
Die Oberflächenstruktur soll die Anheftung, Proliferation und Differenzierung von
Zellen erlauben und unterstützen.
2.5.2. Natürliche Trägermaterialien
Natürliche Trägermaterialien sind i. d. R. biokompatibel, biodegradierbar und setzen sich aus
den strukturgebenden Bestandteilen physiologischer Gewebe zusammen (z. B. Kollagen,
GAG). Die geringe mechanische Stabilität, unkontrollierte Degradationsraten,
Sterilisationsschwierigkeiten und die damit in Zusammenhang stehende mögliche
Übertragung von Pathogenen schränken deren Anwendung ein (WANG et al. 2005). Häufig
finden sie Gebrauch in Form von Composites (z. B. Kombination mit synthetischen
Biomaterialien) oder chemischen Modifikationen, woraus jedoch zytotoxische Effekte und
eine reduzierte Biokompatibilität resultieren können (KARAGEORGIOU u. KAPLAN 2005).
Zu den natürlichen Trägermaterialien zählen unter anderem Fibrin, Kollagen, Hyaluronsäure,
Alginat, Agarose, Chitosan und Seide, die als wesentliche Biomaterialien im Rahmen der
Chondro-Reparation im Folgenden beschrieben werden.
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Literaturübersicht
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2.5.2.1. Fibrin
Dieses auf einer Proteinbasis basierende Polymer gehört zu den natürlichen Komponenten des
intravaskulären Raumes. Das biokompatible und biodegradierbare Fibrin erleichtert und
fördert die Gewebsheilung durch die Erhaltung der Entzündung, die Induktion des eigenen
Abbaus und die Substitution durch zelluläre Komponenten aus dem extravaskulären Raum. Es
weist einen hohen Gehalt an Fibronektin auf, das als essentielles Protein in der Knorpelmatrix
für die Interaktion zwischen Zellen und ECM sorgt. Die Abbauprodukte des Fibrins sind
physiologisch und somit nicht-toxisch, allerdings wurden immunologische Reaktionen
beobachtet (HAISCH et al. 2000; FRENKEL u. DI CESARE 2003). Aufgrund seiner
schlechten mechanischen Eigenschaften und der schnell stattfindenden Degradation kann das
Fibrin keine stabilisierende Funktion übernehmen (FRENKEL u. DI CESARE 2003; PARK
et al. 2005).
Bei Gelenkknorpelschäden konnte in verschiedenen Tierversuchen keine Unterstützung oder
Verbesserung des Heilungsprozesses durch die Anwendung von Fibrin beobachtet werden
(VAN SUSANTE et al. 1998; FRENKEL u. DI CESARE 2003), während HENDRICKSON
et al. (1994) bei 61 % der behandelten Defekte Kollagen vom Typ II nachwiesen, im
Vergleich zu 25 % bei den Kontrolldefekten.
Um die weniger vorteilhaften Eigenschaften auszugleichen, wird Fibrin häufig in Form von
Composites (z. B. mit Kollagen, Alginat) angewandt. Bei der Kombination mit Hyaluronsäure
übernimmt diese die Zellanheftung, Proliferation und Differenzierung, während das Fibrin für
eine einfache und sichere Fixation sorgt und die Interaktionen zwischen Zellen und ECM
sicherstellt (PARK et al. 2005).
2.5.2.2. Kollagen
Im Rahmen vieler In-vitro-Studien wurde bisher das Zellverhalten von Chondrozyten oder
mesenchymalen Stammzellen auf dem Trägermaterial Kollagen untersucht (TOOLAN et al.
1996; NEHRER et al. 1997). Die natürliche adhäsive Oberfläche und die im Kollagen
enthaltenen biologischen Informationen, die die Zellaktivität beeinflussen, fördern die
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Literaturübersicht
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Zellanheftung und das -wachstum. Nach der autologen Implantation dieses Biomaterials ist
keine Irritation des umliegenden Gewebes nachweisbar, die Abbauprodukte sind
physiologisch und daher nicht-toxisch (STARK et al. 2006).
DE FRANCESCHI et al. (2005) untersuchten Träger aus equinem Kollagen vom Typ I und
verglichen die Heilung chondraler Defekte nach Implantation des Trägers mit und ohne
Chondrozyten sowie bei Leerdefekten. Während nach drei Monaten keine Gewebsbildung in
irgendeiner Gruppe nachgewiesen werden konnte, zeigte sich nach sechs Monaten
neugebildetes Gewebe mit fibrokartilaginärem Charakter nur beim zellbesiedelten Träger.
Sowohl WILLERS et al. (2005) als auch LUBIATOWSKI et al. (2006) konnten bei
Membranen aus Kollagen Typ I und III eine Stimulation zur Bildung von hyalinartigem
Knorpel nachweisen. Die Behandlung chondraler Defekte führte nach Implantation von
zellbesiedelten Membranen nach sechs Wochen zur Produktion von Gelenkknorpel mit
glatten und intakten Oberflächen, während unbehandelte Defekte eine Auffüllung mit
Faserknorpel oder fibrösem Gewebe mit oberflächlichen Unregelmäßigkeiten erfuhren.
NEHRER et al. (1997) untersuchten die Auswirkungen verschiedener Kollagentypen auf die
Besiedlung mit Chondrozyten. Während bei der Anwendung von Kollagen Typ II 70 % der
Chondrozyten die kugelige Form des chondrozytären Phänotyps reexprimierten, wiesen die
meisten Zellen bei Anwendung von Kollagen Typ I eine fibroblastenartige, langgestreckte
und abgeflachte Morphologie auf.
Die schnelle Degradationsrate, die alle natürlichen Trägermaterialien aufweisen, schränkt
nach WANG et al. (2005) die Anwendung von Kollagen als Biomaterial zur Behandlung von
Gelenkknorpeldefekten ein. JANSSON et al. (2000) schätzen die Anwendung als
Trägerkonstrukt sogar als ungeeignet ein, weil Kollagene innerhalb einer Knorpelschicht nicht
abgebaut werden können und demzufolge auf Dauer im Gewebe verbleiben. Sie stellen eine
präformierte, nicht im Sinne des hyalinen Knorpels strukturierte und damit als ungünstig zu
bewertende Kollagenstruktur dar. Nach FRENKEL u. DI CESARE (2003) sowie WILLERS
et al. (2005) kann durch die Implantation einer chondrozytenbesiedelten Kollagen-Matrix in
chondrale Defekte die Bildung von hyalinartigem Knorpel stimuliert werden, dessen
biochemische und mechanische Eigenschaften dem natürlichen Gewebe entsprechen.
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Literaturübersicht
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2.5.2.3. Hyaluronsäure
Die Hyaluronsäure, ein GAG der extrazellulären Matrix des Knorpelgewebes, zeichnet sich
durch ihre hervorragende Biokompatibilität und Biodegradierbarkeit aus. Die für den Einsatz
in der Knorpelregeneration notwendigen physiko-chemischen und strukturellen Eigenschaften
werden allerdings nur durch Quervernetzungen oder Esterverbindungen erreicht. Diese
Modifizierung des Biomaterials führt zu einer Verminderung der Biokompatibilität (GOA u.
BENFIELD 1994).
Durch die Anwendung von Hyaluronsäure als Trägergerüst für kultivierte Chondrozyten kann
die Bildung von nativem hyalinartigem Knorpelgewebe induziert werden (PAVESIO et al.
2003; NEHRER et al. 2006).
2.5.2.4. Alginat, Agarose
Bei diesen natürlichen Trägermaterialien handelt es sich um Polysaccharide, die aus braunen
Algen gewonnen werden. Sie können Anwendung als injizierbares Material oder als Hydrogel
finden. Durch den hohen Wassergehalt erlauben sie eine adäquate Diffusion von Nährstoffen
und Sauerstoff hin zu den Zellen und von Abfallprodukten und Carbondioxiden weg von den
Zellen (SÖNTJENS et al. 2006).
Alginat begünstigt in vitro die Chondroneogenese und den Erhalt des chondralen Phänotyps
im 3D-Kultursystem (WONG et al. 2001; HUNZIKER 2002; WANG et al. 2005). So können
dedifferenzierte Knorpelzellen in einer Alginat-3D-Kultur redifferenzieren und
mesenchymale Stammzellen bei entsprechenden mechanischen Bedingungen zu
Chondrozyten differenzieren (HUNZIKER 2002). Durch die schnelle Biodegradation und
eingeschränkte Biokompatibilität ist dieses Trägermaterial für die Knorpeltransplantation
nicht geeignet (PERKA 2000; WANG et al. 2005). Im Rahmen der Untersuchung von
FRAGONAS et al. (2000) konnte bei Kaninchen nach der Implantation dieses
Trägermaterials die Auffüllung entsprechender Läsionen durch fibröses Gewebe
nachgewiesen werden. Durch die Implantation als Zell-Matrix-Konstrukt werden z. T. starke
Fremdkörper- und immunologische Reaktionen induziert (HUNZIKER 2002).
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Literaturübersicht
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Agarose wird v. a. in In-vitro-Studien zur Untersuchung des Verhaltens von Chondrozyten
während der Kultivierung eingesetzt. Die schlechte Biodegradierbarkeit macht das Material
ungeeignet für die In-vivo-Anwendung im Rahmen des Knorpelersatzes. Die alleinige
Implantation in chondrale Defekte des Kniegelenkes beim Kaninchen führte in verschiedenen
Studien infolge von Fremdkörperreaktionen zur Hemmung spontaner Reparaturmechanismen
(RAHFOTH et al. 1998; FRENKEL u. DI CESARE 2003).
2.5.2.5. Chitosan
Chitosan ist ein deacetyliertes Derivat des Chitins, das aus den Schalen von Krustentieren und
den Zellwänden von Pilzen gewonnen wird. Zusammen mit Chondroitin-Sulfat bildet dieses
Polysaccharid ein Hydrogel. Wird Chitosan als Flüssigkeit injiziert, geliert diese bei
Körpertemperatur (FRENKEL u. DI CESARE 2003).
In vivo induziert dieses Biomaterial nur eine minimale Fremdkörperreaktion. Seine
antibakterielle Natur in vivo und in vitro beruht auf dem stimulatorischen Effekt gegenüber
Makrophagen und der chemotaktischen Wirkung für neutrophile Granulozyten (DI
MARTINO et al. 2005). Der kationische Charakter ist primär verantwortlich für die
elektrischen Interaktionen mit den anionischen GAG, Proteoglykanen und anderen negativ
geladenen Molekülen. Seine Biokompatibilität, vorhersagbare Porosität und Degradationsrate
sowie seine strukturelle Ähnlichkeit mit verschiedenen GAG des Gelenkknorpels macht das
Chitosan als Trägermaterial für das Cartilage Tissue Engineering interessant. Die Anwendung
in Kombination mit Alginat erhöht die Zellbindung und Proliferation in vitro im Vergleich
zur alleinigen Anwendung von Alginat. Während sich nach einer zweiwöchigen Kultivierung
von Chondrozyten auf Chitosan fibroblastenähnliche Zellen zeigen und im Verlauf von der
zweiten zur dritten Woche die Produktion von Kollagen Typ II sinkt, behalten die Zellen auf
einem Chitosan-Alginat-Composite ihre Morphologie und die Produktion des Kollagens Typ
II steigt an (ZHENSHENG u. ZHANG 2005). In Kombination mit Hyaluronsäure erweist sich
die Chondrozytenadhäsion, Proliferation und Synthese von Aggrecan und Kollagen Typ II als
signifikant höher als nur auf Chitosan. Eine weitere Anwendung kann dieses natürliche
Trägermaterial auch im Bereich des Knochen Tissue Engineering finden. Biokompatible und
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Literaturübersicht
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biodegradierbare Composites können mit Calciumphosphat, Hydroxylapatit oder Beta-
Tricalciumphosphat (ß-TCP) gebildet werden (DI MARTINO et al. 2005).
2.5.3. Synthetische Trägermaterialien
Viele natürliche Trägermaterialien sind aufgrund ihrer mangelnden mechanischen Stabilität
und ihrer schnellen Degradation für das Knorpel-Tissue-Engineering nicht geeignet. Alginat,
Agarose und Fibrin rufen z. T. starke immunologische Abwehrreaktionen bzw.
Fremdkörperreaktionen der umliegenden Gewebe hervor. Zudem erbrachte in vielen Studien
die Implantation dieser Biomaterialien nicht die gewünschte Auffüllung chondraler Defekte
mit hyalinem Knorpel, sondern mit dem mechanisch weniger beanspruchbaren Faserknorpel
(FRAGONAS et al. 2000; ZHENSHENG u. ZHANG 2005). Um diese beschriebenen
Nachteile der natürlichen Trägermaterialien zu umgehen, wurden auch Studien an
synthetischen Materialien durchgeführt, um deren Eignung für den Einsatz zur Behandlung
von Gelenkknorpeldefekten zu prüfen. Als großen Vorteil zeigte sich dabei die bessere
Kontrollierbarkeit von Form, Oberflächenbeschaffenheit sowie von mechanischen und
physiko-chemischen Eigenschaften. Viele der synthetischen Trägermaterialien verursachen
allerdings in vivo Entzündungsreaktionen (WANG et al. 2005). Der Schwerpunkt der
Forschung gilt derzeit Materialien wie Polyactid-Säure (PLA), Polyglykol-Säure (PGA),
Polyglykol-Polyactid-Kopolymere (PLGA), Polycaprolacton, Dacron, Teflon und
Karbonfasern.
2.5.3.1. Polyactid-Säure, Polyglykol-Säure, Polyglykol-Polyactid-Säure-Kopolymer
Polyactid-Säure (PLA) und Polyglykol-Säure (PGA) sind Polymere auf Karbohydratbasis und
bezüglich der chemischen Struktur ähnlich. Die Biodegradation erfolgt hauptsächlich durch
einen unspezifischen hydrolytischen Zerfall. Dabei können saure Abbauprodukte und
niedermolekulare Fragmente freigesetzt werden (HOFFMANN et al. 1997). Der Einsatz
dieser Materialien kann zellfrei (VON SCHROEDER et al. 1991; NIEDERAUER et al. 2000)
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Literaturübersicht
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oder mit in-vitro kultivierten Chondrozyten (FREED et al. 1994; CHU et al. 1995) erfolgen.
Im Rahmen einer Studie mit chondrozytenbesiedelter PGA konnte bei Schweinen nach 24
Wochen die Auffüllung chondraler Defekte durch hyalinartiges Knorpelgewebe
nachgewiesen werden, das histologisch, mechanisch und biochemisch dem nativen Gewebe
entsprach (FRENKEL u. DI CESARE 2003). Auch andere In-vitro- und In-vivo-Studien
wiesen den Erhalt des chondrozytären Phänotyps und die Produktion einer
knorpelspezifischen ECM nach (KUO et al. 2006), wobei die Knorpelzellen auf PGA etwa
doppelt so schnell wachsen wie auf PLA (FREED et al. 1993). Nach längeren
Beobachtungszeiträumen wurde eine vermehrte Fibrosierung des Knorpelregenerates
beschrieben (SHAPIRO et al. 1993). Die Beurteilung der Biokompatibilität und
Biodegradierbarkeit reicht von akzeptabel (VON SCHROEDER et al. 1993) bis schlecht
(ATHANASIOU et al. 1996; HUNZIKER 2002). Entsprechend der Studie von KUO et al.
(2006) konnten GRANDE et al. (1997) im Vergleich zu Kollagenträgern sowohl für PGA als
auch für PLA eine deutlich bessere Förderung von Proteoglykanen nachweisen sowie eine
gesteigerte Chondrozytenproliferation, -differenzierung und -reifung.
Das Kopolymer Polyglykol-Polyactid-Säure (PLGA) ist ebenfalls biokompatibel. Der Abbau
kann mehrere Wochen bis Jahre dauern. Die dabei entstehenden Degradationsprodukte sind
natürliche Metaboliten und daher nicht-toxisch (KANG et al. 2005). Mit Hilfe
chondrozytenbesiedelter PLGA-Polydioxanon-Vliese konnten PERKA et al. (2000) die
Ausheilung tiefer Knorpeldefekte mit hyalinartigem Knorpelgewebe erreichen. Die
Degradation des Trägermaterials erfolgte dabei langsamer als die simultane Synthese
knorpelspezifischer Matrixmoleküle, so dass über den Beobachtungszeitraum von 4 bis 12
Wochen zu jedem Zeitpunkt eine ausreichende Transplantatintegrität vorhanden war.
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Literaturübersicht
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2.5.3.2. Dacron, Teflon, Karbonfasern
Dacron, Teflon und Karbonfasern gehören zur Gruppe der nicht resorbierbaren
Biomaterialien. Diese fehlende Biodegradierbarkeit stellt einen großen Nachteil der
artifiziellen Polymere dar (O´DRISCOLL 1998). Der Einsatz von Dacron und Teflon beim
Kaninchen erbrachte eine hohe Variabilität hinsichtlich des entstehenden Ersatzgewebes. Dies
reichte von einer insuffizienten Knorpelregeneration bis hin zu hyalinartigen Geweben
(MESSNER 1993). Im Bereich der Humanmedizin führte die Implantation dieser Stoffe
postoperativ zu einem erhöhten Auftreten von Einschränkungen der Gelenkbeweglichkeit
(DEFRERE u. FRANCKART 1992).
Der experimentelle Einsatz von Karbonfasern zur Behandlung chondraler Defekte wurde
ebenfalls beschrieben. Diese können aber immunologische Reaktionen verursachen und zur
Anhäufung von Fremdkörperriesenzellen im Gewebe sowie zur Entwicklung einer Synovitis
mit entsprechenden Schmerzreaktionen führen (PARSON et al. 1985; MORTIER u.
ENGELHARDT 2000).
Die beschriebenen natürlichen und synthetischen Trägermaterialien führen in der Regel mit
oder ohne Zellbesiedlung zur Auffüllung von Gelenkknorpeldefekten durch knorpelartige
Ersatzgewebe. Die histologischen, mechanischen und biochemischen Eigenschaften dieser
Gewebe entsprechen dabei mehr oder weniger denen des hyalinen Knorpels. Durch Traumata,
Stoffwechselstörungen und generelle Alterungsprozesse entstehende Gelenkknorpeldefekte
betreffen nicht selten auch den subchondralen Knochen. Daher ist häufig der Einsatz von
Knorpel- und Knochenersatzmaterialien indiziert. Im folgenden Abschnitt wird zunächst auf
mögliche Knochenersatzstoffe und deren Eigenschaften eingegangen.
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Literaturübersicht
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2.6. Einsatz von Biomaterialien bei der Behandlung von osteochondralen Defekten
2.6.1. Transplantateigenschaften von Knochenersatzstoffen
Indikationen für den Einsatz von Knochenersatzstoffen stellen neben den osteochondralen
Defekten segmentale Knochenverluste und Pseudarthrosen nach Frakturen, rekonstruktiven
Eingriffen oder Tumorexzisionen dar. Für Materialien, die als solche Stoffe eingesetzt werden
sollen, gelten eine Reihe von Anforderungen, die erfüllt werden sollten (WIPPERMANN
1996; PERKA 2000; MOORE et al. 2001):
1) Biokompatibilität
Die Biokompatibilität stellt die Verträglichkeit mit dem körpereigenen Gewebe sicher,
so dass es nach der Implantation zu keinen Abstoßungsreaktionen kommt.
2) Osteokonduktion
Das eingebrachte Material dient als Matrix für das einwachsende ortsständige
Knochengewebe. Der Prozess der Osteokonduktion schließt die Differenzierung und
Reifung der einwachsenden Zellen ein. Idealerweise wird dabei das eingebrachte
Material „schleichend“ substituiert und der neugebildete Knochen funktioneller
Bestandteil des Skeletts.
3) Osteoinduktion
Die Osteoinduktion umfasst die Bildung neuen Knochens durch die Rekrutierung
pluripotenter Zellen, welche in Chondro- sowie Osteoblasten differenzieren und
nachfolgend neuen Knochen bilden. Die Steuerung erfolgt durch osteoinduktive
Proteine (Bone Morphogenetic Proteins [BMP], basischer Fibroblastenwachstums-
faktor [FGF], Insulin-like Growth Factor [IGF], Platelet Derived Growth Factor
[PDGF] u. a.).
4) Biodegradierbarkeit
Zur Erhaltung der Stabilität ist eine geringe und langsame Biodegradierbarkeit
wichtig. Der Abbau kann biochemisch, physikalisch, humoral oder zellulär erfolgen,
wobei alle Wege auch kombinierbar sind. Die Degradation des Knochenersatzstoffes
sollte mit einer gleichzeitigen Osteogenese im proportionalen Ausgleich stehen, um
eine mechanische Schwächung des Transplantates zu vermeiden.
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Literaturübersicht
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5) Sterilisierbarkeit
Für die klinische Anwendung ist die Sterilisierbarkeit der entsprechenden Materialien
unerlässlich.
6) Verfügbarkeit
Das Material sollte reproduzierbar in eine dreidimensionale Struktur gebracht werden
können.
7) Biomechanische Stabilität
Nur eine gewisse strukturelle und biomechanische Stabilität erlaubt den Einsatz eines
Biomaterials zur Behandlung chondraler Defekte in vivo. Einwirkende Kräfte sollten
nicht zur unmittelbaren Zerstörung des Materials führen.
Für die intrakorporale Integration eines Knochenersatzstoffes gibt es verschiedene
Möglichkeiten. Sie kann durch Resorption mit anschließendem Remodelling des vitalen
ortsständigen Knochens erfolgen. Ebenfalls möglich ist die reizlose Integration des Materials
im Knochen ohne oder mit nur geringem Ab- und Umbau (Verbundosteogenese,
Osseointegration). Reagiert das umliegende Gewebe mit einer Fremdkörperreaktion, kommt
es zur bindegewebigen Einscheidung des Ersatzstoffes mit einer narbigen Stabilisierung des
knöchernen Defektes (Fibrointegration). Im ungünstigsten Fall tritt eine Infektion auf, die
einen teilweisen oder totalen Verlust des Knochenersatzmaterials zur Folge haben kann
(FOITZIK u. STAUSS 1999).
Neben natürlichen (z. B. Hyaluronsäure und Kollagen) und synthetischen Materialien (z. B.
PLA, PGA, PLGA), die bereits in den Kapiteln 2.5.2. und 2.5.3. beschrieben worden sind, ist
auch der Einsatz von Metallen wie Edelstahl, Titanium oder Titanium-Legierungen möglich
(KARAGEORGIOU u. KAPLAN 2005). Keines dieser Materialien erfüllt jedoch
zufriedenstellend die Anforderungen, die an ein Knochenersatzmaterial gestellt werden.
Einen weiteren Ansatzpunkt stellen die seit Ende der 70er Jahre hergestellten mineralischen
Knochenersatzstoffe aus synthetisch hergestellten und porosierten Kalziumphosphaten (v. a.
Tricalciumphosphat [TCP] und Hydroxylapatit [HA]) dar.
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Literaturübersicht
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2.6.2. Kalzium-Phosphat-Keramiken
Kalzium-Phosphat-Keramiken sind chemisch und physikalisch charakterisiert durch die
Kristallstruktur, die Granulatpartikelgröße (0,2-2,0 mm), den Makro- (> 0,1 mm) und
Mikroporenanteil (< 0,005 mm). Die biomechanische Stabilität dieser Stoffe ist vergleichbar
mit der von spongiösem Knochen.
Die Biostabilität dieser Materialien im lebenden Organismus ist im Wesentlichen von zwei
Mechanismen abhängig. Zum einen betrifft dies Auflösungserscheinungen ohne die
Beteiligung von Zellen wie z. B. Hydrolyse, zum anderen die Phagozytose mit nachfolgenden
intrazellulären Abbauvorgängen. Durch die physikalisch-chemische Auflösung der Brücken
zwischen einzelnen Partikeln der Keramik werden Kalzium-Phosphat-Teilchen aus dem
Verbund gelöst, von Zellen phagozytiert und intrazellulär abgebaut. Mit zunehmender
Makroporosität steigt die Degradationsrate der Keramik an. Die biokompatiblen Stoffe gehen
einen direkten Verbund mit dem ortsständigen Knochen ein. Dichtere Modifikationen weisen
keine sichtbaren Auflösungs- oder Abbauerscheinungen auf, während hochporöse dagegen
aufgrund ihres geringeren Abstandes der einzelnen Poren untereinander sichtbare
Degenerationserscheinungen aufweisen (OCHSNER et al. 1983). Im Organismus stehen die
Kalzium-Phosphate immer in Kontakt mit der Interzellularsubstanz, so dass es zu
Auflösungserscheinungen an der Oberfläche kommt. Dabei ist die Stärke der Auflösung
abhängig vom Löslichkeitsprodukt. In-vitro-Studien zeigten eine 12-22 mal größere
Löslichkeit von TCP im Vergleich zu HA (DRISKELL et al. 1973). Zusätzlich unterliegen
TCPs teilweise auch dem zellulären Abbau (OSBORN 1985).
Im Folgenden sollen die Eigenschaften der Kalzium-Phosphat-Keramiken Hydroxylapatit und
Tricalciumphosphat im Organismus sowie deren möglicher Einsatz bei der Therapie
osteochondraler Defekte näher beschrieben werden.
2.6.2.1. Hydroxylapatit
Dieses Kalzium-Phosphat stellt eine Mineralkomponente des natürlichen Knochens dar und
kann vollsynthetischen Ursprungs, aus Algen gewonnen oder tierischer Herkunft sein.
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Literaturübersicht
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Während SOBALLE et al. (1992) diesem Knochenersatzstoff eine gute osseointegrative
Eigenschaft zuschreiben, bezeichnen VAN SUSANTE et al. (1998) ihn als ungeeignete
Substanz. Der Abbau von Hydroxylapatit im Organismus erfolgt durch
Fremdkörperriesenzellen, die allerdings nur in der Lage sind, kleine Mengen zu resorbieren.
Größere Partikel des Kalziumphosphates können nach GUO et al. (2004) bis zu 10 Jahre im
Körper verbleiben. Bei direktem Kontakt dieses Trägerstoffes mit Knochengewebe kann der
Abbau auch durch Osteoklasten erfolgen (WIPPERMANN 1996).
In Fibrinkleber suspendierte Chondrozyten wurden auf das Hydroxylapatit gegeben und
anschließend in Defekte des Kniegelenkes von Ziegen transplantiert. Vier Wochen post
