Stefanie Lapp Ha - TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule ...

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Deutschen Nationalbibliografie;
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1. Auflage 2013
© 2013 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH,
Gießen
Printed in Germany
ISBN 978-3-86345-191-2
Verlag: DVG Service GmbH
Friedrichstraße 17
35392 Gießen
0641/24466
info@dvg.de
www.dvg.de

Tierärztliche Hochschule Hannover
In vivo Untersuchungen über die onkolytische Wirkung des
Staupevirus bei dem disseminierten histiozytären Sarkom des
Hundes in einem Mausmodell
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet)
Vorgelegt von
Stefanie Lapp
aus Arnstadt / Thüringen
Hannover 2013

Wissenschaftliche Betreuung:
Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, Ph.D.,
Institut für Pathologie
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, Ph.D.
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Volker Moennig
Tag der mündlichen Prüfung: 11.11.2013
Die Anfertigung dieser Arbeit wurde durch ein Stipendium der Studienstiftung
des deutschen Volkes gefördert.

Teile dieser Arbeit wurden auf der Jahrestagung der Fachgruppe Pathologie der
Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft in Fulda (2013) präsentiert.
Lapp, S., C. Puff, W. Baumgärtner:
Neue Aufgaben für einen Altbekannten - Erkenntnisse zu Staupevirus-assoziierter
Onkolyse in persistierend infizierten kaninen histiozytären Sarkomtransplantaten in
der Maus
Tierärztliche Praxis Kleintiere / Heimtiere 3: A33-A39
Puff, C., S. Lapp, Y. Barthel, W. Baumgärtner:
Kanines histiozytäres Sarkom – Virale Onkolyse im Mausmodell
Tierärztliche Praxis Kleintiere / Heimtiere 3: A33-A39

Für meine Familie

Alles Gescheite ist schon gedacht worden, man muss nur versuchen, es noch einmal zu denken.
(aus Wilhelm Meisters Wanderjahre, Betrachtungen im Sinne der Wanderer)
Johann Wolfgang von Goethe

Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ............................................................................................................ 1
2. Literaturübersicht ............................................................................................... 3
2.1. Virale Onkolyse und onkolytische Viren ............................................................................. 3
2.1.1. Ein kurzer geschichtlicher Abriss ..................................................................................... 3
2.1.2. Onkolytische Viren im Allgemeinen - Definition und Mechanismen ................................ 3
2.1.3. Onkolytische Viren im Speziellen .................................................................................... 6
2.1.4. Onkolytische Virotherapie in der Veterinärmedizin ....................................................... 10
2.1.5. Herausforderungen der Virotherapie ............................................................................. 11
2.2. Histiozytäre Neoplasien ...................................................................................................... 13
2.2.1. Histiozyten ..................................................................................................................... 13
2.2.2. Formen histiozytärer Erkrankungen beim Hund ............................................................ 14
2.2.3. Histiozytäres Sarkom des Hundes und des Menschen ................................................. 15
2.2.4. Die permanente histiozytäre Sarkomzelllinie DH82 ...................................................... 16
2.3. Das kanine Staupevirus ...................................................................................................... 16
2.3.1. Die kanine Staupeviruserkrankung................................................................................ 16
2.3.2. Die Eigenschaften des Staupevirus............................................................................... 17
2.3.2.1. Lymphotropismus und Mechanismen der Immunsuppression .............................. 17
2.3.2.2. Nectin-4 als epitheliales Rezeptorprotein und Tumorzellmarker ........................... 18
2.3.3. Die Rolle von Monozyten und Makrophagen im Zuge einer Staupevirusinfektion ........ 18
2.3.4. Immunisierung gegen das kanine Staupevirus ............................................................. 19
2.3.5. Der Staupevirusimpfstamm Onderstepoort ................................................................... 20
2.4. Mausmodelle in der onkologischen Forschung ............................................................... 20
2.4.1. Die severe combined immunodeficiency (Scid) - Mutation ........................................... 21
2.4.2. Transplantation persistierend Virus-infizierter Tumorzellen .......................................... 22
2.5. Tumorprogression und der Einfluss des Tumormikromilieus ....................................... 23
2.5.1. Tumorangiogenese ........................................................................................................ 24
2.5.2. Tumorimmunität ............................................................................................................. 25
2.5.2.1. Natürliche Killer (NK-) und Natürliche Killer T- (NKT-) Zellen ............................... 26
2.5.2.2. Tumor-assoziierte Makrophagen (TAM)................................................................ 26
2.5.3. Interferon-γ (IFN-γ), Tumorimmunität und Anti-Angiogenese ....................................... 28
2.6. Arten des Zelluntergangs, deren morphologische Nachweismethoden und
assoziierte immunologische Reaktionen .......................................................................... 29
2.6.1. Nekrose ......................................................................................................................... 29
2.6.2. Apoptose ........................................................................................................................ 30
2.6.3. Autophagie ..................................................................................................................... 30
2.6.4. Zelluntergang-assoziierte immunologische Reaktionen ................................................ 31
3. Material und Methoden .................................................................................... 33
3.1. Allgemeiner Versuchsaufbau ............................................................................................. 33
3.1.1. Tierversuchsplan: DH82-Transplantate mit intratumoraler Injektion von CDV-Ond ..... 33
3.1.2. Tierversuchsplan: DH82CDVpi-Transplantate .............................................................. 38
3.2. Zellkulturelle Vorarbeiten zum Tierversuch ...................................................................... 41

II
Inhaltsverzeichnis
3.2.1. Vorbereitung der Zellen für die Transplantation ............................................................ 41
3.2.2. Ernte der zu transplantierenden Zellen ......................................................................... 42
3.2.3. CDV-Ond zur intratumoralen Infektion der Xenotransplantate ...................................... 43
3.2.3.1. CDV-Ond-Inaktivierung mittels UV-Licht-Bestrahlung ........................................... 43
3.3. Methodik des Tierversuchs ................................................................................................ 44
3.3.1. Mäuse ............................................................................................................................ 44
3.3.2. Haltung und Maßnahmen zur Minimierung des Keimdruckes in der Umgebung .......... 44
3.3.3. Handling und Untersuchung der Tiere unter der Maßgabe der Minimierung des
Keimdruckes .................................................................................................................. 45
3.3.4. Xenotransplantation von DH82- und DH82CDVpi-Zellen bzw. des Plazebos .............. 47
3.3.5. Tumormessung und Kalkulation des Tumorvolumens .................................................. 48
3.3.6. Intratumorale Injektionen ............................................................................................... 49
3.3.7. Euthanasie ..................................................................................................................... 49
3.3.8. Sektion und Probennahme ............................................................................................ 50
3.4. Probenprozessierung für Histochemie und Immunhistologie ........................................ 51
3.5. Histologie ............................................................................................................................. 54
3.5.1. Auswertung der HE-gefärbten Präparate ...................................................................... 54
3.6. Immunhistologie .................................................................................................................. 55
3.6.1. Antikörper und Seren ..................................................................................................... 56
3.6.2. Schnitte für die Immunhistologie ................................................................................... 59
3.6.3. Protokoll der Immunhistologie (ABC-Methode) ............................................................. 61
3.6.4. Demaskierungsverfahren .............................................................................................. 63
3.6.4.1. Mikrowellenvorbehandlung .................................................................................... 63
3.6.4.2. Trypsin ................................................................................................................... 63
3.6.5. Kontrollen für die Immunhistologie ................................................................................ 63
3.6.5.1. Positivkontrollen der Serien und erfolgreichen Antikörperetablierung .................. 63
3.6.5.2. Negativkontrollen der Serien und erfolgreichen Antikörperetablierung ................. 64
3.6.6. Auswertung der Immunhistologie .................................................................................. 64
3.6.6.1. CDV-Nukleoprotein und CD44 .............................................................................. 64
3.6.6.2. MHC II und aktivierte Caspase 3 ........................................................................... 65
3.6.6.3. CD31 ...................................................................................................................... 65
3.6.6.4. Mac 3, CD3 und CD45R ........................................................................................ 66
3.6.6.5. AGM 1 .................................................................................................................... 66
3.7. Statistik ................................................................................................................................. 67
3.8. Zusätzliche Untersuchungen ............................................................................................. 67
3.8.1. Eignung einer Glioblastomzelllinie des Hundes zur Infizierbarkeit mit kaninen
Viren .............................................................................................................................. 67
4. Ergebnisse ........................................................................................................ 69
4.1. DH82-Transplantate mit intratumoraler Injektion ............................................................. 69
4.1.1. Ergebnisse der Vorversuche ......................................................................................... 69
4.1.1.1. Klinische / in vivo-Ergebnisse zur Volumenentwicklung der DH82-Tumoren
bis 77 Tage nach Transplantation ......................................................................... 69
4.1.1.2. Klinische / in vivo-Ergebnisse zur Volumenentwicklung der DH82-Tumoren
nach einmaliger intratumoraler Injektion ................................................................ 70
4.1.2. Ergebnisse der Hauptversuche ..................................................................................... 72
4.1.2.1. Klinische / in vivo-Ergebnisse zur Volumenentwicklung der DH82-Tumoren
bei maximal zehnmaliger intratumoraler Injektion ................................................. 72

Inhaltsverzeichnis
III
4.1.2.2. Tumormorphologie der DH82-Tumoren mit zehnmaliger intratumoraler
Injektion sowie der nicht-injizierten DH82-Kontrolltumoren ................................... 74
4.2. DH82CDVpi-Transplantate .................................................................................................. 76
4.2.1. Klinische / in vivo Ergebnisse zur Volumenentwicklung der DH82CDVpi-
Transplantate ................................................................................................................. 76
4.2.2. Makroskopische Tumormorphologie der DH82CDVpi-Transplantate sowie der
DH82-Kontrolltumoren ................................................................................................... 78
4.2.3. Histologische und immunhistologische Untersuchungsergebnisse zu den
DH82CDVpi-Transplantaten und deren Kontrollen (DH82-Transplantate) ................... 80
4.2.3.1. Nachweis von Staupevirusantigen ........................................................................ 80
4.2.3.2. Allgemeine Tumormorphologie (HE, CD44- und MHC II- Immunhistologie) ......... 81
4.2.3.3. Tumor- und Nekroseflächen .................................................................................. 92
4.2.3.4. Apoptose ................................................................................................................ 94
4.2.3.5. Tumorvaskularisation ............................................................................................. 96
4.2.3.6. Charakterisierung der durch die Tumoren hervorgerufenen Entzündungsreaktion
des Wirtsorganismus ............................................................................... 98
4.2.3.6.1 Mac 3-positive Zellen........................................................................................... 98
4.2.3.6.2 CD3-positive Zellen ........................................................................................... 102
4.2.3.6.3 CD45R-positive Zellen....................................................................................... 105
4.2.3.6.4 Vergleich der Entzündungsparameter ............................................................... 108
4.2.3.7. Korrelationsanalysen ........................................................................................... 112
4.3. Infektion einer Glioblastomzelllinie mit kaninen Viren .................................................. 113
4.4. Antikörperetablierungen für die Immunhistologie ......................................................... 114
5. Diskussion ...................................................................................................... 115
5.1. DH82-Transplantate mit intratumoraler Injektion ........................................................... 115
5.1.1. Volumenentwicklung und makroskopische Tumormorphologie der DH82-Tumoren
mit maximal zehnmaliger intratumoraler Injektion ....................................................... 116
5.2. DH82CDVpi-Transplantate ................................................................................................ 119
5.2.1. Volumenentwicklung und makroskopische Tumormorphologie .................................. 119
5.2.2. Histologische und immunhistologische Tumormorphologie ........................................ 121
5.2.2.1. Nachweis von Staupevirusantigen ...................................................................... 121
5.2.2.2. Tumormorphologie ............................................................................................... 121
5.2.2.3. Tumormikromilieu ................................................................................................ 126
5.2.3. Eignung des Scid-Mausmodells in der viralen Onkolyseforschung ............................ 133
5.2.4. Eignung des Staupevirus als onkolytisches Agens beim histiozytären Sarkom des
Hundes ........................................................................................................................ 133
5.3. Schlussbetrachtung .......................................................................................................... 135
6. Zusammenfassung ......................................................................................... 137
7. Summary ......................................................................................................... 141
8. Literaturverzeichnis ....................................................................................... 145
9. Anhang ............................................................................................................ 165
9.1. Bezugsquellen für Antikörper, Chemikalien, Reagenzien, Tiere, Viren und Zellen .... 165

IV
Inhaltsverzeichnis
9.2. Bezugsquellen für Geräte und Einmalartikel .................................................................. 169
9.3. Lösungen und Puffer für die Immunhistologie .............................................................. 174
9.3.1. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ................................................................ 174
9.3.2. Zitratpuffer ................................................................................................................... 174
9.3.3. Trypsin ......................................................................................................................... 174
9.3.4. 3,3´-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid-Lösung (DAB) ............................................. 174
9.4. Tabellen .............................................................................................................................. 175
9.5. Abkürzungen ...................................................................................................................... 205
10. Danksagung .................................................................................................... 209

Einleitung 1
1. Einleitung
Kanine histiozytäre Sarkome kommen als lokale und disseminierte Form vor
(Schwens et al., 2011). Die häufigsten, von dieser Tumorerkrankung betroffenen,
Hunderassen sind Berner Sennenhunde und Rottweiler (Affolter und Moore, 2002).
Während sich bei der lokalisierten Form die Mehrheit der Tumoren in der Haut der
Gliedmaßen befindet, stellt die disseminierte Form ein multizentrisches Geschehen
dar, dessen Primärtumor am häufigsten in Milz, Leber, Lunge, Knochenmark oder
Lymphknoten lokalisiert ist. Ferner ist diese Form, im Zuge der schnellen klinischen
Verschlechterung des Patienten sowie des mangelhaften Ansprechens auf
chemotherapeutische Behandlungen, regelmäßig assoziiert mit einer schlechten
Prognose (Affolter und Moore, 2002). Mit kombinierter Chemo- und Radiotherapie
wurde in einer Studie von Fidel et al. (2006) eine mittlere Überlebenszeit von 158
Tagen erreicht.
Das Hundestaupevirus (CDV) gehört, wie auch das Masernvirus, zum Genus der
Morbilliviren und zur Familie der Paramyxoviridae (Pringle; 1999, Beineke et al.,
2009). Es ist klinisch im Wesentlichen mit einer, mit Leukopenie und Verlust von
Lymphozyten einhergehenden, Immunsuppression, katarrhalischen Erkrankungen
des Gastrointestinal- und Respirationstraktes sowie akuten oder chronischen Leukound
/ oder Polioenzephalitiden assoziiert (Baumgärtner, 1993; Deem et al., 2000;
Beineke et al., 2009).
Onkolytische Viren sind virale Organismen, die zur zytoreduktiven Therapie humaner
und veterinärmedizinisch relevanter Neoplasien eingesetzt werden können (Parato et
al., 2005; Arendt et al., 2009; Bourke et al., 2011; Patil et al., 2012). Nachdem sich
Berichte über Tumorregressionen nach akzidenteller Maservirusinfektion in den
letzten zwei bis drei Jahrzehnten des letzten Jahrhunderts häuften (Bluming et al.,
1971; Zygiert et al., 1971; Taqi et al., 1981), erhielt die virale Onkolyseforschung,
vornehmlich im humanmedizinischen Bereich, zu Beginn des neuen Jahrtausends
kräftigen Aufwind. Seither stehen eine Vielzahl, teilweise tumorselektiver und
genetisch veränderter Viren im Fokus humanmedizinischer Krebsforschung (Parato

2
Einleitung
et al., 2005; Patil et al., 2012). In der Veterinärmedizin befinden sich
dementsprechende Untersuchungen hingegen noch in ihren Anfängen. Angeregt
durch vielfach ermutigende Ergebnisse in Studien zur viralen Onkolyse mit
Masernviren, sowie deren pathogenetische und virostrukturelle Ähnlichkeiten zum
nah verwandten kaninen Staupevirus, gelangte auch letzteres zunehmend in der
Fokus der viralen Onkolyseforschung (Suter et al., 2005; Puff et al., 2009, del Puerto
et al., 2011; Miest et al.; 2011).
Ziel dieser Studie war die Beurteilung des onkolytischen Potenzials des kaninen
Staupevirus auf Transplantate eines kaninen histiozytären Sarkoms im Mausmodell.
Hierfür wurden Xenotransplantate kaniner histiozytärer Sarkomzellen in der
Unterhaut immunsupprimierter Mäuse generiert. Es erfolgten intratumorale
Applikationen des kaninen Staupevirus und die klinische Beobachtung der
Tumorvolumenentwicklung. Gleichzeitig fanden Xenotransplantationen von Zellen
der gleichen Linie statt, die jedoch persistierend mit den kaninen Staupevirus infiziert
waren. Auch hier erfolgte die klinische Beobachtung der Tumorvolumenentwicklung.
Mit dem Ziel der Analyse des, einer Tumorregression zu Grunde liegenden,
Mechanismus, wurden die entstandenen persistierend-infizierten Tumoren
histologisch und immunhistologisch aufgearbeitet
Hedan et al. (2011) äußern in einer Studie zu histiozytär-proliferativen Erkrankungen
des Menschen die Vermutung, dass diese und die entsprechende kanine Variante
pathogenetische Gemeinsamkeiten aufweisen. Insofern kann das kanine histiozytäre
Sarkom als Modell zur Erforschung des Potenzials virotherapeutischer
Behandlungen der humanen Erkrankung dienen.

Literaturübersicht 3
2. Literaturübersicht
2.1. Virale Onkolyse und onkolytische Viren
Virale Onkolyse beschreibt ein, zur konventionellen Chemo-, Radio- und
chirurgischen Therapie alternatives Konzept zur Benutzung von so genannten
onkolytischen bzw. onkotropen Viren zur Behandlung von Tumorerkrankungen.
Vorteile bestehen vor Allem in der biotechnologischen Veränderbarkeit von Viren, die
es ermöglicht durch Steigerung der Tumorselektivität und -spezifität therapeutische
Erfolge in Neoplasien zu erzielen, die sich als resistent gegen konventionelle Radiound
Chemotherapeutika erwiesen haben (Vähä-Koskela et al., 2007).
2.1.1. Ein kurzer geschichtlicher Abriss
Erste Erwähnung eines viro-therapeutischen, anti-proliferativen Effektes findet 1912
eine attenuierte Tollwutvakzine, welche einer Frau mit einem Zervixkarzinom in Folge
akzidenteller Tollwutinfektion verabreicht wurde (Sinkovics et al., 2008). In den
folgenden Jahren wurden, unter anderem vom Institut Pasteur in Paris, eine Vielzahl
von Viren in Tumorstudien an Labornagern getestet, welche auf einer ersten
Konferenz zu onkogenen und onkolytischen Viren 1957 in Houston, Texas
Erwähnung fanden (Sinkovics et al., 2008). Schub bekam dieses Feld der Forschung
im Wesentlichen durch Berichte von Leukämiepatienten, die im Zuge einer
natürlichen Masernvirusinfektion Regressionen erfuhren (Bluming et al., 1971;
Zygiert et al., 1971; Taqi et al., 1981). Kurze Zeit später richtete sich die
Aufmerksamkeit auf einen attenuierten Newcastle Disease-Virusstamm, der in vitro
und in vivo onkolytische Aktivität bei einer humanen Neuroblastomzelllinie zeigte
(Lorence et al., 1994). Während sich die veterinärmedizinische Forschung auf
diesem Gebiet noch in den Kinderschuhen befindet, stehen seither eine Vielzahl,
teilweise tumorselektiver und genetisch veränderter Viren im Fokus
humanmedizinischer Krebsforschung (Parato et al., 2005; Patil et al., 2012).
2.1.2. Onkolytische Viren im Allgemeinen - Definition und Mechanismen
Onkolytische Viren sind zufällig entdeckte, spezifisch ausgewählte oder genetisch
veränderte Organismen, die zur zytoreduktiven Therapie humaner und

4 Literaturübersicht
veterinärmedizinisch relevanter Neoplasien eingesetzt werden können (Parato et al.,
2005; Arendt et al., 2009; Bourke et al., 2011; Patil et al., 2012). In der Literatur
werden 3 Generationen onkolytischer Viren beschrieben: 1. in-vitro passagierte,
genetisch unveränderte Virusstämme, 2. genetisch veränderte, selektiv infizierende
bzw. selektiv replizierende Virusstämme und 3. Transgen-exprimierende, so
genannte armierte, onkolytische Viren (Liu et al., 2007). Neben genetisch
veränderten Stämmen sind auch Wildtyp-Virusstämme bekannt, welche z.B. durch
die Ausnutzung Tumor-spezifischer Defekte in der Interferonantwort (Stojdl et al.,
2000) oder über die Nutzung überexprimierter Rezeptoren (Suter et al., 2005)
Tumorzellen selektiv infizieren bzw. sich selektiv in diesen replizieren.
Den Viren jeder Entwicklungsstufe ist gemein, dass sie Tumorzellen infizieren, sich in
ihnen vermehren und idealerweise über primäre oder sekundäre Mechanismen zu
Zelluntergängen führen (Liu et al., 2007).
Onkolytische Viren der ersten Generation sind genetisch unveränderte Virusstämme.
(Liu et al., 2007). Deren primäre Schädigung der Tumorzelle unterscheidet sich kaum
von Mechanismen des Zelluntergangs einer normalen Zelle nach Infektion mit einem
Krankheitserreger. Nach Bindung des Virus an Zelloberflächenrezeptoren, dessen
Endozytose und intrazellulärer Aufspaltung in das Genom und die Strukturproteine,
kommt es im Allgemeinen zur Replikation des viralen Genoms durch Nutzung
zellulärer Transkriptions- und Translationsmechanismen (Parato et al., 2005; Kumar
et al., 2010). Das kann zur Hemmung der zellulären DNS-, RNS- und
Proteinsynthese zu Gunsten der Virusreplikation sowie zur Integration viraler
Proteine in zelluläre Membranen führen. Diese Ereignisse gipfeln, nach
intrazellulärer Multiplikation, schließlich in der Desintegration zellulärer Membranen
mit nachfolgender Karyo- und Zytolyse der Wirts- bzw. Tumorzelle in Folge
explosionsartiger Freisetzungen von Virionen (Parato et al., 2005, Kumar et al.,
2010). Führen diese Geschehnisse allein nicht zur letalen Schädigung der
Tumorzelle, können Virus-bedingte subletale Störungen der Zellhomöostase eine
Aktivierung von intrinsischen und / oder extrinsischen Apoptosemechanismen
bewirken (Ye et al., 2006; Elankumaran et al., 2006). Jiang et al. (2007) sowie Ito et

Literaturübersicht 5
al. (2006) messen des Weiteren autophagischen Mechanismen des Zelluntergangs
eine Bedeutung im Rahmen der Virotherapie von Tumoren bei.
Ferner rufen Virusinfektionen, in der Regel über die Ausschüttung von Interferon-γ
(IFN-γ) und die Präsentation viralen Antigens auf der Zelloberfläche, eine Aktivierung
der angeborenen und erworbenen Immunantwort hervor (Tizard und Schubot, 2008;
Kumar et al., 2010). Bezüglich eines synergistischen, antitumoralen Effektes einer
Immunreaktion immunkompetenter Wirte im Zusammenhang mit einer Virotherapie
gibt es jedoch kontroverse Berichte (Melcher et al., 2011).
Weiterhin beobachteten Breitbach et al. (2007 und 2011) einen, die Entwicklung
einer Tumorvaskularisation begrenzenden Effekt in Folge Applikation eines
onkolytischen Vesikulären Stomatitis Virus (VSV). Diese stand wiederum im
Zusammenhang mit reduzierter Tumorzellproliferation.
Um die Sicherheit einer Therapie mit onkolytischen Viren zu erhöhen bzw. die Gefahr
der Schädigung nicht-neoplastischer Zellen zu verringern, gilt die Aufmerksamkeit
der Entwicklung von Viren, die Tumorzellen selektiv infizierenden und sich in diesen
replizieren. Diese stellen nach Liu et al. (2007) onkolytische Viren der zweiten
Generation dar. Um eine selektive Infektion zu ermöglichen, fusionierten z.B.
Hammond et al. (2001) das Hämagglutinin-Bindungsprotein auf der Oberfläche eines
Masernvirusstammes mit Antikörpern gegen karzinoembryonales Antigen (CEA).
CEA wird, als Tumor-assoziiertes Antigen, von vielen neoplastischen Zellen
überexprimiert, während es von epithelialen Zellen nur weniger normaler adulter
Gewebe gebildet wird (Hammarström, 1999). Prototypen der selektiv replizierenden
onkolytischen Viren stellen die so genannten conditionally replicating adenoviruses
(CrAd) dar. Bei diesen Organismen handelt es sich um Adenoviren, welche zwar in
der Lage sind eine Vielzahl von Zellen zu infizieren, jedoch nur in p53-defizienten
Zellen replizieren können und somit eine spezifische Virusvermehrung in
Tumorzellen ermöglichen (Bischof et al., 1996). Kommerziell erhältliche CrAd wie
ONYX-015 und H101 sind seither, zum Teil in Kombination mit konventionellen
Chemotherapeutika, mit unterschiedlichen Erfolgen in klinischen Studien der Phasen
1 bis 3 eingesetzt worden (Kirn 2001; Yu et al. 2007).

