zde - 1. lékařská fakulta - Univerzita Karlova
zde - 1. lékařská fakulta - Univerzita Karlova
zde - 1. lékařská fakulta - Univerzita Karlova
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
SEKCE PREGRADUÁLNÍ TEORETICKÁ – VÍTĚZNÉ PRÁCE<br />
Obrázek 2. Purifikační kroky z pilotní purifikace na denaturačním 9% polyakrylamidovém gelu obarveným Coomassie<br />
briliantovou modří: <strong>1.</strong> marker Blue Ranger Prestained 2. hrubý lyzát, 3. nenavázaná frakce, 4. první promývací krok, 5. třetí promývací<br />
krok, 6. eluát - <strong>1.</strong> frakce (GST-rCeCS), 7. eluát – 2. frakce (GST-rCeCS), 8. přečištěná rCeCS, 9. eluát po odštěpení rCeCS (GST +<br />
proteasa preScission), 10. marker Precision Plus Protein Dual Color Standards<br />
Obrázek 3. BN PAGE na 7,5% polyakrylamidovém gelu: Na jednu dráhu bylo aplikováno 15 μg celkového proteinu. <strong>1.</strong> rCeCS, 2. α-<br />
-Lactalbumin (14,2 kDa), 3. Anhydrasa kyseliny uhličité (29 kDa), 4. Ovalbumin (90 kDa), 5. Hovězí sérový albumin (66 a 132 kDa), 6.<br />
Ureasa (272 a 545 kDa)<br />
Absorpční UV/VIS spektrum rCeCS ukazuje dvě maxima při vlnové délce 286 nm a 408 nm v poměru 1 : 0,25, typické pro<br />
enzymy obsahující pyridoxal-5´-fosfát (Obr. 4). Z CD spektra měřeného v daleké UV oblasti jsme zaznamenali maxima u 220<br />
a 209 nm, která jsou charakteristická pro přítomnost α-helikálního uspořádání peptidového řetězce. Z výsledných hodnot naměřeného<br />
spektra odhadujeme 30% obsah α-helixů v rCeCS. Určení obsahu β-struktury v rCeCS je z naměřeného CD spektra<br />
nemožná.<br />
Nejdůležitějším výsledkem je potvrzení skutečnosti, že rCeCS má cysteinsynthasovou aktivitu. Při stanovení substrátové<br />
specifity rCeCS jsme vycházeli ze znalostí alternativních reakcí cystathionin-β-synthasy, která vykazuje vysokou konzervovanost<br />
katalytické domény s CS. Výsledné aktivity jsme porovnávali s CBS aktivní jádro. Studovali jsme celkem 6 reakcí (Tab. 1),<br />
které jsme analysovali oběma směry. Reakce jsme vyhodnotili pomocí HPTLC desky s ninhydrinovou detekcí. Enzymovou aktivitu<br />
rCeCS jsme zjistili jen u jedné studované reakce a to: O-acetyl-serin + sulfid → cystein + acetát.<br />
Přečištěná rCeCS vykazuje hodnotu K M 5,54 ± 0,66 mmol/l pro sulfid a 4,23 ± 1,15 mmol/l pro O-acetyl-L-serin. Hodnota<br />
molární aktivity enzymu (kcat) je 137 ± 13 s -1 .<br />
Zjištěné kinetické parametry u rCeCS jsme porovnali s jinými enzymy jevícími cysteinsynthasovou aktivitu (tab. 2). Hodnota<br />
KM pro O-acetyl-L-serin je srovnatelná s jinými porovnanými hodnotami, zatímco pro sulfid je podobná jen cystathionin-β-<br />
-synthase u Trypanosoma cruzi. U rostlinných a bakteriálních CS je hodnota KM pro sulfid podstatně vyšší a lze se proto domnívat,<br />
že CS (gen C17G<strong>1.</strong>7) u C. elegans hraje svou roli především v přítomnosti vysoké koncentrace sulfidu. Hodnota kcat nedosa-<br />
65
Change language