operationem zeigten sich Inseln hyalinartigen Knorpels im Bereich des Hydroxylapatit-
Kleber-Überganges. Um den Träger selbst bildete sich aber fibröses Gewebes. Die dadurch
bedingte schlechte Integration des Kalzium-Phosphat-Trägers in den Defekt führte zur
Instabilität der Verbindung zwischen Implantat und Empfängerorganismus, infolgedessen es
zu einem graduellen Verlust des neu entstandenen hyalinartigen Knorpelgewebes kam. Ein
Jahr später wies das Gewebe einen vollständig fibrokartilaginären Charakter auf und der
Knochenersatzstoff war nur noch in Teilen nachweisbar. Neben der schlechten
Biodegradierbarkeit konnte gegenüber der physiologischen Knorpelreparatur ein nur wenig
verbessertes Regeneratgewebe festgestellt werden. SUOMINEN et al. (1996) konnten im
Tierversuch nach der Implantation von nativem Hydroxylapatit in Kniegelenkdefekte einen
hohen Anteil an hyalinem Knorpelregenerat aufweisen, jedoch war der Beobachtungszeitraum
mit 12 Wochen sehr kurz.
2.6.2.2. phasenreines Beta-Tricalciumphosphat als keramische Matrix
Die Alpha(α)- und Beta(ß)-Phasen des Tricalciumphosphates sind chemisch identisch,
verhalten sich aber im physiologischen Milieu unterschiedlich. Während das α-TCP einer
langsamen Resorption unterliegt und auch noch nach Jahren im Knochen nachweisbar ist,
wird das ß-TCP innerhalb von 8-12 Monaten vollständig resorbiert und durch natürlichen
Knochen ersetzt (FOITZIK u. STAUSS 1999; MOORE et al. 2001; GUO et al. 2004).
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Literaturübersicht
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Das vollsynthetisch hergestellte ß-TCP Cerasorb ® mit einer Phasenreinheit von > 99 %
zeichnet sich durch seine interkonnektierende Porosität aus, die das Einwachsen des
Knochens ermöglicht. Die osteokonduktive Wirkung dieses Kalzium-Phosphates regt den
Knochen zum direkten Einwachsen in seine durchgehenden Poren an bevor der
Resorptionsvorgang beginnt und fungiert so als Leitschiene für die Knochenneubildung. Die
Biokompatibilität des Materials gewährleistet das Ausbleiben ungünstiger Gewebereaktionen
oder immunologischer Abwehrreaktionen. Das Material wird ohne bindegewebige
Abkapselung oder pathologische Gewebeveränderungen sehr gut in den natürlichen Knochen
integriert. Das ß-TCP wird vollständig abgebaut, wobei die Resorptionsrate der
Knochenneubildung angepasst ist. Neben der physiko-chemischen Löslichkeit erfolgt der
Abbau durch Fremdkörperriesenzellen, Osteoklasten und Makrophagen. Damit werden
bestehende Lücken in den interkonnektierenden Porenverbindungen erweitert und
geschlossene interporöse Septen durchbrochen. Je nach Durchmesser der Poren und Grad der
Porositäten ist das Resultat im Vergleich mit anderen porösen Keramiken ein schnellere
knöcherne Durchbauung (SOOST 2000). Die homogene Struktur aus Makro- und Mikroporen
bewirkt eine starke Kapillarwirkung und damit die Benetzung der so deutlich vergrößerten
Oberfläche mit Blutbestandteilen und Zellen mit osteogener Potenz. Das interkonnektierende
Mikroporensystem und v. a. die Makroporen werden von einem kollagenen Fasergeflecht
durchzogen und von Blutgefäßen erschlossen. Die Kollagenfasern übernehmen eine
Leitschienenfunktion für Blutgefäße und den sich neu bildenden Knochen. Die stark
vergrößerte Oberfläche bietet ebenfalls mehr Kontaktfläche für die zelluläre Resorption und
resultiert in einer kürzeren Degradationszeit. Der überwiegend auf chemischer Löslichkeit
beruhende Abbau führt am Einsatzort und in der Umgebung zu keinem Zeitpunkt zu
zellschädigenden oder unphysiologischen pH-Werten. Bei der Degradation durch
hydrolytische Prozesse werden Ca- und Phosphat-Ionen im physiologischen Verhältnis frei
und stehen am Ort des knöchernen Aufbaus als eine Art Substratüberschuss zur Verfügung
(FOITZIK u. STAMM 1997). Der Grad der Phasenreinheit des ß-TCP korreliert unmittelbar
mit der Geschwindigkeit, mit der das Implantat in vivo ab- bzw. umgebaut wird. Nur mit
einer phasenreinen Keramik ist ein kontrollierter Regenerationsprozess im Bereich des
Knochens möglich (KLEIN et al. 1984). Die Biokompatibilität dieses Materials beruht auf der
Bioaktivität. Bei Einsatz des Implantates in den Defekt kommt es zur Verbundosteogenese
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Literaturübersicht
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mit flächenhaftem, direktem Knochenanwuchs ohne Bildung einer Zwischenschicht
(POSNER 1985).
Neben der bisherigen klinischen Anwendung als Knochenersatzmaterial (FOITZIK u.
STAMM 1997; HAUSCHILD et al. 2000; MERTEN et al. 2000; ERBE et al. 2001) führten
GUO et al. (2004) eine Studie zur Eignung des ß-TCP als Ersatzmaterial bei osteochondralen
Defekten durch. Sie besiedelten ß-TCP-Träger mit autologen mesenchymalen Stammzellen
und implantierten das Konstrukt in osteochondrale Defekte. Nach 24 Wochen konnte im
Vergleich zur fehlenden spontanen Knorpelreparatur bei leeren Kontrolldefekten
neugebildetes hyalinartiges Knorpelgewebe in den Defekten mit guter Verbindung zum
angrenzenden normalen Knorpel und subchondralen Knochen nachgewiesen werden.
Um ausreichend autologe Knorpelzellen für die Besiedlung von Trägermaterialien zur
Verfügung stellen zu können, wird i. d. R. die In-vitro-Vermehrung der gewonnenen Zellen
notwendig. Mögliche Kultivierungsverfahren werden im Folgenden beschrieben.
2.7. Kultivierungsverfahren zur Vermehrung artikulärer Chondrozyten
Die Entwicklung komplexer bioartifizieller Organe gilt derzeit noch als problematisch. Einen
wesentlichen limitierenden Faktor stellt dabei die fehlende Vaskularisation bzw. hoch
problematische vaskuläre Erschließung und die folglich mangelhafte Sauerstoff- und
Nährstoffversorgung der künstlichen Gewebe dar (WALLES et al. 2003). Die dabei
verwendeten Zellen können autologen, heterologen oder xenogenen Ursprungs sein. Der
Vorteil der autologen Zellen besteht darin, dass zur Vermeidung einer Abstoßungsreaktion
keine Immunsuppression des Patienten notwendig ist. Es werden adulte gewebetypische
Zellen des Patienten entnommen, die allerdings häufig nur in begrenztem Umfang zur
Verfügung stehen. So wird in den meisten Fällen die Durchführung einer In-Vitro-
Zellvermehrung notwendig, die jedoch das Risiko der Dedifferenzierung der Zellen birgt
(GIERE 2005).
Um die in den vorhergehenden Kapiteln beschriebenen Trägermaterialien zur Behandlung
von Gelenkknorpeldefekten mit ausreichend autologen Knorpelzellen besiedeln zu können,
wird häufig nach der Entnahme dieser Zellen vom Patienten die kulturelle Vermehrung
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Literaturübersicht
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notwendig. Die verwendeten Kultivierungsverfahren müssen dabei die besondere Situation
der Chondrozyten im Gelenkmilieu berücksichtigen. Der fehlende Zell-Zell-Kontakt durch
die Einbettung in die Knorpelmatrix in vivo sollte imitiert werden. Zudem unterliegen die
Matrixmoleküle im Gelenkknorpel einer geringen Umsatzrate, so dass die Proteoglykane im
Kulturmedium eine vergleichsweise hohe Halbwertszeit aufweisen sollten (HUCH et al.
2002).
Prinzipiell werden zwei verschiedene Kultivierungstechniken für die Zellvermehrung
unterschieden. Die klassische zweidimensionale Kultivierung (z. B. Organ-, Auswuchs-,
Monolayerkultur) erfolgt in Zellkulturflaschen oder Petrischalen. Die Chondrozyten erfahren
dabei aber eine Dedifferenzierung, d. h. sie verändern sich in ihrer Morphologie und ihrem
Metabolismus. Dabei steigert sich der Verwandlungsgrad mit der Länge der Kulturdauer oder
Höhe der Passagezahlen. Als charakteristisch gelten eine hohe Zellproliferation
(Hyperproliferation), eine sich ändernde Zellform von runden zu spindelförmigen Zellen und
Störungen im Zellmetabolismus. Vor allem bei den artikulären Chondrozyten stellt die
Dedifferenzierung ein Problem dar, weil im Anschluss die Sezernierung von minderwertigem
Knorpel erfolgt. Dieser weist einen deutlich höheren Gehalt an Kollagen Typ I und auch III
auf als der native hyaline Knorpel (STARK et al. 1998; KAPS et al. 2004; MARLOVITS et
al. 2004a). Zusätzlich zeigen sich Veränderungen in der Zusammensetzung der
Grundsubstanz in Form eines verminderten Aggrecan- oder GAG-Gehaltes (SCHMIDT-
ROHLFING et al. 2004). Es findet eine Dedifferenzierung von hyalinem zu Faserknorpel im
Monolayer statt.
Die Durchführung der dreidimensionalen Kultivierung erfolgt in Matrices oder Flüssigkeiten
(z. B. Alginat, Agarose) und führt nicht zur Dedifferenzierung der Zellen (HÄUSELMANN et
al. 1992). Zuvor zweidimensional kultivierte Zellen erhalten die Möglichkeit der
Redifferenzierung. Ursächlich werden dafür die räumliche Anordnung der Zellen und das
Vorhandensein bestimmter Bestandteile der ECM im Kulturmedium diskutiert. Ein
entsprechender Nachweis steht jedoch noch aus (SCHMIDT-ROHLFING et al. 2004).
Zusammenfassend ermöglichen zweidimensionale Kultivierungsverfahren die rasche
Proliferation artikulärer Chondrozyten, so dass diese Form der Zellvermehrung bei sehr
geringen Knorpelmengen genutzt werden kann, um schnellstmöglich viele Zellen zu
gewinnen. Die Chondrozyten bleiben aber nur in dreidimensionaler Umgebung phänotypisch
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Literaturübersicht
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stabil. Der Erhalt des Phänotyps der artikulären Chondrozyten ist die Grundvoraussetzung für
die Sezernierung einer Knorpelmatrix, die der des nativen hyalinen Knorpelgewebes
entspricht. Ausschließlich diese Knorpelzellen sind in der Lage Kollagen vom Typ II zu
produzieren. Dedifferenzierte Zellen hingegen synthetisieren vor allem Kollagen vom Typ I
und III. Das dabei entstehende Knorpelgewebe ist funktionell minderwertig im Vergleich zum
hyalinen Knorpel. Durch den Transfer von zweidimensional vermehrten Zellen in
dreidimensionale Kulturen erfolgt der Rückgewinn ihres Phänotyps (HUCH et al. 2002).
Eine weitere Unterscheidung erfolgt zwischen statischer und dynamischer Kultivierung. Bei
der dynamischen Form (z. B. „Spinner culture“) erfolgt eine Belastung der Zellen während
der Entwicklung im Labor. Durch den mechanischen Einfluss werden die Chondrozyten
Kräften ausgesetzt, die tendenziell denen im Gelenk entsprechen und zur Erhaltung des
Phänotyps beitragen (ALTMAN et al. 2002; HUCH et al. 2002).
2.8. High Mobility Group Proteine
Die High Mobility Group (HMG) bezeichnet eine Familie von Nicht-Histon-Proteinen, deren
Namensgebung aus ihrer hohen Mobilität bei der Elektrophorese im Polyacrylamidgel
resultiert. Diese Proteine wurden ursprünglich aus Säugetierzellen isoliert, sind aber in
verschiedenen Zelltypen ubiquitär und in konstanten Mengen zu finden. Es erfolgt eine
Unterteilung in drei Unterfamilien, die jeweils mit Hilfe charakteristischer funktioneller
Elemente mit der Desoxyribonukleinsäure (DNA) bzw. dem Chromatin interagieren können:
HMG Box bindende Proteine (HMGB), HMG Nukleosom bindende Proteine (HMGN) und
HMG A(Adenin)T(Thymin)-Hook bindende Proteine (HMGA) (BUSTIN 2001; BLANK
2003). Diese Nicht-Histon-Proteine fungieren als Architekturelemente des Chromatins. Sie
besitzen die Fähigkeit, die Struktur ihrer Zielzellen zu modifizieren und somit strukturelle
Veränderungen der DNA bzw. des Chromatins zu induzieren, um so DNA-abhängige
Prozesse wie z. B. Transkription, Replikation, Rekombination oder DNA-Reparatur zu
erleichtern bzw. zu ermöglichen (WOLFFE 1994; BUSTIN u. REEVES 1996; BUSTIN
1999; KÖRNER 2004).
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Literaturübersicht
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2.8.1. HMGA Proteine
Derzeit sind vier Mitglieder der HMGA Proteinfamilie bekannt: HMGA 1a, b, c und
HMGA 2 (REEVES 2001). Als gemeinsames charakteristisches funktionelles Merkmal
besitzen sie drei identische, jedoch unabhängige DNA-bindende AT-Hooks. Diese tragen eine
positive Ladung und bestehen jeweils aus neun Aminosäuren, wobei die Aminosäuren Prolin-
Arginin-Glycin-Arginin-Prolin die Kernsequenz bilden, die von einer bestimmten Anzahl an
Lysinen und Argininen umringt wird, was wiederum einen Einfluss auf die Bindung ausübt
(ELTON et al. 1987; REEVES u. NISSEN 1990; ARAVIND u. LANDSMAN 1998). Die
bevorzugt an AT-reichen DNA-Sequenzen (AA(T/A)T) stattfindende Bindung mit dem AT-
Hook erfolgt an einer kleinen Furche der DNA (REEVES et al. 1987) und führt zu ATP-
(Adenosintriphosphat)-unabhängigen Strukturveränderungen des gebundenen Bereiches, die
vermutlich durch das gleichzeitige Binden der drei Domänen hervorgerufen werden
(KAPPES 2004). Entscheidender als die Sequenz scheint aber für die Bindung die Struktur
der DNA zu sein, da die HMGA Proteine bevorzugt an DNA-Abschnitte mit verdrehter oder
geknickter Anordnung binden (REEVES u. NISSEN 1993; LIU et al. 1999). Abhängig von
Sequenz, Organisation, Topologie oder Länge des DNA-Substrates kann die HMGA-Bindung
eine lineare DNA verbiegen, Verbiegungen und Knicke entfernen, entwinden oder Schleifen
bilden (CHASE et al. 1999; BAGGA et al. 2000; LIU et al. 2000)
HMGA Proteine sind an der Formierung sog. Enhancesomen (Multiproteinkomplexe)
beteiligt und spielen damit eine wichtige Rolle bei der Expression von Genen (BRUNETTI et
al. 2001). Sie können verschiedene Funktionen in diesen Enhancesomen ausüben, teilweise
durch Protein-Protein-Interaktionen, v. a. aber durch HMGA-DNA Interaktionen, die zu einer
DNA-Biegung führen (REEVES u. BECKERBAUER 2001). Die Proteine gehören zu den am
stärksten modifizierten Eiweißen im Zellkern. Die Modifikationen erfolgen durch
Phosphorylierungen, Acetylierungen, Methylierungen sowie Poly-ADP-
(Adenosindiphosphat)-Ribosylierungen und führen zu veränderten biologischen Aktivitäten
und Bindungsaffinitäten gegenüber ihren Substraten (NISSEN et al. 1991; REEVES et al.
1991; BANKS et al. 2000). Sie sind abhängig vom Zellzyklus und exogenen Einflüssen und
werden über verschiedene Kaskaden vermittelt. Bezüglich der funktionellen Auswirkungen ist
derzeit noch wenig bekannt (REEVES 2001).
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Literaturübersicht
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Hauptsächlich erfolgt die Expression von HMGA Proteinen in undifferenzierten oder
Embryonalzellen, während in ausdifferenzierten, nicht-proliferierenden Zellen und Geweben
nahezu keine Exprimierung nachweisbar ist. In vielen malignen Tumoren hingegen, wie z. B.
Prostatakarzinomen (BUSSEMAKERS et al. 1991), Schilddrüsenkarzinomen (KIM et al.
2000), Tumoren des Zentralnervensystems (GIANINI et al. 2000), Magenkarzinomen (NAM
et al. 2003) und Lungenkarzinomen (REEVES u. BECKERBAUER 2001), findet eine
Überexpression statt. Zudem konnten verschiedene Studien eine Korrelation zwischen dem
Ausmaß der Überexpression und dem Maligniditätsgrad sowie dem Metastasierungspotential
der Neoplasien nachweisen (GIANCOTTI et al. 1985; BUSTIN u. REEVES 1996;
BANDIERA et al. 1998; ABE et al. 2000).
2.8.2. HMGA 2-Protein
Das HMGA 2-Protein wird normalerweise fast ausschließlich in proliferierenden,
mesenchymalen, undifferenzierten Zellen im Laufe der Embryogenese exprimiert
(BUSSEMAKERS et al. 1991; ZHOU et al. 1995; CHIAPPETTA et al. 1996; ROGALLA et
al. 1996; ABE et al. 2000). Eine abnorme Expression des HMGA 2-Proteins ist zumeist mit
einer Veränderung des zellulären Wachstums und der Differenzierung verbunden. Im Rahmen
einer Studie an Mäusen konnten ZHOU et al. (1995) nachweisen, dass das Fehlen dieses
Proteins zum Zwergenwachstum (Pygmäenphänotyp) führt. Eine Überexpression hingegen
bewirkt unter anderem die vermehrte Bildung von Fettzellen, was darauf hindeutet, dass das
HMGA 2-Protein eine wichtige Rolle bei der Adipogenese spielt (ANAND u. CHADA 2000).
Ebenfalls konnte bisher in vielen benignen Bindegewebstumoren eine starke
Überexprimierung des Proteins nachgewiesen werden (BATTISTA et al. 1999; ARLOTTA et
al. 2000).
SCHLÜTER (2005) konnte im Rahmen der durchgeführten Studie proliferative Effekte des
HMGA 2-Proteins auf humane glatte Muskelzellen aufzeigen. Die exogene Applikation von
rekombinantem HMGA 2 induzierte einen signifikanten proliferativen Effekt.
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Literaturübersicht
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Die aufgeführten Studien haben gezeigt, dass das HMGA 2-Protein auf verschiedene Zellen
einen proliferativen Effekt ausüben kann. Diese Induktion der Zellvermehrung soll in der
eigenen Studie genutzt werden, um eine Proliferationsbeschleunigung der isolierten caninen
Chondrozyten während der Kultivierung zu erreichen und damit deren Dauer deutlich zu
minimieren.
2.9. Real-Time-Polymerasekettenreaktion in der Diagnostik
2.9.1. Ablauf des Prozesses der Polymerasekettenreaktion
Die Polymerasekettenreaktion (PCR; engl. Polymerase Chain Reaction) findet z. B.
Anwendung beim Nachweis von Bakterien und Viren mit spezifischen Primern, bei der
Erfolgskontrolle von Krebschemotherapien oder im Rahmen der Forensik bzw.
Gerichtsmedizin. Der Reaktionsprozess der PCR läuft in drei Schritten ab:
1) Denaturierung
Durch die Erhitzung der doppelsträngigen DNA auf 95 °C werden die
Wasserstoffbrückenbindungen, die die beiden DNA-Einzelstränge zusammenhalten,
aufgebrochen.
2) Primerhybridisierung (Primer Annealing)
Die für diesen Schritt benötigten Primer besitzen das gegengleiche Muster der DNA,
sind ca. 20-30 Nukleotide lang und binden an vorbestimmte Stellen. Dabei werden sie
an Anfang und Ende des spezifischen Abschnitts gesetzt. Nach der erfolgten Trennung
der beiden DNA-Einzelstränge wird die Temperatur gesenkt, so dass sich die Primer
an die einzelnen Stränge anlagern können. Die Temperatur während dieser Phase
richtet sich nach den verwendeten Primern und liegt in der Regel 2 bis 3 °C unterhalb
von deren Schmelzpunkt, der normalerweise 50 bis 65 °C beträgt. Eine falsch
gewählte Temperatur kann dazu führen, dass die Primer sich nicht (Temperatur zu
hoch) oder an falschen Stellen (Temperatur zu niedrig) an die Ausgangs-DNA
anlagern. Da die Primer im großen Überschuss zugegeben werden, kommt es praktisch
nicht zur Rückbildung des anfangs eingesetzten DNA-Doppelstranges.
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Literaturübersicht
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3) Elongation (Polymerisation, Verlängerung)
Während dieser Phase füllt die DNA-Polymerase die fehlenden Stränge mit freien
Nukleotiden auf. Das Enzym beginnt am 3´-Ende des angelagerten Primers und folgt
dann dem DNA-Strang. Der Primer wird nicht wieder abgelöst, da er den Anfang des
Einzelstranges bildet. Die notwendige Temperatur hängt von der verwendeten DNA-
Polymerase ab und liegt in der Regel zwischen 68 und 72 °C. Die Dauer dieser Phase
richtet sich nach der verwendeten DNA-Polymerase und der Länge des zu
vervielfältigenden DNA-Fragmentes.
Ein mehrfacher Ablauf des Prozesses ist durch die Änderung der Temperatur der
Reaktionsmischung möglich (STRYER 1996; WALTER u. FRANCKE 1998).
2.9.2. Das Prinzip der Real-Time-Polymerasekettenreaktion
Die Real-Time-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) stellt eine moderne Weiterentwicklung
der herkömmlichen PCR dar, bei der die nachzuweisende DNA in Echtzeit reproduzierbar
quantifiziert werden kann. Sie findet u. a. Anwendung zur Quantifizierung einer Virusmenge
(z. B. zur Überprüfung der Wirksamkeit von antiviralen Therapieversuchen) oder zur
Unterscheidung zwischen homozygoten und heterozygoten Zellen.
Während der RT-PCR wird auf Basis eines Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers (FRET)
ein Fluoreszenzsignal erzeugt, das sich proportional zum angereicherten DNA-Produkt
verhält (BRÜNING et al. 2001; WÜRTH 2004). Die Fluoreszenzsignale entstehen entweder
sequenzunspezifisch durch interkalierende Farbstoffe in der doppelsträngigen DNA oder
sequenzspezifisch durch Hybridisierung mit entsprechenden fluoreszenzmarkierten Sonden.
Bei der Interkalierung lagern sich Fluoreszenzfarbstoffe (z. B. Ethidiumbromid oder
SYBR ® Green) in die DNA ein bzw. binden an die doppelsträngige DNA. Die damit
verbundene Fluoreszenzzunahme korreliert mit der Zunahme der Ziel-DNA von Zyklus zu
Zyklus. Von Nachteil ist bei diesem sequenzunspezifischen Detektionssystem die geringe
Spezifität, da zwischen verschiedenen PCR-Produkten nicht unterschieden werden kann.
Nach Ablauf der PCR ist jedoch die Durchführung einer Schmelzkurvenanalyse möglich,
anhand derer die Fragmentlänge und dadurch die Spezifität bestimmt werden kann. Dafür
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Literaturübersicht
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wird die DNA aufgeschmolzen und im Anschluss die Temperatur langsam erniedrigt. Bei
einer für jede Sequenz typischen Temperatur bildet sich aus den Einzelsträngen wieder ein
Doppelstrang und die Fluoreszenz steigt an (WÜRTH 2004).
Für sequenzspezifische Detektionssysteme können verschiedene fluoreszenzmarkierte
Hybridisierungssonden zum Einsatz kommen. Das zugrunde liegende Prinzip beruht auf der
sehr sensiblen Reaktion der Fluorophore auf ihre Umgebung. Sie können durch benachbarte
Moleküle, besonders durch andere Chromophore „gequencht“, d. h. in ihrer Fluoreszenz
gemindert oder gar gelöscht werden. Umgekehrt können benachbarte Fluorophore ihre
Energie aufeinander übertragen (FRET). Folgende Sonden können unter anderem Anwendung
finden: LightCycler ® -Sonden, TaqMan ® -Sonden, Molecular Beacons und Skorpions Sonden.
• LightCycler ® -Sonden bestehen aus zwei verschiedenen, jeweils mit einem
FRET-Donor bzw. FRET-Akzeptor markierten Oligonukleotiden, die
nebeneinander an die Ziel-Sequenz binden und damit die Fluorophore in eine
für den FRET ausreichende Nähe bringen (Abb. 7a und 7b).
FRET-Donor FRET-Akzeptor
Abb. 7a: Primer, LightCycler ® -Sonden und Einzelstrang-DNA liegen
ungebunden vor. Die räumliche Trennung von FRET-Donor und FRET-
Akzeptor verhindert die Energieüberübertragung zwischen den beiden
Fluorophoren.
Primer Primer
Einzelstrang-DNA
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Literaturübersicht
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Abb. 7b: Die Bindung der LightCycler ® -Sonden an der Ziel-DNA führt zu einer
räumlichen Annäherung der Fluorophore mit entsprechender messbarer
Fluoreszenz.
• TaqMan ® -Sonden sind an einem Ende mit einem Quencher, am anderen mit
einem Reporter-Fluoreszenzfarbstoff markiert. Diese Sonden binden
zunächst am komplementären Zielstrang der DNA zwischen den
Primerbindungsstellen. Während der Elongation der PCR wird die
Hybridisierungssonde bei der Synthese des zweiten Stranges durch die
3´-Exonucleaseaktivität der Taq-Polymerase, ein hitzestabiles Enzym vom
thermophilen Bakterium Thermus aquaticus, in kleine Fragmente
geschnitten. Diese Bruchstücke werden aus dem Zielstrang freigesetzt, so
dass sich Reporter- und Quenchermolekül räumlich voneinander trennen.
Die zunehmende Reporterfluoreszenz kann gemessen werden. Da die Taq-
Polymerase ihre 3´-Exonucleaseaktivität nur am DNA-Strang entfaltet,
bleiben nicht-hybridisierte Sondenmoleküle unbeschadet und zeigen
demzufolge auch keine messbare Fluoreszenz (Abb. 8a, 8b, 8c).
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messbare Fluoreszenz
des Reporters