6 Literaturübersicht
Onkolytische Viren der dritten Generation sind Organismen, welche durch
Transgenexpression erhöhte Selektivität und Wirksamkeit erreichen (Liu et al., 2007).
Die Wirkung von Herpes- und Vacciniaviren mit transgener Expression des Zytokins
Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) ist
gekennzeichnet durch eine nochmals verbesserte selektive Infektion von
Tumorzellen sowie eine starke Rekrutierung von Immunzellen zur Injektionsstelle
(Liu et al., 2007). Im Zuge intratumoraler Behandlungen mit diesen Viruskonstrukten
ergaben sich Erfolg versprechende, regressive Wirkungen auf die primären
Neoplasien (Mastrangelo et al., 1999; Hu et al., 2006) sowie deren Fernmetastasen
(Mastrangelo et al., 1999). Weiterhin sind intratumoral zu applizierende, onkolytische
Viren bekannt, die zusätzlich zu ihrer zytolytischen Wirkung, durch transgene
Expression eines Enzyms, zur Aktivierung eines gleichzeitig applizierten, zuvor
inaktiven und damit nicht-zytotoxischen Chemotherapeutikums (prodrug), führen.
Derartige Ansätze kombinieren virusbedingte Zytolyse mit einer, in Sicherheit und
Verträglichkeit verbesserten, konventionellen Chemotherapie (Freytag et al, 2002).
2.1.3. Onkolytische Viren im Speziellen
Tabelle 1 zeigt die wichtigsten, derzeit bekannten, natürlich vorkommenden
onkotropen Viren, welche, in den meist Fällen in genetisch modifizierter Form, in
präklinischen und klinischen Studien verwendet werden.
Spezielles Augenmerk soll, auf Grund der nahen Verwandtschaft zum kaninen
Staupevirus, auf das Masernvirus und dessen onkolytisches Potenzial gelegt
werden.
Das Maservirus ist ein einzelsträngiges RNS-Paramyxovirus (Genus Morbillivirus) mit
negativer Polarität seines Genoms und Verursacher der, regelmäßig mit starker
Immunsuppression und Exanthemen einhergehenden, Masernerkrankung. Sein
Genom kodiert für 6 Proteine: das Nukleokapsid (N), das Phosphoprotein (P), das
Hämagglutinin (H), das Fusionsprotein (F), das Large-Protein (L) sowie zwei
akzessorische Proteine (C und V). Die Bindung an die zellulären Rezeptoren CD46
und CD150 (signaling lymphocyte adhesion molecule, SLAM) erfolgt durch die H-
und F-Proteine (Yanagi et al., 2006). Nectin-4 vermittelt den Eintrag des Virus in die
Zelle sowie dessen laterale Streuung (Mühlebach et al., 2011). Nach Infektion der

Literaturübersicht 7
Zelle bewirkt es eine Synzytienbildung (zytopathogener Effekt) durch Verschmelzung
benachbarter, die Rezeptorproteine exprimierender, Zellen (Wild et al., 1991). Nach
dem Bekanntwerden mehrerer Fälle von Regressionen hämatopoetischer Tumoren
nach akzidenteller Infektion (Bluming et al., 1971; Zygiert et al., 1971; Taqi et al.,
1981), erfuhr die Forschung zum onkolytischen Potenzial von Masernviren einen
ausgeprägten Antrieb im Zusammenhang mit Erkenntnissen bezüglich der Eignung
des Edmonston-Masernvirusimpfstamm (MV-Ed) als onkolytisches Agens. Dieser
gängige Masernvirusimpfstamm benutzt bevorzugt CD46 als Rezeptorprotein
(Santiago et al., 2002). Damit ist dieser in der Lage CD46-überexprimierende
Tumorzellen effizienter zu infizieren und zur Synzytienbildung zu bewegen, als nichttransformierte,
weniger intensiv CD46-exprimierende Zellen (Anderson et al.; 2004).
Diese Tatsache macht MV-Ed zu einem Tumor-selektiv wirksamen Virus, bei dessen
Verwendung nur minimale zytopathogene Effekte in normalen Körperzellen
beobachtet werden (Msaouel et al., 2009). Neben Erfolg versprechenden in vitro
Untersuchungen bezüglich des Effektes von MV-Ed auf humane Lymphom- (Grote et
al., 2001) und Myelomzellen (Peng et al., 2001) bzw. deren
Xenotransplantatäquivalenten im Tiermodell, zeigten Heinzerling et al. (2005) und
Künzi et al. (2006) Erfolge bei der in vitro und in situ Therapie von humanen kutanen
T-Zell-Lymphomen.
Derzeit befinden sich zwei rekombinante MV-Ed-Derivate in der ersten Phase
klinischer Studien. Ein CEA-exprimierender Stamm führt nach Infektion zu
messbaren Serumgehalten sowie verstärkter tumoraler Expression dieses Peptids
(Peng et al., 2002). Während sein therapeutisches Potenzial in präklinischen
Tiermodellstudien mit einer Vielzahl von humanen Neoplasien gezeigt wurde
(Msaouel et al., 2009), konzentrieren sich klinische Studien derzeit auf
intraperitoneale Behandlungen von Frauen mit Ovartumoren. Das therapeutische
Resultat war dosisabhängig, jedoch zeigten alle Frauen mit messbar erhöhten
Serum-CEA-Gehalten eine Stabilisierung der Erkrankung (Galanis et al., 2010).
Aktuell laufen klinische Studien unter Verwendung des gleichen Virusstammes zur
Therapien von Glioblastoma multiforme (Msaouel et al., 2009). Das zweite, im
Moment in klinischen Studien befindliche, MV-Ed-Derivat exprimiert den Natrium-

8 Literaturübersicht
Iodid-Symporter, welcher in der Lage ist Radioisotope innerhalb von Zellen zu
konzentrieren. Er kommt derzeit zur Behandlung von multiplen Myelomen zum
Einsatz. Hier liegt der Vorteil in der Möglichkeit begründet, dass nach Applikation von
Radioisotopen die Infektionsrate in vivo messbar ist. Dadurch kann die
therapeutische Effizienz und Sicherheit von kombinierten Radiotherapien (so
genannter Radiovirotherapie) gesteigert werden (Dingli et al., 2003; Msaouel et al.,
2009). Unlängst wurden Tiermodell-basierte Erfolge in der Verwendung eines
rekombinanten MV erzielt, dessen Hämagglutinin mit einem Antikörper gegen CD133
fusioniert ist und dadurch eine spezifische Infektion CD133-positiver Tumorzellen
ermöglicht. Hierbei wurden Regressionen der Tumortransplantate bzw. eine
verhinderte peritoneale Metastasierung beobachtet (Bach et al., 2013). CD133-
positive Tumorzellen werden als so genannte Tumorstammzellen bzw. tumor
initiating cells betrachtet, die, resistent gegen konventionelle Radio- und
Chemotherapien, häufig Ausgangspunkte von, mit erhöhter Proliferationsrate und
Aggressivität einhergehenden, Rezidivbildungen sind (Klonisch et al., 2008).
Die wesentliche Herausforderung für eine systemische Virotherapie mit Maserviren
besteht jedoch in der nahezu vollständigen Immunisierung der Gesellschaft durch
flächendeckende Masernprophylaxe, deren Rolle bezüglich der Schmälerung des
therapeutischen Effektes jedoch kontrovers diskutiert wird (Myers et al., 2004;
Heinzerling et al., 2005).

Literaturübersicht 9
Tab. 1: In präklinischen und klinischen Studien verwendete, natürlich
vorkommende onkotrope Viren (modifiziert nach Parato et al., 2005)
Virus
Mechanismus des Onkotropismus
Adenovirus Konditionelle Replikation in p53-
defizienten Tumorzellen
Reovirus Selektive Infektion RAS-Proteinüberexprimierender
Zellen
Herpes simplex Virus Typ 1
Selektive Replikation in Tumorzellen
Newcastle Disease Virus Selektive Replikation in Zellen mit
defekter IFN-γ-Antwort
Vacciniavirus Selektive Infektion von Tumorzellen
durch erhöhte Undichtigkeit von
Tumorgefäßen
Coxsackievirus Selektive Infektion in DAFüberexprimierenden
Tumorzellen
Masernvirus Selektive Infektion durch
Überexpression viraler Rezeptoren
(CD46) auf Tumorzellen
Vesikuläres Stomatitisvirus Selektive Replikation in Zellen mit
defekter IFN-γ-Antwort
Influenzavirus Selektive Replikation in Zellen mit
defekter IFN-γ-Antwort
Retrovirus
Virusproteinexpression ausschließlich in
Tumorzellen durch Tumor-spezifische
Promotoren
Myxomavirus Selektive Replikation in Zellen mit
defekter STAT1- und IFN-γ-Antwort
Legende: DAF, decay accelerating factor; STAT1, signal transducer and activator of transcription 1,
IFN-γ, Interferon-γ, RAS-Proteine, rat sarcoma Proteine (Proto-Onkogen kodierte GTPasen).

10 Literaturübersicht
2.1.4. Onkolytische Virotherapie in der Veterinärmedizin
Während im humanmedizinischen Bereich schon vielversprechende Fortschritte bei
der Konstruktion onkolytischer Viren gemacht wurden, befinden sich entsprechende
Forschungen im veterinärmedizinischen Bereich noch in ihren Anfängen.
Angeregt durch die Erfolg versprechenden Versuche mit onkolytischen Masernviren
(MV) sowie deren gravierenden pathogenetischen (zytolytische Infektion von Zellen
des Immunsystems; Benutzung von CD46, CD150 als leukozytäre Rezeptoren) und
virostrukturellen Ähnlichkeiten mit dem eng verwandten kaninen Staupevirus (CDV),
kam es ab Mitte des ersten Jahrzehnts des 21. Jahrhunderts vermehrt zu Berichten
über die Verwendung des Hundestaupevirus als potenzielles onkolytisches Agens
(Suter et al., 2005; Puff et al., 2009, del Puerto et al., 2011; Miest et al.; 2011). Erste
Erwähnung findet es bei Suter et al. (2005), die zeigten, dass Green Fluorescent
Protein-gekoppeltes CDV primäre und etablierte kanine Lymphomzelllinien infiziert
und bei Letzteren zur Zytolyse und Apoptoseinduktion führt. Ferner induzierte in
einer Studie von Puff et al. (2009) eine CDV-Infektion einer kaninen Makrophagen- /
Monozyten-Tumorzelllinie (DH82-Zellen) eine reduzierte zelluläre Expression von
Matrixmetalloproteinase-2 (MMP-2) sowie eine vermehrte zelluläre Expression des
reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motifs (RECK). Beide
Beobachtungen werden im Zusammenhang mit einem reduzierten invasiven und
metastatischen Potenzial von Tumorzellen diskutiert (Puff et al., 2009). Ferner wurde
CDV, bzw. wurden prodrug-armierte CDV-MV-Chimären erfolgreich in Studien mit
der humanen Zervixkarzinomzelllinie HeLa in vitro bzw. mit murinen Tumorzelllinien
in vivo angewendet (del Puerto et al., 2011; Miest et al., 2011).
Wesentliche Bedeutung haben, auch in der veterinärmedizinischen Forschung, die
conditionally replicating adenoviruses: Genetisch veränderte kanine Varianten dieser,
insbesondere das kanine Adenovirus-2, zeigten in vitro onkolytische Eigenschaften
bei kaninen Osteosarkomzelllinien sowie in deren Xenotransplantatäquivalenten in
vivo (Hemminki et al., 2003; Le et al., 2006). Selektive Replikationen in Tumorzellen
wurden durch eine Osteokalcin-Promotor-gesteuerte Transkription des viralen
Genoms erreicht (Hemminki et al., 2003).

Literaturübersicht 11
Ferner spielen, im Sinne Spezies-übergreifender Versuchsansätze, auch nichtkanine
Viren eine Rolle in Bezug auf Tumoren des Hundes. Hierbei sollten die
Vacciniavirus-Stämme GLV-1h68 sowie LIVP1.1.1 Erwähnung finden, welche in vitro
und in vivo onkolytische Aktivität in kaninen Mammaadenom-,
Mammadenokarzinom- sowie Weichgewebssarkomzelllinien und deren
Xenotransplantatäquivalenten zeigten (Gentschev et al., 2009, 2010 und 2012). Des
Weiteren wiesen Ternovoi et al. (2005) produktive Infektionen von humanem
Adenovirus 5 in mehreren kaninen Zelllinien unterschiedlicher Histogenese in vitro
nach. Ferner erwiesen sich, ebenfalls in vitro, attenuierte Myxomaviren in
verschiedenen primären und etablierten kaninen Zelllinien als zytopathogen und
Apoptose-induktiv (Urbasic et al., 2012).
2.1.5. Herausforderungen der Virotherapie
Trotz der gewaltigen Fortschritte auf dem Gebiet und den gegebenen Vorteilen der
Virotherapie, bestehen auch wesentliche Hindernisse, die eine Progression eines
onkolytischen Virus von einer präklinischen bzw. frühen in eine spätere Phase
klinischer Studien oder sogar in die reguläre therapeutische Anwendung erschweren.
Diese Hindernisse sehen viele Autoren in der zu geringen klinischen Effektivität
sowie den Schwierigkeiten der systemischen Applikation eines Virotherapeutikums
begründet (Mc Cormick et al., 2005). Abbildung 1 zeigt die von Parato et al. (2005)
und Vähä-Koskela et al. (2007) geschilderten Hürden, die ein onkolytisches Virus
nach intravaskulärer Applikation sowie nach intratumoraler Injektion auf dem Weg
zur vollständigen Infektion aller Zellen eines Tumors nehmen muss. Vähä-Koskela et
al. (2007) geben ferner einen umfassenden Überblick über Studien zu Strategien mit
dem Ziel der Steigerung der Therapieeffizienz. Diese umfassen eine Vorbehandlung
mit proteolytischen Enzymen zur Erleichterung der Virusausbreitung im Tumor
(McKee et al., 2006) bzw. die Verwendung rekombinanter Viren, welche Matrixdegradierende
Enzyme exprimieren (Schäfer et al., 2012). Sie betonen ferner die, in
mehreren Studien nachgewiesene, Effizienzsteigerung nach multiplen intratumoralen
Injektionen im Vergleich zu einmaligen. Weiterhin wird die Möglichkeit der
vektorbasierten Gentherapie beleuchtet, bei welcher nicht-replizierende, onkotrope,
virale Vektoren, die z.B. Apoptose-induzierende Proteine oder p53 exprimieren,

12 Literaturübersicht
eingesetzt werden. Als Möglichkeiten eine Virus-neutralisierende Immunantwort zu
verhindern, benennen Vähä-Koskela et al. (2007) die Möglichkeit des Umhüllens der
Viren mit einem Polymer bzw. der Einkapselung in nicht-immunogene Liposomen.
Weiterhin betonen sie Erfolg versprechende Ergebnisse in Studien mit Interferon-γexprimierenden
CrAd (Su et al., 2006) sowie bezüglich multimodaler Therapien.
Diese bieten, durch Kombinationen aus Viro- und konventioneller Therapie, die
Möglichkeit der virusbedingten Resensibilisierung von Tumorzellen in Bezug auf
Radio- und Chemotherapie (Mantwill et al., 2006). Weiterhin haben, unter Anderem
veterinärmedizinisch basierte, Forschungen die Vorteile einer zellbasierten
Zuführung (mittels so genannter carrier cells) des Virus bezüglich der Umgehung der
Immunantwort des Wirts herausgestellt (Alcayaga-Miranda et al., 2010; Saito et al.
2011). Hierbei wurden zum einen Osteosarkomzellen des Hundes als
Transportvehikel für selektiv replizierende kanine Adenoviren zur systemischen
Behandlung von Osteosarkomxenotransplantaten im Mausmodell verwendet. Saito
et al. (2011) setzten systemisch, bestrahlte, Adenovirus-infizierte Tumorzellen zur
Behandlung eines murinen Plattenepithelkarzinommodells mit multiplen
Lungentumoren ein.

Literaturübersicht 13
Abb. 1: Begrenzende Faktoren einer hohen Infektionsrate der Zellen eines
Tumors mit einem onkolytischen Virus
Evasion virusresistenter Zellen
und sukzessive neue
Tumorformation
Zytolyse von infizierten Tumorzellen
durch infiltrierende Leukozyten vor
stattgefundener Virusausschüttung
Verhinderung einer Virusausbreitung
von Zelle zu Zelle durch
neutralisierende Antikörper
Im Bindegewebe
versteckte Tumorzellen
entziehen sich der
Infektion
Absorption von Virus durch
Antikörper oder Leukozyten
nach intravaskulärer
Applikation
Hoher interstitieller Druck und
stromales Bindegwewebe verhindert
gleichmäßige Verteilung der
Viruspartikel
Viruspartikel
Neutralisierende
Antikörper
Leukozyt
intakte Tumorzelle
infizierte, lytische
Tumorzelle
In der Abbildung sind die Ereignisse in einem soliden Tumor nach systemischer oder intratumoraler
Applikation eines onkolytischen Virus und die möglichen Hindernisse einer vollständigen Infektion aller
Tumorzellen schematisch dargestellt (modifiziert nach Vähä-Koskela et al., 2007).
2.2. Histiozytäre Neoplasien
2.2.1. Histiozyten
Histiozytäre Zellen sind Zellen myeloischer Herkunft und umschließen Makrophagen
sowie dendritische Zellen. Ihre Vorläuferzellen stellen CD34-positive Stammzellen
dar, welche sich unter Einfluss verschiedener Zytokine (Granulozyten-
Makrophagenkolonie-stimulierender Faktor, Tumornekrosefaktor, transformierender
Wachstumsfakor-β, Interleukin-4) in die zwei Formen der dendritischen Zellen
(Langerhanszellen und interstitiell-dendritische Zellen) sowie Monozyten und
Makrophagen differenzieren (Favara et al., 1997, Schwens et al., 2011). Eine

14 Literaturübersicht
Unterscheidung der verschiedenen histiozytären Zelltypen ist auf Grund ihrer
ähnlichen morphologischen Kriterien in der Regel nur immunphänotypisch möglich
(Favara et al., 1997, Schwens et al., 2011)
2.2.2. Formen histiozytärer Erkrankungen beim Hund
Der Komplex kaniner histiozytärer Erkrankungen wird in neoplastische und reaktive
Formen eingeteilt und stellt eine, bezüglich klinischer Symptomatik und
pathologischer Erscheinungsformen, in sich sehr heterogene Gruppe dar (Moore et
al., 1996 und 2006; Affolter et al., 2000 und 2002; Nagata et al., 2000; Weiss et al.,
2007, Allison et al., 2008). Tabelle 2 zeigt die derzeit aktuelle Klassifikation
histiozytär-proliferativer Erkrankungen.
Tab. 2: Klassifikation histiozytär-proliferativer Erkrankungen des Hundes
(modifiziert nach Schwens et al., 2011)
Erkrankung
Referenz
Neoplastische
Formen
Reaktive
Formen
kutaner Histiozytomkomplex
kutanes Histiozytom
Moore et al. (1996)
metastasierendes Histiozytom
Kaim et al. (2006)
Moore et al. (1996)
Langerhans-Zell-Histiozytose Nagata et al. (2000)
histiozytäres Sarkom (HS)
Affolter and Moore
lokales HS
(2002)
disseminiertes HS
hämophagozytäres histiozytäres Sarkom Moore et al. (2006)
dendritische Leukämie Allison et al. (2008)
reaktive Histiozytose
Affolter et al. (2000)
kutane Form
systemische Form
hämophagozytäres Syndrom Weiss et al. (2007)

Literaturübersicht 15
2.2.3. Histiozytäres Sarkom des Hundes und des Menschen
Kanine histiozytäre Sarkome kommen als lokale und disseminierte Form, welche
früher als kanine maligne Histiozytose bezeichnet wurde, vor (Schwens et al., 2011).
Affolter und Moore (2002) fanden in einer umfassenden, die beiden Formen
vergleichenden Studie, unter den betroffenen Hunderassen eine Überrepräsentation
von Rottweilern und Berner Sennenhunden (79%). Ferner waren auch Golden,
Labrador und Flat Coated Retriever häufiger betroffen als andere Rassen. Abadie et
al. (2009) postulieren eine oligogene Vererbung der Erkrankung in Berner
Sennenhundlinien. Ferner wurden in einer vergleichenden Studie an Tumoren von
Berner Sennenhunden und Flat Coated Retrievern, Deletionen in mehreren
Tumorsuppressorgenen gefunden, die zu numerischen Aberrationen der DNS-
Kopienanzahl führten. Einige dieser Aberrationen waren vergleichbar mit denen, die
bei humanen histiozytären Neoplasien gefunden werden, was die Autoren Hedan et
al. (2011) zu der Vermutung führt, dass kanine und humane histiozytär-proliferative
Erkrankungen pathogenetische Gemeinsamkeiten aufweisen. Somit kann die kanine
Variante als Modell zur Erforschung der Pathogenese und Therapie entsprechender
humaner Erkrankungen dienen.
In der Studie von Affolter und Moore (2002) fand sich die Mehrheit der lokalisierten
histiozytären Tumoren in der Subkutis der Gliedmaßen und hatte nach chirurgischer
Behandlung und / oder Radiotherapie bessere prognostische Aussichten als die
disseminierte Form. Bei dieser waren die Primärtumoren am häufigsten in der Milz,
Leber, Lunge, Knochenmark oder Lymphknoten lokalisiert. Eine schlechte Prognose,
die schnelle klinische Verschlechterung der Patienten sowie das häufige Fehlen
eines Ansprechens auf chemotherapeutische Behandlungen spiegeln das aggressive
Verhalten dieser Erkrankung wider (Affolter und Moore, 2002). Zur Therapie werden
Nitrosoharnstoffverbindungen chemotherapeutisch mit oder ohne kombinierte
Radiotherapie verwendet (Fidel et al., 2006 und Rassenick et al., 2010). In
kombinierter Therapie konnte die mittlere Überlebenszeit von 123 auf 158 Tage nach
Diagnosestellung gesteigert werden (Fidel et al., 2006). Ähnliche Überlebenszeiten
finden sich auch in Folge disseminierter histiozytärer Sarkome beim Menschen
(Hornick et al., 2004; Hedan et al., 2011; Saboo et al., 2012). Histiozytäre Sarkome

16 Literaturübersicht
des Menschen stellen eine seltene Tumorerkrankung dar, welche im Wesentlichen in
Lymphknoten, Haut und Gastrointestinaltrakt beobachtet wird (Hornick et al., 2004)
2.2.4. Die permanente histiozytäre Sarkomzelllinie DH82
Die DH82-Tumorzelllinie wurde 1988 von Wellmann et al. aus dem Knochenmark
eines Golden Retrievers, welcher an einem disseminierten histiozytären Sarkom
erkrankt war, gewonnen und zytomorphologisch sowie ultrastrukturell charakterisiert.
Seit jeher werden die Zellen dieser Makrophagen- / Monozytenlinie in der
Erforschung der Ehrlichiose, im Wesentlichen des Hundes (Harrus et al., 2003),
eingesetzt. Ferner wurden sie zur Herstellung und Charakterisierung eines
monoklonalen Antikörpers gegen den Hyaluronidaserezeptor CD44 verwendet
(Alldinger et al., 1999). Weiterhin wurde an ihnen der Effekt einer
Staupevirusinfektion auf die Expression Matrix-modellierender Proteine untersucht
(Puff et al., 2009) sowie die anti-proliferative Wirkung verschiedener
Weinrebenextrakte auf die Tumorzellen in vitro beurteilt (Empl et al., 2012).
2.3. Das kanine Staupevirus
2.3.1. Die kanine Staupeviruserkrankung
Das kanine Staupevirus (CDV) gehört, neben dem Masernvirus, dem Morbillivirus
der Delfine, dem Morbillivirus der Schweinswale, dem phocinen Staupevirus, dem
Peste-de-petit-ruminant-Virus und dem Rinderpestvirus zum Genus der Morbilliviren
und zur Familie der Paramyxoviridae (Pringle; 1999, Beineke et al., 2009). Es infiziert
neben dem Haushund eine Reihe weiterer terrestrischer und aquatischer Karnivoren
und ist klinisch im Wesentlichen mit einer, mit Leukopenie und Verlust von
Lymphozyten einhergehenden, Immunsuppression, katarrhalischen Erkrankungen
des Gastrointestinal- und Respirationstraktes sowie zentralnervöser Symptomatik im
Zuge einer akuten oder chronischen Leuko- und / oder Polioenzephalitis assoziiert
(Baumgärtner, 1993; Deem et al., 2000; Beineke et al., 2009). Je nach einzelnem
oder kombiniertem Vorliegen dieser Manifestationen unterscheidet man die
katarrhalische, nervöse oder systemische Form der Staupe (Baumgärtner, 1993;
Deem et al., 2000; Beineke et al., 2009).

