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Report Tiermodelle vom Zytoplasma in den Zellkern, und dort wurde die PGK-Neo-Kassette entfernt und die Expression des mutierten Keratin 14 ermöglicht. Dies führte zu Blasenbildung ausschließlich in den Hormon-behandelten Arealen, was ein Überleben der Tiere erlaubte. Folgestudien zeigten unter anderem, dass die Blasen nach Ende der Hormon-Behandlung schnell abheilten, was wahrscheinlich auf eine Einwanderung von epidermalen Stammzellen in die betroffenen Areale zurückzuführen ist. Mit diesem in vivo-Modell der dominanten EBS steht nun ein überlebensfähiges Tiermodell der Erkrankung zur Verfügung, welches die Analyse der Symptompathogenese und eine Therapieentwicklung ermöglicht. Der Kollagen VII-Hypomorph als Modell für EBD Die Möglichkeit, mit Hilfe einer intronischen PGK-Neo-Kassette die Expression eines Gens stark zu verringern, haben wir vor kurzem auch zur Generierung eines in vivo-Modells für EBD genutzt 20 . Diese EB-Form kann – abhängig von der zugrundeliegenden Mutation im Gen für Kollagen VII (COL7A1) – dominant oder rezessiv vererbt werden. Kollagen VII als Hauptbestandteil der Verankerungsfibrillen ist ein 290 kDa großes Protein mit einer sehr langen zentralen Tripelhelix, die von zwei globulären Domänen flankiert wird. Die schwerwiegendsten klinischen Symptome werden durch rezessive Mutationen hervorgerufen, die zu einer starken Reduktion der Kollagen VII-Synthese bis hin zum vollständigen Fehlen des Proteins in der Haut führen. Die betroffenen Patienten leiden nicht nur unter einer stark erhöhten Tendenz zu Blasenbildung, sondern entwickeln auch bereits im Kindesalter starke Narben und schwerwiegende Mutilationen an den Händen und Füßen. Außerdem zeigen sie eine erhöhte Inzidenz von Plattenepithelkarzinomen, die sich bevorzugt an stark von Blasenbildung betroffenen Arealen entwickeln und deren Metastasen die häufigste Todesursache darstellen 1 . Zur Generierung eines langlebigen in vivo-Modells der rezessiven EBD wurde eine konditionale Inaktivierung des Col7a1-Gens angestrebt und Exon 2 mit zwei loxP-Sequenzen flankiert. Diese erlauben die Cre- Rekombinase-vermittelte Exzision dieses Exons, was zu einer Leserasterverschiebung und Generierung von Stop-Codons führt, die die Proteinsynthese abbrechen. Gleichzeitig wurde auch eine PGK-Neo-Kassette Abb. 3: In vivo-Modell der rezessiven EBD. Die Einführung der PGK-Neo-Kassette führt zu stark verringerter Expression von Kollagen VII (Immunofärbung im Panel „Phänotyp“), was Blasenbildung verursacht (gekennzeichnet mit Sternchen). Die intradermale Injektion von Wild-Typ-Fibroblasten kann diesen Phänotyp teilweise revertieren. zur Selektion der ES-Zellen in Intron 2 eingeführt (Abb. 3). Nach Etablierung der entsprechenden transgenen Linie konnte gezeigt werden, dass die PGK-Neo-Kassette einen starken Einfluß auf die Prozessierung der Kollagen VII-mRNA hat und die Proteinexpression auf ca. 10% des Wildtypniveaus senkt. Die Kollagen VII-hypomorphe Maus zeigte Blasenbildung der Haut und der Schleimhäute als klinische Symptome. Die verbliebenen Kollagen VII-Mengen reichten aber aus, um die Lebenserwartung der Tiere gegenüber der Situation bei konventioneller Gen-Inaktivierung 19 wesentlich zu erhöhen, auf bis zu sechs Monate. Innerhalb dieses Zeitraums konnte auch die Entstehung anderer Symptome der EBD beobachtet und analysiert werden, vor allem die Bildung von Mutilationen an den Extremitäten. Es konnte gezeigt werden, dass die Entwicklung der Mutilationen auf entzündlichen und darauf folgenden fibrotischen Prozessen beruht 20 . Dies ermöglicht es nun, therapeutische Maßnahmen, wie etwa anti-inflammatorische oder anti-fibrotische Behandlung der Extremitäten, in diesem Tiermodell zu testen. Außerdem eignen sich diese hypomorphen Mäuse auch für die Testung der Anfälligkeit für Tumorentstehung, da die fibrotisch veränderten Pfoten im Zeitverlauf beobachtet und analysiert werden können. Aus Sicht der betroffenen Patienten ist die Testung neuartiger biologisch begründeter Therapieansätze für EBD am wichtigsten. Die Effizienz einer Form der Substitutionstherapie konnte anhand dieses hypomorphen Mausmodells bereits gezeigt werden. Werden Fibroblasten aus Tieren mit normaler Kollagen VII-Synthese in die Rückenhaut der hypomorphen Tiere injiziert, so wird die Deponierung von Kollagen VII an der Basalmembran verstärkt. Außerdem ist bereits sieben Tage nach der Injektion die Resistenz der Haut gegenüber mechanischem Stress deutlich erhöht 20 . Dies zeigt, dass in diesem in vivo- Modell für EBD eine Analyse der Symptompathogenese