Literaturübersicht
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Quencher Reporter
Primer Primer
Abb. 8a: Primer, TaqMan ® -Sonden mit Reporter- und Quenchermolekül sowie
Einzelstrang-DNA liegen ungebunden vor.
Quencher
Einzelstrang-DNA
Taq-Polymerase
Abb. 8b: Die Sonden binden am komplementären DNA-Zielstrang zwischen den
Primerbindungsstellen. Erst im Anschluss kann die Taq-Polymerase ihre
3´-Exonukleaseaktivität am DNA-Strang entfalten.
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Reporter

Literaturübersicht
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Abb. 8c: Durch die Taq-Polymerase erfolgt eine Fragmentierung der
Hybridisierungssonde mit folgender Abkopplung vom DNA-Strang. Die so
entstehende räumliche Trennung zwischen Quencher- und Reportermolekül
führt zu einer messbaren Fluoreszenz.
• Molecular Beacons bestehen ebenfalls aus Oligonukleotiden, die sowohl mit
einem Reporter-Fluorophor als auch mit einem Quencher gekoppelt sind. Die
Sonden sind so konstruiert, dass die zum Zielstrang komplementäre Sequenz
(„Loop“) am 5´- und am 3´-Ende um einen selbstkomplementären
Sequenzabschnitt („Steam“) mit einer Basenlänge von ca. sechs Nukleotiden
erweitert ist und das Molekül dadurch eine Haarnadelstruktur erhält.
Reporter- und Quenchermolekül befinden sich am 3´- und 5´-Ende. Der
durch die Haarnadelstruktur der Sonde bedingte geringe Abstand zwischen
den beiden Molekülen führt zu einer Unterdrückung der Fluoreszenz (Abb.
9a). Lagert sich diese Schleifen-Region während des PCR-Zyklus an eine
komplementäre DNA-Sequenz an, vergrößert sich der Abstand zwischen
Quencher und Reporter und die Fluoreszenz wird messbar (Abb. 9b).
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messbare Fluoreszenz
des Reportermoleküls