Literaturübersicht 17
2.3.2. Die Eigenschaften des Staupevirus
Als Paramyxovirus ist das CDV ein behülltes, nicht-segmentiertes, einzelsträngiges
RNS-Virus negativer Polarität dessen Genom für 6 Strukturproteine kodiert (Pringle,
1999). Das Hämagglutinin (H)- und das Fusions (F)-Protein sind auf der Lipidhülle
lokalisiert und für die Bindung der zellulären Rezeptoren zum Zweck des Eindringens
bzw. des Austritts des Virus aus der Wirtszelle verantwortlich. Das Nukleo (N)-
Protein, das Large (L)-Protein und das Phospho (P)- Protein sind Bestandteile des
Nukleokapsids. Das Matrix (M)-Protein ist an der inneren Oberfläche lokalisiert und
verbindet die H- und F-Glykoproteine mit dem Nukleokapsid (Hall et al., 1980; Örvell
et al., 1980). Weiterhin sind die V- und C-Proteine, ähnlich denen des MV, als
akzessorische Virusstrukturkomponenten bekannt (Beineke et al., 2009).
2.3.2.1. Lymphotropismus und Mechanismen der Immunsuppression
Pathogenitätsstudien von Appel et al. (1969, 1970), Krakowka et al. (1980) sowie von
Messling et al. (2004) an Hunden und Frettchen mit einer Staupevirusinfektion haben
initiale Infektionen von zirkulierenden Lymphozyten gezeigt, welche sich im
Folgenden auf residente Zellen der sekundären und später der primären
lymphatischen Organe ausweiteten. Innerhalb einer Woche kam es in der Studie von
von Messling et al. (2004) so zur nahezu vollständigen Beeinträchtigung des
Immunsystems, welche im Wesentlichen durch eine hochgradige Lymphopenie
gekennzeichnet war. Die mit einer Staupevirusinfektion assoziierte
Immunsuppression ist gekennzeichnet durch eine lang anhaltende Störung der
zellulären und humoralen Immunantwort und geht mit einer Depletion von CD4+ T-
Helfer-, CD8+ zytotoxischen T- und CD21+ B-Zellen einher (Wünschmann et al.,
2000; Beineke et al., 2009). Studien von Moro et al. (2003) und Schobesberger et al.
(2005) haben gezeigt, dass es nicht nur zum Untergang infizierter, sondern auch zu
Apoptosen nicht-infizierter Lymphozyten kommt und die immunologischen Störungen
auch einige Zeit nach Beendigung der Virämie erhalten bleiben. Die Autoren
postulieren eine Hyperreaktivität des angeborenen Immunsystems auf die
Virusinfektion mit konsekutiver, immunpathologisch bedingter, Störung der
Lymphozytenhomöostase (Moro et al., 2003; Schobesberger et al., 2005). Der

18 Literaturübersicht
Lymphotropismus der Morbilliviren, also auch des CDV, wird verursacht durch die
Bindung der viralen H- und N-Glykoproteine an das signaling lymphocyte activation
molecule (SLAM, CD150) (Tatsuo et al., 2001), welches laut Wenzlow et al. (2007)
beim Hund auf vielfältigen Zelloberflächen exprimiert wird. Beim Menschen findet
sich SLAM auf unreifen Thymozyten, B- und T-Lymphozyten, Makrophagen und
dendritischen Zellen und gilt als wesentlicher Rezeptor für das Masernvirus (Yanagi
et al., 2006). Ferner beschreiben diese Autoren CD46 als alternativen Rezeptor,
welcher von attenuierten Masernvirusstämmen genutzt wird. Seine Rolle im Rahmen
der Infektion von Lymphozyten bei einer Staupevirusinfektion ist jedoch unklar. CD46
ist bisher nur auf neoplastischen, kaninen Lymphozyten in vitro detektiert worden
(Suter et al., 2005).
2.3.2.2. Nectin-4 als epitheliales Rezeptorprotein und Tumorzellmarker
Im Jahr 2011 entdeckten Noyce et al. Nectin-4 als MV-Rezeptor epithelialer Zellen
des Respirationstrakts und bestätigten kürzlich ebenfalls dessen Rolle bezüglich der
Eintragung des CDV in kanine epitheliale Zellen (Noyce et al., 2013). Ähnlich der
Aufregulation des MV-Rezeptors CD46 auf Tumorzellen (Anderson et al.; 2004),
wiesen Fabre-Lafay et al. (2007), Takano et al. (2009) und Derycke et al. (2010)
interessanterweise eine vermehrte Nectin-4-Expressionen auf
Mammakarzinomzellen, Lungen- bzw. Ovartumorzellen nach. Hierin besteht ein
weiterer Ansatzpunkt onkolytischer Tumortherapien mit dem MV bzw. CDV (Noyce et
al., 2012 und 2013).
2.3.3. Die Rolle von Monozyten und Makrophagen im Zuge einer
Staupevirusinfektion
Während es im Zuge einer natürlichen Staupevirusinfektion zu massiver Infektion
von T- und B-Lymphozyten kommt, beschreiben mehrere Autoren eine nahezu
abwesende (von Messling et al., 2004) bzw. restriktive (Stein et al., 2008) Infektion
von Zellen der Monozyten-Makrophagenlinie. Ferner wurden nur transiente
Rückgänge bzw. sogar Zunahmen dieser Zellen im Differenzialblutbild infizierter
Tiere beobachtet (McCullough et al., 1974; Stein et al., 2008). Deren morphologische
sowie funktionelle Charakterisierung spricht zudem für eine Steigerung der

Literaturübersicht 19
phagozytären, Antigen-präsentierenden und T-Zell-stimulativen Funktion in Folge
einer Infektion mit CDV. Brügger et al. (1992) beobachteten in vitro eine erhaltene
Fähigkeit zur Phagozytose und Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies durch
infizierte Makrophagen. Ferner betonen die Autoren die gesteigerte prokoagulatorische
Aktivität der infizierten Zellen. Stein et al. (2008) stellten in infizierten
monozytären Zellen eine gesteigerte MHC-I-, CD1c-, CD80- und CD86-Expression
fest. Während MHC-I im Wesentlichen für die Präsentation von zytosolischem und
viralem Antigen und für die T-Zellaktivierung verantwortlich ist, dient CD1c darüber
hinaus der Antigenpräsentation für natürliche Killer (NK) -Zellen. Auch CD80 und
CD86 besitzen ähnliche Aufgaben in der Antigenpräsentation und Kostimulation der
T-Zellaktivierung (Tizard und Schubot, 2008). Ähnliche Antigenaufregulationen
wurden im Zuge der nervösen Form der Staupe nach Infektion von Mikroglia
beschrieben (Stein et al., 2004). Sie werden von den Autoren für eine Beseitigung
des Virus aus den Zellen und von Wisniewski et al. (1972) für die, im Rahmen einer
überschießenden Bystander-Immunität entstehenden, Demyelinisierungen
verantwortlich gemacht.
Die Infektion von DH82-Zellen führte in einer Studie von Gröne et al. (2002) zur
Aufregulierung von Interleukin (IL)-1 und vermehrten Ausschüttung von IL-6 und
Tumornekrosefaktor (TNF). Indes berichten Krakowka et al. (1987) neben einer
Induktion der Prostaglandin-E2-Produktion durch infizierte monozytäre Zellen von
einer gestörten Freisetzung von IL-1 und schließen daraufhin auf eine beeinträchtigte
Antigenpräsentation mit sukzessiv herabgesetzter B-Zell-Differenzierung und
Antikörperproduktion.
2.3.4. Immunisierung gegen das kanine Staupevirus
Untersuchungen zur Seroprävalenz in der deutschen Hundepopulation finden sich
von 1984 und 1987. In den Studien, in denen ungeimpfte Tiere untersucht wurden,
ergaben sich Seroprävalenzen von 25% in der Altersgruppe der 3- 6 Monate alten
und 90% in der Altersgruppe der über 3 Jahre alten Hunde (Grünberg, 2000). In
einer Studie aus Chicago, USA, welche an Tierheimhunden mit unbekanntem
Impfstatus durchgeführt wurden, zeigten sich 37% und 41% der Tiere seropositiv
(Litster et al., 2012). Zu ähnlichen Ergebnissen kommen Lechner et al. (2010), die

20 Literaturübersicht
Tierheimtiere aus Florida untersuchten. Hier ergab sich eine Staupeseroprävalenz
von 35,5%. Auch in diesen beiden Untersuchungen zeigten sich positive
Korrelationen zwischen dem Alter der Hunde und dem Vorhandensein
neutralisierender Antikörper. Da, nach Schultz et al. (2006 und 2010), selbst 9 Jahre
nach Grund- jedoch ohne weitere Auffrischungsimmunisierung noch neutralisierende
Antikörper nachzuweisen waren, ist davon auszugehen, dass die, unter
veterinärmedizinischer Versorgung stehende, Hundepopulation einen hohen Anteil
seropositiver Tiere aufweist. Es werden ausschließlich Lebendvakzine zum Zweck
einer aktiven Immunisierung verwendet (Selbitz und Moos, 2006). Die zugelassenen
Vakzineklassen beruhen auf den, vom Onderstepoort-Stamm abgeleiteten, so
genannten avianisierten Stämmen sowie auf den, durch Attenuierung nach
Passagierung in Hundezellkulturen entstandenen, Rockborn- und Snyder-Hill-
Stämmen (Selbitz und Moos, 2006).
2.3.5. Der Staupevirusimpfstamm Onderstepoort
Der attenuierte Staupevirusimpfstamm Onderstepoort (CDV-Ond) entstand nach
dessen Isolation im Zuge vielfältiger in vitro Passagen und Passagen in Hühnereiern
(Haig et al., 1956). Im Gegensatz zu, verstärkt zu persistierenden, nicht-zytolytischen
Infektionen führenden, Wildtypvirusstämmen ist er gekennzeichnet durch
ausgeprägte zytopathogene Effekte z.B. der Tendenz zur Synzytienbildung (Plattet et
al., 2005). Nichtsdestotrotz konnten persistierend mit dem CDV-Ond infizierte DH82-
Tumorzellen generiert werden (Puff et al., 2009). Zurbriggen et al. (1995) verglichen
weiterhin die Modi der Virusausbreitung in Zellkultur und beobachteten, dass
während CDV-Ond durch eine hohe Rate der Virionfreisetzung eher direkt
benachbarte Zellen unselektiv infizierte, der Wildvirusstamm A75/17 Zellfortsätze
nutzte, um entfernte Zellen selektiv zu infizieren. Hierbei kam es zu einer
vergleichsweise geringen Freisetzung infektiöser Partikel aus infizierten Zellen.
2.4. Mausmodelle in der onkologischen Forschung
Die Maus ist der am weitreichendsten genutzte Modellorganismus in der
Onkogenese- und Onkotherapieforschung (Sharkey et al., 1982; Kerbel et al., 2003;
Céspedes et al., 2006). Neben der Verwendung von syngenen Tumortransplantaten,

Literaturübersicht 21
spontan im Mausorganismus entstehenden Tumoren und den, durch Expression
eines Transgens induzierten Neoplasien, spielen die Xenotransplantate von
humanen Tumoren in immunsupprimierte Mausstämme die wichtigste Rolle in der
Erforschung und Prüfung von Onkotherapeutika (Céspedes et al., 2006 ). Während
aus den zu untersuchenden Tumorzelllinien oder resezierten primären Tumoren, in
den meisten Fällen, subkutane (heterotope) Xenotransplantate generiert werden,
haben sich jedoch auch orthotope Transplantate bewährt (Céspedes et al., 2006).
Aus der Verwendung von Mausstämmen mit unterschiedlichen Defekten ihres
Immunsystems (Nude, SCID, NOD/SCID, Rag-1-defizient) ergeben sich verbesserte
Tumoraufnahmen und die Möglichkeit der Evaluierung des Wirkungsmechanismus
eines Therapeutikums unter Vernachlässigung des adaptiven Immunsystems
(Hudson et al., 1998; Céspedes et al., 2006). Gleichermaßen beeinträchtigt diese
Gegebenheit jedoch auch die Untersuchung der gegebenenfalls Therapie-adjuvanten
immunologischen Reaktionen (Hudson et al., 1998; Céspedes et al., 2006).
2.4.1. Die severe combined immunodeficiency (Scid) - Mutation
Individuen des C.B.-17 Inzuchtstammes mit BALB/c-Hintergrund, welche homozygot
für die Scid-Mutation waren, wurden erstmals von Bosma und Kollegen am Fox
Chase Cancer Center, Philadelphia, USA entdeckt, vermehrt und als C.B.-17scid
bezeichnet (Bosma et al., 1983). Fehlerhafte V(D)J-Rekombinationen der
Antigenrezeptorgene führen durch den Abbruch der lymphozytären Differenzierung
zu einer nahezu vollständigen Abwesenheit funktioneller B- und T-Lymphozyten
(Schuler et al., 1986). Myeloische Zellen sowie NK-Zellen werden in normaler Anzahl
und Funktion angetroffen (Dorshkind et al., 1984). Custer et al. (1985) untersuchten
die lymphatischen Organe von Scid-Mäusen und stellten im Knochenmark eine, dem
Knochenmark der Vergleichstiere ähnelnde Zellularität fest, während der Thymus
und die sekundären lymphatischen Organe und Einrichtungen massive lymphozytäre
Depletionen aufwiesen. Weiterhin wiesen Custer et al. (1985) mittels
Durchflusszytometrie T-Lymphozyten in Thymus und Milz nach, deren Funktionalität
die Autoren auf Grund der Morphologie der Zellen jedoch in Frage stellen. Ferner
beobachteten sie keine B-Zellen, jedoch Plasmazellen und Serumimmunglobulin. Es
wird postuliert, dass die Scid-Mutation zur aberranten Ausbildung von

22 Literaturübersicht
Immunglobulinen und T-Zellrezeptoren führt und es nachfolgend verstärkt zur
Elimination dieser fehlerhaften Zellen und damit zu der lymphatischen Depletion
kommt (Schuler et al., 1986; Bosma et al., 1988). Gleichermaßen können jedoch
durch zufällige produktive Rekombinationen und klonale Expansion dieser Zellen
nachweisbare Serumimmunglobulinwerte gemessen werden bzw. funktionale T-
Zellen entstehen (Schuler et al., 1986; Bosma et al., 1988). In einer detaillierten
Studie von Bosma et al. (1988) zeigten 2-23% der untersuchten Tiere den so
genannten leaky–Phänotyp. Die histologischen Kriterien der lymphatischen Organe
glichen jedoch denen der, einwandfrei dem Scid-Phänotyp zurechenbaren Tiere.
Zellen mit T- und B-Zell-Phänotyp werden ferner mit zunehmendem Lebensalter der
Tiere gehäuft angetroffen (Carroll et al., 1991). Die Autoren gehen jedoch von einer,
auf Grund der begrenzten Heterogenität ihrer Rezeptoren, eingeschränkten
Funktionalität dieser Zellen aus. Infektionsstudien mit Listeria monocytogenes haben
gezeigt, dass es zwar IFN-γ-abhängig, jedoch T-Zell-unabhängig, zu einer von
Makrophagen-dominierten, mikrobiziden Immunantwort kommt (Bancroft et al.,
1989). Scid-Mäuse sind hochempfänglich gegenüber opportunistischen Infektionen
und haben unter keimärmsten Bedingungen eine Lebenserwartung von 40 bis 80
Wochen (Bosma und Carroll, 1991). Insbesondere die Infektion mit Pneumozystis
carinii stellt eine wesentliche Gefahr für Scid-Maushaltungen dar (Roths et al, 1990;
Bosma und Carroll, 1991).
2.4.2. Transplantation persistierend Virus-infizierter Tumorzellen
In der viralen Onkolyseforschung haben Xenotransplantationen persistierend
infizierter Tumorzellen Erkenntnisse in Bezug auf mögliche immunvermittelte
Mechanismen der Regression Virus-infizierter Tumoren erbracht (Reid et al., 1979;
Minato et al., 1979; Schattner et al., 1985; Vandepol und Holland, 1986). Reid et al.
(1979) schlossen aus einem Transplantationsexperiment mit persistierend mit dem
VSV infizierten Zellen in bestrahlte, und damit jeglicher zellulären Immunantwort
beraubter, Nacktmäuse, dass eine zelluläre, nicht-B- und nicht-T-Zell basierte
Immunantwort für die Abstoßung persistierend infizierter Zellen verantwortlich sein
muss. Sie widerlegten in der gleichen Studie die Möglichkeit einer in vivo
milieubedingten Verhinderung der Proliferation der persistierend infizierten Zellen,

Literaturübersicht 23
welche in vitro den nicht-infizierten Ausgangszellen in Bezug auf Morphologie und
Wachstumsrate glichen. In weiterführenden Untersuchungen stellten Minato et al.
(1979) und Schattner et al. (1985) sowie Vandepol und Holland (1986) NK-Zellen als
die von Reid et al. (1979) vermutete zelluläre Komponente heraus. Ferner
adressierten Alain et al. (2006) die Fragestellung der möglichen Entstehung
persistierend infizierter und virus-resistenter Tumorzellen nach onkolytischer
Virotherapie und deren Potenzial, als therapieresistente Ausgangszellen, ein
neuerliches Tumorwachstum zu initiieren. Persistierend mit dem Reovirus infizierte
Raji-Zellen (Burkitt Lymphomzellen) zeigten kein Tumorwachstum in vivo. Von der
Virusinfektion bereinigte Zellen zeigten ein ähnliches Wachstumsverhalten wie deren
nicht-infizierte Ursprungszellen, waren jedoch wiederum empfänglich für Reovirusbedingte
Onkolyse nach einmaliger intratumoraler Injektion. Die Autoren schließen
daraus eine begrenzte Gefahr der Entstehung therapieresistenter Zellen und
argumentieren, dass das tumorigene Potenzial persistierend infizierter Zellen
lediglich unterdrückt, jedoch nicht verloren ist.
2.5. Tumorprogression und der Einfluss des
Tumormikromilieus
Bei klinischer Diagnosestellung wiegen Tumoren mindestens 1 g bzw. besitzen einen
Zellgehalt von mindestens 10 9 Zellen, von denen sich ein, je nach Tumor
unterschiedlich großer, Anteil im proliferativen Pool bzw. in der so genannten
Wachstumsfraktion befindet (Kumar et al., 2010). Dementsprechend besteht die
Voraussetzung des Tumorwachstums im mehrheitlichen Vorhandensein
proliferierender Zellen gegenüber untergehenden Zellen (Kumar et al., 2010).
Als Tumormikromilieu wird das Gefüge aus den, die Tumorzellen umgebenden,
stromalen (z.B. Fibroblasten und Endothelzellen) Zellen, den Zellen des
Immunsystems, der extrazellulärer Matrix und der darin löslichen Faktoren
bezeichnet (Wojton und Kaur, 2010). Im Hinblick auf Tumorpro- und
Tumorregressionen bestehen zwischen den einzelnen Komponenten vielfältige
Wechselwirkungen, über die anhand der Tumorangiogenese und Tumorimmunität
ein Überblick gegeben werden soll.

24 Literaturübersicht
2.5.1. Tumorangiogenese
Solide Tumoren können ohne eine eigene Blutgefäßversorgung zur Versorgung mit
Sauerstoff und Nährstoffen sowie dem Abtransport von Abfallprodukten nicht größer
werden als 1 bis 2 mm im Durchmesser (Kumar et al., 2010). Zum Zweck weiteren
Tumorwachstums ist entweder das Einsprossen von Gefäßen aus der Umgebung
(Neoangiogenese) oder die Rekrutierung von Endothelvorläuferzellen aus dem
Knochenmark und der dadurch bedingten de novo Entstehung von Tumorgefäßen
(Vaskulogenese) nötig (Kumar et al., 2010; Weis und Cheresh, 2011). Folkman et al.
(1971) schilderten als Erste die Unabdingbarkeit einer Blutgefäßversorgung für das
Tumorwachstum und postulierten in diesem Zusammenhang das Vorhandensein
eines „Tumorangiogenesefaktors“. Da Tumorzellen per se keine angiogenetischen
Kapazitäten haben (Folkman et al., 1989) kommt es durch das Überwiegen pro- über
anti-angiogenetischer Faktoren des Tumormikromilieus zum so genannten
angiogenic switch. Dieser Begriff beschreibt das, sprichwörtliche Umlegen des
Schalters zur Aufnahme der Blutgefäßversorgung einer, sich vorher im Ruhestadium
befindlichen, Ansammlung neoplastischer Zellen. Erst hierdurch wird eine
Progression des Tumors bzw. dessen Metastasierung möglich (Bergers und
Benjamin, 2003; Ribatti et al. 2007; Baeriswyl und Christofori, 2009). Als einer der
Auslöser des angiogenic switch gilt die, durch den relativen Mangel an Sauerstoff
(Hypoxie), verstärkte Aktivität des Hypoxie-induzierbaren Faktors-1-α (HIF-1-α),
welcher, als Transkriptionsfaktor, die verstärkte Ausschüttung angiogenetischer
Zytokine bewirkt (Maxwell et al., 1997, Fang et al., 2001). Abbildung 2 stellt diesen
Zusammenhang sowie verschiedene pro- und anti-angiogenetische Faktoren dar.
Vasostatin, das N-terminale Spaltprodukt des Hitzeschockproteins Calretikulin wurde
von Pike et al. (1998 und 1999) als potenter Angiogeneseinhibitor identifiziert.
Interessanterweise beschreiben Brunner et al. (2012) die Abspaltung des
Calretikulin-N-Terminus und dessen Externalisierung als Vasostatin nach einer
Staupevirusinfektion von Verozellen.

Literaturübersicht 25
Abb. 2: Pro- und anti-angiogenetische Faktoren bei der Tumorvaskularisation
(Murphy et al., 1993; Anand-Apte et al., 1997; Yao et al., 2000; Yao et al.,
2002; Bergers et al., 2003; Baeriswyl et al., 2009)
Ansammlung
neoplastischer Zellen
Pro-angiogenetische
Faktoren
VEGF
bFGF
PDGF
EGF
MMP-9
vaskularisierter Tumor
HIF-1-α
Blutgefäß
Thrombospondin-1
Angiostatin
Endostatin
Canstatin
Tumstatin
Vasostatin
TIMP-3
IL-12
INF-γ
Anti-angiogenetische
Faktoren
Blutgefäß mit einsprossenden
Kapillaren
Die Abbildung gibt eine Übersicht über das Zusammenwirken verschiedener, pro- und
antiangionetisch wirksamer, löslicher Faktoren des Tumormikromilieus und deren Bedeutung im Zuge
des angiogenic switch. Legende: HIF-1-α, Hypoxie-induzierbarer Faktor-1-α, VEGF, vascular
endothelial growth factor; bFGF, basic fibroblast growth factor; PDGF, platelet derived growth factor;
EGF, epithelial growth factor; MMP-9, Matrixmetalloproteinase-9; TIMP-3, tissue inhibitor of
metalloproteinases-3; IL-12, Interleukin-12; INF-γ, Interferon-γ
2.5.2. Tumorimmunität
Die Reaktionen des Immunsystems auf Tumoren sind komplex und gekennzeichnet
durch deren antigenetische Stimulation zum einen, und Immunsuppression bzw.
Immunevasion durch die Tumorzellen zum anderen. Folglich stellt die
Tumorregression durch eine alleinige Immunreaktion des Wirtes eine Seltenheit dar
(Tizard und Schubot, 2008; Kumar et al., 2010). Ferner werden Tumor-assoziierte
Entzündungsreaktionen, je nach vorherrschenden Immunzellkomponenten, deren

26 Literaturübersicht
Dichte und Verteilungsmuster mit anti- als auch mit pro-proliferativen Effekten auf ein
bestehendes Tumorgeschehen in Verbindung gebracht (Hanahan et al., 2003; Galón
et al., 2006; Fridman et al. 2011).
Neben CD8-exprimierenden, zytotoxischen und CD4-exprimierenden, kostimulativen
T-Zellen (Shankaran et al., 2001), kommt dem angeborenen Immunsystem eine
wesentliche Bedeutung in der Tumorimmunität zu.
2.5.2.1. Natürliche Killer (NK-) und Natürliche Killer T- (NKT-) Zellen
Smyth et al. (2000) wiesen in einer Studie die Bedeutung von NK- und NK-T-Zellen
bezüglich der Verhinderung von Tumorinitiation und Metastasierung in 6 murinen
Tumormodellen nach. Es wird gemeinhin angenommen, dass es zur Erkennung und
anschließender Lyse einer Tumorzelle durch NK-Zellen durch das Fehlen von MHC-
I-Molekülen als inhibitorischem Signal kommt (Lanier, 1998; Tizard und Schubot,
2008). Diefenbach et al. (2000) wiesen zudem die Erkennung transformierter Zellen
über den Lektin-ähnlichen Rezeptor NKG2D (natural killer group 2D) nach, dessen
Ligand im Wesentlichen auf den Oberflächen von Tumor- und anderweitig
veränderten, nicht jedoch normalen, Zellen exprimiert wird. Hitzeschockproteinreiche
Tumorzelllysate stimulieren die pro-inflammatorische Zyto- und Chemokinproduktion
durch NK-Zellen, welche wiederum zur Anlockung und Aktivierung von Makrophagen
führt (Zeng et al., 2006). NK-Zellen werden durch Stimulation von IL-12 zur
vermehrten Produktion von IFN-γ angeregt und aktiviert (Tizard und Schubot, 2008).
2.5.2.2. Tumor-assoziierte Makrophagen (TAM)
Eine Vielzahl an Studien assoziiert einen hohen Gehalt Tumor-assoziierter
Makrophagen (TAMs) mit Tumorprogression, Angiogenese, Metastasierung und
einer damit verbundenen schlechteren Prognose. Beispielhaft war dies in
hepatozellulären Karzinomen (Tong Ding et al., 2008), Adenokarzinomen der Lunge
(Zhang et al., 2011) und bei humanen Ewing-Sarkomen der Fall (Fujiwara et al.,
2011). Makrophagen werden je nach der Art ihrer Aktivierung als Makrophagen des
M1- (klassischer Weg der Aktivierung) bzw. des M2- Phänotyps (alternativer Weg der
Aktivierung) bezeichnet (Dalton et al., 1993; Gordon, 2003; Martinez et al., 2008).
Während Monozyten und residente Makrophagen im Rahmen der klassischen

Literaturübersicht 27
Aktivierung angeregt durch IFN-γ, IL-12 und IL-18 zu M1-Makrophagen polarisiert
werden (Dalton et al., 1993; Gordon, 2003; Martinez et al., 2008) bewirkt die
Stimulation mit, im Wesentlichen, IL-4 und IL-13 die Polarisierung zu M2-
Makrophagen (Gordon, 2003; Martinez et al., 2008). M1-Makrophagen vermitteln im
Allgemeinen die Immunreaktionen gegen intrazelluläre Pathogene und Tumoren,
indem sie pro-inflammatorische und tumorizide Faktoren wie z.B. TNF, IL-12,
Stickstoffmonoxid (NO) bzw. induzierbare Stickstoffmonoxidsynthase (iNOS) und
reaktive Sauerstoffspezies ausschütten (Schmid und Varner, 2010). M2-
Makrophagen haben einen eher immunsuppressiven und Gewebe-homöostatischen
Phänotyp (tissue remodeling, Wundheilung), der mit der Produktion von, unter
anderem die Tumorprogression fördernden, Faktoren wie Wachstumsfaktoren und
Angiogeneseinduktoren, MMPs und IL-10 einhergeht (Lewis et al., 2000; Giraudo et
al., 2004, Martinez et al., 2008, Schmid und Varner, 2010). Es gilt als gesichert, dass
TAMs, nach ihrer Rekrutierung zum Ort des neoplastischen Geschehens, angeregt
und vermittelt durch zahlreiche Zytokine, Transkriptionsfaktoren und Signalwege der
Zellen des Tumormikromilieus, ihren Phänotyp von der M1- zur M2-Polarisierung hin
verändern (Mantovani et al. 2002 und 2004; Allavena et al., 2008; Sica et al., 2008,
Schmieder et al., 2012). Frühe Hinweise darauf gaben die Beobachtungen von Klimp
et al. (2001) und DiNapoli et al. (1996), dass nur ein Bruchteil Ovar- bzw.
Mammatumor-begleitender TAMs tumorizides NO und iNOS produzieren. Ferner
wiesen Sica et al. (2000) in TAMs eine fehlende Produktion des INF-γ-induzierenden
und anti-angiogenetisch wirksamen M1-Zytokins IL-12, zu Gunsten der Produktion
des immunsuppressiven M2-Zytokins IL-10 nach. Die Modulation der TAMs vom M2-
in den M1-Phänotyp führte in einer Studie von Hagemann et al. (2008) zur
Regression fortgeschrittener Tumorstadien im Mausmodell. Abbildung 3 gibt eine
Übersicht über die Makrophagenpolarisierung im Zusammenhang mit einem
Tumorgeschehen.

