zde - 1. lékařská fakulta - Univerzita Karlova

26
SEKCE POSTGRADUÁLNÍ – TEORETICKÁ ČÁST
SURFACE MAPPING OF HUMAN CYSTATHIONINE Β-SYNTHASE BY CHEMICAL MODIFICATION OF
AMINO ACIDS
Author: Ing. Aleš Hnízda
Supervisor: doc. MUDr. Viktor Kožich, CSc., of the Charles Univerzity in Prague, First Faculty of Medicine, Institute of
Inherited Metabolic Disorders
Cystathionine β-synthase (CBS) is a tetrameric enzyme containing 551 amino acids, which catalyzes condensation of serine
with homocysteine. Deficiency of this enzyme results in homocystinuria, the most common genetic disorder of sulfur amino
acid metabolism.
The 3-D structure of this protein was determined only for the dimeric truncated form (amino acids 1-413) lacking the C-terminal
domain since hydrophobicity of the C-domain and putative conformational flexibility prevented successful crystallization
of the full-length CBS protein. The aim of this work is to obtain complementary data on spatial arrangement of truncated
and wild type CBS enzyme using chemical modification of surface exposed amino acid residues.
Feasibility of surface mapping was tested using truncated CBS modified by agents specifically reacting with selected amino
acids. Labeled protein was digested by appropriate proteolytic enzymes, modified residues being indentified by MALDI-TOF
mass spectrometry.
Initially, we tested eight labelling compounds and six of them turned out to be suitable since they have not altered the
quarternary structure and activity of CBS, namely 4 –hydroxyphenylglyoxal, N-ethylmaleinimide, diethylpyrocarbonate, N-hydroxysulfosuccinimide
acetate, N-brom-succinimide and N-acetylimidazole.
Then, we compared data obtained by chemical labelling with solvent accessibility calculated from structural model of truncated
CBS. N- and C- terminal parts were not assigned by X-ray diffraction and were identified as the most reactive in the protein. It can be
implied that these regions are solvent-exposed and enormously flexible. Other reactive residues were solvent exposed in the model;
the only exception was labelling of one buried cysteine residue. Our data suggest that reactivity of amino acid residues reflects their
surface accessibility but it can be also influenced by protein structure dynamics and microenviroment of side-chains.
In conclusion, we developed protocols for chemical labeling of truncated CBS and feasibility of this approach was successfully
tested. Using this technique we could study spatial arrangement of full-lenght CBS.
CHEMICKÉ CHAPERONY OVLIVŇUJÍ SBALOVÁNÍ MUTOVANÝCH FOREM CYSTATHIONIN -Β- SYN-
THASY
Autoři: Kopecká J., Kožich V.
Školitel: doc. MUDr. Viktor Kožich, CSc., Ústav dědičných metabolických poruch 1. LF a VFN
Homocystinurie z deficitu cystathionin-β-synthasy (CBS) je nejčastějším onemocněním metabolismu sirných aminokyselin. Abnormální
sbalování a agregace mutovaných proteinů je jedním z hlavních mechanismů patogeneze deficitu CBS. Chemické chaperony
jsou látky, které pomáhají sbalovat a stabilizovat proteiny, které mají zvýšenou tendenci k tomuto chování; jejich podávání je novým
trendem v léčbě tzv. konformačních onemocněních. Tato studie se zaměřuje na sledování efektu vybraných látek na kvarterní strukturu
a aktivitu panelu 27 patogenních mutantů CBS reprezentujících dvě třetiny všech známých alel homocystinurických pacientů.
Pro studii byla vybrána δ-aminolevulová kyselina (prekursor kofaktoru CBS – hemu) a tři chemické chaperony – betain, taurin
a glycerol. Jelikož se nepodařil prokázat transport serinu a S-adenosyl-L-methioninu do buněk E. coli, byly tyto látky ze studie
v pokaryotickém systému vyřazeny. Zbývající látky byly přidávány do růstového média koexpresně. Bakteriální lyzáty byly analyzovány
pomocí nativní elektroforézy v polyakrylamidovém gelu a následného western blottingu s imunochemickou detekcí, specifická
enzymová aktivita byla měřena pomocí eseje s radioaktivně značeným substrátem. Více než polovina testovaných mutantů
byla pozitivně ovlivněna přítomností 0,5 mM δ-aminolevulátu, 100 mM betainu a/nebo 750 mM glycerolu; tyto látky podporovaly
správné sbalení mutovaných enzymů, ve většině případů došlo i ke zvýšení katalytické aktivity. Nejvýraznějšího efektu jsme
dosáhli koexpresní přítomností glycerolu; 13 mutantů tvořilo 1,3-3,3krát více správně sbalených forem, specifická aktivita byla
zvýšena až 6,2krát. δ-Aminolevulát ovlivnil 13 mutantů (1,3-4,1krát více správně sbalených forem, až 3,5krát vyšší specifická aktivita).
Betain podpořil správné sbalování u 8 mutantů (1,3-1,8krát více správně sbalených forem, až 1,6krát vyšší specifická aktivita).
Tato studie prokázala, že sbalování některých CBS mutantů je možné ovlivnit pomocí chemických chaperonů a tím obnovit jejich
biologickou aktivitu, což by v budoucnu mohlo přinést nové možnosti terapie homocystinurie.
Práce byla podpořena grantem Wellcome Trust Senior Fellowship, grantem GAUK č. 257845 a Výzkumným záměrem UK VZ MSM
ČR 0020620806.
PROCES ZMĚNY U PACIENTŮ S ANOREXIA NERVOSA: MEZINÁRODNÍ POSTGRADUÁLNÍ SPOLU-
PRÁCE VE VĚDECKÉ PŘÍPRAVĚ V OBLASTI PORUCH PŘÍJMU POTRAVY
Autorka: MUDr. Svetlana Žuchová
Školitelka: prof. MUDr. Hana Papežová, Ph.D., Psychiatrická klinika, 1. LF UK a VFN
V našem sdělení se budeme věnovat mezinárodnímu projektu INTACT jako jedné z forem mezinárodní spolupráce v postgraduálním
vzdělávání a výzkumu. Projekt INTACT (Individually Tailored Stepped Care for Women with Eating Disorders) je součástí