Literaturübersicht
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Abb. 9a: Primer, Molecular Beacon und Einzelstrang-DNA liegen ungebunden
vor. Durch die Haarnadelstruktur der Sonde befinden sich Quencher- und
Reportermolekül in unmittelbarer Nähe mit entsprechender Unterdrückung der
Fluoreszenz.
Abb. 9b: Durch Anlagerung der Sonde am DNA-Einzelstrang werden Quencher-
und Reportermolekül räumlich voneinander entfernt und die Fluoreszenz wird
messbar.
Primer
„Steam“
Quencher
Einzelstrang-DNA
messbare Fluoreszenz
• Die komplexen Oligonukleotide der Skorpions-Sonden vereinigen die
Eigenschaften von RT-PCR-Sonden und PCR-Primern in einem (Uni-
Skorpions) oder zwei Molekülen (Bi-Skorpions). Ähnlich wie die Molecular
Beacons weisen auch diese Sonden eine charakteristische Sekundärstruktur
mit einer selbstkomplementären Schaft-Region auf, deren Enden mit
Reporterfluorophor und Quencher modifiziert wurden. Zusätzlich findet sich
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„Loop“
Primer
Reporter

Literaturübersicht
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„Steam“
am 3´-Ende ein PCR-Primer (Abb. 10a). Während des PCR-Zyklus kann mit
steigender DNA-Konzentration eine Reporter-Fluoreszenz durch Anlagerung
der Loop-Region an eine komplementäre DNA-Sequenz und damit
vergrößertem Abstand zwischen Quencher und Reporter beobachtet werden
(Abb. 10b).
Abb. 10a: Skorpionssonden und Einzelstrang-DNA liegen ungebunden vor.
Durch die Haarnadelstruktur der Sonde befinden sich Quencher- und
Reportermolekül in unmittelbarer Nähe mit entsprechender Unterdrückung der
Fluoreszenz.
Quencher
Uni-Skorpions Bi-Skorpions
„Loop“
Reporter
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Einzelstrang-DNA
Primer
Quencher Reporter
Primer