28 Literaturübersicht
Abb. 3: Polarisation des Makrophagen-Phänotyps im Tumormikromilieu
M1 Makrophage
Anti-proliferativ
Monozyt/
ortsständiger
Makrophage
IFN- γ
M2 Makrophage
NO
iNOS
ROS
TNF
IL-12
Fördern Th1-
Antwort
Pro-proliferativ
IL-4
IL-13
IL-10
Glukokortikoide
Wachstumsfaktoren
(VEGF, bFGF)
MMPs
IL-6
IL-8
Fördern Th2-
Antwort
Die Abbildung gibt einen Überblick über die, die Polarisation des Makrophagen-Phänotyps,
bestimmenden löslichen Faktoren sowie, die, je nach Phänotyp, anti- bzw. pro-proliferativ wirksamen
Effektormoleküle (modifiziert nach Schmid und Varner, 2010). Legende: INF-γ, Interferon-γ, IL-4,
Interleukin-4, IL-13, Interleukin-13, IL-10, Interleukin-10, M1, Makrophagen-Phänotyp nach
klassischer Aktivierung, M2, Makrophagen-Phänotyp nach alternativer Aktivierung, NO,
Stickstoffmonoxid, iNOS, induzierbare Stickstoffmonoxidsynthase, ROS, reactive oxygen species,
TNF, Tumornekrosefaktor, IL-12, Interleukin-12, VEGF, vascular endothelial growth factor; bFGF,
basic fibroblast growth factor; MMPs, Matrixmetalloproteinasen, IL-6, Interleukin-6, IL-8, Interleukin-8
2.5.3. Interferon-γ (IFN-γ), Tumorimmunität und Anti-Angiogenese
IFN-γ kommt im Rahmen der Tumorimmunität eine Schlüsselrolle zu (Dunn et al.,
2006). Kaplan et al. (1998) beschrieben als Erste dessen fundamentale Bedeutung in
einer Studie mit Interferonrezeptor-defizienten bzw. Interferonrezeptor-defizienten
und p53-defizienten, immunkompetenten Mäusen. Es kam zu einer schnelleren und
hochfrequenteren Tumorentstehung sowie zur Entwicklung eines breiteren
Spektrums von Tumorarten als bei den Kontrolltieren. Neben des per se antiproliferativen
Effekts (Johns et al., 1992; Qin et al., 1997) und der schon genannten
Stimulation von NK-Zellen, kommt den Interferonen, insbesondere im

Literaturübersicht 29
Zusammenhang mit der Anti-Tumorimmunität, eine Bedeutung in der Aufregulierung
von MHC-Molekülen, der Kostimulation von Makrophagen und deren Polarisierung
zum M1-Phänotyp, der Aktivierung von zytotoxischen T-Zellen und der Th1-Zell-
Differenzierung zu (Gordon, 2003; Dunn et al., 2006). In einer Studie von Yao et al.
(1999) führt eine Tumor-assoziierte, IL-12-vermittelte IFN-γ-Ausschüttung durch
residente NK-Zellen zur Produktion von Interferon-induzierbarem Protein-10 (IP-10),
welche wiederum eine verstärkte Anlockung von NK-Zellen bewirkt. Die, auf diese
Art stimulierten, NK-Zellen erwiesen sich als hochgradig zytolytisch auf benachbarte
Endothelzellen. Yao et al. (1999) sehen in diesen Ergebnissen die Bedeutung der
anti-angiogenetischen Wirkung der IL-12-INF-γ-NK-Zell-Achse. Ferner wiesen
Vasostatin-IL12- und Vasostatin-IP10-Kombinationstherapien verbesserte antiangiogenetische
und Tumor-statische Eigenschaften auf als Einzeltherapien (Yao et
al., 2000 und 2001). Sgadari et al. (1996) beschreiben eine hemmende Wirkung von
IL-12 auf die basic fibroblast growth factor (bFGF)-induzierte Angiogenese. Bei
Angiolillo et al. (1995) bewirkte IP-10 eine Hemmung von bFGF und der
Differenzierung von Endothelzellen in kapilläre Strukturen.
2.6. Arten des Zelluntergangs, deren morphologische
Nachweismethoden und assoziierte immunologische
Reaktionen
Die zum Stand der Forschung wichtigsten Arten des Zellunterganges sind Nekrose,
Apoptose und Autophagie (Krysko et al., 2008; Walsh und Edinger, 2010).
2.6.1. Nekrose
Unter Nekrose wird im Allgemeinen das morphologische Korrelat eines, auch als
Onkose bezeichneten, Mechanismus des Zelltodes, welcher sich durch
Schwellungen der Somata und der Denaturierung zellulärer Proteine mit daraus
resultierender Plasmakoagulation auszeichnet, verstanden (Weerasinghe und Buja,
2012). Nekrotische Zellen sind morphologisch gekennzeichnet durch
Hypereosinophilie, den Zusammenbruch von Zellorganellen sowie schließlich der
Plasmamembran, was zu einem Austritt zellulärer Inhalte in das extrazelluläre Milieu

30 Literaturübersicht
führt (Kumar et al., 2010). Die Betrachtung von Nekrose als unkontrollierte, aus einer
physiko-chemischen Stresssituation hervorgehende Art des Zelltodes wird vermehrt
in Frage gestellt und letztlich eher als Konsequenz kontrollierter, Caspaseunabhängiger
Interaktionen verschiedenster biochemischer und molekularer
Gegebenheiten gesehen, in dessen Mittelpunkt die vermehrte Aktivität reaktiver
Sauerstoffspezies steht (Festjens et al. 2006; Zong und Thompson, 2006). Krysko et
al. (2008) geben einen Überblick über verschiedene Methoden der morphologischen
Diskriminierung nekrotischer von apoptotischen Zellen, betonen jedoch, dass im
Gegensatz zur Apoptose, keine eindeutigen biochemischen Marker zur Darstellung
nekrotischer Zellen zur Verfügung stehen.
2.6.2. Apoptose
Der Begriff der Apoptose wurde von Kerr et al. (1972) geprägt und morphologisch
beschrieben als Zelluntergang im Zuge der Abschnürung membranbegrenzter, so
genannter apoptotischer Körperchen, welche wiederum durch lysosomale Enzyme
phagozytierender Zellen degradiert werden. Man unterscheidet verschiedene Phasen
im Ablauf der Apoptosekaskase: Initiations-, Promotions- / Inhibitions- und
Effektorphase (Kumar et al., 2010). Der morphologische bzw., immunhistologische
Nachweis der Initiations- und Effektorphase kann z.B. durch Antikörper gegen FAS
bzw. FAS-Ligand, aktivierte Caspase 8, 9, und 10 (Initiation) bzw. der
Effektorcaspasen 3, 6 und 7 erbracht werden (Huppertz et al., 1999).
Effektorcaspasen führen wiederum zu DNS-Fragmentierungen, die mit Hilfe der
TUNEL (Terminal dUTP Nick End Labeling)- Methode (Gavrieli et al., 1992)
nachgewiesen werden können.
2.6.3. Autophagie
Im Rahmen der Autophagie kommt es nach Abschnürung autophagosomaler
Membranen vom endoplasmatischen Retikulum (Hayashi-Nishino et al., 2009),
welche in der Folge zelluläre Bestandteile umschließen und diese nach Fusion mit
Lysosomen mit Hilfe der lysosomalen Enzyme degradieren (Dunn, 1994). Die
Bedeutung der Autophagie als eigenständiger, zum Zelltod führender Prozess wird in
der Literatur kontrovers diskutiert (Mizushima et al., 2008) bzw. als Alternative zur

Literaturübersicht 31
Apoptose betrachtet, durch die eine Zelle entweder in Richtung des Zelltodes oder
Zellerhalts polarisiert werden kann (Maiuri et al., 2007). Zum Beispiel zeigen Mora et
al. (2009), dass es zum Zelltod durch Induktion von Autophagie in Apoptoseresistenten
Tumorzellen kommen kann, wohingegen Autophagiemechanismen nach
Ogata et al. (2006) und Kouroku et al. (2007) sogar zum Schutz vor Zelltod nach
endoplasmatischem Retikulum-Stress beitragen können. Der Goldstandard zum
Nachweis von Autophagie ist die elektronenmikroskopische Darstellung
autophagosomaler Vakuolen (Mizushima et al., 2004, Martinet et al., 2013).
Weiterhin wird die, unter Anderem immunhistochemische, Visualisierung
autophagosomaler Membranen durch Antikörper gegen das mammalian microtubuleassociated
protein 1 light chain 3 (Martinet et al, 2006; Sato et al., 2007; Martinet et
al., 2013) beschrieben.
2.6.4. Zelluntergang-assoziierte immunologische Reaktionen
Nekrotischer Zelldebris, wie auch apoptotische Körperchen werden zum finalen
Abbau von phagozytierenden Zellen, im Wesentlichen von Makrophagen,
aufgenommen und degradiert (Krsyko et al., 2003). Cocco et al. (2001) zeigten, dass
die Erkennung nekrotischer Zellen, die Exkretion pro-inflammatorischer Zytokine
durch aktivierte Makrophagen auslöst, während apoptotische Zellen eine
phlogistische Immunantwort verhindern. In einem weiteren Vergleich der Reaktionen
von Makrophagen auf die Aufnahme von nekrotischen gegenüber apoptotischen
Zellbestandteilen, beobachteten Barker et al. (1999) eine transiente Aufregulierung
von T-Zell-stimulativen Molekülen und damit der Induktion einer adaptiven
Immunantwort. Nach Aufnahme von Bestandteilen apoptotischer Zellen kam es zur
Ausschüttung inhibitorischer Zytokine. Bezüglich der Reaktionen dendritischer Zellen
nach Phagozytose nekrotischer im Vergleich zu apoptotischer Tumorzellen kamen
Sauter et al. (2000) zu ähnlichen Ergebnissen: Zur Ausreifung der dendritischen
Zellen, also zur Abnahme der Antigenakquise bei gleichzeitiger Aufregulierung der
MHC-Expression zuvor internalisierter Tumorantigene sowie T-Zell-kostimulativer
Moleküle, kam es lediglich nach Phagozytose nekrotischer Tumorzellen. Weiterhin
führte die Phagozytose nekrotischer jedoch nicht-apoptotischer Zellen zur
Freisetzung von Hitzeschockproteinen (HSP) wie HSP gp96, Calretikulin, hsp90,

32 Literaturübersicht
hsp70 aus dem endoplasmatischen Retikulum. Diese induzierten wiederum die
Expression Antigen-präsentierender Moleküle auf dendritischen Zellen und trugen
somit zu deren Ausreifung bei (Basu et al., 2000).

Material und Methoden 33
3. Material und Methoden
3.1. Allgemeiner Versuchsaufbau
Es wurden zwei verschiedene Versuchsansätze gewählt. Zum einen wurden Xenotransplanate
aus Zellen der Makrophagen- / Monozytenzelllinie DH82 in Scid-
Mäusen generiert, welche, nach Erreichen eines festgelegten Zeitpunktes,
intratumoral, einfach bzw. zehnfach mit CDV-Ond infiziert wurden. Zum anderen
entstanden aus der Transplantation von DH82-Zellen, welche persistierend mit den
CDV-Ond infizierten waren, persistierend infizierte Xenotransplantate. Es erfolgte, je
Tier und Zelllinie, eine einmalige Transplantation von 3x10 6 Zellen in einem Volumen
von 100 Mikroliter (µl) Zellkulturmedium (siehe Unterabschnitt 3.3). Vergleichende in
vivo- und post mortem- Untersuchungen der Tumorvolumina schlossen sich an.
Weiterhin wurden die Tumoren, welche aus den persistierend infizierten Zellen
entstanden waren, im Vergleich zu Tumoren, welche von nicht-infizierten Zellen
ausgingen, inklusive ihrer Tumormikromilieus histologisch und immunhistologisch
untersucht.
3.1.1. Tierversuchsplan: DH82-Transplantate mit intratumoraler Injektion
von CDV-Ond
Jede Versuchsgruppe bestand aus 6 weiblichen Scid-Mäusen. Die
Eingewöhnungszeit der Tiere von 2 Wochen wurde für die zellkulturellen Vorarbeiten
der Transplantation genutzt. Der Versuch begann an Tag 0 mit der Transplantation
von DH82-Tumorzellen bzw. der Mock-Transplantation von 100 µl serumfreien
Zellkulturmediums. Im Folgenden sollten die entstandenen Tumoren intratumoral
injiziert werden. Der Zeitpunkt der intratumoralen Injektion, bzw. der ersten von
maximal 10 intratumoralen Injektionen, war festgelegt worden als der Tag, an dem
die Tumoren einen Durchmesser von 0,5 cm bzw. ein Volumen von circa 0,06 cm 3
haben würden. Basierend auf den Erkenntnissen eines Vorversuches zur
Schnelligkeit der Tumorentwicklung aus transplantierten, unbehandelten DH82-
Zellen wurde, unter Anderem zur Vereinfachung der Praktikabilität, hierfür der Tag 35
nach der Transplantation gewählt.

34
Material und Methoden
In einem weiteren Vorversuch wurde die Wirksamkeit einer einmaligen,
intratumoralen Injektion von CDV-Ond und UV-inaktiviertem CDV-Ond (siehe
Unterabschnitt 3.2) als Kontrolle getestet. Ein zusätzlicher Vorversuch beschäftigte
sich mit der Effizienz einer einmaligen intratumoralen Applikation von CDV-Ond in
DH82-Tumoren, die erst die Hälfte (circa 0,03 cm³) des ursprünglich festgelegten
Volumens am Tag der Injektion hatten. Basierend auf den Ergebnissen der
Vorversuche, wurde zum einen das Therapieregime zu Gunsten den, alle zwei Tage
statt findenden, maximal zehnfachen, Injektionen verändert und zum anderen die
Zeitpunkte zur Tötung, Sektion und Probennahme (im Folgenden bezeichnet als
Probennahmezeitpunkt, PZP) folgendermaßen festgelegt (Abb. 4):
PZP 1: Tag nach der 5. Injektion bzw. Tag 44 nach Transplantation
PZP 2: Tag nach der 10. Injektion bzw. Tag 54 nach Transplantation
PZP 3: Tag 10 nach der letzten Injektion bzw. Tag 63 nach Transplantation
PZP 4: Tag 24 nach der letzten Injektion bzw. Tag 77 nach Transplantation
Für den Vorversuch wurde die längstmögliche Dauer (bis zum PZP 4) gewählt um
Erkenntnisse in Bezug auf die Langzeitwirkung der intratumoralen Applikationen zu
gewinnen und auf der Basis die restlichen PZP festzulegen.
Verschiedene Arten der intratumoralen Behandlung standen zur Verfügung:
1. intratumorale Injektion von CDV-Ond (Virusinfektion)
2. intratumorale Injektion von UV-inaktiviertem CDV-Ond (Plazebo 1)
3. intratumorale Injektion von Zellkulturmedium (Plazebo 2)
4. keine intratumorale Injektion (Kontrolle)
Die PZP in den Versuchsgruppen ohne intratumorale Injektion wurden analog der
PZP der Versuchsgruppen mit injizierten Tumoren gewählt. Tabelle 3 zeigt die
Versuchsgruppen mit ihren Gruppenbezeichnungen und –kodierungen sowie den
Zeitpunkten der letzten Versuchstage, respektive Tötungstage.
Die klinischen Untersuchungen der Tiere inklusive der Messungen der
Tumorausdehnungen und Kalkulation der Tumorvolumina erfolgten während des
Behandlungszeitraumes stets vor der intratumoralen Injektion. Nach Beendigung des

Material und Methoden 35
Behandlungszeitraumes fanden klinische Untersuchungen mit Bestimmung der
Tumorvolumina alle zwei bis drei Tage statt (siehe auch Unterabschnitt 3.3).
Abbildung 4 stellt die beschriebenen Versuchsabläufe chronologisch dar.
Tab. 3: Übersicht über die Versuchsgruppen mit intratumoraler Applikation
(Virusinfektion; Plazebo 1 und 2) der DH82-Transplantate und deren
Kontrollen
Gruppenkodierung
Gruppenbezeichnung
PZP
5.1 DH82-Transplantat mit intratumoraler Injektion von CDV- 1
Ond alle 2 Tage (5 Injektionen)
5.2 DH82-Transplantat mit intratumoraler Injektion von CDV- 2
Ond alle 2 Tage (10 Injektionen)
5.3 DH82-Transplantat mit intratumoraler Injektion von CDV- 3
Ond alle 2 Tage (10 Injektionen)
5.4 DH82-Transplantat mit intratumoraler Injektion von CDV- 4
Ond alle 2 Tage (10 Injektionen)
7.1 DH82-Transplantat mit intratumoraler Injektion von UVinaktiviertem
1
CDV-Ond alle 2 Tage (5 Injektionen)
7.2 DH82-Transplantat mit intratumoraler Injektion von UVinaktiviertem
2
CDV-Ond alle 2 Tage (10 Injektionen)
7.3 DH82-Transplantat mit intratumoraler Injektion von UVinaktiviertem
3
CDV-Ond alle 2 Tage (10 Injektionen)
7.4 DH82-Transplantat mit intratumoraler Injektion von UVinaktiviertem
4
CDV-Ond alle 2 Tage (10 Injektionen)
8.1 DH82-Transplantat mit intratumoraler Injektion von 1
Zellkulturmedium (5 Injektionen)
8.2 DH82-Transplantat mit intratumoraler Injektion von 2
Zellkulturmedium alle 2 Tage (10 Injektionen)
8.3 DH82-Transplantat mit intratumoraler Injektion von 3
Zellkulturmedium alle 2 Tage (10 Injektionen)
8.4 DH82-Transplantat mit intratumoraler Injektion von 4
Zellkulturmedium alle 2 Tage (10 Injektionen)
1.1 DH82-Transplantat ohne intratumorale Injektion 1
1.2 DH82-Transplantat ohne intratumorale Injektion 2
1.3 DH82-Transplantat ohne intratumorale Injektion 3
1.4 DH82-Transplantat ohne intratumorale Injektion 4
2.4 DH82-Transplantat mit einfacher intratumoraler Injektion
von CDV-Ond
4.4 DH82-Transplantat mit einfacher intratumoraler Injektion
von UV-inaktiviertem CDV-Ond
4
4

36
Material und Methoden
Fortsetzung Tab. 3
DH82-Transplantat mit einfacher intratumoraler Injektion 4
6.4
von CDV-Ond am Zeitpunkt der Hälfte der festgelegten
Tumorgröße
Mock-Transplantat aus serumfreiem Zellkulturmedium 63 Tage nach
9
Transplantation
Die in der Tabelle aufgelisteten Tierkodierungen geben mit der ersten Zahl die Zugehörigkeit zur Art
der Applikation und mit der zweiten Zahl den Probennahmezeitpunkt an. Legende: CDV-Ond, canine
distemper virus, Stamm Onderstepoort; PZP, Probennahmezeitpunkt

Material und Methoden 37
Abb. 4: Chronologischer Ablauf des Versuches der intratumoralen CDV-Applikation in die DH82-
Transplantate
PZP 1 - Tag 44
PZP 2 - Tag 54
PZP 3 - Tag 63
PZP 4 - Tag 77
Tag -14
Tag 0
Tag 35
Tag 37
Tag 39
Tag 41
Tag 43
Tag 45
Tag 47
Tag 49
Tag 51
Tag 53
Eingang der Tiere
Transplantation
Tötung und Sektion
Zellkulturelle Vorarbeiten während
der Eingewöhnungsphase
Intratumorale Injektion
PZP Probennahmezeitpunkt
Die Abbildung zeigt den zeitlichen Ablauf des DH82-Transplantationsversuches mit intratumoraler CDV-Applikation vom Tag des
Eingangs der Tiere, über den Tag der Tumorzelltransplantation, den Zeitraum der intratumoralen Injektionen, den Untersuchungszeitraum,

38
Material und Methoden
3.1.2. Tierversuchsplan: DH82CDVpi-Transplantate
Jede Versuchsgruppe bestand aus 6 weiblichen Tieren. Die Eingewöhnungszeit der
Tiere von 2 Wochen wurde für die zellkulturellen Vorarbeiten der Transplantation
genutzt. Der Versuch begann an Tag 0 mit der Transplantation persistierend mit dem
CDV-Ond infizierter DH82-Zellen (DH82CDVpi-Zellen) und DH82-Zellen als Kontrolle
bzw. der Mock-Transplantation von 100 µl serumfreien Zellkulturmediums. Im
Folgenden wurden die Ausdehnungen der entstandenen Tumoren im Rahmen der
klinischen Untersuchungen der Tiere lediglich vermessen und deren Tumorvolumen
kalkuliert (siehe Unterabschnitt 3.3). Eine intratumorale Injektion fand nicht statt.
Analog zu dem Vorversuch zur Schnelligkeit der Tumorentwicklung ausgehend von
transplantierten DH82-Zellen, wurde auch hier zunächst eine Langzeitstudie nach
statt gefundener Transplantation durchgeführt. Basierend auf den Ergebnissen
wurden die Zeitpunkte zur Tötung, Sektion und Probennahme (im Folgenden
bezeichnet als Probennahmezeitpunkt, PZP) folgendermaßen festgelegt:
PZP 1pi: Tag 7 nach Transplantation
PZP 2pi: Tag 14 nach Transplantation
PZP 3pi: Tag 21 nach Transplantation
PZP 4pi: Tag 35 nach Transplantation
Der PZP 4pi war somit analog dem Tag der ersten intratumoralen Injektion in die
DH82-Transplantate wie im Abschnitt 3.1.1 beschrieben.
Hinzu kam der PZP der Langzeitstudie:
PZP 5pi: Tag 77 nach Transplantation
Die PZP in den Versuchsgruppen mit Transplantation von DH82-Zellen wurden
analog der PZP der Versuchsgruppen mit transplantierten DH82CDVpi gewählt.
Tabelle 4 zeigt die Versuchsgruppen mit ihren Gruppenbezeichnungen und –
kodierungen sowie den Zeitpunkt der letzten Versuchstage, respektive Tötungstage.
Abbildung 5 stellt die beschriebenen Versuchsabläufe chronologisch dar.

Material und Methoden 39
Tab. 4: Übersicht über die Versuchsgruppen mit DH82CDVpi-
Transplantaten und deren Kontrollen
Gruppenkodierung
Gruppenbezeichnung
PZP
3.0 DH82CDVpi-Transplantat ohne intratumorale Behandlung 1pi
3.1 DH82CDVpi-Transplantat ohne intratumorale Behandlung 2pi
3.2 DH82CDVpi-Transplantat ohne intratumorale Behandlung 3pi
3.3 DH82CDVpi-Transplantat ohne intratumorale Behandlung 4pi
3.4 DH82CDVpi-Transplantat ohne intratumorale Behandlung 5pi
1.A DH82-Transplantat ohne intratumorale Behandlung 1pi
1.B DH82-Transplantat ohne intratumorale Behandlung 2pi
1.C DH82-Transplantat ohne intratumorale Behandlung 3pi
1.0 DH82-Transplantat ohne intratumorale Behandlung 4pi
1.4 DH82-Transplantat ohne intratumorale Behandlung 5pi
9
Mock-Transplantat aus serumfreiem Zellkulturmedium
63 Tage nach
Transplantation
Die in der Tabelle aufgelisteten Tierkodierungen geben mit der ersten Zahl die Zugehörigkeit zur Art
der Behandlung und mit dem zweiten Buchstaben oder der zweiten Zahl den Probennahmezeitpunkt
an. Legende: DH82CDVpi, persistierend CDV-infizierte DH82-Zellen; PZP, Probennahmezeitpunkt

40
Material und Methoden
Abb. 5: Chronologischer Ablauf des DH82CDVpi-Transplantationsversuches
PZP 1pi - Tag 7
PZP 2pi - Tag 14
PZP 3pi - Tag 21
PZP 4pi - Tag 35
PZP 5pi - Tag 77
Tag -14
Tag 0
Eingang der Tiere
Transplantation
PZP; Probennahmezeitpunkt
Zellkulturelle Vorarbeiten während
der Eingewöhnungsphase
Tötung und Sektion
Die Abbildung zeigt den zeitlichen Ablauf des DH82CDVpi-Transplantationsversuches vom Tag des Eingangs der Tiere, über den Tag
der Tumorzelltransplantation, den Untersuchungszeitraum bis zur Tötung und Sektion der Tiere.

