In vitro quantitation of Theileria parva sporozoites for use - TropMed ...

Samenvatting 175
______________________________________________________________________________________________
Hoofdstuk zeven is een verslag van pogingen om stabilaten te vriesdrogen, meer bepaald om een
beschreven protocol te herhalen en te verbeteren. Vriesdrogen is potentieel een goedkopere manier
om stabilaat te bewaren. Bij een eerdere poging was men er in geslaagd om dieren te infecteren met
gelyofiliseerd stabilaat, maar was tevens vastgesteld dat minder dan 1% van de sporozoieten de
procedure overleefd hadden. Indien dit kon herhaald worden moest getracht worden om dit
rendement te verhogen. Katete en Chitongo T. parva sucrose en trehalose stabilaten werden getest.
Tevens werden gehele geïnfecteerde teken, speekselklieren van teken en stabilaatgruis
gelyofiliseerd. In geen enkele combinatie werden leefbare sporozoieten gevonden. Mogelijke
redenen van dit falen worden besproken.
In hoofdstuk acht wordt de optimalisatie van de Sporozoiet Neutralisatie Test (SNT) beschreven en
getest aan de hand van verschillende sera. Momenteel is SNT gebaseerd op een telling van
geïnfecteerde cellen, wat een tijdrovende en subjectieve bezigheid is. Voorgesteld wordt om
testplaat wells in te delen in positieve en negatieve wells. Dit is een meer gebruikersvriendelijke
methode met binaire resultaten die kunnen geanalyseerd worden in een logistische regressie. Dit
hoofdstuk beargumenteert ook het gebruik van microtitratie platen in plaats van microtubes voor in
vitro titraties. Door de platen gedurende één minuut te schudden en de target cellen in de koelkast te
bewaren vóór infectie in plaats van bewaring bij 37°C, bleek het resultaat minstens zo efficiënt te
zijn als datgene van de oorspronkelijke methode. Bovendien werd een snellere methode om platen
te lezen door PCR geëvalueerd. Tenslotte werd de in vitro procedure ingekort met 48 uur door het
gebruik van een mitogeen (Concavalin A) om PBM-celculturen op te starten, achterwege te laten.
Sera van runderen, experimenteel geïnfecteerd met levende sporozoieten, dode sporozoieten of
lymfoblasten geparasiteerd door schizonten, werden wekelijks in parallel getest tegenover een
positieve (anti-p67) en een negatieve (FCS) controle. De sera werden tevens getest in een PIM-
ELISA, p67-ELISA en een SELISA met geparasiteerde lymfoblasten als antigen. Geen significante
sporozoiet inhibitie werd vastgesteld bij de drie sera, ondanks dat een duidelijk verschil met de
controles werd waargenomen. Serum van het dier, geïnfecteerd met levende sporozoieten, reageerde
positief in de drie serologische testen. Serum van het schizont geïnfecteerde dier reageerde positief
in de SELISA en PIM-ELISA. Het gebrek aan sporozoiet neutralisatie in serum van het rund, dat
verschillende malen geïnoculeerd werd met schizonten, toont tevens de voorheen beschreven lage
p67 expressie in schizonten aan. Anti-PIM sera blijken verder inefficiënt te zijn voor sporozoiet
neutralisatie en de SNT is specifiek voor anti-p67 antilichamen.