und auch die Entwicklung und Validierung von Therapieansätzen möglich ist. Darüber hinaus kann diese transgene Linie nach Rekombinase-vermittelter Entfernung der PGK-Neo-Kassette genutzt werden, um einen konditionalen Knock-out von Kollagen VII durch Verwendung von Hormonrezeptorgekoppelten Cre-Rekombinase-Varianten zu erhalten. Damit wird auch die topische Gen-Inaktivierung möglich, was es erlaubt, das Auftreten und die Entwicklung klinischer Sympotme in einzelnen Geweben zu beobachten, zum Beispiel der Haut ohne Beteiligung der Schleimhäute. Zusammenfassung und Ausblick Anhand der dargestellten Tiermodelle für die verschiedenen Formen der Epidermolysis 16 | 9. Jahrgang | Nr. 3/2008 LABORWElT
Tab. 1: Mausmodelle für verschiedene EB-Formen EB-Subtyp Zielgen Änderung Phänotyp EBS Krt14 Expression einer verkürzten Keratin-14-Variante Blasenbildung innerhalb der basalen unter Kontrolle d. endogenen Promoters Keratinozyten, perinatal letal6 Krt14 Ersatz von Krt14 durch eine Vimentin-cDNA Blasenbildung innerhalb der basalen Keratinozyten, perinatal letal7 Plec Inaktivierung perinatal letal8 bullosa wird deutlich, dass konventionelle Gen-Inaktivierungen zwar die Bedeutung des Zielgens für die Funktionen der Haut zeigen können, darüber hinaus aber als Modelle für die Erkrankungen nur bedingt geeignet sind. Insbesondere die häufig schwerwiegenderen Phänotypen der transgenen Tiere im Vergleich zu den klinischen Symptomen der Patienten machen direkte Vergleiche und Analysen der Symptompathogenese schwierig. Die kurze Lebenserwartung der Knock-out-Tiere macht es außerdem unmöglich, die Entstehung sekundärer Symptome einer Erkrankung, wie etwa die Mutilationen und Tumorbildung bei rezessiver EBD, zu untersuchen. Langfristig werden sicherlich auch für weitere Formen der EB Tiermodelle geschaffen werden, die eine konditionale Inaktivierung der Zielgene in einem bestimmten Zelltyp oder Gewebe areal erlauben. Daneben stellt auch die Verwendung der PGK-Neo-Kassette zur Generierung von hypomorphen Tieren eine elegante Möglichkeit dar, die letalen Auswirkungen eines vollständigen Fehlens von Proteinen zu mildern und so überlebensfähige in vivo-Modelle für humane Erkrankungen zu erhalten. Literatur Plec Inaktivierung via Cre-loxP-system mit Cre-Expression unter Kontrolle des Keratin 15-Promotors [1] Has, C., Bruckner-Tuderman, L., J Dermatol Sci 44 (2006), 129-144. [2] Aumailley, M., Has, C., Tunggal, L., Bruckner-Tuderman, L., Expert Rev Mol Med 8 (2006), 1-21. [3] Fine, J. D., Eady, R. 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Teils d. b4-Integrins Blasenbildung, perinatal letal12 Itga6 Inaktivierung Blasenbildung, perinatal letal13 Col17a1 Ersetzen von Exon 2 durch PGK-Neo-Kassette Blasenbildung, ca. 20% der Tiere überleben die ersten 8 Wochen14 BP230 Ersetzen der Exons1-3 durch PGK-Neo-Kassette Blasenbildung nach mechanischem Stress, motorische Defekte15 Lama3 Inaktivierung Blasenbildung, perinatal letal16 Lamc2 Inaktivierung Blasenbildung, perinatal letal17 EBD Col7a1 Inaktivierung Blasenbildung, letal innerhalb der ersten 14 Tage18 [5] Varki, R., Sadowski, S., Uitto, J., Pfendner, E., J Med Genet 44 (2007), 181-192. [6] Vassar, R., Coulombe, P. A., Degenstein, L., Albers, K., Fuchs, E., Cell 64 (1991), 365-380. [7] Lloyd, C., Yu, Q. C., Cheng, J., Turksen, K., Degenstein, L., Hutton, E., Fuchs, E., J Cell Biol 129 (1995), 1329-1344. [8] Andra, K., Lassmann, H., Bittner, R., Shorny, S., Fassler, R., Propst, F., Wiche, G., Genes Dev 11 (1997), 3143-3156. 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D., Paul, D., Erlacher, M., Berens von Rautenfeld, D., Hausser, I., Fassler, R., Bruckner-Tuderman, L., J Clin Invest (2008), in press Korrespondenzadresse Prof. Dr. Leena Bruckner-Tuderman Universitäts-Hautklinik Freiburg Molekulare Dermatologie Hauptstr. 7 79104 Freiburg Tel.: +49-(0)761-270 6716 Fax: +49-(0)761-270 6936 bruckner-tuderman@uniklinik-freiburg.de www.uniklinik-freiburg.de Report Tiermodelle Quantitative miRNA detection in less than one day miRtect-IT miRNA Labeling and Detection Kit Based on splinted-ligation technology – miRNA is directly labeled by ligation, then visualized. • Speed - capture and label miRNA in just over 2 hours • Sensitivity - detect miRNA in as little as 50 ng or less of total RNA • Quantitative Results - accurate miRNA measurement in 6 hours Now in Europe USB Europe GmbH Hauptstrasse 1 79219 Staufen Germany T: +49 (0)76 33-933 40 0 F: +49 (0)76 33-933 40 20 www.usbweb.com custserv@usbweb.de LABORWElT 9. Jahrgang | Nr. 3/2008 | 17
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