Material und Methoden 41
3.2. Zellkulturelle Vorarbeiten zum Tierversuch
Es wurden zum einen DH82-Tumorzellen verwendet, welche von der European Collection
of Cell Cultures (ECACC) bezogen, subkultiviert und als Passage 8 bei -80°C
gelagert worden waren. Zum anderen fanden DH82CDVpi-Zellen Verwendung.
Diese viruspartikelproduzierende Zellpopulation war, wie bei Puff et al. (2009)
beschrieben, durch CDV-Ond-Infektion von DH82-Zellen der 104. Passage und
deren mehrmalige Passage generiert und als DH82CDVpi-Zellen der Passage 139
bei -80°C gelagert worden. Bei 37°C und 5% CO 2 im Brutschrank (Thermo Fisher
Scientific) erfolgte die neuerliche Kultivierung beider Zelllinien in Minimal Essential
Medium mit Earle’s Salzen und L-Glutamin (Wachstumsmedium, MEME, PAA) und
folgenden Zusätzen: 10% fetales Kälberserum (FKS, Biochrom AG), 1% Penicillin/
Streptomycin (P/S), 1% nicht-essenzielle Aminosäuren (NEAA, Sigma Aldrich
Chemie GmbH).
3.2.1. Vorbereitung der Zellen für die Transplantation
Der DH82- und DH82CDVpi-Zellrasen sollte zum Zeitpunkt der Ernte für die
Transplantation eine Konfluenz von circa 70% bis 80% besitzen. Zum Zweck der
Determinierung der optimal auszusähenden Zellzahl der, zur Transplantation
bestimmten, Zellen, wurde eine Zellverdünnungsreihe angefertigt. Basierend auf den
Ergebnissen erfolgte in den folgenden Arbeitsschritten eine Aussaat von 13333
Zellen/cm 2 bzw. 1x10 6 Zellen in Zellkulturflaschen mit einer Fläche von 75 cm 2 (T75)
und 2,33x10 6 Zellen in Zellkulturflaschen mit einer Fläche von 175 cm 2 (T175)
(Nunc TM , Thermo Fisher Scientific und Cellstar ® , Greiner bio-one GmbH & Co. KG).
Folgendes Protokoll hat sich als geeignet für eine ideale Konfluenz und Vitalität der
Zellen zum Zeitpunkt der Transplantation erwiesen:
Tag 1: Auftauen der Zellen und Aussaat in einer Zellkulturflasche mit einer Fläche
von 25 cm 2 (T25)
Tag 3 : Passage und Aussaat von 13333 Zellen/cm 2 in T75 oder T175
Zellkulturflaschen
Tag 6: Mediumwechsel

42
Material und Methoden
Tag 10: Ernte und Transplantation
Die Transplantation erfolgte dementsprechend mit Passage 10 der DH82- bzw. mit
der Passage 141 der DH82CDVpi-Zellen. Das Passagieren und die Aussaat der
Zellen wurden, wie von Sayed-Ahmed (2011) beschrieben, durchgeführt.
3.2.2. Ernte der zu transplantierenden Zellen
Das, in diesem Schritt zum Waschen und Resuspendieren der Zellen verwandte,
Medium war serum- und NEAA-freies MEME mit 1% Penicillin/Streptomycin
(Spülmedium). Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung von Zellen für eine
Versuchsgruppe à 6 Tiere.
Vorsichtiges Schaben der Zellen und Resuspension in dem, in der Flasche
vorhandenen, Wachstumsmedium
Überführung der Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen (Greiner bio-one
GmbH & Co. KG)
Spülen des Flaschenboden durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren von
serumfreiem Spülmedium und Zugabe zur Zellsuspension im
Zentrifugenröhrchen
Zentrifugation für 10 Minuten (min) bei 250 x g und 4°C
Resuspension des Zellpellets in serumfreien Spülmedium und Überführung in
ein Becherglas
Bestimmung der Zellzahl pro 1 Milliliter (ml) serumfreiem Spülmediums
(Sayed-Ahmed, 2011)
Für 6 Einzeldosen à 100 µl mit einem Zellgehalt von 3x10 6 Zellen wurden, um
Pipettierunsicherheiten auszugleichen, 6 Einzeldosen a 150 µl und einem
Zellgehalt von 4,5x10 6 Zellen vorbereitet.
Abnahme des, einem Zellgehalt von 27x10 6 Zellen entsprechenden, Volumens
gut resupendierter Zellsuspension aus dem Becherglas und Überführung in
ein Zentrifugenröhrchen
Zentrifugation für 10 min bei 250 x g und 4°C

Material und Methoden 43
Vorsichtiges Dekantieren und komplette Abnahme des Überstandes mit Hilfe
einer Pipette
Bestimmung des Volumens des Zellpellets durch reverses Pipettieren
Zugabe des Volumens an serumfreiem Spülmedium abzüglich des Volumens
des Zellpellets (900 µl – Volumen des Zellpellets)
Überführen von 6 x 150 µl Zellsuspension (Einzeldosis) in je ein 1,5 ml
Eppendorfgefäß
3.2.3. CDV-Ond zur intratumoralen Infektion der Xenotransplantate
Der CDV-Ond-Stamm wurde von Dr. Metzler (Institut für Virologie,
Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Zürich) zur Verfügung gestellt. Die interne
Bezeichnung des, für die intratumoralen Infektionen verwendeten, Virus lautet CDV-
Ond X (22.5.2006) und weist eine, 50% eines Zellmonolayers inifizierende Dosis
(tissue culture infectious dose 50 , TCID 50 ) von 10 4,5 pro 100 µl Virussuspension auf.
Die Virusproduktion, -ernte und -titration zur Bestimmung der TCID 50 wurde wie bei
Sayed-Ahmed (2011) beschrieben, durchgeführt. Die Virusproduktion fand in
Verozellen statt. Entsprechend befinden sich die Viruspartikel in, für Verozellen
verwendetem, Wachstumsmedium (MEME mit 10% FKS und 1% P/S).
3.2.3.1. CDV-Ond-Inaktivierung mittels UV-Licht-Bestrahlung
In Anlehnung an das Protokoll von Gerhauser (2009) wurden im Institut für Virologie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover verschiedene Passagen des CDV-Ond
mittels UV-Licht inaktiviert. Dafür wurden 10 ml (CDV-Ond X, 22.5.2006) bzw. 30 ml
(CDV-Ond XI, 21.9.2010) in eine Petrischale gegeben und für 1 Stunde (CDV-Ond X,
22.5.2006) bzw. 3 h (CDV-Ond XI, 21.9.2010) mit 4 Entkeimungslampen (Philips
TUV, G15T8, Holger Veith Handelsvertretung) bestrahlt. Danach folgte der Ausgleich
des, durch die Bestrahlung entstandenen, Flüssigkeitsverlustes durch destilliertes
Wasser. Danach wurden beide Lösungen gepoolt. Die dabei entstandene Lösung
UV-inaktivierten Virus’ erwies sich in einer weiteren Virustitration (Sayed-Ahmed,
2011) als nicht mehr zytopathogen.

44
Material und Methoden
3.3. Methodik des Tierversuchs
Die Genehmigung für die vorzunehmenden Transplantationen, Injektionen /
Infektionen, Untersuchungen sowie Tötungen der Mäuse wurde vom Landesamt für
Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit Oldenburg unter dem Aktenzeichen
33.9-42502-04-08/1515 erteilt.
3.3.1. Mäuse
Die verwendeten Tiere waren weibliche Scid-Mäuse (CB17/lcr-Prkdc scid/Crl),
welche in einem Alter von 4 Wochen von einem kommerziellen Anbieter (Charles
River Wiga Deutschland GmbH) gekauft wurden. Die Tiere wurden in
Versuchsgruppen à 6 Tiere pro Gruppe randomisiert und innerhalb zweier Wochen
vor Versuchsbeginn (Tag der Transplantation der Tumorzellen) an die Umgebung
und das, während der Versuchsphase nötige, handling gewöhnt.
3.3.2. Haltung und Maßnahmen zur Minimierung des Keimdruckes in der
Umgebung
Die Tiere wurden in Gruppen zu je 6 Tieren im Tierstall des Institutes für Pathologie
der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover gehalten. Die Haltung erfolgte in
einem unterdruckführenden, individuell belüfteten Käfigsystem (Sealsafe ® Cage
1291H, Tecniplast Deutschland GmbH). Die Beleuchtung lief in einem 12 Stunden
Tag-Nacht-Rhythmus ab. Die Temperatur lag zwischen 20 und 24°C. Die relative
Luftfeuchtigkeit betrug 50-60%. Die Ausstattung der Käfige bestand aus einem
mouse house (Tecniplast Deutschland GmbH) sowie, zuvor mit 25 kGy
strahlensterilisierter und vakuumverpackter, pathogenfreier Einstreu (Ssniff bedding
Faser spez., sterilis. 25kGy, ssniff Spezialdiäten GmbH). Es stand, bei 121°C 20 min
autoklaviertes, Leitungswasser ad libitum zur Verfügung. Ebenfalls ad libitum wurde,
zuvor vakuumverpacktes, Total Pathogen Freies (TPF) Haltungsfutter (Ratte / Maus
Haltung TPF, Altromin Spezialfutter GmbH & Co. KG) angeboten. Die Käfige wurden
wöchentlich getauscht, gereinigt, zweifach bei 120°C 1 Stunde autoklaviert und unter
einer Sicherheitswerkbank (HeraSafe, Heraeus, Kendro Laboratory Products GmbH)
neu mit Einstreu, Futter und Wasser befüllt. Das Umsetzen der Tiere verlief ebenfalls
unter der Sicherheitswerkbank. Die Ausstattung der gereinigten Käfige erfolgte durch

Material und Methoden 45
den, mit einem, bei 121°C 20 min autoklavierten, OP-Sicherheitskittel,
Gesichtsmasken und OP-Hauben (Henry Schein Vet GmbH) ausgestatteten,
Experimentator. Alle Arbeiten, welche mit Berührungen der Flächen, zu denen die
Tiere Kontakt haben, einhergingen, wurden mit sterilen, gepuderten OP-
Handschuhen (Unigloves GmbH) durchgeführt. Zur Desinfektion der Werkbank
wurde 1%iges Venno Vet 1 super (Menno Chemie-Vertriebsgesellschaft mbH)
verwandt. Die Einwirkzeit betrug 1 Stunde bei gleichzeitiger UV-Licht-Bestrahlung.
3.3.3. Handling und Untersuchung der Tiere unter der Maßgabe der
Minimierung des Keimdruckes
Jegliche Tätigkeiten, die mit dem handling der Tiere einhergingen, wurden stets von
2 Personen ausgeführt. Beide Untersucher trugen zu jeder Zeit autoklavierte OP-
Kittel, Masken und Hauben. Eine Person (sterile Person, Person A) war lediglich für
das handling der Tiere und der, von diesen berührbaren, Oberflächen verantwortlich
und trug sterile OP-Handschuhe. Die andere Person (unsterile Person, Person B)
war mit unsterilen Einmalhandschuhen ausgestattet und für jegliche Tätigkeiten, die
mit dem Berühren potenziell kontaminierter Oberflächen einhergingen, zuständig.
Zum Zweck der klinischen Untersuchung wurde jedes Tier von Person A aus dem
Käfig genommen und in ein hohes, sterilisiertes Untersuchungsgefäß (500 ml
Becherglas) gesetzt. In diesem wurde das Tier, durch Person B, in die Feinwaage
(Sartorius TE13S-DS) verbracht. Das Gewicht in Gramm sowie Haltung / äußere
Erscheinung und Verhalten / Aktivität wurde, in Anlehnung an das von Ulrich (2006)
beschriebene Punktesystem, protokolliert. Tabelle 5 stellt die Punktekodierung den
klinisch beobachtbaren Eigenschaften gegenüber. Die Protokollführung übernahm
Person B.

46
Material und Methoden
Tab. 5: Übersicht über Kodierung der während der klinischen
Untersuchung festgestellten Befunde bezüglich der Haltung,
äußeren Erscheinung und des Verhaltens (modifiziert nach Ulrich et
al., 2006)
Kategorie Veränderung Punktzahl
Haltung /
äußere Erscheinung
Verhalten
normale Haltung; Haare 0
glatt, glänzend und dem
Körper dicht anliegend
normale Haltung;
1
struppige, stumpfe Haare
leicht aufgekrümmter 2
Rücken;
struppige, stumpfe Haare
stark aufgekrümmter 3
Rücken; struppige, stumpfe,
verunreinigte Haare
aufmerksam und neugierig, 0
in Bewegung;
Fress- / Trinkverhalten;
agonistisches
Sozialverhalten
ruhig, geringgradig 1
reduzierte spontane
Bewegung; nicht-reduzierte
induzierte Bewegung;
Selbstmutilation
mittelgradig reduzierte 2
spontane Bewegung;
geringgradig reduzierte
induzierte Bewegung
keine spontane Bewegung, 3
kaum induzierte Bewegung
Nach Beendigung der klinischen Untersuchung entfernte Person A das Tier aus dem
Untersuchungsgefäß. Darauf folgend wurde das Tier durch Person B durch eine
farbliche Markierung (edding ® Skin Marker, edding International GmbH) am Schwanz
markiert, bzw. dessen Markierung erneuert, sodass es in der Gruppe identifizierbar
war. An den Untersuchungszeitpunkten nach stattgefundener Transplantation
erfolgte zusätzlich die Vermessung der Tumoren bzw. die Untersuchung des
entsprechenden Hautareals (siehe Abschnitt 3.3.5). Dafür wurden die Tiere von
Person A mit den Hintergliedmaßen auf die linke Handfläche gesetzt und durch

Material und Methoden 47
Fixierung der Nackenhaut zwischen Daumen und Zeigefinger der rechten Hand so
gestreckt, dass eine einwandfreie Vermessung des Tumors ermöglicht wurde
(Abbildung 6).
Abb. 6: Darstellung des handlings
des Tieres und des
Vorgehens während der
Vermessung des Tumors
mittels einer Schieblehre
Vor der Transplantation wurden die Tiere ein- bis zweimal pro Woche, nach der
Transplantation alle 2 bis 3 Tage klinisch untersucht. Ferner erfolgte ein täglicher,
kurzer check up, bei dem die Tiere, ohne den Käfig zu öffnen, soweit möglich, nach
der genannten Punktekodierung beurteilt wurden.
3.3.4. Xenotransplantation von DH82- und DH82CDVpi-Zellen bzw. des
Plazebos
An dem Datum der letzten Untersuchung vor der Transplantation wurde das
Hautareal, in welches die Zellen eingebracht werden sollten, möglichst vollständig
von Haaren entfernt. Hierfür wurde eine gebogene Schere nach Metzenbaum (Henry
Schein Vet GmbH) verwendet. Das Hautareal befand sich auf der linken Körperseite
und wies ungefähre Abmessungen von 2,5 cm in kranio-kaudaler und 1,5 cm in
dorso-ventraler Richtung, beginnend circa 0,5 cm kaudal der linken Achsel, auf.

48
Material und Methoden
Die Zellen wurden nach der beschriebenen Herstellung der Einzeldosen in den
Eppendorfgefäßen in den Tierstall verbracht. Zunächst fand eine klinische
Untersuchung der Tiere wie beschrieben statt. Die Zellsuspension im
Eppendorfgefäß wurde zunächst durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren
gründlich resuspendiert. Danach erfolgte die Aspiration von 100 µl der
Zellsuspension in eine Einmal-Feindosierungsspritze (1 ml) mit integrierter Kanüle
(0,3 mm x 12 mm) (Omnican ® F, B. Braun Melsungen AG). Währenddessen wurde
die Maus, zum Zweck der Stressminimierung, im Untersuchungsgefäß in der Waage
belassen. Nach Herausnahme der Maus aus dem Untersuchungsgefäß wurde diese
von Person A wie beschrieben fixiert. Anschließend erfolgte die Desinfektion des, für
die Transplantation vorgesehenen, Hautareals mit sterilen, in 70%igem
Isopropylalkohol getränkten Tupfern (moll ® zell-Alkoholtupfer, TEN-PACK GmbH). Auf
einer gedachten, horizontalen Linie durch das Schultergelenk auf Höhe des
Rippenbogens wurde anschließend die Kanüle circa 2 bis 3 mm tief eingestochen
und das komplette, in der Spritze befindliche, Volumen injiziert. Als Plazebo dienten
100 µl des serumfreien Spülmediums. Eventuell aus der Einstichstelle austretende
Flüssigkeit wurde mit einem Alkoholtupfer aufgenommen, um ein Ablecken durch die
Tiere zu verhindern. Danach wurde die Maus zurück in den Käfig verbracht.
3.3.5. Tumormessung und Kalkulation des Tumorvolumens
Zum Zweck der Tumormessung wurden die Tiere wie zuvor beschrieben fixiert. Alle
ein bis zwei Messtermine musste das Fell über dem Hautareal erneut gekürzt
werden. Die Messung erfolgte durch die Person B mit Hilfe einer Schieblehre (Nonius
Präzisionskleinmessschieber 70mm, Messmittelonline C. Schulz measuring
instruments) (Abbildung 6). Hierbei wurden die kranio-kaudale sowie die dorsoventrale
Ausdehnungen der Umfangsvermehrung in Millimeter auf zwei
Dezimalstellen genau abgelesen und protokolliert. In einigen Fällen, besonders bei
sehr kleinen Umfangsvermehrungen, konnte es für das Erkennen der
Umfangsvermehrung hilfreich sein, das betreffende Areal mit einem feuchten Tupfer
(kein Alkoholtupfer) zu benetzen. Im Falle nicht vorhandener Umfangsvermehrungen
wurde das Areal eingehend untersucht und der Negativbefund protokolliert.

Material und Methoden 49
Die Kalkulation des Tumorvolumens in mm 3 erfolgte mit der Formel V= a 2 b/2 wie bei
Grote et al. (2001) beschrieben. Hierbei war a der kürzeste und b der längste
Durchmesser des Tumors in mm.
3.3.6. Intratumorale Injektionen
Es wurden intratumorale Injektionen mit dem CDV-Ond vorgenommen. Als Plazebo
bzw. Kontrolle dienten UV-inaktviertes CDV-Ond bzw. Zellkulturmedium (MEME mit
10% FKS und 1% P/S). Das handling der Tiere verlief analog dessen bei der
Transplantation. Für alle intratumoralen Injektionen wurden Einmal-
Feindosierungsspritzen (1 ml) mit integrierter Kanüle (0,3 mm x 12 mm) (Omnican ®
F, B. Braun Melsungen AG) verwendet. Nach gründlichem Resuspendieren der
Lösungen wurden 100 µl aspiriert und zentral in den Tumor, je nach Tumorgröße, 1
bis 5 mm tief appliziert.
3.3.7. Euthanasie
Die Tötung der Tiere erfolgte nach Versuchsplan bzw. vorgezogen z.B. im Falle
eines, das maximale Tumorvolumen von 1,6875 cm 3 übersteigenden
Tumorvolumens. Ferner stellte ein moribunder Allgemeinzustand einen Grund für
eine vorgezogene Tötung dar. Nach verkürzter klinischer Untersuchung (ohne
Tumormessung) erfolgte die Prämedikation, Anästhesie und Euthanasie nach Ulrich
(2006) im Zuge intrakardialer Applikation von 1 mg/kg Medetomidin (Domitor ® , Pfizer)
und 200 mg/kg Ketamin (Ketamin 10%, WDT). Im Vorhinein fand die Prämedikation
durch subkutane Injektion von 0,5 mg/kg Medetomidin und die darauf folgende
intraperitoneale Anästhesie mit 100 mg/kg Ketamin statt. Für die Euthanasie wurde 1
Teil Medetomidin mit 2 Teilen Ketamin gemischt. Diese Mischung enthielt
entsprechend 0,33 mg/ ml Medetomidin und 66,66 mg/ ml Ketamin. Für eine 18 g
schwere Maus wurden 0,11 ml der Mischung intrakardial appliziert. Medetomidin für
die Prämedikation wurde zum Zweck der genaueren Dosierung in einer 1:50
Verdünnung mit 0,9%iger NaCl-Lösung (B. Braun Melsungen AG) verwandt. Für eine
18 g schwere Maus erfolgte die subkutane Applikation von 0,45 ml. Ketamin für die
Anästhesie wurde zum Zweck der genaueren Dosierung in einer 1:20 Verdünnung

50
Material und Methoden
mit 0,9%iger NaCl-Lösung (B. Braun Melsungen AG) verwandt. Für eine 18 g
schwere Maus erfolgte die intraperitoneale Applikation von 0,36 ml.
3.3.8. Sektion und Probennahme
Die Sektion erfolgte erst nach komplettem Verlust der Reflexe sowie der Herz- /
Kreislauffunktion. Zunächst wurde das tumortragende Hautareal, unter Belassung
von, je nach Tumorvolumen, bis zu 1,5 cm breiten Rändern makroskopisch
gesunden Gewebes, exzidiert. Es erfolgte zunächst die fotografische Dokumentation,
die Protokollierung des Gewichts des Hautareals sowie die Vermessung des Tumors
und Kalkulation des Tumorvolumens wie zuvor beschrieben. Die Hautproben, welche
Tumoren ab circa 0,3 cm im Durchmesser aufwiesen wurden tumormittig geteilt. Eine
Hälfte wurde zur 24-stündigen Fixation in 10%iges, gepuffertes Formalin (im
Folgenden Formalin) gegeben. Die andere Hälfte wurde sofort in einen Gefrierblock
bzw. mehrere Gefrierblöcke weiterverarbeitet (siehe Abschnitt 3.3.9) Im Fall, dass
zum Zeitpunkt des Versuchsendes kein Tumor an der injizierten Stelle vorlag, wurde
das Hautareal analog zu den tumortragenden Hautarealen exzidiert und
entsprechend in Formalin fixiert. Auf die Herstellung von Gefriermaterial wurde in
diesen Fällen verzichtet.
Als nächstes wurden die regionären Lymphknoten der linken Flanke gewonnen und
für eine Identifikation in folgender Reihenfolge in eine Biopsiekapsel
(Kapselbeschriftung „LND“, Lymphonodus drainierend) platziert:
1. Lymphonodus axillaris
2. Lymphonodus brachialis
3. Lymphonodus inguinalis superficialis
Diese wurde zur Fixation des Lymphknotengewebes ebenfalls in Formalin eingelegt.
Da die Lymphknoten der immunsupprimierten Mäuse z.T. unter 1 mm groß waren,
konnten sie in einigen Fällen nicht sicher identifiziert werden. Dieses wurde
entsprechend auf dem Sektionsprotokoll vermerkt.
Danach wurde eine vollständige Sektion mit makroskopischer Begutachtung der
Organe durchgeführt. Insofern sich keine makroskopisch-pathologischen Befunde

Material und Methoden 51
erheben ließen, wurde auf eine Asservierung der Organe in Formalin verzichtet und
die Organe und der Tierkörper unschädlich beseitigt. Dies galt nicht für die Gruppen,
welche eine intratumorale Behandlung mit CDV-Ond bzw. UV-inaktiviertem CDV-
Ond erfahren hatten. Bei diesen wurden, von je einem Tier pro Gruppe, die Organe
entnommen und in Formalin eingelegt.
Ferner fand, insofern es eine ausreichende Tumorgröße zuließ, die Immersion und
Fixation von Tumorgewebe zweier Tiere je Gruppe in frischer, 2,5%iger
Glutaraldehydlösung statt. Nach Fixation erfolgte die Einbettung in Epon wie bei
Eydner (2011) beschrieben. Dies diente zur Asservierung von Tumorgewebe für
elektronenmikroskopische Untersuchungen.
3.4. Probenprozessierung für Histochemie und Immunhistologie
Abbildung 7 zeigt die Verarbeitung des tumortragenden Hautareals. Die
Tumorhälften wurden je nach Tumorgröße weiter unterteilt. Bei Tumoren ab einer
Gesamttumorgröße von circa 1 cm im Durchmesser erfolgte die Unterteilung in
Schnittebenen mit der Bezeichnung T3, T2 und T1, bei etwas kleineren Tumoren T2
und T1. Die höhere Zahl war immer die zentrumsnaheste Ebene. War die
Tumorhälfte zu klein um noch einmal geteilt zu werden lautete die Bezeichnung T.
Dieses Schema galt für Gefrierproben und Paraffinproben gleichermaßen. Im Fall
dessen, dass zum Zeitpunkt des Versuchsendes kein Tumor an der injizierten Stelle
vorlag, wurde das formalinfixierte Hautareal in circa 0,3 mm breite Hautstreifen
auflamelliert. Die Bezeichnung des Paraffinblockes lautete Haut. Während die
Teilung des Gewebes für die Gefrierproben direkt bei der Sektion (siehe Abschnitt
3.3.8) erfolgte, wurden die Gewebe, die als Paraffinproben dienen sollten, erst nach
Formalinfixation weiter unterteilt. Zur Herstellung von Gefrierproben wurden die
Gewebescheiben in runde Aluminiumhütchen platziert, mit Tissue Tec ® -O.C.T TM -
compound (Sakura, Finetek Germany GmbH, Staufen) überschichtet, in ein mit
Isopentan (C. Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe) befülltes Behältnis gestellt und
anschließend in einer, flüssigen Stickstoff enthaltenen, Styroporkiste eingefroren. Die
Gefrierproben wurden bei -80°C gelagert. Zur Herstellung von Paraffinblöcken
erfolgte die Einbettung in Folge maschineller Entwässerung in einer aufsteigenden

52
Material und Methoden
Alkoholreihe in einem Paraffin-Paraplast-Gemisch (Histo-Comp ® , Fa. Vogel GmbH &
Co. KG). Die Paraffinblöcke lagerten bei Raumtemperatur.

