tesi dottorato fabbro.pdf - OpenstarTs - Università degli Studi di Trieste
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La concentrazione dell’enzima <strong>di</strong> restrizione da usare <strong>di</strong>pende dalla concentrazione<br />
dell’amplificato.<br />
Digestione: 3h a 60°C.<br />
Controllare il campione <strong>di</strong>gerito su gel <strong>di</strong> agarosio 3% in TBE 1X.<br />
6.9.2 SEQUENZIAMENTO<br />
a) PRE-PCR DI SEQUENZA<br />
• Buffer 1X<br />
• MgCl2 1,5 mM<br />
• dNTP 200 µM<br />
• primer 0,5 µM<br />
• DNA (1 µl da 50 µl <strong>di</strong> 2xYT in cui è stata risospesa 1 colonia del clone da<br />
analizzare)<br />
• Taq DNA polimerasi 0,025 U/µl<br />
• H2O bi<strong>di</strong>stillata sterile a 20 µl<br />
Primer forward VHseq: 5' CAA CTT TCA ACA GTA GCG GC 3'<br />
Primer back VHPTL: 5' GGA GGG TCG ACC ATA ACT TCG TAT AAT GTA<br />
Con<strong>di</strong>zioni <strong>di</strong> amplificazione:<br />
denaturazione lunga - 94°C per 5'<br />
30 cicli:<br />
• denaturazione breve - 94°C per 30''<br />
• appaiamento - 60°C per 30''<br />
• allungamento - 72°C per 45''<br />
TAC TAT ACG AAG TTA TCC TCG AGC GGT A 3'<br />
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