Literaturübersicht
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Abb. 10b: Durch Anlagerung der Sonde am DNA-Einzelstrang werden
Quencher- und Reportermolekül räumlich voneinander entfernt und die
Fluoreszenz wird messbar.
Im Gegensatz zu herkömmlichen PCR-Methoden wird bei Anwendung der RT-PCR die
gelelektrophoretische Auftrennung der Fragmente überflüssig. Durch die Messung der
entstehenden Fluoreszenz erfolgt bereits während des Prozesses der Nachweis der PCR-
Produkte und die Daten stehen somit sofort zur Verfügung (WÜRTH 2004). Bei Verwendung
der Hybridisierungssonden kann zudem das Anfärben mit dem gesundheitsschädlichen
Ethidiumbromid entfallen (BRÜNING et al. 2001).
Im Rahmen der eigenen Studie findet die RT-PCR keine Anwendung. Sie könnte jedoch in
folgenden Studien zur Bestimmung der Zellqualität eingesetzt werden. Mit Hilfe dieses
Verfahrens kann die Zusammensetzung der gebildeten Kollagene sowie die Ausbildung der
Proteoglykane Aggrecan und Versican untersucht werden, um Aussagen über die Qualität der
Chondrozyten und der von ihnen synthetisierten Matrix oder über deren eventuelle
Dedifferenzierung treffen zu können.
messbare Fluoreszenz
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Literaturübersicht
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2.10. Rasterelektronenmikroskopie zur Untersuchung und bildlichen Darstellung von
Oberflächenstrukturen
2.10.1. Funktionsweise des Rasterelektronenmikroskops
Nachdem es KNOLL und RUSKA 1931 gelang, das erste Elektronenmikroskop zu bauen,
konnte dies 1938 bereits erstmals serienmäßig von Siemens produziert werden. Zu den
Anwendungsbereichen der Rasterelektronenmikroskopie zählen v. a. Materialforschungen,
biologisch-medizinische Fragestellungen (morphologische Untersuchungen, Lokalisation von
Proteinen mittels Immunomarkierung), Schadensanalysen (Untersuchung von Bruchflächen),
die Kriminalistik (Vergleichsuntersuchungen an sehr kleinen Objekten) und
Qualitätskontrollen (Qualität von Bauelementen in der Halbleitertechnologie) (www.uni-
saarland.de).
Mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie können Oberflächenformen räumlich
strukturierter Objekte betrachtet und analysiert werden. Dazu wird ein Elektronenstrahl auf
einen Bereich extrem limitierter Ausdehnung der Probe gebündelt und durch Ablenkspulen
Zeile für Zeile wie nach einem Raster über das Objekt gelenkt (GIESE 1995; FLEGLER et al.
1997; GOLOB 2001). Der komplette Vorgang findet normalerweise im Hochvakuum statt,
um Wechselwirkungen mit Atomen und Molekülen in der Luft zu vermeiden. Das „Abtasten“
des Objektes mit dem Primärelektronenstrahl verursacht je nach chemischer
Zusammensetzung und Oberflächenneigung ein lokal unterschiedliches Herausschlagen von
niederenergetischen Sekundärelektronen (SE) aus der Objektoberfläche. Die SE werden durch
eine Saugspannung in Richtung des Detektors beschleunigt und erzeugen dort eine ihrer
Menge entsprechende Anzahl von Impulsen. Je nach Positionierung des Detektors in der
Probenkammer wird ein unterschiedliches Bild erzeugt. Der Standard-SE-Detektor ist seitlich
über der Probe angeordnet und liefert ein sehr natürliches, räumlich wirkendes Bild, weil die
dem Detektor zugewandte Seite des Objektes heller ist als die im abgewandte. Aus beiden
Seiten treten gleich viele Elektronen aus, aber die, die aus der abgewandten Seite austreten,
werden mit wesentlich geringerer Effizienz registriert und erscheinen im Bild daher dunkel
(GOLOB 2001). Die punktförmig aus der Objektoberfläche austretenden SE werden in
unterschiedlichen Mengen herausgeschlagen. Dadurch entstehen unterschiedlich große
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Literaturübersicht
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Videosignale mit entsprechender Helligkeit der Leuchtpunkte auf dem Monitor. Die
Zeilenablenkung auf dem Monitor verläuft synchron mit der Zeilenablenkung des
Elektronenstrahls im Rasterelektronenmikroskop (REM). Der Eindruck eines
dreidimensionalen Oberflächenbildes der Probe wird zudem dadurch erzeugt, dass aus schräg
zum einfallenden Elektronenstrahl verlaufenden Flächen weniger Sekundärelektronen
austreten, die im Monitorbild abgeschattete Bilder darstellen. Rückstreuelektronen (RE) sind
Elektronen aus dem Primärstrahl, die an den getroffenen Atomkernen der Probenoberfläche
elastisch reflektiert werden. Die Energie der RE liegt im Bereich der eingestrahlten
Primärelektronen. Die Bildauflösung liegt je nach Höhe der Primärenergie im
Mikrometerbereich. Der RE-Detektor ist in der Regel als Vier-Quadranten Halbleiter-
Detektor direkt oberhalb der Probe platziert. Abhängig von der Beschaltung der
Halbleiterkristalle erhält man unterschiedliche Topographiekontraste, tiefliegende
Objektbereiche erscheinen dunkel (www.wikipedia.org). Das Auflösungsvermögen von
Abbildungen mittels RE ist erheblich schlechter als von solchen, die mit Hilfe von SE erzeugt
werden (GOLOB 2001).
Die hohe Auflösung ermöglicht es, strukturelle Details mit Abmessungen um 1 Nanometer
(nm) bei elektrisch gut leitenden Proben darzustellen. Bei elektrisch isolierenden und
strahlungsempfindlichen Materialien liegt das Auflösungsvermögen um 5 nm (GIESE 1997).
Der nutzbare Vergrößerungsbereich liegt bei fünf- bis 100000fach. Im Vergleich zum
Lichtmikroskop kann ein ca. 100fach besseres Auflösungsvermögen erreicht werden, die
mögliche Tiefenschärfe ist sogar um Faktor 300 besser (FLEGLER et al. 1995; GIESE 1997).
Mögliche Anwendungen stellen morphologische Untersuchungen im Bereich von Biologie
und Medizin dar sowie Oberflächenbeurteilungen, Materialuntersuchungen wie z. B.
Keramiken, moderne Verbundwerkstoffe und Metallegierungen sowie Schadensanalyen wie
z. B. die Untersuchung von Bruchflächen (FLEGLER et al. 1995).
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Literaturübersicht
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2.10.2. Physikalisch-technische Grundlagen der Rasterelektronenmikrokopie
Die Erzeugung des Elektronenstrahls erfolgt in einer Energiequelle, die zumeist aus einem
haarnadelförmig gebogenen Wolfram-Draht und einer Bündelungselektrode
(Wehneltelektrode) besteht. Durch Erhitzung erfolgt die Emission von Elektronen, die
anschließend in einem zwischen Quelle und Anode gelegenen elektrischen Feld (Spannung
200 bis 30000 Volt) beschleunigt werden (FLEGLER et al. 1995; GIESE 1997; GOLOB
2001). Mit Hilfe von Magnetspulen wird der Primärelektronenstrahl auf einen Punkt auf dem
Objekt fokussiert und anschließend zeilenweise über die Oberfläche geführt (Rasterung).
Damit ein möglichst kleiner Abtastfleck des Elektronenstrahls von ca. 3 nm Durchmesser auf
dem Objekt erzeugt wird, wird noch eine Endlinse (strahlformierende Linse) zwischen
Magnetspulen und Objekt eingebracht (GIESE 1997; GOLOB 2001). Eine Konsequenz des
schlanken abbildenden Elektronenstrahls ist die, dass sich sein Durchmesser nur geringfügig
mit der Höhe über der Probe ändert. Proben mit Objektdetails in unterschiedlichen Höhen
werden demnach überall von einem Strahl etwa konstanten Durchmessers getroffen und daher
scharf abgebildet (GOLOB 2001). Durch das Auftreffen des Elektronenstrahls auf dem
Objekt sind verschiedene Interaktionen möglich, deren Detektion Informationen über die
Beschaffenheit der Probe geben kann. Die Intensität des detektierten Signals an dem Punkt,
auf den der Elektronenstrahl fokussiert ist, wird als Grauwert in dem entsprechenden Pixel auf
dem Bildschirm dargestellt. Nach kurzer Zeit wird der Strahl zum nächsten Punkt bewegt und
die Messung wiederholt. So wird die Objektoberfläche zeilenweise analysiert. Das System
wird unter Vakuum gehalten, da sich ein wirksamer Elektronenstrahl bei atmosphärischem
Druck nicht erzeugen lässt (FLEGLER et al. 1995).
Als meistgenutzte Informationsquelle dienen die zuvor beschriebenen SE. Sie haben eine
Energie von einigen Elektronenvolt (eV) und werden detektiert. Der Kontrastmechanismus
bei SE basiert darauf, dass in erhabenen Teilen des Objektes mehr Elektronen die Probe
verlassen und diese Bereiche daher hell erscheinen. Das Volumen, in dem SE herausgelöst
werden, ist vergleichsweise klein. Daher erlauben die erzeugten Bilder eine sehr hohe
Auflösung. Vom Objekt reflektierte Primärelektronen haben die Energie von einigen k-(Kilo)-
eV. Das Volumen, in dem es zu derartigen Interaktionen kommt, hängt stark von der
Beschleunigungsspannung und vom Objektmaterial ab. Daher haben RE-Bilder eine
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Literaturübersicht
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schlechtere Auflösung. Tiefliegende Objektbereiche erscheinen dunkel. Zusätzlich hängt die
Intensität von der Ordnungszahl des Elementes ab. Schwerere Elemente sorgen für eine starke
Rückstreuung und entsprechende Bereiche erscheinen hell. Dies ermöglicht Rückschlüsse auf
die chemische Natur des Objektmaterials (www.wikipedia.org).
2.10.3. Anwendung der Rasterelektronenmikroskopie im Rahmen des Tissue
Engineerings
Für die Anwendung des REM finden sich im Rahmen des Tissue Engineerings verschiedene
Indikationen. So erfolgt der Einsatz beispielsweise zur Untersuchung von Zellmorphologien
(YAMANE et al. 2005) und Mikrostrukturen verschiedener Knorpel- oder
Knochenersatzstoffe (GELINSKY et al. 2004; SÁNCHEZ-SALCEDO et al. 2006) sowie zur
Bewertung der Dichte und Integration von Chondrozyten, die auf Trägermaterialien
aufgebracht wurden (WILLERS et al. 2005).
In der Regel erfolgt die Probenfixierung mit Glutaraldehyd und Phosphat-Puffer für
unterschiedlich lange Zeiträume (einige Stunden bis mehrere Tage). Nach einer
durchgeführten Spülung wird die Probe erneut mit Osmiumtetroxiden (OsO4) fixiert, um im
getrockneten Zustand der Untersuchung mittels Rasterelektronenmikroskopie zugeführt zu
werden (PARK et al. 2005; SOLCHAGA et al. 2005; WILLERS et al. 2005; YAMANE et al.
2005).
2.11. Studienspezifische Anwendung der dargestellten Verfahren
Die National Science Foundation definierte 1988 das Tissue Engineering als Anwendung von
Prinzipien und Methoden der technischen Entwicklung und der Biowissenschaften zum
Zwecke eines besseren Verständnisses der Beziehungen von Struktur und Funktion in
gesunden und pathologisch veränderten Geweben und die Entwicklung eines biologischen
Ersatzes zur Wiederherstellung, Erhaltung oder Verbesserung der Gewebefunktion (DEBUS
2005).
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Literaturübersicht
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Die vorliegenden Ergebnisse zum Einsatz von zellbesiedeltem ß-TCP bei osteochondralen
Defekten erscheinen vielversprechend. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit werden
keramische Matrices aus ß-TCP mit einer Phasenreinheit von mehr als 99 % mit kultivierten
caninen Chondrozyten besiedelt. Im Anschluss erfolgt mit Hilfe der
Rasterelektronenmikroskopie die Untersuchung der Zellmorphologie sowie der Dichte und
Integration der Chondrozyten auf dem Trägermaterial. Zur Bestimmung der Zellqualität findet
im Rahmen einer anschließenden Studie die RT-PCR Anwendung. Es wird die
Zusammensetzung der gebildeten Kollagene sowie die Ausbildung der Proteoglykane
Aggrecan und Versican untersucht, um Aussagen über die Qualität der Chondrozyten und der
von ihnen synthetisierten Matrix oder über deren eventuelle Dedifferenzierung treffen zu
können.
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Material und Methoden
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3. Material und Methoden
3.1. Geräte und Bezugsquellen
Brand Plastibrand ® GmbH + Co, Wertheim
- Südlabor SL-Pette Autoclavable 10, 100, 1000 µl
- Glaspipette Brand 5, 10 ml
Jürgens / Omnilab, Bremen
- Vakuumpumpe mit Pasteurpipette
Menzel-Gläser, Braunschweig
- Haemacytometer (Neubauer-Zählkammer)
Polaron Equipment, Watford (England)
- Sputtercoater, Modell SC7640
Thermo Electron Corporation, Waltham, USA
- Forma Scientific Automatic CO2-Inkubator
- Heraeus LaminAir 2448 GS (Werkbank)
- Heraeus Sepatech Labofuge
Zeiss, Jena
- Lichtmikroskop Axioskop 2 Plus
- Digitalkamera Axiocam HR
- Rasterelektronenmikroskop, Modell 1530 VP
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Material und Methoden
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3.2. Reagenzien, Verbrauchsmaterialien und Bezugsquellen
Biochrom KG, Berlin
- Hanks-Medium
- PBS (Phosphate Buffered Saline)
Brand Plastibrand ® GmbH + Co, Wertheim
- Starlab TipOne 1-10, 1-100, 100-1000 µl
- Brand Pasteurpipetten
Curasan AG, Kleinostheim
- Cerasorb ® (Beta-Tricalciumphosphat-Zylinder)
Glaswarenfabrik Karl Hecht KG, Sondheim
- Elka-Assistent (Objektträger)
Invitrogen GmbH, Karlsruhe
- Medium 199
- TrypLE (Trypsin-Ersatz)
- Trypanblau-Stock
Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
- Glutaraldehyd 2 %
- Ethanol
- Phosphatpuffer-Lösung
Nalge Nunc International, Rochester, USA
- Kryoröhrchen 2 ml
Nunc, Wiesbaden
- Zellkulturflasche Nunclon
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Material und Methoden
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Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
- Fluoreszenzmarker DAPI (4´,6-Diamidino-2-phenylindol)
Sarstedt, Nümbrecht
- Kunststoffröhrchen 13 ml
- Plastikstopfen
Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg
- Collagenase NB8
VMR International GmbH, Darmstadt
- Methanol Normapur
3.3. Versuchsaufbau
Ingesamt werden fünf Cerasorb ® -Zylinder mit in der Zellkultur vermehrten Chondrozyten
besiedelt und weitere fünf Zylinder mit Knorpelspänen beschickt und anschließend inkubiert.
Für die Beurteilung des Zellwachstums auf und in den Zylindern werden je zwei Konstrukte
mit 4´,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) angefärbt. Nachdem je zwei weitere Zylinder mit
Trypanblau angefärbt wurden, um die Zellvitalität zu beurteilen, werden diese noch zusätzlich
mit DAPI behandelt. Je einer der Zylinder wird der Rasterelektronenmikroskopie zur
Bestimmung der Zellmorphologie zugeführt.
3.4. Isolierung, Expansion und Gewinnung der Knorpelzellen
3.4.1. Knorpelzellisolierung
Alle nachfolgend beschriebenen Arbeiten fanden in steriler Umgebung statt, d. h. sowohl die
Arbeit an den Werkbänken, die Verwendung von Gefäßen, Verbrauchsmaterialien, Medien
und Reagenzien erfolgte unter sterilen Kautelen. Der im Rahmen dieser Arbeit verwendete
canine Knorpel stammt von Patienten der Klinik für Kleintiere der Tierärztlichen Hochschule
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Material und Methoden
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Hannover sowie der Tierklinik Asterlagen, Duisburg-Rheinhausen. Er wird in Form von
Spänen, in Hanks-Medium gelagert, in einem 13 ml fassenden Kunststoffröhrchen geliefert.
Das Zellkulturmedium wird nach kurzem Herunterzentrifugieren der Knorpelspäne mit Hilfe
einer Vakuumpumpe mit einer über einen Gummischlauch angeschlossenen Pasteurpipette
abgesaugt, im Anschluss erfolgt die Waschung mit 10 ml Phosphate Buffered Saline (PBS).
Im Folgenden werden die Späne mit einer sterilen Pinzette in eine 25 cm² Zellkulturflasche
überführt. Nach Zugabe von 4 ml einer Mischlösung aus gleichen Anteilen Collagenase NB8
und Medium 199 (enthält 20 % fötales Kälberserum sowie 200 International Units (I.U.)/ml
Penicillin und 200 Milligramm (mg)/ml Streptomycin) erfolgt eine Inkubation bei 37 °C und
5 % Kohlendioxid (CO2) für mindestens sechs Stunden bis die Zellen aus den Spänen
herausgelöst sind. Während dieses Zeitraumes erfolgt eine mehrmalige Resuspension. Zum
Ende der Inkubation wird die Zellösung nochmals resuspendiert und der Überstand mit den
Zellen mit Hilfe einer Pipette in ein steriles 13 ml fassendes Kunststoffröhrchen überführt.
Anschließend werden die Chondrozyten bei 800 rpm abzentrifugiert und mit 10 ml Medium
199 gewaschen. Nach erneuter Zentrifugation werden die Zellen mit 5 ml Medium 199
resuspendiert und in eine 25 cm² Zellkulturflasche überführt. Es folgt wiederum eine
Inkubation bei 37 °C und 5 % CO2.
3.4.2. Zellkultur
Die Dauer der Inkubation der Chondrozyten bei 37 °C, 5 % CO2 und Medium 199 richtet sich
nach dem Fortschreiten der Expansion und erfolgt, bis etwa ¾ der Flasche bewachsen sind.
Dies nimmt etwa einen Zeitraum von einer halben bis einer Woche ein. Um die Ernährung
und damit das Überleben der Zellen gewährleisten zu können, ist es notwendig, während der
Phase der Inkubation zweimal wöchentlich einen Austausch des Zellkulturmediums
vorzunehmen. Nachdem das Medium über eine an eine Vakuumpumpe angeschlossene
Pasteurpipette abgesaugt worden ist, werden im Anschluss mit einer 5 ml Stangenpipette 5 ml
frisches Medium in die Zellkulturflasche gegeben.
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Material und Methoden
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3.4.3. Ernten der in Zellkultur vermehrten Knorpelzellen
Um die in der Zellkultur vermehrten caninen Knorpelzellen ernten zu können, wird zunächst
das Zellkulturmedium mit Hilfe einer an eine Vakuumpumpe angeschlossene Pasteurpipette
abgesaugt. Anschließend werden die Zellen mit 5 ml PBS gewaschen. Die Ablösung der
Chondrozyten von der Oberfläche der Zellkulturflasche erfolgt durch Zugabe von 1 ml
TrypLE (Trypsin-Ersatz). Die Zellösung wird anschließend wiederum in ein 13 ml fassendes
Kunststoffröhrchen überführt und es folgt eine Waschung der Chondrozyten mit 10 ml
Medium 199. Nach Resuspension der Zellen mit 2 ml Medium 199 erfolgt die Bestimmung
der Zellzahl mit dem Haemacytometer. Die Zellkonzentration wird über eine entsprechende
Verdünnung mit Medium auf 100000 Zellen / ml eingestellt. Eine Kontrolle der Zellzahl kann
im Anschluss erneut mit dem Haemacytometer erfolgen.
3.5. Besiedlung der Cerasorb ® -Zylinder
Die zu besiedelnden Cerasorb ® -Zylinder (Abb.11) bestehen aus ß-Tricalciumphosphat mit
einer Phasenreinheit von mehr als 99 %. Die Abmessungen dieser Konstrukte betragen 8,5 x
20 mm. Die Makroporen der Zylinder sind kreisrund und weisen einen Durchmesser von ca. 1
mm auf.
Abb. 11: Cerasorb ® -Zylinder in einer Zellkulturflasche
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Material und Methoden
___________________________________________________________________________
3.5.1 Besiedlung der Cerasorb ® -Zylinder mit in der Zellkultur vermehrten Zellen
Insgesamt werden fünf Cerasorb ® -Zylinder mit Zellen, die zuvor in Zellkulturen vermehrt
worden sind, besiedelt. Die verwendeten Zylinder haben ein Aufnahmevolumen von etwa
1,2 ml Flüssigkeit. Um eine möglichst dichte Besiedlung mit Zellen zu ermöglichen und um
zu verhindern, dass die Chondrozyten das Kulturgefäß anstatt des Zylinders besiedeln, wird
das Konstrukt jeweils in einem kleinvolumigen Gefäß mit Zellen beimpft. Zur Anwendung
kommen dabei Kryoröhrchen mit einem Fassungsvermögen von ca. 2 ml. Diese Röhrchen
sind somit nur wenig größer als das Konstrukt, so dass nur ein geringes Zellösungsvolumen
(ca. 1,5 ml) eingesetzt werden muss. Die Zylinder werden dabei mit der Seite ohne
Makroporen nach unten in die Kryoröhrchen überführt. Insgesamt werden jeweils zweimal
600 µl Zellösung (100000 Zellen / ml) durch die oberen Makroporen in die Zylinder gegeben,
so dass die Konstrukte mit der Zellösung gefüllt und überschichtet sind. Eventuell vorhandene
Luftblasen werden vorsichtig entfernt. Im Anschluss werden die Kryoröhrchen verschlossen.
Allerdings wurden, um einen Gasaustausch zu ermöglichen, die Deckel leicht gelockert
belassen. Es folgt eine Inkubation für mindestens sechs Stunden bei 37 °C und 5 % CO2,
damit sich die Zellen an das Konstrukt anheften können.
Danach werden die Cerasorb ® -Zylinder jeweils vorsichtig in eine Zellkulturflasche mit einem
entsprechenden Halter gegeben (Abb. 12).
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Material und Methoden
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Abb. 12:
Links: 13 ml-Kunststoffröhrchen mit in Hanks-Medium / 1.5 % Agarose fixiertem
Halter; überschichtet mit PBS, um ein Austrocknen des Gels zu verhindern.
Rechts: Zellkulturflasche mit in Hanks-Medium / 1.5 % Agarose fixiertem Halter;
überschichtet mit PBS, um ein Austrocknen des Gels zu verhindern.
Durch das größere Volumen in der Zellkulturflasche ist eine ausreichende Versorgung mit
Nährmedium sowie Sauerstoff gegeben. Das Konstrukt wird vorsichtig mit 15 ml Medium
199 überschichtet. Dabei ist darauf zu achten, das Zellkulturmedium nicht direkt auf den
Zylinder zu geben, sondern die Flüssigkeit am Gefäßrand in die Flasche laufen zu lassen. Auf
eine eventuelle Luftblasenbildung ist zu achten und diese gegebenenfalls durch leichtes
Schütteln der gefüllten Flasche zu beheben. Ebenso, wie beim Kryoröhrchen, ist auch bei der
Zellkulturflasche auf einen dichten Verschluss zu verzichten, um den Gasaustausch zu
ermöglichen. Im Anschluss wird die Flasche aufrecht in den Inkubator gestellt und bei 37 °C
und 5 % CO2 etwa eine Woche darin belassen. Nach Ablauf von jeweils drei Tagen ist das
Medium auszutauschen. Dafür wird das Zellkulturmedium über eine an eine Vakuumpumpe
angeschlossene Pasteurpipette abgesaugt und anschließend 5 ml frisches Medium zugegeben.
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Material und Methoden
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3.5.2. Beschickung der Cerasorb ® -Zylinder mit caninen Knorpelspänen
Ebenfalls fünf Cerasorb ® -Zylinder werden mit je zwei caninen Knorpelspänen variabler
Größe beschickt. Die dafür verwendeten Späne werden mit einer feinen Pinzette in die
Makroporen der Zylinder verbracht. Anschließend werden diese Konstrukte ebenfalls mit 15
ml Medium 199 überschichtet. Die Zellkulturflasche wird so verschlossen, dass ein
Gasaustausch weiterhin möglich ist. Die Flasche wird aufrecht in den Inkubator gestellt und
bei 37 °C und 5 % CO2 etwa eine Woche darin belassen. Nach Ablauf von jeweils drei Tagen
ist das Medium wie beschrieben auszutauschen.
3.6. Auswertung der Besiedlung und Vitalitätsnachweis der Zellen
3.6.1. Zellvitalitätstest mit Trypanblau
In der vorliegenden Studie wird die Färbung mit Trypanblau zum Nachweis toter Zellen auf
den Konstrukten angewendet. Hierbei handelt es sich um einen Farb-Ausschluss-Test, der bei
einer vitalen Zelle eine intakte Zellmembran voraussetzt, die das Eindringen des Farbstoffes
ins Zellinnere verhindert. Tote Zellen weisen eine permeable Memran auf, durch die der
Farbstoff ins Innere diffundieren kann und das Zytoplasma blau färbt. Hierfür wird zunächst
das Zellkulturmedium mit Hilfe einer Pasteurpipette aus der Flasche abgesaugt. Anschließend
wird das Konstrukt vorsichtig zweimal mit PBS gewaschen, um noch eventuell vorhandenes
Medium zu entfernen. Der Zylinder wird in ein passendes Gefäß (13 ml Kunststoffröhrchen)
überführt und mit einer 0,2 %igen Trypanblaulösung überschichtet. Dazu ist es notwendig,
1,5 ml des 0,4 %igen Trypanblau-Stocks mit 1,5 ml PBS zu verdünnen. Es folgt eine 15
minütige Inkubation bei Raumtemperatur. Die Trypanblaulösung wird mit Hilfe der
Vakuumpumpe und der daran angeschlossenen Pasteurpipette entfernt und eventuell
überschüssige Reste durch vorsichtige dreimalige Waschung des Konstruktes mit PBS
ebenfalls beseitigt. Der Zylinder wird auf einen Objektträger gelegt. Die mikroskopische
Auswertung und entsprechende Dokumentation erfolgt mittels Zeiss Axioskop 2 Plus und
Axiocam HR.
- 77 -