Material und Methoden 53
Abb. 7: Weiterverarbeitung des exzidierten, tumortragenden Hautareals
Die Abbildung zeigt die weiterverarbeitenden Schritte nach Exzision des tumortragenden Hautareals.
Die hellrote Umfangsvermehrung hebt sich von der rötlich-gelblichen Unterhaut ab. Links ist die
Herstellung von Paraffinblöcken, rechts die Herstellung von Gefriermaterial dargestellt.
Von dem hergestellten Paraffinmaterial wurden im Folgenden 80 Serienschnitte des,
im Falle mehrerer vorhandener Paraffinblöcke, Blockes mit der
tumorzentrumsnahesten Schnittebene, mit Hilfe eines Rotationsmikrotoms (Leica
RM2035, Leica Biosystems) hergestellt. Eine Ausnahme stellt das Tier mit der
Bezeichnung 1.B.3 dar. Von diesem wurden 120 Serienschnitte angefertigt. Ferner
liegen von dem Tier mit der Bezeichnung 1.4.3 200 Tumorserienschnitte vor. Diese
dienten, auf Grund frühzeitiger Herausnahme des Tieres aus der Untersuchung, als
Gewebe zur Etablierung von Antikörpern für die Immunhistologie.
Alle Schnitte wiesen eine Dicke von 2 bis 3 µm auf und wurden auf SuperFrost /
Plus-Objektträger aufgezogen (SuperFrost ® / SuperFrost ® Plus Slides, Menzel-
Gläser, Gerhard Menzel GmbH). Es schloss sich eine 20 bis 30-minütige

54
Material und Methoden
Inkubationszeit bei 57°C an, die dem Zweck der Entfernung von Paraffinresten und
der Verbesserung der Adhäsion des Schnittes auf der Glasoberfläche diente.
3.5. Histologie
Die Serienschnitte Nr. 1, Nr. 40 und Nr. 80 wurden mit Hämatoxylin-Eosin (HE) mit
Hilfe eines Färbeautomaten (Leica ST 4040; Leica Biosystems) gefärbt.
3.5.1. Auswertung der HE-gefärbten Präparate
An diesen HE-gefärbten Schnitten erfolgte zunächst eine erste Beurteilung der
Quantität des im Paraffinschnitt vorhandenen Tumorgewebes sowie, unter
Zuhilfenahme CD44-immunhistologisch gefärbter Schnitte (siehe Unterabschnitt 3.6),
die lichtmikroskopische Charakterisierung der Tumoren. Auf der Grundlage basierte
die Entscheidung, der für die immunhistologischen Färbungen, zu verwendenden
Serienschnittnummern.
An Schnitten der DH82CDVpi-Transplantate und der nicht-infizierten
Kontrolltransplantate wurde anschließend der histologisch feststellbare Anteil der
Nekrosefläche an der Gesamttumorfläche morphometrisch untersucht. Hierfür
wurden zunächst Bilder der HE-gefärbten Tumorschnitte in 100-facher Vergrößerung
mit Hilfe eines digitalen Kameramikroskopes (Olympus BX-51, Olympus Optical Co.
Europe GmbH) erstellt. Im Falle von Tumoren, die größer als circa 1 mm im
Durchmesser waren, mussten mehrere Bilder pro Tumorschnitt generiert werden. Mit
Hilfe der cell-D imaging software (Olympus Soft Imaging Solutions, Münster) erfolgte
die Auswahl des zu fotografierenden Bereiches sowie die Speicherung der
Bilddateien im a tagged image file (tif)- Format. Die Auswertung erfolgte an Hand der
Analysis 3.1-Software (Soft Imaging System). Hierfür wurde zunächst, je Bild die
gesamte, durch Tumorzellen eingenommene, Fläche in µm 2 bestimmt und durch
Addition der Einzelflächen die Tumorgesamtfläche pro Tumorschnitt errechnet.
Danach erfolgte die Vermessung der, durch Nekroseareale eingenommenen Fläche
in µm 2 in jedem Einzelbild. Nekrotische Areale waren definiert als
Tumorgewebeanteile, die sich durch Hypereosinophilie, Homogenität, Verlust der
zellulären Grenzen, Karyopyknosis, -rhexis und –lysis sowie Akkumulationen von

Material und Methoden 55
Zell- und Gewebedebris auszeichneten. Durch Addition der Einzelflächen wurde die
Gesamtnekrosefläche errechnet und in % der Tumorgesamtfläche ausgedrückt. Die
mit der Analysis 3.1-Software in jedes Einzelbild eingezeichneten Areale (sog.
overlays) wurden als separate ausführbare Unix-Datei im ovl-Format abgespeichert.
3.6. Immunhistologie
Es wurde die Avidin-Biotin-Komplex-Methode (ABC-Methode) wie bei Alldinger et al.
(1996) beschrieben, eingesetzt. In Tabelle 6 sind die immunhistologisch in
Serienschnitten nachgewiesenen Antigene aufgelistet und ihrer Verwendung
gegenübergestellt. Ferner wurden zum Zweck der Etablierung immunhistologischer
Markierungen weitere Antigennachweise angestrebt, die jedoch an Serienschnitten
im Rahmen dieser Untersuchung keine Verwendung fanden. Diese sowie ihre
Lokalisation und Bedeutung sind in Tabelle 7 aufgelistet.
Tab. 6: Übersicht über die in Serienschnitten der Tumoren aller
Versuchsgruppen nachgewiesenen Antigene und deren Verwendung
Antigen
Verwendung
CDV-Nukleoprotein Darstellung der Staupevirus infizierten
DH82-Tumorzellen
CD44
MHC II
CD31
Aktivierte Caspase 3
Mac 3
Nachweis und Charakterisierung der xenotransplantierten
Zellen
Darstellung der Tumorvaskularisation
Darstellung apoptotischer Tumorzellen
Darstellung der murinen Makrophagen
CD3 Darstellung der murinen Zellen mit T-
Zellrezeptor
CD45R
Asialo-Gangliosid-M 1 (AGM 1)
Darstellung muriner CD45R positiver Zellen
Darstellung der murinen NK-Zellen
Legende: CD, cluster of differentiation; CDV, canine distemper virus; MHC, major histocompatibility
complex

56
Material und Methoden
Tab. 7:
Antigen
Calretikulin
CD68
CD161
Cortactin
Übersicht über die weiteren, über die Antigene in Tabelle 6 hinaus,
angestrebten Antigennachweise
Lokalisation und Bedeutung
Chaperonprotein des endoplasmatischen Retikulums
Makrophagen-assoziiertes Oberflächenantigen
NK-Zell-assoziiertes Oberflächenantigen
Zytoplasmatisches, Aktin-bindendes Protein
F4/80 Makrophagen-assoziiertes Oberflächenantigen
Ki 67
Microtubule-associated
protein 1 light chain 3 (LC 3)
VEGF
Von Willebrand Faktor
(factor 8 related antigen)
nukleäres, während der Teilungsphase aktives Protein
Oberflächenantigen autophagosomaler Vakuolen
löslicher Angiogenese-fördernder Faktor
zytoplasmatisches Protein in Endothelzellen
Legende: CD, cluster of differentiation; VEGF, vascular endothelial growth factor
3.6.1. Antikörper und Seren
Die für die Serienfärbungen der Tumorschnitte sowie für Antikörperetablierungen
verwendeten Primärantikörper sind mit Angaben zu ihrer Bezeichnung, Klonalität,
Herkunft, Anforderungen für die Antigendemaskierung, angewandten Verdünnung
und des einzusetzenden Sekundärantikörpers in Tabelle 8 aufgeführt.

Material und Methoden 57
Tab. 8: Bezeichnung, Klonalität, Herkunft, Art der Antigendemaskierung,
angewandte Verdünnung der verwendeten Primär- und
Sekundärantikörper
Antigen Bezeichnung,
Klonalität und
Herkunft des
Primärantikörpers
Demaskierung Verdünnung Sekundärantikörper
Antikörper die für Serienfärbungen verwendet wurden
CD44
anti-Hund, CD44,
mAK, Ratte, E.
Kremmer, (Alldinger et
al., 1999)
entfällt 1:200 RaR-b
MHC II
anti-Hund, MHC II
dog26, mAK, Ratte, E.
Kremmer; (Cobbold
and Metcalfe, 1994)
Zitratpuffer/
Mikrowelle
1:100 RaR-b
CD31 anti-Human, CD31 /
PECAM1 (C-
Terminus), pAK,
Kaninchen, Fa. Acris
Zitratpuffer/
Mikrowelle
1:50 GaR-b
CDV-
Nukleoprotein
anti-Hund, CDV D110,
mAK, Maus, A.
Zurbriggen
Zitratpuffer/
Mikrowelle
1:100 GaM-b
Aktivierte
Caspase 3
anti-Human / Maus /
Ratte, cleaved
Caspase 3 (Asp175),
pAK, Kaninchen, Fa.
Cell Signaling
Zitratpuffer/
Mikrowelle
1:200 GaR-b
Mac 3
anti-Maus, CD107bbiotiniliert,
mAK, Ratte,
Fa. AbD Serotec
Zitratpuffer/
Mikrowelle
1:200 Entfällt
CD3 anti-Human, CD3 (A
0452), pAK,
Kaninchen, Fa. Dako
CD45R anti-Maus, CD45R /
B220-biotiniliert, mAK
Ratte, Fa. BD
Biosciences
Zitratpuffer/
Mikrowelle
Zitratpuffer/
Mikrowelle
1:4000 GaR-b
1:1000 Entfällt

58
Material und Methoden
Fortsetzung Tab.8
AGM 1 anti-Maus / Ratte,
Asialo GM1, pAK,
Kaninchen, Fa. Wako
Pure Chemical
Industries
Zitratpuffer/
Mikrowelle
1:300 GaR-b
getestete Antikörper, die jedoch nicht für Serienfärbungen von Tumorschnitten
verwendet wurden
Calretikulin
C-Terminus
anti-Human / Maus /
Ratte / Hund,
Calreticulin (405-417),
pAK, Kaninchen, Fa.
Calbiochem
verschiedene
Demaskierungen
verschiedene
Verdünnungsstufen
zwischen
1:100 und
1:3200
GaR-b
Calretikulin N-
Terminus/
Vasostatin
anti-Human / Maus /
Ratte, CALR N-
Terminal, pAK,
Kaninchen, Fa. Sigma-
Aldrich Chemie GmbH
Trypsin 1:400 GaR-b
CD68
anti-Human, CD68,
mAK, Maus, Fa. Dako
Zitratpuffer/
Mikrowelle
1:50
1:200
GaM-b
CD68
anti-Human, CD68
(E19160), pAk,
Kaninchen, Fa. Spring
Bioscience
Zitratpuffer/
Mikrowelle
1:100
1:200
GaR-b
CD161
anti-Maus / Ratte,
CD161 / NK1.1, pAk,
Kaninchen, Fa. Bioss
Zitratpuffer/
Mikrowelle und
ohne
Demaskierung
verschiedene
Verdünnungsstufen
zwischen
1:100 und
1:3200
GaR-b
Cortactin
anti-Human, Cortactin
(H-191), pAK,
Kaninchen, Fa. Santa
Cruz Biotechnology
Zitratpuffer/
Mikrowelle
1:300 GaR-b
F4/80 anti-Maus, F4/80,
mAK, Ratte, AbD
Serotec
Trypsin 1 :50 RaR-b

Material und Methoden 59
Fortsetzung Tab. 8
Ki 67 anti-Human, Ki 67,
pAK, Kaninchen, Fa.
DCS Innovative
Diagnostik-Systeme
Ki 67 anti-Human, Ki 67,
pAK, Kaninchen, Fa.
abcam
Zitratpuffer/
Mikrowelle
Zitratpuffer/
Mikrowelle
1:400 GaR-b
1:5000 GaR-b
LC 3
anti-Maus, LC 3 A/B,
pAk, Kaninchen, Fa.
abcam
Zitratpuffer/
Mikrowelle
1:800 GaR-b
VEGF anti-Human / Maus /
Ratte, VEGF-A (N-
Term), pAK,
Kaninchen, Fa. Acris
Zitratpuffer/
Mikrowelle und
ohne
Demaskierung
verschiedene
Verdünnungsstufen
zwischen
1:100 und
1:3200
GaR-b
Von
Willebrand
Faktor
anti-Human, Von
Willebrand Faktor,
pAK, Kaninchen, Fa.
Dako
Zitratpuffer/
Mikrowelle
1:500 GaR-b
Legende: AGM 1, Asialo-Gangliosid-M 1; CD, cluster of differentiation; CDV, canine distemper virus;
Fa., Firma; GaM-b (goat-anti-mouse-biotiniliert, Klon BA 9200, Vector Laboratories, Burlingame,
USA); GaR-b (goat-anti-rat-biotiniliert, Klon BA 1000, Vector Laboratories, Burlingame, USA); LC, light
chain; mAK, monoklonaler Antikörper; MHC, major histocompatibility complex; PECAM, platelet
endothelial cell adhesion molecule; pAK, polyklonaler Antikörper; RaR-b (rabbit-anti-rat-biotiniliert,
Klon BA 4001, Vector Laboratories, Burlingame, USA); VEGF, vascular endothelial growth factor
3.6.2. Schnitte für die Immunhistologie
Für den immunhistologischen Nachweis von Staupevirusantigen wurden die
Paraffinserienschnitte Nr. 2 und Nr. 79 benutzt. Tabelle 9 zeigt die Zuordnung der
weiteren immunhistologisch untersuchten Antigene zu den
Paraffinserienschnittnummern. Diese wurden für alle Versuchsgruppen gleich
gewählt. Von Tumoren der, unter „Abweichungen“ in Tabelle 9 aufgeführten,
Tierindividuen wurden andere als die festgelegten Serienschnittnummern gewählt.
Grund hierfür waren nicht ausreichende Tumorquantitäten in dem eigentlichen
Schnittbereich. Die in der Tabelle nicht aufgelisteten Serienschnittnummern dienten

60
Material und Methoden
als Negativkontrollen, für eventuelle Wiederholungen bzw. als Reserve für zukünftig
durchzuführende Untersuchungen.
Tab. 9:
Übersicht über die für immunhistologische Untersuchungen
genutzten Serienschnitte
Antigen Nummer des
Serienschnittes
CDV 2; 79 entfällt
Abweichungen
(Serienschnittnummer: Tierbezeichnung)
CD44 75 115: 1.B.3
4: 1.C.4; 1.C.6; 3.2.4, 3.2.5; 3.3.2; 1.4.1
41: 3.2.2; 3.2.6; 1.0.4; 3.3.6
MHC II 66 109: 1.B.3
13: 1.C.4; 1.C.6; 3.2.4, 3.2.5; 3.3.2; 1.4.1
37: 3.2.2; 3.2.6; 1.0.4; 3.3.6
CD31 67 110: 1.B.3
12: 1.C.4; 1.C.6; 3.2.4, 3.2.5; 3.3.2; 1.4.1
38: 3.2.2; 3.2.6; 1.0.4; 3.3.6
aktivierte
Caspase
3
74 117: 1.B.3
7: 1.C.4; 1.C.6; 3.2.4, 3.2.5; 3.3.2; 1.4.1
45: 3.2.2; 3.2.6; 1.0.4; 3.3.6
Mac 3 77 118: 1.B.3
6: 1.C.4; 1.C.6; 3.2.4, 3.2.5; 3.3.2; 1.4.1
43: 3.2.2; 3.2.6; 1.0.4; 3.3.6
CD3 70 112: 1.B.3
10: 1.C.4; 1.C.6; 3.2.4, 3.2.5; 3.3.2; 1.4.1
48: 3.2.2; 3.2.6; 1.0.4; 3.3.6
CD45R 71 113: 1.B.3
9: 1.C.4; 1.C.6; 3.2.4, 3.2.5; 3.3.2; 1.4.1
47: 3.2.2; 3.2.6; 1.0.4; 3.3.6
AGM 1 64 108: 1.B.3
14: 1.C.4; 1.C.6; 3.2.4, 3.2.5; 3.3.2; 1.4.1
49: 3.2.2; 3.2.6; 1.0.4; 3.3.6
Die in der Tabelle aufgelisteten Tierkodierungen geben mit der ersten Zahl die Zugehörigkeit zur Art
der Applikation, mit dem mittleren Buchstaben oder der mittleren Zahl den Probennahmezeitpunkt
(beides siehe Tabellen 4 und 5) und mit der letzten Zahl die Nummerierung der Maus innerhalb ihrer
Gruppe von 6 Tieren an. Legende: AGM 1, Asialo-Gangliosid-M 1; CD, cluster of differentiation; CDV,
canine distemper virus; MHC, major histocompatibility complex;

Material und Methoden 61
3.6.3. Protokoll der Immunhistologie (ABC-Methode)
Die Ausführung der immunhistologischen Färbungen der auf SuperFrost / Plus-
Objektträger aufgezogenen und getrockneten Paraffinschnitte erfolgte an Hand eines
Protokolls nach Alldinger et al. (1996).
1. Entparaffinierung und Rehydrierung der Schnitte zweimalig 5 min in Roticlear ®
(Carl Roth GmbH & Co. KG), einmalig 5 min in Isopropanol (Carl Roth GmbH
& Co. KG), und einmalig 3 min in 96%igem Ethanol (Carl Roth GmbH & Co.
KG)
2. Hemmung der endogenen Peroxidase durch 30-minütige Immersion der
Schnitte in 197 ml 85%igem Ethanol + 3 ml frisch dazu gegebenem 30%igem
Wasserstoffperoxid (H 2 O 2 ) (VWR International GmbH), entspricht einer
Konzentration von 0,5%igem H 2 O 2 in der endgültigen Lösung
3. dreimaliges Spülen der Schnitte unter langsamem Rühren in einer mit 200 ml
phosphatgepufferten Kochsalzlösung (siehe Anhang) (PBS)-gefüllten
Glasküvette für je 5 min
4. Antigendemaskierung je nach verwendetem Primärantikörper (Abschnitt 3.6.4
und Tabelle 7)
5. im Falle einer durchgeführten Antigendemaskierung: zweimaliges Spülen der
Schnitte unter langsamen Rühren in PBS für je 5 min
6. Einsetzen der Schnitte in Coverplates und Shandon Racks (Coverplates TM
Sequenza)
7. einmaliges Spülen der Schnitte mit PBS für 5 min
8. Überschichten der Schnitte mit je 120 µl Blockserum (1:5 in PBS verdünntes
Ziegennormalserum) und Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur zum
Blocken unspezifischer Bindung des Sekundärantikörpers
9. Verdünnung des Primärantikörpers nach Angaben in Tabelle 7 in PBS mit
1%igem bovinen Serumalbumin (Sigma-Aldrich Chemie GmbH)
10. Auftragen von 120 µl der Primärantikörperverdünnung bzw. des
Negativkontrollserums (siehe Abschnitte 3.6.5) und Inkubation über Nacht bei
4°C
11. dreimaliges Spülen der Schnitte mit PBS für je 5 min

62
Material und Methoden
12. Verdünnung (1:200) des Sekundärantikörpers (Tabelle 7) in PBS
13. Auftragen von 120 µl des Sekundärantikörpers und Inkubation 30 min bei
Raumtemperatur
14. dreimaliges Spülen der Schnitte mit PBS für je 5 min
15. Auftragen von 120 µl circa 30 min zuvor frisch hergestellter ABC-
Komplexlösung (Vectastain Elite ABC kit, Vector Laboratories, Inc.) und
Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur. Die Herstellung der ABC-
Komplexlösung erfolgt an Hand der Herstellerangaben.
16. zweimaliges Spülen der Schnitte mit PBS für je 5 min
17. Lösen der Schnitte aus den Coverplates und Verbringen in eine mit 200 ml
PBS gefüllte Glasküvette
18. einmaliges Spülen der Schnitte unter langsamen Rühren in der PBS-gefüllten
Glasküvette für 5 min
19. Herstellen der 3,3´-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (DAB)-Lösung (Sigma-
Aldrich Chemie GmbH) durch Auflösen von 0,1 g DAB in 200 ml PBS und
Zugabe von 250 µl 30%igem H 2 O 2
20. Immersion der Schnitte in der DAB- / H 2 O 2 -Lösung für 5 min unter
vorsichtigem Rühren
21. einmaliges Spülen der Schnitte unter langsamen Rühren in einer mit 200 ml
PBS-gefüllten Glasküvette für 5 min
22. zweimaliges Spülen der Schnitte unter langsamen Rühren in einer mit 200 ml
Leitungswasser gefüllten Glasküvette für je 5 min
23. Gegenfärbung der Schnitte durch Immersion in Mayers Hämalaunlösung (Carl
Roth GmbH & Co. KG) für circa 30 Sekunden
24. Bläuen der Schnitte unter fließendem Leitungswasser für circa 10 min
25. Dehydrierung der Schnitte in einer aufsteigender Alkoholreihe: circa 30
Sekunden in 70%igem Ethanol, 1 min in 96%igem Ethanol, 1 min in
Isopropanol sowie 2malig in Essigsäurebutylester für je 5 min
26. Eindecken der Schnitte mittels eines Eindeckautomaten (Promountes ®
RCM2000, Medite)

Material und Methoden 63
3.6.4. Demaskierungsverfahren
3.6.4.1. Mikrowellenvorbehandlung
Die Schnitte wurden in dem Einsatz der Glasküvette in ein mikrowellengeeignetes
Gefäß verbracht. Dieses wurde so mit Zitratpuffer (siehe Anhang) angefüllt, dass ein
Verkochen des Puffers ausgeschlossen war. Bei 800 Watt wurde der Puffer mit den
Schnitten zum Kochen gebracht und 20 min weiter gekocht. Im Anschluss erfolgte
das vorsichtige Abkühlen der Schnitte unter fließendem destilliertem Wasser
(Kahveci et al., 2003)
3.6.4.2. Trypsin
Die Inkubation der Schnitte erfolgte in frisch hergestellter Trypsinlösung (siehe
Anhang) für 60 min im Wasserbad bei 37°C (Kahveci et al., 2003).
3.6.5. Kontrollen für die Immunhistologie
3.6.5.1. Positivkontrollen der Serien und erfolgreichen Antikörperetablierung
Es wurden Schnitte von, mit dem Staupevirus infizierten, Hunden aus dem Archiv
des Institutes für Pathologie sowie Schnitte eines DH82CDVpi-Zellpellets als
Kontrollen für den Nachweis des CDV-Nukleoproteins mitgeführt. Für die
Untersuchung der Expression von MHC II auf der Oberfläche der transplantierten
DH82-Zellen stellte lymphatisches Gewebe eines Hundes die Positivkontrolle dar.
Ein DH82-Zellpellet diente als Kontrolle für die CD44-Immmunhistologie. Für den
Nachweis der murinen Immunantwort mittels Antikörpern gegen Mac 3, CD3, CD45R
und AGM 1 sowie den Nachweis apoptotischer Zellen mittels aktivierter Caspase 3-
Immunhistologie bestanden die Positivkontrollen aus lymphatischem Gewebe einer
immunkompetenten SJL-Maus sowie einer immunsupprimierten Scid-Maus. Als
Kontrolle für die CD31-Immunhistologie diente gefäßreiches Nierengewebe einer
Scid-Maus.
Lymphatische Organe eines Hundes, einer immunkompetenten SJL-Maus sowie
einer immunsupprimierten Scid-Maus wurden als Kontrollgewebe für die LC 3- und

64
Material und Methoden
Calretikulin-(Vasostatin-) sowie ein DH82-Zellpellet für die Cortactin-Immunhistologie
verwendet.
3.6.5.2. Negativkontrollen der Serien und erfolgreichen Antikörperetablierung
Es wurden entsprechend dem Proteingehalt der Antikörperlösung angeglichene
Negativkontrollseren bzw. Isotypkontrollen verwendet. Als Kontrolle für die CDV-
Immunhistologie diente neben Aszitesflüssigkeit von Balb/c-Mäusen (BioLogo, Dr.
Hartmut Schultheiß e.K.) ein gegen murines IgG1-gerichter Antikörper (mouse IgG1
negative control, CBL600, Chemicon Millipore) in einer Verdünnung von 1:1000. Als
Negativkontrollserum für die CD44-Immunhistologie diente 1:200-verdünnter
Mediumüberstand kultivierter DH82-Zellen (Alldinger et al., 1999). Serum von nichtimmunisierten
Kontrollkaninchen wurde für die Immunhistologie von aktivierter
Caspase 3 (Verdünnung 1:600000), CD31 (Verdünnung 1:1,2 x 10 6 ), CD3
(Verdünnung 1:300000) und AGM 1 (Verdünnung 1:3000) verwendet. Ein gegen
IgG2a der Ratte gerichteter Antikörper (Rat IgG2a monoclonal isotype; R&D
Systems) diente in einer Verdünnung von 1:1000 als Negativkontrolle für die MHC IIsowie
für die CD45R-Immunhistologie. Weiterhin wurde ein gegen IgG1 der Ratte
gerichteter Antikörper (Rat IgG1 monoclonal isotype R&D Systems) als Kontrolle für
die Mac 3-immunhistologische Färbung ebenfalls in einer Verdünnung von 1:1000
verwendet.
Serum von nicht-immunisierten Kontrollkaninchen in einer Verdünnung von 1:3000
wurde als Negativkontrolle für die LC 3-, Calretikulin-(Vasostatin-) sowie Cortactin-
Immunhistologie verwendet.
3.6.6. Auswertung der Immunhistologie
Analog der Auswertung der HE-gefärbten Präparate erfolgte ausschließlich die
Auswertung der immunhistologisch gefärbten Schnitte von den DH82CDVpi-
Transplantaten und deren nicht-infizierten Kontrolltransplantaten.
3.6.6.1. CDV-Nukleoprotein und CD44
Die Bewertung des Vorliegens von CDV-Nukleoprotein sowie CD44-Antigen erfolgte
rein qualitativ unter zu Hilfenahme eines Lichtmikroskopes (Axiostar plus, Carl Zeiss

Material und Methoden 65
Microscopy GmbH) und diente der Beurteilung der persistierenden Infektion der
DH82CDVpi-Zellen auch nach Transplantation in den Mausorganismus bzw. zur
Verdeutlichung der Tumorgrenzen.
3.6.6.2. MHC II und aktivierte Caspase 3
Zunächst wurden Bilder der immunhistologisch gefärbten Tumorschnitte in 100-
facher Vergrößerung mit Hilfe eines digitalen Kameramikroskopes (Olympus BX-51,
Olympus Optical Co. Europe GmbH) erstellt. Im Falle von Tumoren, die größer als
circa 1 mm im Durchmesser waren, mussten mehrere Bilder pro Tumorschnitt
generiert werden. Mit Hilfe der cell-D imaging software (Olympus Soft Imaging
Solutions GmbH) erfolgte die Auswahl des zu fotografierenden Bereiches sowie die
Speicherung der Bilddateien im tagged image file (tif)- Format. Die Auswertung
erfolgte an Hand der Analysis 3.1-Software (Soft Imaging System GmbH). Hierfür
wurde zunächst pro Bild die region of interest (ROI) definiert, die sich aus den im Bild
vorhandenen Tumorarealen zusammensetzte. In dieser wurde diejenige Fläche
morphometrisch bestimmt, welche eine Expression des Chromogens aufwies und als
prozentualer Anteil der Gesamtfläche der ROI ausgedrückt. Chromogenartefakte
wurden durch Herausnahme aus der ROI von der Messung ausgeschlossen.
Weiterhin erfolgte der Ausschluss unspezifisch gefärbter Strukturen (z.B. Haare,
Haarfollikelepithel und Epidermis). Die ROI wurde als separate ausführbare Unix-
Datei im sfr-Format abgespeichert. Die Justierung der zu detektierenden
Farbintensität erfolgte durch Abzug eventueller Hintergrundfärbungen der
Negativkontrollen. Die gesamte prozentuale, durch das Chromogen markierte Fläche
wurde durch Mittelwertbildung der Prozentwerte der Einzelflächen bestimmt. Da im
Fall dieser beiden Antigene die Färbung von Bestandteilen der Tumorzellen
angestrebt wurde, erfolgte die morphometrische Bestimmung ausschließlich
intratumoral.
3.6.6.3. CD31
Die CD31-Immunhistologie diente, durch spezifisches Anfärben von Endothelzellen,
der Bestimmung der Gefäßdichte. Sie erfolgte quantitativ mit Hilfe eines
Lichtmikroskopes (Axiostar plus, Carl Zeiss Microscopy GmbH) durch Zählen

66
Material und Methoden
markierter Gefäßstrukturen in allen intratumoralen Gesichtsfeldern bei 400-facher
Vergrößerung. Chromogen-markierte Strukturen, welche keine deutlichen Lumina
umschlossen wurden nicht gezählt. Die Gefäßdichte wurde als Anzahl der Gefäße
pro µm 2 Tumorfläche ausgedrückt. Die Werte der Tumorgesamtflächen wurden der
in Abschnitt 3.5.1 dargestellten Auswertung entnommen.
3.6.6.4. Mac 3, CD3 und CD45R
Zunächst wurden Bilder der immunhistologisch gefärbten Tumorschnitte in 100-
facher Vergrößerung mit Hilfe eines digitalen Kameramikroskopes (Olympus BX-51,
Olympus Optical Co. Europe GmbH) erstellt. Im Falle von Tumoren, die größer als
circa 1 mm im Durchmesser waren, mussten mehrere Bilder pro Tumorschnitt
generiert werden. Mit Hilfe der cell-D imaging software (Olympus Soft Imaging
Solutions GmbH) erfolgte die Auswahl des zu fotografierenden Bereiches sowie die
Speicherung der Bilddateien im tagged image file (tif)- Format. Im Fall dieser
Antigene musste der zu fotografierende Bereich größer gewählt werden, da
peritumorale Bezirke (siehe unten) in die morphometrisch Bewertung einbezogen
wurden. Die Auswertung erfolgte an Hand der Analysis 3.1-Software (Soft Imaging
System GmbH). Da mit den Antikörpern die murine Entzündungsreaktion quantifiziert
werden sollte, wurden zum einen das intratumorale und zum anderen das
peritumorale Kompartiment evaluiert. Das peritumorale Kompartiment war definiert
als das gesamte, auf dem Schnitt vorhandene, Haut- und Unterhautgewebe, welches
sich innerhalb eines Millimeters in der Peripherie des Tumors befand (Kuroda et al.,
2012; Sorbye et al., 2012). Die morphometrische Bestimmung und Errechnung der
Chromogen-markierten prozentualen Fläche erfolgte analog der in Abschnitt 3.6.6.2
dargestellten Vorgehensweise.
3.6.6.5. AGM 1
Eine Auswertung der AGM 1 Immunhistologie erfolgte nicht.

