tesi dottorato fabbro.pdf - OpenstarTs - Università degli Studi di Trieste

6.8 CONFRONTARE GLI ANTICORPI ANTI ACTINA CON GLI
ANTI TRANSGLUTAMMINASI
La ricerca degli anticorpi anti-tTG di classe IgA per il confronto con gli AAA è stata
eseguita con la metodica immunoenzimatica ELISA su sieri di pazienti celiaci, su controlli
sani e su soggetti con altre malattie autoimmuni ( Morbo di Chron, Rettocolite Ulcerosa)
Il test si è dimostrato affidabile perchè dotato di elevata di specificità (98%) e sensibilità
(99%), poco costoso e non operatore dipendente.
La transglutamminasi umana (h-tTG) utilizzata come antigene è stata ottenuta mediante la
tecnologia del DNA ricombinante.
Il test ELISA è stato seguito in apposite piastre in polietilene a 96 pozzetti secondo il
seguente protocollo:
1. Attivazione su piastra..- preparare una soluzione di h-tTG diluita in PBS. ad una
concentrazione di 20µg/ml
2. Lasciare in incubare a +4 per almeno 14-16 ore. .In questa fase l’antigene si lega
al fondo dei pozzetti.
3. Lavare la piastra per tre volte con PBS Tween 0,005%.
4. Saturazione della piastra - dispensare 300 µl di PBS Tween 0,1 % per evitare la
formazione di legami specifici tra anticorpi del siero e zone rimaste prive di
antigene sul fondo del pozzetto dando così risultati falsamente positivi .La
saturazione deve durare 40 minuti a RT
5. Dispensare in ogni pozzetto 100 µl di siero diluito. Per il controllo bianco si
dispensa un uguale volume di PBS Tween 0,1%. Per il controllo positivo ,nello
studio delle IgA si usa una diluizione 1:200
6. Incubare i sieri per 60 minuti a RT. Durante questa fase gli anticorpi anti –tTG di
classe IgA eventualmente presenti nel siero testati si legano all’antigene sul fondo
del pozzetto
7. Lavare nuovamente con la procedura prima descritta.
8. Dispensare per ogni pozzetto gli anticorpi anti Ig A .marcati con fosfatasi alcalina
(Sigma) Il solvente per gli anticorpi anti IgA è il PBS-BSA 1%PEG 4%. La
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