Zellbiologie & Imaging - Laborwelt

Blitzlicht Zellbasierte Assays
Gelbasierte Angiogenese-
Assays – neues Konzept
zur Meniskusproblematik
Dr. Roman Zantl, Dr. Ulf Rädler, Elias Horn, ibidi GmbH, Martinsried
Der Meniskus von Flüssigkeiten, der sich in kleinen Wells an der Wasser-Luftgrenzfläche
bildet, ist bei der Durchführung von gelbasierten Angiogenese-Assays wie zum Beispiel dem
Tube Formation Assay aus drei Gründen störend: Erstens beeinträchtigt er die homogene
Zellverteilung durch die Senke in der Mitte. Zweitens bleibt ein Großteil des teuren Gels
in der Kante zwischen Boden und Seitenwand ungenutzt. Drittens befinden sich die Zellen
auf der gekrümmten Oberfläche teilweise außerhalb des scharf abzubildenden Bereichs. In
dem hier vorgestellten µ-Slide Angiogenesis von ibidi werden diese drei Probleme mit einer
„well-in-a-well“-Struktur gelöst. Die Idee beruht darauf, dass die Oberfläche eines zu 100%
gefüllten Töpfchens exakt eben ist. Im Vergleich zu handelsüblichen 96-well-Platten. erspart
die neue Struktur 90% des einzusetzenden Gels.
Substanzen mit anti-angiogenetischer Wirkung
wird großes Potential bei der unterstützenden
Therapie von Tumorerkrankungen
zugeschrieben. Aufgrund des unkontrollierten
Zellwachstums haben Tumore einen
besonders großen Bedarf an Sauerstoff und
Nährstoffen. Das schnelle Wachstum von Gewebe
ist deshalb auf die Bildung neuer Gefäße
im und um den Tumor herum angewiesen.
Eine medikamentöse Beeinträchtigung der
Angiogenese könnte demnach das Tumorwachstum
verringern und damit die Chancen
A B C
Tube Formation Assay
homogene
Zellaussaat
Gelmatrix
5x
tube
formation
Sprouting Spheroid
Zell Sphäroid
5x
bei der Behandlung mit komplementären
Behandlungsmethoden, wie chirurgischen
Eingriffen, Bestrahlung und Chemotherapie
vergrößern.
Mit Nährstoffen unterversorgtes Gewebe
setzt Signalstoffe frei, die das benachbarte
Gewebe und insbesondere Endothelzellen
dazu bringen, neue Gefäße zu erzeugen.
Dieser Prozess ist meist chemotaktisch getrieben.
Ein vielgenannter Faktor in diesem
Zusammenhang ist das Molekül VEGF (vascular
endothelial growth factor), der Endo-
sprouting
(sprießen)
Stück aus Gefäßwand
12 h 12 h 12 h
Sprouting Aortic Tissue
sprouting
(sprießen)
Abb. 1: Bei gelbasierten Angiogenese-Assays wird die Entwicklung von auf einer Gelmatrix
(gelb) kultivierten Zellen mikroskopisch verfolgt. Beim Tube Formation Assay (A)
bilden vereinzelt ausgesäte Zellen charakteristische, netzartige Strukturen. Im Gegensatz
dazu bilden Endothelzellen aus sphäroidförmigen Zellverbänden oder Gefäßstücken
sprossenartige Strukturen. Dies wird beim Sprouting Spheroid Assay (B) und
beim Sprouting Aortic Tissue Assay (C) genutzt.
24 | 9. Jahrgang | Nr. 3/2008 LABORWElT
5x
thelzellen zur Zellteilung und möglicherweise
zur gerichteten Bildung neuer Gefäße anregt.
Neben einer Behandlung der Tumorzellen ist
deswegen die Unterdrückung der Angiogenese
bei Endothelzellen eine lohnende Strategie
in der Tumorbehandlung.
In vitro-Assays zur Untersuchung
der Angiogenese
Es gibt zahlreiche in vivo- und in vitro-Assays
zur Untersuchung des anti-angiogenetischen
Potentials von Substanzen. Dazu wird die
Wirkung von Stoffen auf die Gefäßneubildung
durch Endothelzellen oder deren
Vorläuferzellen anhand von Modellsystemen
analysiert. Die Möglichkeiten reichen von der
Impfung von Hühnereiern mit Endothelzellen
und verschiedenen Modellsystemen in Tieren
bis zu zellbasierten Untersuchungen. Zu den
prominenten Beispielen der zellbasierten
Assays gehören der „tube formation assay“
und der „sprouting assay“.
Beim tube formation assay werden vereinzelte
Zellen auf eine dünne Gelschicht
aufgetragen und dort für eine bestimmte Zeit
unter Zugabe von aktivierenden Substanzen
kultiviert. Das angiogenetische Potential
wird analysiert, indem die Ausprägung einer
charakteristischen Netzstruktur anhand
verschiedener Parameter (Anzahl der Knotenpunkte,
Anzahl der Verzweigungen pro
Knotenpunkt, Gesamtlänge aller Netzstrukturen,
etc.) mit mikroskopischen Aufnahmen
bestimmt wird. Obwohl die Zellen auf einer
dreidimensionalen Matrix wachsen, sind
die gebildeten Strukturen zweidimensional
und als solche der Mikroskopie gut zugänglich.
Ähnlich ist das Vorgehen beim sprouting
assay, wo ein Sphäroid aus Endothelzellen
oder auch direkt ein Stück des Gefäßes,
also etwa ein ringförmiger Querschnitt des
Gefäßes, auf die Gelmatrix gelegt werden.
Je nach Potential zur Angiogenese sprießen
aus diesen Endothelzellverbänden neue „Gefäße“
stärker oder schwächer aus. Bei beiden
Assays werden keine Gefäße mit einem Lumen
ausgebildet, sondern charakteristische
Strukturen der Gefäßbildung.
Um gute lichtmikroskopische Aufnahmen
zu erhalten, ist es erforderlich, dass sich die
Zellen in einer optischen Ebene befinden –
genauer ausgedrückt: innerhalb des Tiefenschärfebereichs
des verwendeten Objektivs
liegen. Dieser beträgt typischerweise bei
den für die Assays verwendeten 5x- oder 10x-
Objektiven rund 75 µm oder entsprechend
20 µm. Trotzdem liegen die Zellen in den
typischen Bildausschnitten von etwa 4 mm
x 3 mm (5x Objektiv) beziehungsweise 2
mm x 1,5 mm (10x Objektiv) aufgrund der
Meniskusbildung im Allgemeinen nicht im
Tiefenschärfebereich wie in Abbildung 2 C
zu sehen.