Material und Methoden
___________________________________________________________________________
Um die Zellmorphologie für die spätere Fixierung zu erhalten, ist darauf zu achten, dass das
Konstrukt nicht austrocknet. Eventuell wird dafür die Zugabe von PBS notwendig.
3.6.2. Fluoreszenzmikroskopie zur Beurteilung des Zellwachstums
Um das Zellwachstum auf und in den Zylindern beurteilen zu können, wurde eine
Fluoreszenzfärbung mit DAPI durchgeführt. Dieser Farbstoff gehört zur Gruppe der Indol-
Farbstoffe und wird zur DNA-Färbung, zur Kernfärbung sowie für die Färbung lebender
Zellen verwendet. Diese Färbung erfolgt im Anschluss an die bereits durchgeführte
Trypanblau-Färbung, um vitale Zellen, die mit dieser Färbung nicht sichtbar gemacht werden
konnten, anzufärben. Dafür wird das Konstrukt für 15 Minuten in einer
1 µg/ml DAPI-Methanollösung bei 37 °C inkubiert. Durch die Inkubation in dieser Lösung
werden die Zellen fixiert und permeabilisiert, so dass sie von DAPI angefärbt werden können.
Die Auswertung im Fluoreszenzmikroskop erfolgt mit Hilfe eines DAPI-Filters. Trypanblau-
gefärbte Zellen erscheinen dabei als dunkel gefärbt, während DAPI-gefärbte Zellen im
Fluoreszenzlicht leuchten. Die Dokumentation erfolgt mittels Axioskop 2 Plus und Axiocam
HR.
Anschließend wird das Konstrukt in ein Kryoröhrchen überführt und kann für eventuelle
spätere Auswertungen gelagert werden.
3.6.3. Rasterelektronenmikroskopie zur Bestimmung der Zellmorphologie
Mit Hilfe des Rasterelektronenmikroskopes wird die Morphologie der Zellen auf den
Cerasorb ® -Zylindern beurteilt. Nach Entfernung des PBS werden die besiedelten Konstrukte
zunächst durch Zugabe von Glutaraldehyd 2% in Phosphatpuffer für mindestens 6 Stunden
fixiert. Anschließend erfolgt die Entwässerung der Proben in aufsteigender Alkoholreihe.
Dafür werden die Konstrukte mindestens 2 x 15 Minuten in 30 %igem Ethanol, 2 x 15
Minuten in 50 %igem Ethanol, 2 x 15 Minuten in 70 %igem Ethanol , 2 x 15 Minuten in
80 %igem Ethanol, 2 x 15 Minuten in 90 %igem Ethanol, 2 x 15 Minuten in 96 %igem
Ethanol und 3 x 20 Minuten in 100 %igem Ethanol verbracht. Im Anschluss werden die
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Material und Methoden
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Konstrukte aus dem reinen Alkohol entnommen und grob abgetropft. Auf einem REM-Halter
aufgeklebt, kommen die Proben noch feucht in den Rezipienten des Sputtercoaters, der mittels
einer Drehschieberpumpe evakuiert wird. Über einen Zeitraum von 30 bis 60 Minuten
verdampft der gesamte Alkohol auch aus den kleinsten Ritzen der porösen Keramik. Im
Anschluß werden die Konstrukte mit ca. 6 nm Silber beschichtet und hiernach ins REM
eingeschleust.
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Ergebnisse
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4. Ergebnisse
4.1. Zellkultur-Kontrollen
4.1.1. Zellvitalitätsnachweis mit Trypanblau
In den Zellkultur-Kontrollen konnten sowohl rundliche als auch spindelförmige Zellen mit
Ausläufern differenziert werden. Neben Zellanhäufungen konnten auch zellfreie Bereiche
beobachtet werden. Die Zellgröße variierte zwischen etwa 10 bis 30 µm, die Zellen mit
Ausläufern erreichten Ausmaße bis 100 µm. Vereinzelt fanden sich blaue, rundliche und teils
abgeflachte Zellen, deren Größen zwischen 1 und 10 µm variierten (Abb. 13).
50 µm
Abb. 13: Zellkultur-Kontrolle; Trypanblau-Färbung (40er Objektiv, Belichtungszeit
229,64 ms)
4.1.2. Zellwachstumsnachweis durch Fluoreszenzfärbung mit DAPI
Gleichmäßig verteilt fanden sich auf dunklem Untergrund sowohl rundliche als auch
abgeflachte, leuchtend helle Zellen, deren Größen zwischen etwa 10 bis 20 µm variierten. Nur
vereinzelt konnten dazwischen dunkel gefärbte Zellen gleicher Größe protokolliert werden.
Kleinere Bereiche erwiesen sich als zellfrei (Abb. 14).
- 80 -

Ergebnisse
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Abb. 14: Zellkultur-Kontrolle; Trypanblau-Färbung, anschließend DAPI-Färbung (10er
Objektiv, Belichtungszeit 39,8 ms)
4.2. Cerasorb ® -Zylinder mit in der Zellkultur vermehrten caninen Chondrozyten
4.2.1. Zellvitalitätsnachweis mit Trypanblau
Auf der hellen, kristallin erscheinenden Zylinderoberfläche fanden sich gleichmäßig verteilt,
einzeln liegende, rundliche oder z. T. abgeflachte, hell- bis dunkelblau gefärbte Zellen ohne
erkennbare Zellausläufer (Abb. 15). Nur vereinzelt konnten auch kleinere zellfreie Bereiche
beobachtet werden. Die Ansiedlung von Zellen konnte bis an die Poren der Cerasorb ® -
Zylinder heran nachgewiesen werden. Die Zellgrößen betrugen 2 bis 10 µm, teils auch bis
30 µm.
Abb. 15: Chondrozyten-besiedelter Cerasorb ® -Zylinder links (Trypanblau-Färbung,
Auflichtmikroskopie [40er Objektiv, Belichtungszeit 197,09 ms]) im Vergleich zur
Zellkultur-Kontrolle rechts (Trypanblau-Färbung, Auflichtmikroskopie [40er Objektiv,
Belichtungszeit 229,64 ms])
- 81 -
50 µm

Ergebnisse
___________________________________________________________________________
4.2.2. Zellwachstumsnachweis durch Fluoreszenzfärbung mit DAPI nach
vorangegangener Trypanblau-Färbung
Homogen verteilt fanden sich auf der dunkel erscheinenden Zylinderoberfläche dicht
aneinander liegende, hell leuchtende Zellen. Diese 5 bis 20 µm großen Strukturen wiesen eine
rundliche, seltener auch abgeflachte Form auf. Sehr vereinzelt konnten dazwischen dunkel
gefärbte Zellen mit einer Größe von 1 bis 5 µm beobachtet werden. Zellfreie Bereiche fanden
sich kaum (Abb. 16).
Die Poren der Cerasorb ® -Zylinder stellten sich im Mikroskop als dunkle, runde Bereiche dar.
Zellansiedlungen konnten bis an den Rand der Poren nachgewiesen werden. Mikroskopische
Betrachtungen in die Poren hinein zeigten auch hier leuchtend helle Zellen rundlicher, teils
abgeflachter Struktur (Abb. 17). Sie lagen weniger dicht beieinander, so dass auch zellfreie
Bereiche differenziert werden konnten. Die Zellgrößen entsprachen denen auf der
Zylinderoberfläche. Nur sehr vereinzelt konnten auch in den Poren dunkel gefärbte
Zellstrukturen nachgewiesen werden, deren Größe etwa 1 bis 5 µm betrug.
Abb. 16: Chondrozyten-besiedelter Cerasorb ® -Zylinder mit Pore links (Trypanblau-
Färbung, anschließend DAPI-Färbung, Fluoreszenzmikroskopie [10er Objektiv,
Belichtungszeit 99,5 ms]) im Vergleich zur Zellkultur-Kontrolle (Trypanblau-Färbung,
anschließend DAPI-Färbung, Fluoreszenzmikroskopie [10er Objektiv, Belichtungszeit
39,8 ms])
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Ergebnisse
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Abb. 17: Chondrozyten-besiedelter Cerasorb ® -Zylinder links (Trypanblaufärbung,
anschließend DAPI-Färbung, Fluoreszenzmikroskopie in eine Pore des Zylinders hinein
[10er Objektiv, Belichtungszeit 99,5 ms]) im Vergleich zur Zellkultur-Kontrolle rechts
(Trypanblau-Färbung, anschließend DAPI-Färbung, Fluoreszenzmikroskopie [10er
Objektiv, Belichtungszeit 39,8 ms])
4.2.3. Zellwachstumsnachweis durch Fluoreszenzfärbung mit DAPI
Auf dunklem Untergrund konnten hell leuchtende, homogen verteilte Zellen ohne größere
zellfreie Bereiche differenziert werden. Die rundlichen, teils abgeflachten Zellen lagen sehr
dicht beieinander, teils mit direktem Zell-Zell-Kontakt und wiesen Größen zwischen etwa 5
und 30 µm auf (Abb. 18). Zellausläufer fanden sich nicht. Dieses Zellwachstum konnte bis an
die Ränder der bei der Mikroskopie dunkel erscheinenden Poren nachgewiesen werden (Abb.
19).
Abb. 18: Chondrozyten-besiedelter Cerasorb ® -Zylinder (DAPI-Färbung,
Fluoreszenzmikroskopie [10er Objektiv, Belichtungszeit 14,73 ms])
- 83 -

Ergebnisse
___________________________________________________________________________
Abb. 19: Chondrozyten-besiedelter Cerasorb ® -Zylinder mit Pore (DAPI-Färbung,
Fluoreszenzmikroskopie [10er Objektiv, Belichtungszeit 14,73 ms])
Bei der mikroskopischen Betrachtung des Inneren der Poren konnte auch in diesem Bereich
Zellwachstum nachgewiesen werden. Die rundlichen bzw. abgeflachten, hell leuchtenden
Zellen ohne Zellausläufer erreichten Größen zwischen 2 und 25 µm. Sie lagen weniger dicht
beieinander, aber dennoch gleichmäßig verteilt vor. Kleinere Areale konnten als zellfrei
differenziert werden.
4.2.4. Bestimmung der Zellmorphologie mittels Rasterelektronenmikroskopie
Die Makroporen der Cerasorb ® -Zylinder erschienen in der REM-Untersuchung als kreisrunde
Aussparungen in der Oberfläche mit einem Durchmesser von ca. 1 mm (Abb. 20, oben links).
Auf der körnig, teils bröckelig wirkenden Oberfläche konnten relativ gleichmäßig verteilt
Zellen mit jeweils mehreren Ausläufern, welche teilweise Aufzweigungen zeigten,
nachgewiesen werden, über die größtenteils ein direkter Zell-Zell-Kontakt zu erkennen war.
Die Zellkörper wiesen dabei Größen von etwa 20 µm auf (Abb. 20, unten rechts). Ebenfalls
konnte ein Zellwachstum in den Poren der Zylinder beobachtet werden (Abb. 20, unten links).
In den höheren Vergrößerungen (Abb. 20, unten rechts) zeigten sich bei einem Teil der Zellen
rissähnliche Strukturen in den Körpern oder Ausläufern.
- 84 -

Ergebnisse
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Abb. 20: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen eines mit einer Zellsuspension
besiedelten Cerasorb ® -Zylinders.
4.3. Cerasorb ® -Zylinder mit caninen Knorpelspänen
4.3.1. Zellvitalitätsnachweis mit Trypanblau
Auf dem hellen, kristallin erscheinenden Untergrund konnten in unmittelbarer Umgebung zu
einigen mit Knorpelspänen gespickten Poren der Cerasorb ® -Zylinder einzelne oder in
kleineren Gruppen liegende, hell- bis dunkelblau gefärbte, kugelförmige oder leicht
abgeflachte Zellen ohne erkennbare Zellausläufer nachgewiesen werden. Die Zellgrößen
betrugen ca. 10 bis 20 µm (Abb. 21, 22).
- 85 -

Ergebnisse
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10 µm
Abb. 21: Mit Knorpelspan gespickter Cerasorb ® -Zylinder (Trypanblau-Färbung,
Auflichtmikroskopie [40er Objektiv, Belichtungszeit links 14,12 ms, Belichtungszeit
rechts 9,82 ms])
Abb. 22: Mit Knorpelspan gespickter Cerasorb ® -Zylinder mit Blick auf Makropore
(Trypanblau-Färbung, Auflichtmikroskopie [40er Objektiv, Belichtungszeit 14,12 ms])
In unmittelbarer Umgebung anderer mit Knorpelspänen gespickter Poren der Cerasorb ® -
Zylinder konnten auf der weiß erscheinenden Oberfläche bzw. in den Poren keine
Zellstrukturen nachgewiesen werden (Abb. 23).
- 86 -
10 µm

Ergebnisse
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Abb. 23: Mit Knorpelspan gespickter Cerasorb ® -Zylinder mit Blick auf Makropore
(Trypanblau-Färbung, Auflichtmikroskopie [40er Objektiv, Belichtungszeit 14,12 ms])
4.3.2. Zellwachstumsnachweis durch Fluoreszenzfärbung mit DAPI
Auf dem dunkel erscheinenden Untergrund konnten in unmittelbarer Umgebung einiger mit
einem Knorpelspan gespickten Poren hell leuchtende, kugelförmige oder teils abgeflachte
Zellen ohne Zellausläufer nachgewiesen werden. Die Zellgrößen betrugen 5 bis 30 µm.
Während die Zellen dicht an der Makropore homogen verteilt und dicht beieinander, teils mit
direktem Zell-Zell-Kontakt zueinander lagen, nahm die Zellzahl mit zunehmender Entfernung
von der Pore drastisch ab (Abb. 24).
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Ergebnisse
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Abb. 24: Mit Knorpelspan gespickter Cerasorb ® -Zylinder – Aufnahmen mit
zunehmender Entfernung von der gespickten Makropore von links oben nach rechts
unten (DAPI-Färbung, Fluoreszenzmikroskopie [40er Objektiv, Belichtungszeit oben
links 3,98 ms, oben rechts 1,99 ms, unten links 2,79, unten rechts 5,97 ms]). Der
unfokussierte Teil stellt den Knorpelspan dar.
Im Bereich anderer mit einem Knorpelspan gespickten Makroporen konnte kein
Zellwachstum nachgewiesen werden. Die Zylinderoberfläche erschien homogen dunkelgrau.
In den Poren konnte der eckige Knorpelspan teilweise fokussiert werden. Auf der ebenfalls
dunklen Oberfläche zeigten sich hell leuchtende, rundliche oder teils abgeflachte Zellen.
Zellausläufer fanden sich nicht. Die Zellgrößen betrugen zwischen 5 und 20 µm (Abb. 25).
Abb. 25: Mit Knorpelspan gespickter Cerasorb ® -Zylinder mit Blick auf den
Knorpelspan in einer Makropore (DAPI-Färbung, Fluoreszenzmikroskopie [40er
Objektiv, Belichtungszeit 3,98 ms])
- 88 -

