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Aislamiento de Mycoplasma en leche
y pulmones de pequeños rumiantes
Las diferentes especies de micoplasma son patógenos frecuentes en
muchas especies, incluido el ser humano. Para identificar la variedad
concreta deben emplearse medios y técnicas específicas.
En este artículo se detallan los métodos para hacerlo.
Ana Fernández, Gema Chacón
Exopol
Imágenes cedidas por los autores
Los micoplasmas son microorganismos
de pequeño tamaño pertenecientes
a la clase Mollicutes que se caracterizan
por carecer de pared celular, su
reducido genoma y su simplicidad
estructural. Están ampliamente distribuidos
en la naturaleza y muchos de
ellos son patógenos, tanto para los animales
como para el hombre.
Condiciones y
características de cultivo
• Requieren medios de cultivo especiales
que aporten los nutrientes
necesarios para los micoplasmas y
que contengan inhibidores específicos
de bacterias para el aislamiento
primario.
• Necesitan una atmósfera rica en
CO 2 .
• Su crecimiento es lento.
• Forman colonias de pequeño tamaño
visibles bajo microscopio estereoscópico.
Las colonias casi siempre
tienen forma de huevo frito (1).
Acholeplasma spp.
• Forman colonias grandes (2).
• Prueba de la digitonina negativa (3).
Ureaplasma spp.
• Requieren urea en el medio para
crecer (4).
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• Prueba de la digitonina positiva.
• Prueba de ureasa positiva.
Diferenciación
entre micoplasmas y
formas L de bacterias
Las formas L son bacterias que pierden
la capacidad de sintentizar la
pared celular y forman colonias con
la misma morfología (forma de
“huevo frito”) que los micoplasmas.
Se pueden diferenciar unos microorganismos
de otros mediante la tinción
de Dienes. Los micoplasmas
adquieren tinción permanente durante
más de 24 horas (5). Las formas L
de bacterias pierden la coloración en
menos de 30 minutos (6). •
Tabla 1. Enfermedades en pequeños rumiantes producidas por mycoplasmas.
Enfermedad
Agalaxia contagiosa
(mamitis, artritis, conjuntivitis y,
ocasionalmente, abortos)
Neumonía
Especies
afectadas
Oveja
Cabra
Oveja
Cabra
Agente
M. agalactiae
M. m. mycoides L. C.
M. capricolum subsp. capricolum
M. putrefaciens
M. ovipneumoniae
M. m. mycoides L. C.
M. capricolum subsp. capricolum
M. m. capri
M. agalactiae (ocasionalmente)
Pleuroneumonía contagiosa caprina (no
M. capricolum subsp.
Cabra
descrita en España hasta el momento)
capripneumoniae
Mycoplasma arginini se aisla a menudo en pequeños rumiantes pero se considera no patógeno.
Tabla 2.
Taxonomía de la clase Mollicutes.
Orden
Mycoplasmatales
Familia
Mycoplasmataceae
Género
Ureaplasma
Mycoplasma
Acholeplasmas Acholeplasmataceae Acholeplasma
Tabla 3.
Géneros
Diferenciación de los géneros de la clase Mollicutes.
Tamaño de
las colonias
Prueba de
la digitonina
Prueba de
la ureasa
Acholeplasma Grandes (0,8 μ) Negativa < 3 mm Negativa
Ureaplasma Muy pequeñas (0,1 μ) Positiva > 5 mm Positiva
Mycoplasma Variable Positiva > 5 mm Negativa
Tabla 4.
Especies de micoplamas aisladas a partir de muestras
de pulmones y leche de pequeños rumiantes en EXOPOL*.
M.agalactiae
M. mycoides subsp. mycoides L. C.
Muestras de leche
M. capricolum
M. arginini
M. agalactiae
M. mycoides subsp. mycoides L. C.
Muestras de pulmones
M. capricolum
M. arginini
M. ovipneumoniae
*La identificación de especie se ha realizado mediante inmunoperoxidasa y el test de inhibición
de crecimiento frente a suero monoespecífico, que es la prueba de referencia (en colaboración
con el Laboratorio Central de Sanidad Animal de Santa Fe, Granada, y el Laboratorio Agroalimentario
del Centro Tecnológico I+D de Seguridad Agroalimentaria de Zaragoza).
Aislamiento de micoplasmas
Los cultivos de micoplasmas pueden
presentar colonias con diferentes
morfologías y distintos patrones
de crecimiento, independientemente
de la especie. Es frecuente el aislamiento
de más de una especie de
micoplasma a partir de la misma
muestra clínica. El cultivo permite la
obtención de cepas para la producción
de autovacunas.
Identificación de
micoplasmas mediante
inmunocitoquímica
La identificación de la especie de
micoplasma en los aislamientos
puede efectuarse por diversos procedimientos
con el empleo de técnicas
inmunocitoquímicas.
Esta técnica permite la detección de
micoplasma en una muestra de forma
rápida y sensible mediante la marcación
con anticuerpos específicos.
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1. Colonias grandes con centro.
2. Colonias pequeñas con centro.
3. Colonias sin centro.
4. Formación de film.
5. Hemólisis en agar sangre.
6. Acidificación o alcalinización de
un medio con indicador de pH.
7. Prueba de inhibición del crecimiento:
el desarrollo de una cepa se
inhibe al enfrentarla con un suero
específico que impregna el disco. Si
el suero es frente a M. agalactiae, se
trata de una cepa de M. agalactiae.
8. Prueba AGID (Agar Gel InmunoDiffusion)
para micoplasmas con tinción
azul Coomasie. Se enfrenta a un
extracto crudo de un cultivo de micoplasma
como antígeno (en los pozos
pequeños de la periferia) con un anticuerpo
policlonal anti Mycoplasma
agalactiae (centro del patrón).
9. Células de leche ovina infectada
con Mycoplasma spp.
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