Material und Methoden 67
3.7. Statistik
Die statistische Auswertung der klinisch erhobenen Daten zur
Tumorgrößenentwicklung, der histologischen sowie immunhistologischen Daten
erfolgte an Hand des Statistikprogrammes „Statistical Analysis System“ (SAS) für
Windows, Version 9.3 (SAS Institute Inc). Das an diese Untersuchung adaptierte
Programm wurde von Dr. Karl Rohn (Institut für Biometrie, Epidemiologie und
Informationsverarbeitung der Tierärztlichen Hochschule Hannover) zur Verfügung
gestellt. Zunächst wurden die Daten einer Untersuchung auf Normalverteilung
unterzogen. Da diese nicht vorlag, fand der Wilcoxon-Rangsummentest zum
paarweisen Vergleich der Untersuchungszeitpunkte (Klinik) bzw. der PZPpi
(Histologie, Immunhistologie), der Arten der intratumoralen Behandlungen, sowie der
ausgewerteten Kompartimente (intratumoral, peritumoral) Anwendung. Weiterhin
wurden Rang-Korrelationskoeffizienten nach Spearman zur Untersuchung möglicher
Korrelationen berechnet. Als statistisch signifikant unterschiedlich wurden solche
Daten bewertet, deren Vergleiche p-Werte ≤ 0,05 ergaben. Als statistisch hoch
signifikant unterschiedlich wurden solche Daten bewertet, deren Vergleiche p-Werte
≤ 0,01 ergaben. Die grafische Darstellung erfolgte mit Graph Pad Prism 5 für
Windows (Version 5.04, Graph Pad Software Inc.).
3.8. Zusätzliche Untersuchungen
3.8.1. Eignung einer Glioblastomzelllinie des Hundes zur Infizierbarkeit mit
kaninen Viren
Die Glioblastomzelllinie DGBM (dog glioblastoma multiforme) wurde
freundlicherweise von George Stoica (Texas A&M Universität, College Station, USA)
zur Verfügung gestellt. Die Zellen stammen von einer primären Zellkultur ab, welche
aus Tumorgewebe eines 8 Jahre alten Boxers mit einem Glioblastoma multiforme
Grad 4 generiert wurde (Stoica et al., 2009).
Die Zellen wurden nach Aussaat von 1,5 x 10 6 Zellen in Zellkulturflaschen mit einer
Fläche von 75 cm 2 (Nunc TM , Thermo Fisher Scientific) in Dulbecco’s Modified Eagle
Medium (DMEM, Gibco life technologies GmbH) mit Zusätzen von FKS zu 10% und

68
Material und Methoden
P/S zu 1% kultiviert. Zur Subkultivierung erfolgte das Ablösen der Zellen mittels
Trypsinisierung (Sayed-Ahmed, 2011).
Zum Zweck der Infektion erfolgte eine Aussaat der Zellen in 96-well Mikrotiterplatten
(Nunclon TM Surface, Thermo Fisher Scientific). Nach Etablierung der optimal
auszusähenden Zellzahl wurden pro Vertiefung 4 x 10 5 Zellen ausgesät. Die
Infektionen erfolgten wiederholt, nach dem Protokoll wie bei Sayed-Ahmed (2011)
beschrieben. Die Konfluenz der Zellrasen zum Zeitpunkt der Infektion betrug 70%.
Zur Infektion wurden die Staupevirusstämme CDV-Ond X (siehe Abschnitt 3.2.3),
green fluorescent protein exprimierender CDV-Ond (CDV-OndeGFP; 3.4.2008) und
CDV-R252 (10.10.2006) sowie der kanine Parainfluenza (CPiV) Typ 2-Stamm SV-5
(20.12.2005) verwendet. Die TCID 50 /100 µl der verwendeten Viren lagen bei 10 4,5
(CDV-Ond X), 10 3,5 (CDV-OndeGFP), 10 5 (CDV-R252) und 10 5,25 (CPiV). Die
Multiplizität der Infektion (MOI) betrug 1 bei CDV-Ond X, CDV-R252 und CPiV bzw.
0,1 bei CDV-OndeGFP. Die Zellen wurden täglich auf das Vorliegen eines
zytopathogenen Effektes kontrolliert. Der Nachweis einer Infektion erfolgte mittels
Immunfluoreszenzfärbung mit den bei Sayed-Ahmed (2011) angegebenen
Arbeitsschritten und Antikörpern.

Ergebnisse 69
4. Ergebnisse
4.1. DH82-Transplantate mit intratumoraler Injektion
4.1.1. Ergebnisse der Vorversuche
4.1.1.1. Klinische / in vivo-Ergebnisse zur Volumenentwicklung der DH82-
Tumoren bis 77 Tage nach Transplantation
Es wurden 6 Tieren je 3x10 6 Zellen in einem Volumen von 100 µl Zellkulturmedium
subkutan an die linke Körperseite transplantiert. Es erfolgte eine regelmäßige
klinische Untersuchung der Tiere sowie der Entwicklung des Tumorvolumens.
An der Injektionsstelle entstand nach der Applikation der Zellen eine geringgradige
Schwellung, welche nach circa 7 Tagen einen deutlichen Rückgang, teilweise bis hin
zur Nicht-Nachweisbarkeit, aufwies. Nach dieser anfänglichen Regression wiesen
nahezu alle Tiere ein kontinuierlich schnelles Tumorwachstum bis zum
Probennahmezeitpunkt 4 (PZP 4; 77 Tage nach Transplantation) auf (Abb.8). Ein
Tier dieser Gruppe (Tier Nr. 1.4.3; Gruppenkodierung siehe Unterabschnitt 3.1) wies
am 60. Tag nach Transplantation das im Vorfeld festgelegte maximale
Tumorvolumen auf und wurde daher aus ethischen Gründen an diesem Zeitpunkt
vorgezogen getötet. Ein weiteres Tier zeigte von Beginn an einen stetig
vorhandenen, aber im Wachstum weit zurück bleibenden Tumor (Tier Nr. 1.4.1;
Gruppenkodierung siehe Unterabschnitt 3.1).

70
Ergebnisse
Abb. 8: Volumenentwicklung der Tumoren ausgehend von unbehandelten
DH82-Zellen vom Tag der Transplantation bis zum 77. Tag nach
Transplantation
2200
1600
Tumorvolumen in mm³
1400
1200
1000
800
600
400
200
2
4
0
7
9
11
14
16
18
21
23
25
28
30
32
35
37
39
42
44
46
49
Tage nach Transplantation
51
53
56
58
60
63
65
67
70
72
74
77
Es zeigt sich eine stetige und deutliche Volumenzunahme der Tumoren ab dem 30. Tag nach der
Transplantation. Die durchgezogene Linie verbindet die Medianwerte.
4.1.1.2. Klinische / in vivo-Ergebnisse zur Volumenentwicklung der DH82-
Tumoren nach einmaliger intratumoraler Injektion
Nach näherungsweisem Erreichen des festgelegten Tumorvolumens für die
intratumorale Applikation (0,06 cm 3 ) wurden je 6 Tieren der Virusinjektionsgruppe an
Tag 37 und der Plazebogruppe an Tag 39 nach Transplantation infektiöses CDV-
Ond bzw. UV-inaktiviertes CDV-Ond appliziert. Ferner erfuhren 6 Tiere eine
intratumorale Applikation mit infektiösem CDV-Ond bei einem Tumorvolumen,
welches circa der Hälfte (0,03 mm 3 , Tag 32 nach Transplantation) des festgelegten
Tumorvolumens für die intratumorale Applikation entsprach. Die Tiere wurden bis

Ergebnisse 71
zum 42. Tag nach der Injektion beobachtet. Es ergaben sich nur zum Teil signifikante
Unterschiede der Volumenentwicklung der CDV (0,06 cm² und 0,03 cm²)- und
Plazebo-injizierten Tumoren zu nicht-injizierten Kontrolltumoren (Abb. 9). Einzelne
signifikante Unterschiede bestanden insofern, dass Kontrolltumoren und bei halbem
Volumen mit CDV-Ond injizierte Tumoren an einzelnen Untersuchungszeitpunkten
kleiner waren, als einmalig mit CDV-Ond bzw. Zellkulturmedium injizierte Tumoren
(nicht dargestellt, siehe Tab. 23).
Abb. 9:
Volumenentwicklung der einmalig injizierten DH82-Tumoren sowie
der nicht-injizierten DH82-Kontrolltumoren
3000
Injektion mit CDV
Injektion mit CDV bei 1/2 Tumorvolumen
Injektion mit Plazebo (Zellkulturmedium)
Kontrolle (keine Injektion)
Tumorvolumen in mm³
2000
1000
0
32
35
37
39
42
44
46
49
51
53
56
58
60
63
65
67
70
72
74
77
79
81
Tage nach Transplantation
Es ergaben sich nur zum Teil signifikante Unterschiede der Volumenentwicklung zwischen den
einmalig injizierten Tumoren und den Kontrolltumoren (siehe Tab. 23). Die Pfeile stellen den Tag der
intratumoralen Applikation für die jeweiligen Gruppen dar: violett: Injektion mit infektiösem CDV-Ond
bei einem Tumorvolumen von 0,03 cm 3 an Tag 32; rot: Injektion mit infektiösem CDV-Ond bei einem
Tumorvolumen von 0,06 cm 3 an Tag 37; blau: Injektion mit UV-inaktiviertem CDV-Ond bei einem
Tumorvolumen von 0,06 cm 3 an Tag 39. Die durchgezogene Linie verbindet die Medianwerte.

72
Ergebnisse
4.1.2. Ergebnisse der Hauptversuche
4.1.2.1. Klinische / in vivo-Ergebnisse zur Volumenentwicklung der DH82-
Tumoren bei maximal zehnmaliger intratumoraler Injektion
Ab dem 35. Tag nach der Transplantation der DH82-Zellen erfolgten alle 2 Tage fünfbzw.
zehnmalige intratumorale Applikationen von infektiösem CDV-Ond
(Virusinfektion), UV-inaktiviertem CDV-Ond (Plazebo 1) oder Zellkulturmedium
(Plazebo 2). Die Volumenentwicklung der injizierten Tumoren ist im Vergleich der
Gruppen untereinander und zu nicht-injizierten Kontrolltumoren in Abb. 10
dargestellt. Am Tag der ersten Applikation (Tag 35) bestanden keine signifikanten
Unterschiede der Tumorvolumina der 4 genannten Gruppen. Bereits an Tag 37
wiesen die Tumoren der Plazebo 2-Gruppe signifikant größere Volumina als die
Virusinfektionsgruppe auf. An Tag 41 zeigten beide Plazebogruppen sowie die
Kontrollgruppe signifikant höhere Tumorvolumina. Diese Entwicklung setzte sich
größtenteils bis inklusive des Tages 63 nach Transplantation fort. Ausnahmen
stellten der Tag 44 und 54 nach Transplantation dar. An ersterem war kein
signifikanter Unterschied zwischen der Virusinfektionsgruppe und der Plazebo 1-
sowie der Kontrollgruppe feststellbar. An letzterem wiesen nur die Tumoren der
Kontrollgruppe signifikant höhere Volumina als die mit dem CDV injizierten Tumoren
auf. An Tag 58 und 60 nach Transplantation waren zudem keine signifikanten
Unterschiede zwischen Virusinfektion- und Kontrollgruppe gegeben. Eine
Bestimmung der Tumorvolumina der Plazebogruppen erfolgte an diesen Tagen
jedoch nicht. Ab dem 65. Tag nach der Transplantation ergaben sich keine
signifikanten Volumenunterschiede im Vergleich der CDV-injizierten zu der Plazebo
2-injizierten Tumoren und den Tumoren der Kontrollgruppe mehr. Die Tumoren der
Plazebo 1-Gruppe wiesen bis zum Tag der vorgezogenen Tötung der Tiere der
Plazebogruppen (Tag 70) im Vergleich zur Virusinfektionsgruppe signifikant höhere
Tumorvolumina auf. Die Tötung der Tiere beider Plazebogruppen musste aus
ethischen Gründen vorgezogen geschehen, da die Tumoren an Tag 70 nach der
Transplantation bereits das zuvor festgelegte maximale Volumen überschritten
hatten. Innerhalb jeder Gruppe wurden signifikante Zunahmen der Tumorvolumina
vom Tag 35, zum jeweiligen Tag des Versuchsendes (Tötungstag) festgestellt.

Ergebnisse 73
Abb. 10: Volumenentwicklung der alle 2 Tage injizierten DH82-Tumoren sowie der nichtinjizierten
DH82-Kontrolltumoren
2500
°
*
*
2000
1500
1000
Tumorvolumen in mm³
500
Injektion
mit CDV
Injektion
mit UVinaktiv.
CDV
(Plazebo 1)
Injektion
mit Zellk.-
medium
(Plazebo 2)
Kontrolle
(keine Injektion)
*
° *
*
* *
*
*
*
* *
0
35
37
39
41
42
43
44
45
46
47
49
51
53
54
55
56
58
59
60
63
65
66
67
70
72
74
77
Tage nach Transplantation
* **
*
*
* *
*
°
* *
*
*
° **
* °
* *
*
° °
°
Zu Abb. 10: Entwicklung der Tumorvolumina der maximal zehnmalig, alle 2 Tage mit CDV-Ond
(rot), UV-inaktiviertem CDV-Ond (UV-inaktiv., Plazebo 1, dunkelblau) bzw. Zellkulturmedium
(Zellk.medium, Plazebo 2, hellblau) injizierten DH82-Tumoren im Vergleich zu nicht-injizierten
DH82-Kontrolltumoren (grün). schwarze Pfeile = 1.-5. intratumorale Applikation; braune Pfeile:
6.-10. intratumorale Applikation. Die durchgezogene Linie verbindet die Medianwerte.
* p ≤ 0,01 ° p ≤ 0,05

74
Ergebnisse
4.1.2.2. Tumormorphologie der DH82-Tumoren mit zehnmaliger
intratumoraler Injektion sowie der nicht-injizierten DH82-
Kontrolltumoren
Intra vitam zeigten sich die Tumoren als halbkugelig über die Hautoberfläche
erhabene, teils farblich nicht von der umgebenden Haut abgrenzbare, teils gerötete
Umfangvermehrungen.
Bei der Sektion stellten sie sich weich, gelegentlich multinodulär, gut von der
darunter liegenden Muskulatur der Bauchwand abgrenz- und lösbar und von rötlichgelber
Farbe dar. Im Anschnitt wies das Tumorzentrum häufig eine zerfließliche
Konsistenz und hellgelbe Farbe auf (Verdacht auf Nekrose). Insbesondere bei den
injizierten Tumoren konnten intratumorale Blutungen und Spaltbildungen beobachtet
werden. Das Erscheinungsbild der Tumoren bei der Sektion ist am Beispiel des PZP
2 in Abbildung 11 dargestellt.

Ergebnisse 75
Abb. 11: Makroskopische Tumormorphologie der zehnfach injizierten DH82-
Tumoren sowie der nicht-injizierten DH82-Kontrolltumoren am PZP 2
(Tag nach der letzten intratumoralen Applikation bzw. Tag 54 nach
Transplantation)
Gezeigt sind Bilder der subkutanen Seite der Transplantationsstelle. Die makroskopisch gut
abgegrenzten Umfangsvermehrungen sind mit einer gestrichelten Linie umkreist. A: DH82-
Transplantat mit zehnfacher Applikation von CDV-Ond (Gruppe Virusinfektion); B: DH82-Transplantat
mit zehnfacher Applikation von UV-inaktiviertem CDV-Ond (Gruppe Plazebo 1); C: DH82-Transplantat
mit zehnfacher Applikation von Zellkulturmedium (Gruppe Plazebo 2); D: DH82-Transplantat ohne
intratumorale Injektion (Gruppe Kontrolle); PZP = Probennahmezeitpunkt

76
Ergebnisse
4.2. DH82CDVpi-Transplantate
4.2.1. Klinische / in vivo Ergebnisse zur Volumenentwicklung der
DH82CDVpi-Transplantate
Analog zur Transplantation der DH82- Zellen wurden 30 Tieren je 3x10 6
DH82CDVpi-Zellen (persistierend CDV-infizierte Zellen) in einem Volumen von 100
µl Zellkulturmedium subkutan an die linke Körperseite appliziert. Analog fanden
Transplantationen nicht-infizierter DH82-Zellen statt (Kontrolle). Es erfolgte eine
regelmäßige klinische Untersuchung der Tiere sowie der Entwicklung des
Tumorvolumens.
An der Injektionsstelle entstand nach der Applikation der Zellen eine geringgradige
Schwellung. Während die DH82-Tumoren circa bis zum 24. Tag nach der
Transplantation eine sehr stark undulierende Volumenentwicklung, bei einzelnen
Tieren bis hin zur Nicht-Nachweisbarkeit, aufwiesen, zeigten die DH82CDVpi-
Tumoren circa bis zum 14. Tag nach der Transplantation größtenteils ein stetiges
Vorhandensein der Umfangsvermehrung mit wenig veränderlichen Volumina. Circa
ab dem 14. Tag nach der Transplantation kam es bei diesen zur kontinuierlichen
Volumenabnahme. Tag 35 nach Transplantation stellte den letzten Zeitpunkt dar, an
dem bei einzelnen Tieren noch ein DH82CDVpi-Tumor nachweisbar war.
Währenddessen traten die DH82-Tumoren circa ab dem 24. Tag nach der
Transplantation in eine kontinuierliche Volumenzunahme über. Mit Ausnahme des
Tages 31 waren die DH82-Tumoren ab Tag 25 nach Transplantation signifikant
größer (Abb. 11).

Ergebnisse 77
77
Abb. 12: Volumenentwicklung der DH82CDVpi-Tumoren im Vergleich zu DH82-Tumoren
2000
1000
(Kontrolle) über eine Dauer von 77 Tagen nach der Transplantation
DH82CDVpi
DH82
* * *
* * * * *
300
200
100
50
40
30
20
Tumorvolumen in mm³
10
0
2
3
4
7
9
10
11
14
17
18
21
23
24
25
28
30
31
32
35
37
72
74
Tage nach Transplantation
Zu Abb. 12: Es zeigte sich ein kontinuierlicher Volumenrückgang bis zur vollständigen Regression der
DH82CDVpi-Tumoren (rot) am 35. Tag nach der Transplantation. Die DH82-Tumoren (schwarz)
nahmen stetig an Volumen zu. DH82CDVpi = persistierend CDV-infizierte DH82-Zellen p ≤ 0,01
*

78
Ergebnisse
4.2.2. Makroskopische Tumormorphologie der DH82CDVpi-Transplantate
sowie der DH82-Kontrolltumoren
Intra vitam zeigten sich die DH82CDVpi- und DH82-Tumoren, den frühen
Untersuchungszeitpunkten geschuldet, als nur sehr wenig über die Hautoberfläche
erhabene, in der Regel farblich nicht von der umgebenden Haut abgrenzbare
Umfangvermehrungen.
Ab den Tagen, die mit deutlicher Tumorprogression der DH82-Transplantate
einhergingen (circa ab Tag 24 nach Transplantation), waren die klinischen und
Sektionsbefunde dieser den, in Unterabschnitt 4.1.2.2, beschriebenen, vergleichbar.
Bei den Sektionen zu den Probennahmezeitpunkten 1pi (PZP 1pi) bis
Probennahmezeitpunkten 3pi (PZP 3pi) waren die Transplantate optisch häufig
lediglich durch eine von der Unterhaut abweichende grau-beige Färbung zu
erkennen. Die DH82CDVpi-Transplantate stellten sich besser abgrenzbar, als die
eher flächenhaft wachsenden DH82-Transplantate, dar. Bei den am PZP 4pi (35
Tage nach Transplantation) postmortal untersuchten Tieren der DH82CDVpi-
Transplantatgruppe war äußerlich lediglich bei Einem eine Umfangvermehrung
nachweisbar. Histologisch wurde bei einem weiteren Tier dieser Gruppe eine
Umfangsvermehrung festgestellt (siehe Unterabschnitt 4.2.3). Die makroskopischen
Sektionsbefunde zu den einzelnen PZPpi (Probennahmezeitpunkte des Versuches
mit persistierend infizierten Tumoren und deren nicht-infizierten Kontrollen) sind
beispielhaft in Abbildung 13 dargestellt. Am PZP 5pi (77 Tage nach Transplantation)
konnte an der Transplantationsstelle bei den Tieren mit DH82CDVpi-Transplantaten
kein Befund erhoben werden. Die DH82-Transplantate stellten sich wie in
Unterabschnitt 4.1.2.2 beschrieben dar.

Ergebnisse 79
Abb. 13:
Makroskopische
Tumormorphologie
der DH82CDVpi-
Transplantate sowie
der DH82-Kontrolltumoren
Erscheinungsbild der subkutanen
Seite der Transplantationsstelle
an der
seitlichen Bauchwand. Die
teils mäßig, teils gut
makroskopisch abgrenzbaren
Umfangsvermehrungen
sind mit einer
gestrichelten Linie umkreist.
A: DH82CDVpi-Tumor 7
Tage nach der Transplantation
(PZP 1pi);
B: DH82-Tumor 7 Tage
nach der Transplantation
(PZP 1pi);
C: DH82CDVpi-Tumor 14
Tage nach der Transplantation
(PZP 2pi);
D: DH82-Tumor 14 Tage
nach der Transplantation
(PZP 2pi);
E: DH82CDVpi-Tumor 21
Tage nach der Transplantation
(PZP 3pi);
F: DH82-Tumor 14 Tage
nach der Transplantation
(PZP 3pi);
G: DH82CDVpi-Tumor 35
Tage nach der Transplantation
(PZP 4pi);
H: DH82-Tumor 35 Tage
nach der Transplantation
(PZP 4pi)
Legende:
DH82CDVpi = persistierend
CDV-infizierte DH82-Zellen;
PZP=
Probennahmezeitpunkt

80
Ergebnisse
4.2.3. Histologische und immunhistologische Untersuchungsergebnisse zu
den DH82CDVpi-Transplantaten und deren Kontrollen (DH82-
Transplantate)
4.2.3.1. Nachweis von Staupevirusantigen
Zur Beurteilung des intratumoralen Vorliegens von Staupevirusantigen wurden
Schnitte der DH82CDVpi- und DH82-Tumoren mit einem Antikörper gegen das CDV-
Nukleoprotein immunhistochemisch gefärbt und lichtmikroskopisch beurteilt. Nahezu
100% der Tumorzellen der DH82CDVpi-Transplantate wiesen eine teils
zytoplasmatische, teils zellmembranständige Chromogenmarkierung auf. Diese
stellte sich feingranulär bis grobschollig dar. Bei nahezu allen Tieren blieb das
murine Wirtsgewebe ungefärbt. Eine Ausnahme bildeten die Talgdrüsen, deren
positive Markierung jedoch als unspezifisch interpretiert wurde. Die Tumorzellen der
DH82-Transplantate wiesen keine positive immunhistochemische Markierung auf
(Abb. 14).