Ergebnisse
___________________________________________________________________________
4.3.3. Bestimmung der Zellmorphologie mittels Rasterelektronenmikroskopie
Auf den Zylindern, deren Makroporen mit einem Knorpelspan gespickt wurden (Abb. 26,
oben links), konnten weder auf der äußeren Oberfläche noch in den Poren oder in direkter
Umgebung zu den Knorpelspänen Zellen nachgewiesen werden (Abb. 26).
Abb. 26: Rasterelektronenmikrsokopische Aufnahmen eines mit einem Knorpelspan
gespickten Cerasorb ® -Zylinders.
- 89 -

Diskussion
___________________________________________________________________________
5. Diskussion
Mit der vorliegenden Studie sollte die Möglichkeit der Besiedlung von ß-TCP-Zylindern mit
caninen Knorpelzellen untersucht werden. Unterschiedliche Besiedlungsverfahren wurden
hinsichtlich der Wachstumsgeschwindigkeit und der Ausbreitung der Zellen verglichen.
Zur Therapie von Knorpelschäden wurden eine Vielzahl von Therapieprinzipien entwickelt,
die in ihrer Gesamtheit die möglichst vollständige funktionelle Wiederherstellung der
Gelenkoberfläche zum Ziel haben. Ein vielversprechendes Therapiekonzept stellt dabei die
Mosaikplastik dar (MARLOVITS u. VÉCSEI 2000, GAISSMAIER et al. 2003, HUNTLEY
et al. 2005). Intakter hyaliner Knorpel wird in die Defekte transplantiert und somit vollständig
ausgebildete und funktionell intakte Knorpelmatrix zur Verfügung gestellt. Dabei ist die
Lebensfähigkeit der Chondrozyten an den Rändern der Knorpel-Knochen-Zylinder für den
Langzeiterfolg wichtig, denn die Abwesenheit von Matrix-produzierenden Zellen im Bereich
der Knorpel-Knorpel-Berührung macht eine Integration des implantierten Knorpels
unwahrscheinlich. Bei der Gewinnung der Zylinder besteht jedoch immer das Risiko der
Schädigung der Chondrozyten sowie der Komorbidität in Bereich des Spenderareals.
Weiterhin gibt es derzeit noch keine Langzeitstudien, die beweisen, dass Knorpelgewebe aus
weniger belasteten Arealen den hohen mechanischen Ansprüchen der Hauptbelastungszonen
der Gelenke standhalten kann (BURKART et al. 2001) und es durch die stärkeren und
ungewohnten Krafteinwirkungen nicht zur Auffaserung des transplantierten Knorpels
(FRANK 2003) und nachfolgend zum Verlust an hyalinem Gelenkknorpel kommt
(BENTLEY et al. 2003; SZERB et al. 2005). Um diese Risiken und Nachteile der
Mosaikplastik zu minimieren bzw. auszuschalten, ist es Ziel, eine Matrix mit Chondrozyten
zu besiedeln, die auf der Oberfläche zudem eine hyaline Knorpelmatrix synthetisieren und
diese im Anschluss in die Defekte des Gelenkknorpels im Sinne der Mosaikplastik zu
transplantieren.
In der eigenen Arbeit wurde dazu die Eignung von ß-TCP geprüft, dessen Einsatz bisher v. a.
als Knochenersatzmaterial erfolgte (FOITZIK u. STAMM 1997; HAUSCHILD et al. 2000;
MERTEN et al. 2000; ERBE et al. 2001). In vielen Studien wurden bisher die positiven
Eigenschaften des ß-TCP herausgestellt: kontrollierbare Makroarchitektur, Leistungsstabilität,
nicht-toxisch, gute Kompatibilität, hohe mechanische Stärke, exzellente Osteokonduktion und
- 90 -

Diskussion
___________________________________________________________________________
Biodegradierbarkeit usw. (KLEIN et al. 1984; FOITZIK u. STAUSS 1999; SOOST 2000;
MOORE et al. 2001). Versuchsweise erfolgte dessen Einsatz auch als zellbesiedeltes
Ersatzmaterial bei osteochondralen Defekten des Kniegelenkes beim Schaf (GUO et al. 2004).
Dazu wurde es in Pulverform mit autologen mesenchymalen Stammzellen besiedelt, in die
Defekte implantiert und 24 Wochen post operationem konnte neues Knorpelgewebe
nachgewiesen werden. Im Vergleich dazu wurde in leeren Defekten keine spontane
Knorpelreparatur beobachtet.
In der vorliegenden Arbeit wurden mit Chondrozyten besiedelte oder mit Knorpelspänen
gespickte ß-TCP-Zylinder mit einem durchgehendenden Makroporensystem angewandt. Im
Vergleich zu Zellkultur-Kontrollen konnten deutlich höhere Zellzahlen auf den Konstrukten
nachgewiesen werden. Das insgesamt sehr gute Zellwachstum beweist einen positiven
Einfluss des ß-TCP´s auf die Zellanheftung und Proliferation. Die Form der Konstrukte
ermöglicht deren Implantation ähnlich der Knorpel-Knochen-Zylinder bei der Mosaikplastik.
Bisher wurden im Rahmen dieses Therapieverfahrens Knorpel-Knochen-Zylinder verwendet,
die der Patient selber spenden musste. Die Form der Cerasorb ® -Zylinder scheint jedoch
bestens geeignet zu sein, um stattdessen in Form der „Press fit“-Technik in
Gelenkknorpeldefekte eingesetzt zu werden. Vorteilhaft ist dabei der mögliche Einsatz von
ß-TCP als Knochen- und als Knorpelersatzmaterial. Für beide Indikationen sind gute
Eigenschaften des Materials nachgewiesen worden (FOITZIK u. STAMM 1997;
HAUSCHILD et al. 2000; MERTEN et al. 2000; ERBE et al. 2001; GUO et al. 2004). Die
Verwendung unterschiedlich großer Zylinder erlaubt eine gute Defektauffüllung. Zahlreiche
Studien bewiesen eine gute Einheilung in umliegendes Knochengewebe. Sie konnten gute
osteokonduktive Eigenschaften des Materials, die Anregung von Knochengewebe zum
direkten Einwachsen in seine Makroporen und eine sehr gute Integration in natürlichen
Knochen ohne bindegewebige Abkapselung oder Osteoklastentätigkeit aufzeigen.
Bei der herkömmlichen Mosaikplastik stand häufig zu wenig Spendermaterial zur Verfügung.
Dieses Problem ist bei der Verwendung der Cerasorb ® -Zylinder irrelevant. Herkömmliche
absolute Kontraindikationen wie Neoplasien, Infektionen, Arthritiden und Defektgrößen von
mehr als 6 cm² und 10 mm Tiefe bleiben jedoch bestehen. Das Hauptproblem der bisherigen
Mosaikplastik, die Inkongruenz der Knorpeloberfläche, besteht nach Implantation von ß-TCP-
Zylindern prinzipiell auch. Die Zylinder können die Oberflächenkontur der Gelenkflächen
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Diskussion
___________________________________________________________________________
ebenfalls nur imitieren. Eventuelle Anpassungsmöglichkeiten müssten in entsprechenden
Studien geprüft werden.
Die nutzbaren Spenderareale bei der herkömmlichen Mosaikplastik befanden sich
grundsätzlich in weniger belasteten Knorpelbereichen des Gelenkes, während die
Reimplantation in den Hauptbelastungszonen stattfand. Nicht auszuschließen ist, dass es
infolge der ungewohnten Krafteinwirkung zu einer Auffaserung des Knorpelgewebes kommt
(FRANK 2003). Aber auch nach Implantation besiedelter Cerasorb ® -Zylinder bleibt die Frage
offen, ob die Chondrozyten und deren synthetisierte Matrix auf den Zylindern den starken
Beanspruchungen in den Hauptbelastungszonen eines Gelenkes standhalten könnten.
Im Rahmen des Knorpelersatzes ist es wünschenswert, für die Besiedlung der Keramiken
autologe Zellen zu nutzen, um eine Immunsuppression des Patienten nach der Implantation
überflüssig zu machen. Dafür wurden im Rahmen dieser Studie zwei unterschiedliche
Besiedlungsmethoden untersucht. Die Cerasorb ® -Zylinder der 1. Gruppe wurden mit einer
Zellsuspension beimpft. Dazu wurden zunächst canine Knorpelzellen kulturell vermehrt und
anschließend auf die Zylinder aufgetragen. Die Zylinder der 2. Gruppe wurden mit
Knorpelspänen beimpft, die in die Makroporen der Konstrukte eingebracht wurden. Nach
Ablauf von einer Woche wurden die beiden Besiedlungsmethoden hinsichtlich der
Zellwachstumsgeschwindigkeit und der Zellausbreitung auf den Zylindern verglichen.
Mit Hilfe des in der vorliegenden Studie angewandten Trypanblau-Vitalitätstestes war es
möglich, tote Zellen durch Blau-Färbung sowohl auf den mit Chondrozyten besiedelten als
auch auf den mit Knorpelspänen gespickten ß-TCP-Konstrukten nachzuweisen. Dieses
Verfahren ist mit einfachsten Mitteln in jedem Labor durchführbar. Dieser Farb-Ausschluss-
Test setzt bei einer vitalen Zelle eine intakte Zellmembran voraus, durch die ein Eindringen
des Farbstoffes ins Zellinnere unmöglich ist. Tote Zellen hingegen weisen eine permeable
Zellmembran auf, durch die der Farbstoff ins Innere diffundieren kann und das Zytoplasma
blau färbt. Während die Unempfindlichkeit dieses Testes von großemVorteil ist, stellt die
geringe Sensitivität bei sehr wenig toten Zellen in einer Probe einen Nachteil dar. Der Farb-
Ausschluss-Test mit Trypanblau hat auch seine Schwierigkeiten bei stark geschädigten
Zellen. Die zu erfassenden Zellen müssen noch von einer semipermeablen Membran umgeben
sein, da sonst keine Anfärbung des Zytoplasmas stattfindet und somit eine Überschätzung der
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Diskussion
___________________________________________________________________________
Zellvitalität folgt. Weiterhin wirkt Trypanblau selbst als zytotoxisches Agens mit einer IC50
von 0,095 mM/l (Millimol pro Liter). Die IC50 gibt die Schadstoffkonzentration [mM/l] an,
bei der 50 % der eingesetzten Zellen tot sind (HALLE 1998). Die zytotoxische Aktivität
reicht aus, um geschwächte Zellen abzutöten. Zu dem gibt der Trypanblau-Test eine
Momentaufnahme wieder, anhand derer keine Aussage getroffen werden kann, ob z. B. Zellen
weiter proliferieren können oder nicht (SCHÄRFE 2004).
Durch die Fluoreszenzfärbung mit DAPI war es möglich, sowohl auf den mit der
Chondrozytensuspension besiedelten als auch auf den mit Knorpelspänen gespickten
Konstrukten lebende Zellen nachzuweisen. Der zur Indol-Gruppe gehörende Farbstoff färbt
dabei die DNA bzw. die Chromosomen der entsprechenden Zellen an.
Für die Zellvitalitätsbestimmung kommen prinzipiell auch andere Nachweisverfahren in
Frage, die in der vorliegenden Studie jedoch nicht angewendet wurden. So gelangen die
DNA- bzw. RNA-Farbstoffe Propidiumiodid und Ethidiumbromid ebenfalls nur in das
Zellinnere stark geschädigter oder abgestorbener Zellen, deren Membranintegrität nicht mehr
vollständig vorhanden ist und erzeugen nach Bindung an die DNA bzw. RNA messbare
Fluoreszenzen (JONAS 2004).
Auch das sensitive und hochspezifische „Strom-Ausschluss-Verfahren“ macht sich die intakte
Zellmembran einer vitalen Zelle zu nutze. Die Zellen werden in einem Cell Analyser mit
Unterdruck durch eine Messpore gesaugt, über der ein elektrisches Niederspannungsfeld mit 1
MHz anliegt. Vitale Zellen generieren ein ihrem tatsächlichen Zellvolumen entsprechendes
Signal, während tote Zellen mit einer permeablen und elektrisch durchlässigen Zellmembran
ein deutlich kleineres Signal generieren, dass dem Zellkern entspricht. Die Daten können
ohne Manipulation der Zellen (Färben) gewonnen werden. Diese elektronische
Zellvitalitätsbestimmung erfasst alle Übergangszustände, auch freie Zellkerne, korrekt als tote
Zellen.
Definfiert man die Vitalität einer Zelle über deren Aktivität, kann diese beispielsweise mit
Hilfe des Neutralrot-Assays nachgewiesen werden. Der Farbstoff Neutralrot wird dabei nur in
intakte Liposomen (und aktive DNA) lebender Zellen eingelagert (SCHÄRFE 2004).
Bezüglich der Vitalitätsbestimmung bleibt letztendlich festzustellen, dass die
Trypanblaufärbung ein in der Durchführung einfaches, sicheres, kostengünstiges und in jedem
Labor anwendbares Verfahren darstellt. Sollen anhand der Vitalitätsbestimmung auch
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Diskussion
___________________________________________________________________________
Aussagen über die Proliferationsfähigkeit der Zellen getroffen werden, muss beispielsweise
dem Neutralrot-Assay der Vorrang gelassen werden.
Um die Morphologie der durch Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesenen Zellen auf den
ß-TCP-Konstrukten näher bestimmen zu können, wurde in dieser Arbeit die
rasterelektronenmikroskopische Untersuchung eingesetzt. Durch die im Vergleich zur
Lichtmikroskopie deutlich höheren Vergrößerungen und Auflösungen sowie die viel größere
Tiefenschärfe entsteht ein nahezu dreidimensionaler Bildeindruck (FLEGLER et al. 1995;
GIESE 1997), mit Hilfe dessen die dargestellten Zellen aufgrund ihrer Morphologie mit hoher
Wahrscheinlichkeit den Chondrozyten zugeordnet werden können. Die große
Oberflächensensitivität ließ den Einsatz vor allem bei den mit Knorpelspänen gespickten
Konstrukten sinnvoll erscheinen, da mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie nicht bei allen
gespickten Poren Zellen auf dem Konstrukt nachgewiesen werden konnten. Letztendlich blieb
aber festzustellen, dass auch mit Hilfe des Rasterelektronenmikroskops nicht bei allen
gespickten Poren ein Auswandern von Zellen auf das Konstrukt zu beobachten war. Mögliche
Ursachen könnten dabei ein ungenügender Kontakt zwischen dem Knorpelspan und der
Oberfläche des Cerasorb ® -Konstruktes oder eine massive Schädigung der Chondrozyten
während der Manipulation der Späne darstellen. Um jedoch eine
rasterelektronenmikroskopische Untersuchung durchführen zu können, ist eine aufwendigere
Probenvorbereitung notwendig, die unter Umständen zu einer Veränderung bzw. Zerstörung
der Probe oder zur Artefaktbildung auf der Probenoberfläche führen kann (GOODHEW u.
HUMPHREYS 1991). Weitere Nachteile liegen in der Elektronenstrahlempfindlichkeit und
damit eventuell verbundenen Modifikationen der Probe sowie in den relativ hohen Kosten.
Die starke Streuung der Elektronen an Gasmolekülen stellt einen entscheidenden Störfaktor
dar und macht somit ein Arbeiten im Hochvakuum unerlässlich. Dies machte eine
vollkommene Trocknung der Proben zwingend erforderlich. Dabei ist eine eventuelle
geringgradige Veränderung der Morphologie der Zellen auf den Konstrukten nicht
vollkommen auszuschließen. Weiterhin kann die negative Ladung der Elektronen und die
ihnen durch Beschleunigung übertragene Energie ganz oder teilweise an die Proben
weitergegeben werden, was zu einer elektrischen Aufladung der Probenoberfläche und
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Diskussion
___________________________________________________________________________
schlussendlich zu einer Verschlechterung der Aufnahmequalität führt (GOODHEW u.
HUMPHREYS 1991; SCHMIDT u. WEYHING 2005).
Sowohl durch die Zellvitalitätsbestimmung (Trypanblau-Färbung) und den
Zellwachstumsnachweis (DAPI-Färbung) als auch durch die rasterelektronenmikroskopische
Untersuchung konnte nicht mit 100 %iger Sicherheit nachgewiesen werden, dass es sich bei
den Zellen, die auf den ß-TCP-Konstrukten gewachsen sind, tatsächlich um Chondrozyten
handelt, die zudem auch die gewünschte hyaline Knorpelmatrix produzieren. Mit Hilfe der
RT-PCR ist es möglich, die Zusammensetzung der von den Zellen gebildeten Kollagene zu
bestimmen. Des Weiteren kann dieses Verfahren zur Differenzierung der knorpelspezifischen
Proteoglykane Aggrecan und Versican genutzt werden und folglich zwischen hyalinem und
Faserknorpel unterschieden werden. Durch die möglichen Aussagen über die Qualität der
Chondrozyten und der von ihnen synthetisierten Matrix können Schlussfolgerungen über eine
eventuell stattgefundene Dedifferenzierung der Knorpelzellen auf den Konstrukten getroffen
werden. Der Nachweis von Kollagen Typ II als Hauptbestandteil der synthetisierten
Kollagene und des Proteoglykans Aggrecan würde das Vorhandensein der erwünschten
Chondrozyten beweisen. Die RT-PCR fand im Rahmen dieser Arbeit keine Anwendung, wird
jedoch in einer nachfolgenden Studie durchgeführt.
Für beide Methoden der Besiedlung der ß-TCP-Zylinder konnte im Rahmen dieser Studie ein
Auswandern von Zellen auf das Konstrukt nachgewiesen werden. Dabei war festzustellen,
dass das Besiedlungsverhalten nach dem Beimpfen mit Knorpelspänen dem Verfahren der
direkten Besiedlung mit einer Zellsuspension sowohl in der Geschwindigkeit als auch in der
Ausbreitung des Zellwachstums deutlich unterlegen war.
Die Beimpfung der Zylinder der Gruppe 1 (Besiedlung mittels Zellsuspension) erfolgte in
einem kleinen Gefäß (Kryoröhrchen), wodurch das zu verwendende Mindestvolumen der
Zellsuspension sehr gering gehalten werden konnte. Die Makroporen der Cerasorb ® -Zylinder
erlaubten zudem das Eindringen der Zellösung in das Innere des Keramikkörpers.
Demzufolge konnte über den gesamten Zylinder verteilt und, soweit darstellbar, auch in den
Poren ein starkes Zellwachstum nachgewiesen werden. Im Vergleich zu den
Zellkulturkontrollen zeigten die Zylinderoberflächen der Gruppe 1 ein deutlich stärkeres
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Diskussion
___________________________________________________________________________
Zellwachstum auf als die Kulturen. Die durch die Zellvitalitätsbestimmung mittels
Trypanblau-Färbung nachgewiesenen toten oder abgestorbenen Zellen waren denen durch
Fluoreszenzmikroskopie und DAPI-Färbung nachgewiesenen lebenden Zellen deutlich
unterlegen. Während auf den Zylindern der 1. Gruppe über den gesamten Zylinder verteilt
Zellen beobachtet werden konnten, blieb dies bei den Zylindern der 2. Gruppe (Beschickung
mit Knorpelspänen) auf die unmittelbare Umgebung der Knorpelspäne begrenzt. Die Zellen
zeigten kaum ein Wanderungsverhalten, so dass die Bewachsung der Zylinder deutlich
geringer ausfiel als bei Gruppe 1. Unklar ist, ob das bessere Wachstum der Zellen bei Gruppe
1 im Vergleich zur Gruppe 2 auf ein ausgeprägteres Wanderungsverhalten oder aber auf die
vollständige Durchtränkung mit der Zellsuspension zurückzuführen ist. Die Anzahl der Zellen
nahm mit zunehmender Entfernung von den mit Knorpelspänen gespickten Makroporen
drastisch ab, so dass in einiger Distanz zum Span überhaupt kein Zellwachstum mehr
festgestellt werden konnte. Nicht jeder Knorpelspan führte auf den Zylindern zu einem
Auswandern der Zellen auf das Konstrukt. Als möglicher Grund dafür könnte ein
ungenügender Kontakt des Knorpelspans mit der Oberfläche des Zylinders in Frage kommen,
der den Übertritt der Zellen auf den Zylinder verhindert. Desweiteren könnten eine
mechanische oder nutritive Schädigung der Zellen während der Gewinnung des Spans bzw.
während dessen Transport ursächlich dafür verantwortlich sein, dass ein Wachstum von
Zellen auf dem Konstrukt ausgeblieben ist. Das Verhältnis von lebenden und toten oder
abgestorbenen Zellen ist mit dem der Gruppe 1 vergleichbar. Das deutlich bessere
Zellwachstum auf den Zylindern, wenn in Gruppe 2 auch nur in unmittelbarer Umgebung
zum Knorpelspan, im Vergleich zur Zellkulturkontrolle lässt vermuten, dass die
Chondrozyten die ß-TCP-Matrix als Gerüstsubstanz gut akzeptieren. Das weitere
Wachstumsverhalten sowie die Sezernierung der entsprechenden Kollagene und
Proteoglykane werden in folgenden Studien überprüft.
Für die Zielvorstellung, einen Knorpel-Knochen-Ersatz für die klinische Anwendung zu
entwickeln, bleibt schlussendlich festzustellen, dass die Besiedlung einer ß-TCP-Keramik mit
Chondrozyten grundsätzlich möglich ist und diese Matrix von den Zellen gut angenommen
wird. Dabei war festzustellen, dass die direkte Besiedlung der Zylinder mittels einer
Zellsuspension der Beimpfung mit Knorpelspänen sowohl hinsichtlich der
Wachstumsgeschwindigkeit als auch der Ausbreitung der Zellen deutlich überlegen war.
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Diskussion
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Dennoch sind im Hinblick auf die klinische Anwendung die Besiedlungsverfahren
wünschenswerterweise zu beschleunigen. Die Transfektion (z. B. mit Hilfe des HMGA 2-
Proteins) könnte hier ein erfolgversprechendes Verfahren sein. Im Rahmen vieler Studien
konnte gezeigt werden, dass das HMGA 2-Protein einen proliferativen Effekt auf
verschiedene Zellen ausüben kann (BATTISTA et al. 1999; ANAND u. CHADA
2000ARLOTTA et al. 2000; SCHLÜTER 2005). Diese Induktion der Zellvermehrung soll in
einer nachfolgenden Studie genutzt werden, um eine Proliferationsbeschleunigung der
isolierten caninen Chondrozyten während der Kultivierung zu erreichen und damit deren
Dauer deutlich zu minimieren und die Anzahl der Zellen, die im Anschluss auf das ß-TCP-
Konstrukt aufgebracht werden, deutlich zu erhöhen. Im Hinblick auf eine klinische
Anwendung bleibt das Verhalten des HMGA 2-Proteins im Organismus abzuklären. Von
großem Interesse ist dabei die Frage, ob die hervorgerufene Proliferation auf die Chondozyten
auf den Keramiken begrenzt bleibt und ob diese nach Ablauf einer gewissen Zeitdauer oder
nach ausreichender Vermehrung der Zellen gestoppt werden kann. Zur Beantwortung dieser
Fragen werden weitere Studien durchgeführt.
- 97 -

Zusammenfassung
___________________________________________________________________________
6. Zusammenfassung
Nicole Muschter
Knorpelersatz beim Hund – Untersuchungen zur Besiedlung keramischer Matrices
Ziel dieser Studie war es, das Verhalten caniner Chondrozyten nach kultureller Expansion und
Besiedlung einer Beta-Tricalciumphosphat-(ß-TCP)-Matrix sowie deren
Auswanderungsverhalten auf die Matrix aus einem Knorpelspan zu untersuchen. Dafür
wurden zunächst die Chondrozyten mit Hilfe einer Mischlösung aus Collagenase NB 8 und
Medium 199 und entsprechender Inkubationszeit von circa (ca.) sechs Stunden aus den
caninen Knorpelspänen herausgelöst. Nach Überführung der Zellen in eine Zellkulturflasche
wurden sie in Medium 199 inkubiert, die Dauer der Inkubation richtete sich nach dem
Fortschreiten der Expansion. Nach Ablauf von einer halben bis einer Woche war die
Zellvermehrung ausreichend weit fortgeschritten, so dass die Chondrozyten mit Hilfe von
TrypsinLE (Trypsin-Ersatz) von der Oberfläche der Zellkulturflasche losgelöst und eine
Zellsuspension mit 100000 Zellen pro Milliliter (ml) hergestellt werden konnte. Die
verwendeten 8,5 x 20 Millimeter (mm) großen Cerasorb ® -Zylinder bestanden aus
phasenreinem ß-TCP mit Makroporen von ca. 1 mm Durchmesser. Insgesamt wurden fünf
dieser Zylinder mit 1,5 ml der Zellsuspension beimpft und anschließend in Medium 199 für
ca. eine Woche inkubiert. In einem zweiten Versuchsansatz wurden ebenfalls fünf Cerasorb ® -
Zylinder mit je zwei caninen Knorpelspänen variabler Größe beschickt und anschließend eine
Woche in Medium 199 inkubiert. Die Auswertung der Versuchsreihen erfolgte durch
Zellfärbung und bildgebende Verfahren. Für die Bestimmung der Zellvitalität wurden die
Zylinder mit einer 0,2 %igen Trypanblaulösung überschichtet und anschließend
mikroskopisch ausgewertet. Zellen mit blau gefärbtem Zytoplasma konnten somit als
abgestorben bzw. tot identifiziert werden. Mit Hilfe der Fluoreszenzfärbung mit 4´,6-
Diamidino-2-phenylindol (DAPI) konnten lebende Zellen sichtbar gemacht werden. Die
Bestimmung der Morphologie der Zellen auf den Konstrukten erfolgte durch die
rasterelektronenmikroskopische Untersuchung. Die angewandten Untersuchungsmethoden
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Zusammenfassung
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zeigten sowohl auf den mit der Zellsuspension besiedelten als auch auf den mit
Knorpelspänen beschickten ß-TCP-Konstrukten lebende und tote Zellen fibroblastoiden Typs.
Für beide Methoden der Besiedlung konnte somit in dieser Studie ein Auswandern von Zellen
auf das Konstrukt nachgewiesen werden. Dabei war festzustellen, dass die direkte Besiedlung
der Zylinder mittels Zellsuspension der Beimpfung mit Knorpelspänen sowohl hinsichtlich
der Wachstumsgeschwindigkeit als auch der Ausbreitung der Zellen deutlich überlegen war.
Für die Zielvorstellung, einen Knorpel-Knochen-Ersatz für die klinische Anwendung zu
entwickeln, bleibt schlussendlich festzustellen, dass die Besiedlung einer ß-TCP-Keramik mit
Chondrozyten grundsätzlich möglich ist und diese Matrix von den Zellen gut angenommen
wird. Das weitere Wachstumsverhalten und die Sezernierung der entsprechenden Kollagene
und Proteoglykane werden in folgenden Studien überprüft. Im Hinblick auf die klinische
Anwendung sind die Besiedlungsverfahren wünschenswerterweise zu beschleunigen. Die
Transfektion (z. B. mit Hilfe eine HMGA 2-Proteins) könnte ein erfolgversprechendes
Verfahren sein und wird in einer folgenden Studie überprüft.
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Summary
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7. Summary
Nicole Muschter
Cartilage substitute in the dog - investigations for settlement on ceramic matrices
Aim of this study was to examine the behavior of canine chondrocytes after cultural
expansion and settlement on a beta-tricalciumphosphate-(ß-TCP)-matrix as well as their
emigration behavior onto the matrix from a cartilage flake. First the chondrocytes were
detached from caninen cartilage flakes with the aid of a mixed solution of collagenase NB 8
and medium 199 using a incubation time of approximately (approx.) six hours. After
transfering the cells into a cell-culture-bottle, they were incubated in medium 199. The
incubation time depended on advance of the expansion of the cells. At the completion of one
half of a week to a week the cell-increase was high enough for detaching the chondrocytes
with the aid of TrypsinLE (trypsin substitute) of the surface of the cell-culture-bottle
producing a cell suspension with 100,000 cells per millilitres (ml). The Cerasorb ® -construct
(8.5 x 20 millimeters [mm]) used in this study consisted of phase-pure p-TCP with macro pits
of approx. 1 mm of diameter. 1,5 ml of the cell suspension was given on five of these
Cerasorb ® -constructs and then these were incubated for approx. a week in medium 199. In a
second experimental approach again five Cerasorb ® -constructs were charged each with two
caninen cartilage flakes of variable size and incubated also for a week in medium 199. The
evaluation of the experiments occurred through cell coloring and picture giving procedures.
For the definition of cell vitality the constructs were covered using 0,2 %igen Trypanblue-
solution and then evaluated microscopically. Cells with blue colored cytoplasma were
identified as dead. Living cells were made visible using fluorescence coloring with 4´.6-
Diamidino-2-phenylindol (DAPI). The morphology of the cells on the constructs was
evaluated using raster electrone microscopic investigation. The applied investigation methods
showed in both groups (cell suspension and cartilage flake) living and dead cells of
fibroblastoid type. In this study emigrating of cells on the construct could be proven for both
methods of settlement. It was shown that the direct settlement on the constructs by means of
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Summary
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cell suspension was superior to the method with cartilage flakes as well considering the
growth rate as considering the spreading of cells on the construct. In conclusion the settlement
of chondrocytes on a ß-TCP-construct is possible and the cells grow well on the constructs,
therefore it seems to be possible to develop a cartilage bone substitute for clinical use. The
growth behavior and the secretion of the the corresponding collagene and proteoglycane have
to be investigated in further studies. With regard to the clinical use it is desirable to speed the
settlement procedures up. Furthermore the transfection (e.g. with the aid of a HMGA 2-
protein) of chondrocytes could be a promising method and will be investigated in a following
study.
- 101 -

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Danksagung
___________________________________________________________________________
Danksagung
Herrn Dr. G. Hauschild danke ich für die Überlassung des interessanten Themas sowie die
wissenschaftliche Anleitung und aufopfernde Betreuung bei der Anfertigung dieser Arbeit.
Bei Herrn Prof. Dr. I. Nolte bedanke ich mich für die Möglichkeit der Durchführung meiner Dissertation an
der Klinik für Kleintiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover.
Herrn A. Richter (Zentrum für Humangenetik der Universität Münster) danke ich für die hilfreichen Mühen
bei der Besiedlung der Keramiken und deren mikroskopischen Auswertung sowie für die geduldige
Beantwortung unzähliger Fragen.
Herr M. Bühner danke ich für die hilfreiche Unterstützung bei der rasterelektronenmikroskopischen
Auswertung der Keramiken.
Mein ganz besonderer Dank gilt meinen Eltern, Marlies und Klaus, sowie meinen Großeltern, Regina und
Karl-Heinz, die mir durch ihre finanzielle und liebevolle Unterstützung die Anfertigung dieser Arbeit
ermöglichten und auch bei diversen Fehlschlägen immer an ein gutes Ende glaubten. Des Weiteren danke
ich meinem Bruder Denny und seiner Freundin Maja sowie Herms und Gisela Hungerbühler für die
Aufmunterungen in harten Zeiten.
Ich danke meinen lieben Ex-Kollegen, die mir durch aufmunternde Worte und nette Ablenkungen in harten
Zeiten beistanden. Insbesondere gilt dies für Nina Eberle, Verena von Babo, Katja Ludwig (geb. Wacker),
Ruth Höinghaus, Julia Seipel, Oliver Harms, Tanja Gerlach, Frauke Winkenwerder, Christian
Hackenbroich, Daniela Simon und Julia Tünsmeyer.
Mein Dank gilt außerdem der Familie Wüst, die mir während dieser Zeit immer mit Rat und Tat zur Seite
standen und in „verzweifelten“ Situationen für Ablenkung sorgten.
Weiterhin bedanke ich mich bei unseren liebgewordenen Freunden Susanne und Volker Dürkop sowie
deren Kindern Marie und Angelina, die mit netten gemeinsamen Abenden so manche Gewitterwolke davon
ziehen ließen. Des Weiteren bin ich bes. Susanne und Marie dankbar, dass sie mir die Freude des Reitens
so nahe gebracht haben.
Mein ganz besonderer Dank gilt meinem Schatz Stephan. Deine liebevolle Unterstützung ließ mich
nicht aufgeben. Ohne Dich wäre vieles nicht möglich gewesen! Ich liebe Dich!
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