Ergebnisse 81
4.2.3.2. Allgemeine Tumormorphologie (HE, CD44- und MHC II-
Immunhistologie)
Die Tumormorphologie wurde anhand von HE-Färbungen sowie mit der
immunhistologischen CD44- und MHC II-Markierung der Tumorzellen beurteilt.
Unter Zuhilfenahme der CD44-Immunhistologie wurde, insbesondere bei sehr
kleinen und stark mit murinen Entzündungszellen durchsetzten
Umfangsvermehrungen, deren Abgrenzung zum umliegenden, nicht-gefärbten
Gewebe erleichtert. Die Tumorzellen, nicht jedoch die murinen Gewebe, zeichneten
sich in der CD44-Immunhistologie durch eine ausschließlich zellmembranöse,

82
Ergebnisse
grobschollige Chromogenmarkierung aus (Abb. 15, 16, 17, 18). In nekrotischen
Arealen war teilweise auch zellulärer Debris CD44-positiv markiert (Abb. 18). Die
Beurteilung der Tumormorphologie anhand der HE-Färbung und CD44-
Immunhistologie erfolgte lichtmikroskopisch.
Die MHC II-Immunhistologie wurde zur Beurteilung eines erhaltenen
Makrophagenphänotyps der DH82CDVpi- und DH82-Tumorzellen verwandt. Die
MHC II-positiven Tumorzellen, nicht jedoch die murinen Gewebe, zeichneten sich in
der MHC II-Immunhistologie durch eine zellmembranös-akzentuierte, geringgradig
aber auch zytoplasmatisch vorhandene, grobschollige Chromogenmarkierung aus
(Abb. 21). Die Beurteilung der MHC II-Immunhistologie erfolgte morphometrisch. Die
Dichte MHC II-positiv markierter Zellen wurde als MHC II-positive Fläche in % der
Tumorgesamtfläche ausgedrückt (siehe unten).
Die im Folgenden beschriebenen morphologischen Kriterien der DH82CDVpi- sowie
der DH82-Tumoren sind zum Teil in den Abbildungen 15-20 bildlich dargestellt.
An den ersten 3 PZPpi (7, 14 und 21 Tage nach Transplantation) stellten sich die
DH82CDVpi-Transplantate als in der Subkutis, unter dem Musculus cutaneus trunci
(Hautmuskel) lokalisierte, noduläre, gut abgegrenzte, nicht-bekapselte, in seltenen
Fällen den Hautmuskel infiltrierende (4 von 18 Tiere), zellreiche
Umfangsvermehrungen dar. Ein fibrovaskuläres Stroma war nahezu abwesend. Die
rund-ovalen Zellen waren unregelmäßig angeordnet, hatten eine sehr variable Größe
von 20 bis zu 100 µm im Durchmesser, besaßen unterschiedliche Mengen eines helleosinophilen,
teils leicht granulären, teils deutlich vakuolisierten Zytoplasmas sowie
deutliche Zellgrenzen. Die großen Zellkerne waren zentral, parazentral oder
exzentrisch gelegen und von rund-ovaler und gelegentlich eingekerbter Form. Das
Kern-Zytoplasma-Verhältnis lag bei 2:1 bis 3:1. Das Chromatin stellte sich
grobschollig dar. Es lagen in der Regel 1 bis 2 prominente, amphophile
Kernkörperchen vor. Es war eine deutliche Anisozytose und –karyose, teils mit
Karyomegalie und multinukleären Zellen zu beobachten. Die Mitoserate war sehr
unterschiedlich stark ausgeprägt. Am PZP 1pi waren noch bis zu 4 Mitosen pro
großen Gesichtsfeld (400-fache Vergrößerung) erkennbar, während die Tumoren am
PZP 3pi nur noch 0 bis 1 Mitose pro großem Gesichtsfeld aufwiesen. Zu allen PZPpi

Ergebnisse 83
waren deutliche intratumorale Nekroseherde zu erkennen. Diese waren
gekennzeichnet durch hypereosinophile, homogene Massen, Verluste der
Zellgrenzen bis hin zu Zytolysen der umliegenden Zellen sowie dem Vorliegen noch
intakter Somata, deren Kerne sich jedoch regressiv verändert (Karyopyknosis, -
rhexis und –lysis) darstellten. Die Zellularität der Umfangsvermehrungen sank mit
zunehmender Zeit nach Transplantation (siehe auch Unterabschnitt 4.2.3.3.). Schon
zum PZP 2pi, noch deutlicher jedoch am PZP 3pi, wiesen die Tumoren nur noch
vereinzelte Strukturen auf, die sich als Tumorzellen identifizieren ließen. Auffällig war
die niedrige Dichte intratumoraler, vaskulärer Strukturen (siehe auch Unterabschnitt
4.2.3.5.). Weiterhin lag zu allen PZPpi eine markante, im Wesentlichen mononukleäre
/ histiozytäre Entzündungszellinfiltration vor. Diese war häufig assoziiert mit
degenerativen Veränderungen des vorbestandenen Gewebes (subkutanes
Bindegewebe und Fasern des Hautmuskels). In diesen Bereichen fand sich auch
eine verstärkte Infiltration mit heterophilen Granulozyten. Beide am PZP 4pi noch
vorhandenen Umfangsvermehrungen stellten sich histologisch als Residualläsionen
bestehend aus wenigen, nur noch mit Hilfe einer immunhistologischen CD44-
Markierung sicher identifizierbaren Tumorzellen, tumorzellulärem Debris,
degenerierten Muskelfasern und Entzündungszellen dar. Eine der beiden
Residualläsionen zeigte eine deutliche bindegewebige Demarkierung vom
umliegenden Gewebe. Insofern die Tumorzellen intakt vorlagen, wurden sie deutlich
mit dem Antikörper gegen CD44 markiert. Interessanterweise wiesen die Zellen
jedoch zu keinem PZPpi eine positive MHC II-Immunreaktion auf (Abb. 21).
Die Morphologie der Zellkörper und –kerne der DH82-Transplantate (Kontrollen),
entsprach, mit Ausnahme der Mitoserate (siehe unten), im Wesentlichen, der der
DH82CDVpi-Transplantate. Während die Lokalisation und das Invasionsverhalten an
den ersten 3 PZPpi den DH82CDVpi-Transplantaten vergleichbar war, wies die
Gesamttumormorphologie jedoch auch einige markante Unterschiede auf. Die
Umfangsvermehrungen zeigten teils feine, teils deutliche Stränge fibrovaskulären
Stromas. Die Entzündungsreaktion war geringgradig ausgeprägt und konzentrierte
sich, wenn vorhanden, auf das intratumorale Kompartiment. Im peritumoralen
Bereich ließen sich nahezu keine Reaktionen des Wirtsgewebes feststellen. Ferner

84
Ergebnisse
waren nekrotische Areale selten und in deutlich geringerer Ausprägung zu
beobachten (siehe auch Unterabschnitt 4.2.3.3.). Auffällig war zudem eine
augenscheinlich höhere Dichte intratumoraler Gefäße (siehe auch Unterabschnitt
4.2.3.5.). Die Mitoserate lag zum PZP 1pi, ähnlich den DH82CDVpi-Transplantaten,
bei 4 bis 5 pro großem Gesichtsfeld. Am PZP 3pi wurden stellenweise bis zu 20
Mitosen gezählt. Die Tumore von 80% der Tiere zeigten am PZP 4pi neben einer
markanten Zunahme der morphometrisch bestimmten Tumorfläche (siehe auch
Unterabschnitt 4.2.3.3), ein deutliches Invasionsverhalten. Es kam, teils unter
Zerstörung von Muskelfasern des Hautmuskels, zur Invasion, durch diesen hindurch,
teilweise bis in die oberflächliche Dermis. Im Zuge der Langzeitstudie wurden am
PZP 5pi (77 Tage nach Transplantation) ausgedehnte Nekroseherde in den erheblich
an Fläche zugenommenen Tumoren beobachtet. Zum gleichen Zeitpunkt war an der
Transplantationsstelle der Tiere, die DH82CDVpi-Zellen erhalten hatten, nur
unveränderte Haut und Unterhaut festzustellen. Im Gegensatz zu den PZP 1pi-3pi
zeigten die Tumoren in der CD44-Immunhistologie an den späteren PZP (4pi und
5pi) keine nahezu 100%ige Markierung der Tumorzellen. Während tumorperipher
gelegene Zellen weiterhin eine deutliche zellmembranöse Färbung aufwiesen,
stellten sich die näher am und im Zentrum des Tumors gelegenen Zellen deutlich
schwächer bzw. teilweise nicht markiert dar. Im Gegensatz zu den Zellen der
DH82CDVpi-Tumoren wiesen Zellen der DH82-Transplantate eine MHC II-
Expression auf. MHC II-positiv markierte Zellen lagen entweder vereinzelt und
zufällig verteilt oder, häufiger, in zufällig verteilten Aggregaten. Interessanterweise
wiesen die DH82-Tumoren der PZP 4pi und 5 im Vergleich zu denen der PZP 1pi-3pi
teilweise signifikant höhere Dichten MHC II-positiver Tumorzellen auf (Abb. 21).
Die von den Tumoren beider Gruppen eingenommene Fläche sowie die
Nekroseflächen wurden morphometrisch bestimmt. Die Ergebnisse sind im folgenden
Unterabschnitt erläutert.

Ergebnisse 85

86
Ergebnisse

Ergebnisse 87

88
Ergebnisse

Ergebnisse 89
Zu Abb. 19: Bei höherer Vergrößerung (HE; Balken = 100 µm) zeigen die DH82CDVpi-Tumoren schon
am PZP 1pi und 2pi (A, B) deutliche Nekroseareale (N). Diese sind bei den DH82-Tumoren (C, D)
nicht erkennbar. Am PZP 2pi fallen bei den DH82CDVpi-Tumoren (B) stark vakuolisierte,
degenerierende Tumorzellen (Pfeilspitze) auf. Legende: DH82CDVpi = persistierend CDV-infizierte
DH82-Zellen; HE = Hämatoxylin-Eosin; PZP = Probennahmezeitpunkt; T = Tumor; Pfeile: murine
Entzündungszellinfiltration

90
Ergebnisse
*
Zu Abb. 20: Bei höherer Vergrößerung (HE; Balken = 100 µm) zeigen die DH82CDVpi-Tumoren am
PZP 3pi und 4pi (A, B) deutliche Nekroseareale (N). Diese sind bei den DH82-Tumoren (C, D) nicht
erkennbar. Am PZP 3pi und 4pi fallen bei den DH82CDVpi-Tumoren (B) stark vakuolisierte,
degenerierende Tumorzellen auf (Pfeilspitzen). Es kommt zur Infiltration der DH82-Tumorzellen in den
*
Hautmuskel ( ) am PZP 4pi (D); Legende: DH82CDVpi = persistierend CDV-infizierte DH82-Zellen;
HE = Hämatoxylin-Eosin; PZP = Probennahmezeitpunkt; T = Tumor; Pfeile: murine
Entzündungszellinfiltration

Ergebnisse 91

92
Ergebnisse
4.2.3.3. Tumor- und Nekroseflächen
Die Gesamttumorflächen in µm² sowie die anteiligen Nekroseflächen in % wurden
morphometrisch bestimmt. Deren grafische Darstellung findet sich in Abb. 22.
Die DH82CDVpi-Transplantate wiesen im Vergleich des PZP 1pi mit dem PZP 2pi
sowie dem PZP 3pi signifikante Verringerungen der eingenommenen Flächen auf.
Am PZP 4pi waren nur noch 2 Umfangsvermehrungen feststellbar. Daher waren zu
diesem Zeitpunkt, weder im Vergleich der PZPpi innerhalb der Gruppe, noch im
paarweisen Gruppenvergleich (DH82CDVpi- und DH82-Transplantate; siehe unten),
signifikante Unterschiede errechenbar. Am PZP 5pi waren keine DH82CDVpi-
Tumoren mehr vorhanden. Im paarweisen Gruppenvergleich konnten vergleichbare
Flächen beider Gruppen am PZP 1pi und 2pi festgestellt werden. Signifikant kleinere
Flächen der DH82CDVpi-Tumoren zeigten sich am PZP 3pi.
Der deutliche Größenzuwachs der DH82-Tumoren spiegelte sich in den signifikant
größeren Flächen am PZP 4pi und 5pi im Vergleich zu den früheren PZPpi wider. Am
PZP 2pi waren die Flächen denen am PZP 1pi noch vergleichbar groß.
Die prozentualen Anteile der Nekroseflächen an den Gesamttumorflächen waren
bei den DH82CDVpi-Tumoren an den PZP 2 und 3pi im Vergleich zum PZP 1pi
signifikant größer. Am PZP 4pi waren nur noch 2 Umfangsvermehrungen feststellbar.
Daher waren zu diesem Zeitpunkt, weder im Vergleich der PZPpi innerhalb der
Gruppe, noch im paarweisen Gruppenvergleich (siehe unten), signifikante
Unterschiede errechenbar. Im paarweisen Gruppenvergleich waren die
Nekroseanteile der DH82CDVpi-Tumoren an den PZP 1pi-3pi signifikant größer als
bei den DH82-Tumoren und lagen bei bis zu circa 62% der Tumorgesamtfläche am
PZP 1pi und bis zu 100% am PZP 2 und 3pi. Bei den DH82-Tumoren zeigte sich
eine signifikante Größenzunahme der Nekroseareale am PZP 5pi im Vergleich zu
den PZP 2 bis 4pi.

Ergebnisse 93
Abb. 22: Vergleich der Tumorfläche in µm² und der anteiligen Nekrosefläche in % der
DH82CDVpi und DH82-Tumoren
A B
*
100
810 07 *
°
210 *
07
* °
60
80
410 07
°
210 06
°
*
40
110 06
20
0
0
DH82CDVpi
Tage nach Transplantation DH82
*
°
°
*
°
Tumorfläche in µm 2
Nekrosefläche in %
7
14
21
35
77
7
14
21
35
77
Tage nach Transplantation
°
°
°
Die DH82CDVpi-Tumoren (grau) zeigen bei Rückgang der Tumorfläche (A) einen Anstieg der anteiligen Nekrosefläche (B).
Die Fläche der DH82-Tumoren (weiß) nimmt nach transienter Stagnation kontinuierlich zu. Die anteilige Nekrosefläche zeigt
erst am PZP 5pi (77 Tage nach Transplantation) einen signifikanten Zuwachs. 7 Tage nach Transplantation = PZP 1pi; 14
Tage nach Transplantation = PZP 2pi; 21 Tage nach Transplantation = PZP 3pi; 35 Tage nach Transplantation = PZP 4pi; 77;
Tage nach Transplantation = PZP 5pi;
Legende: DH82CDVpi = persistierend CDV-infizierte DH82-Zellen; PZP = Probennahmezeitpunkt ° p ≤ 0,05 * p ≤ 0,01

94
Ergebnisse
4.2.3.4. Apoptose
Das Vorliegen apoptotischer Zellen wurde im Rahmen morphometrischer
Auswertungen von immunhistochemisch, mit einem Antikörper gegen aktivierte
Caspase 3, markierten Schnitten beurteilt. Die aktivierte Caspase 3-positiven Zellen
zeichneten sich durch eine zytoplasmatische und häufig perinukleäre, feingranuläre
bis grobschollige Chromogenmarkierung aus. Die intratumorale Dichte aktivierter
Caspase 3-positiver Zellen wurde als aktivierte Caspase 3-positive Fläche in % der
Tumorgesamtfläche ausgedrückt (Abb. 23). In nekrotischen Arealen war teilweise
auch zellulärer Debris positiv markiert. Ferner waren wenige murine mononukleäre
Zellen des umgebenden Bindegewebes gefärbt. Morphometrisch wurde allein die
Färbung innerhalb des Tumorareals ausgewertet. Die darin enthaltenen murinen,
Chromogen-markierten Zellen konnten von der Auswertung jedoch nicht
ausgeschlossen werden.
DH82CDVpi-Transplantate wiesen, insbesondere beim Vergleich der Expression am
PZP 1pi mit der am PZP 3pi, eine Tendenz (p = 0,0552) abnehmender Flächen,
welche durch aktivierte Caspase 3-positive Zellen eingenommen wurden, auf. Am
PZP 4pi waren nur noch 2 Umfangsvermehrungen feststellbar. Daher waren zu
diesem Zeitpunkt, weder im Vergleich der PZPpi innerhalb der Gruppe, noch im
paarweisen Gruppenvergleich (siehe unten), signifikante Unterschiede errechenbar.
Am PZP 2pi besaßen die DH82CDVpi-Tumoren im paarweisen Vergleich zu den
DH82-Tumoren eine signifikant höhere aktivierte Caspase 3-Expression. Bei den
DH82-Tumoren kam es zunächst (Vergleich PZP 1, 2 und 3pi) zu einer signifikanten
Verringerung. Danach stieg der Anteil aktivierter Caspase 3-exprimierender Zellen
wieder an. Hierbei waren jedoch nur die Unterschiede zwischen PZP 2pi und 4pi
sowie 5pi statistisch signifikant.

Ergebnisse 95

96
Ergebnisse
4.2.3.5. Tumorvaskularisation
Zur Beurteilung der Tumorgefäßdichte wurden Schnitte der DH82CDVpi- und DH82-
Tumoren mit einem Antikörper gegen CD31 immunhistochemisch gefärbt und
positive Strukturen, die ein eindeutiges Lumen besaßen, gezählt und in Anzahl pro
µm² Tumorfläche ausgedrückt (Abb. 24). Die DH82CDVpi-Tumoren zeigten im
Vergleich der PZPpi untereinander keine signifikant unterschiedliche Gefäßdichte pro
µm² Tumorfläche. Am PZP 4pi waren nur noch 2 Umfangsvermehrungen feststellbar.
Daher waren zu diesem Zeitpunkt, weder im Vergleich der PZPpi innerhalb der
Gruppe, noch im paarweisen Gruppenvergleich (siehe unten), signifikante
Unterschiede errechenbar. An den PZP 1pi-3pi besaßen die DH82-Tumoren im
paarweisen Vergleich zu den DH82DCVpi-Tumoren ein signifikant dichteres
Gefäßnetz. Mit Ausnahme des Vergleiches des PZP 4pi und 5pi, wiesen die DH82-
Tumoren einen signifikanten Rückgang der Gefäßdichte mit fortschreitender Zeit
nach Transplantation auf.

Ergebnisse 97

98
Ergebnisse
4.2.3.6. Charakterisierung der durch die Tumoren hervorgerufenen
Entzündungsreaktion des Wirtsorganismus
4.2.3.6.1 Mac 3-positive Zellen
Das Vorliegen muriner Mac 3-positiver Zellen im peri- und intratumoralen
Kompartiment wurde im Rahmen morphometrischer Auswertungen von,
immunhistochemisch mit einem Antikörper gegen Mac 3 (CD107b) markierten
Schnitten, beurteilt (Abb. 25, 26). Die circa 15-20 µm im Durchmesser betragenden,
überwiegend rund-ovalen, Mac 3-positiven murinen Zellen besaßen einen
mehrheitlich exzentrisch gelegenen, ungefärbten, ovalen und häufig eingekerbten
Zellkern, ein Kern-Zytoplasma-Verhältnis von circa 1:2 bis 1:3, deutlich vakuolisiertes
Zytoplasma und zeichneten sich durch eine zytoplasmatische, grobschollige
Chromogenmarkierung aus. Die geringgradige Färbung der transplantierten
DH82CDVpi- und DH82-Zellen sowie die etwas deutlichere Färbung von Talgdrüsen,
wenigen Keratinozyten und Endothelzellen wurde als unspezifisch interpretiert und
weitestgehend von der morphometrischen Auswertung ausgeschlossen (Abb. 25).
Die Dichte Mac 3-positiver Zellen wurde als Mac 3-positive Fläche in % der
Tumorgesamtfläche (intratumorales Kompartiment) bzw. in % der
Tumorperipheriefläche (peritumorales Kompartiment) ausgedrückt (Abb. 26).
Die DH82CDVpi-Transplantate wiesen im intratumoralen Kompartiment vom PZP
1pi zum PZP 2pi einen signifikanten Anstieg Mac 3-positiver Zellen auf. Im
peritumoralen Kompartiment kam es von PZP 1pi zu PZP 2pi zunächst zu einem
signifikanten Abfall, vom PZP 2pi zum PZP 3pi wiederum zu einer signifikanten
Zunahme Mac 3-positiver Zellen. An PZP 2pi waren signifikant mehr Mac 3-positive
Zellen im intratumoralen als im peritumoralen Kompartiment zu finden. Am PZP 4pi
waren nur noch 2 Umfangsvermehrungen feststellbar. Daher waren zu diesem
Zeitpunkt, weder im Vergleich der PZPpi innerhalb des Kompartimentes, noch im
paarweisen Vergleich zwischen den Kompartimenten, noch im paarweisen Vergleich
der persistierend infizierten und nicht-infizierten Tumoren innerhalb eines
Kompartimentes (siehe unten) signifikante Unterschiede errechenbar (Abb. 26 A).

Ergebnisse 99
Die DH82-Transplantate wiesen im intra- und peritumoralen Kompartiment vom PZP
1pi bis zum PZP 3pi einen stetigen und signifikanten Rückgang Mac 3-positiver
Zellen auf. Im intratumoralen Kompartiment stagnierte der Rückgang ab dem PZP
3pi, sodass signifikante Unterschiede zwischen PZP 4pi bzw. PZP 5pi nur zum PZP
1 bzw. 2pi bestanden. An den PZP 1pi und 2pi waren signifikant mehr Mac 3-positive
Zellen im intra- als im peritumoralen Kompartiment zu finden (Abb. 26 B).
Im paarweisen Vergleich der persistierend infizierten und nicht-infizierten Tumoren
waren am PZP 1pi und 3pi signifikant mehr Mac 3-positive Zellen im peritumoralen
Kompartiment der DH82CDVpi-Tumoren vorhanden. Der maximale Mac 3-positive
Anteil der beurteilten Tumorperipherie betrug bei diesen circa 11% am PZP 1pi. Die
DH82-Tumoren wiesen einen maximalen Mac 3-positiven Anteil an der
Tumorperipheriefläche von circa 5% im PZP 5pi auf (Abb. 26 C). Deutliche
Unterschiede ergaben sich zudem im intratumoralen Kompartiment. Die Dichte Mac
3-positiver Zellen in den DH82CDVpi-Tumoren war mit maximal circa 32% im
Vergleich zu circa 4% bei den DH82-Tumoren bzw. maximal circa 39% im Vergleich
zu circa 2% am PZP 2pi bzw. 3pi signifikant erhöht (Abb. 26 D).

100
Ergebnisse

77
Ergebnisse 101
Abb. 26:
Mac 3-positive intra- und peritumorale Fläche in den DH82CDVpiund
DH82-Tumoren
A
Mac 3-positive Fläche in %
40
35
30
25
20
15
10
DH82CDVpi
intratumoral
peritumoral
°
*
*
*
Mac 3-positive Fläche in %
B
40
30
20
10
DH82
intratumoral
peritumoral
° °
° * *
°
* °
*
°
°
5
0
7
14
21
0
7
14
21
35
Tage nach Transplantation
35
Tage nach Transplantation
C
Mac 3-positive Fläche in %
40
30
20
10
peritumoral
DH82CDVpi
DH82
* °
D
Mac 3-positive Fläche in %
40
30
20
10
intratumoral
DH82CDVpi
DH82
*
°
0
0
7
14
7
14
21
35
Tage nach Transplantation
77
21
35
Tage nach Transplantation
A: Vergleich der intratumoralen (grau schraffiert) und peritumoralen (grau) Mac 3-positiven Fläche bei
den DH82CDVpi-Tumoren; B: Vergleich der intratumoralen (weiß schraffiert) und peritumoralen (weiß)
Mac 3-positiven Fläche bei den DH82-Tumoren; C: Vergleich der peritumoralen Mac 3-positiven
Fläche bei den DH82CDVpi-Tumoren (grau) und den DH82-Tumoren (weiß); D: Vergleich der
intratumoralen Mac 3-positiven Fläche bei den DH82CDVpi-Tumoren (grau schraffiert) und den DH82-
Tumoren (weiß schraffiert); Legende: DH82CDVpi = persistierend CDV-infizierte DH82-Zellen
° p ≤0,05 * p ≤ 0,01
77

102
Ergebnisse
4.2.3.6.2 CD3-positive Zellen
Das Vorliegen muriner CD3-positiver Zellen im peri- und intratumoralen
Kompartiment wurde im Rahmen morphometrischer Auswertungen von,
immunhistochemisch mit einem Antikörper gegen CD3 markierten Schnitten, beurteilt
(Abb. 27, 28). Die circa 10-15 µm im Durchmesser betragenden, mehrheitlich
runden, CD3-positiven murinen Zellen besaßen einen zentral gelegenen
ungefärbten, runden Zellkern, ein Kern-Zytoplasma-Verhältnis von circa 1:1 und
zeichneten sich durch eine zellmembranöse, feingranuläre bis grobschollige
Chromogenmarkierung aus. Die geringgradige Färbung von Talgdrüsen, wenigen
Keratinozyten und Gewebedebris in der Zirkumferenz der Tumoren wurde als
unspezifisch interpretiert und von der morphometrischen Auswertung
ausgeschlossen. Die DH82CDVpi- und DH82-Zellen blieben ungefärbt (Abb. 27). Die
Dichte CD3-positiver Zellen wurde als CD3-positive Fläche in % der
Tumorgesamtfläche (intratumorales Kompartiment) bzw. in % der
Tumorperipheriefläche (peritumorales Kompartiment) ausgedrückt (Abb. 28).
Die DH82CDVpi-Transplantate wiesen leichte Anstiege CD3-positiver Zellen vom
PZP 1pi bis zum PZP 3pi auf, die jedoch nur im peritumoralen Kompartiment im
Vergleich des PZP 1pi zum PZP 3pi signifikant waren. Im intratumoralen
Kompartiment lag die mittlere Dichte CD3-positiver Zellen höher. Ein signifikanter
Unterschied zum peritumoralen Kompartiment ergab sich jedoch nur am PZP 1pi.
Am PZP 4pi waren nur noch 2 Umfangsvermehrungen feststellbar. Daher waren zu
diesem Zeitpunkt, weder im Vergleich der PZPpi innerhalb des Kompartimentes,
noch im paarweisen Vergleich zwischen den Kompartimenten, noch im paarweisen
Vergleich der persistierend infizierten und nicht-infizierten Tumoren innerhalb eines
Kompartimentes (siehe unten) signifikante Unterschiede errechenbar (Abb. 28 A).
Die DH82-Transplantate wiesen im intratumoralen Kompartiment im Vergleich des
PZP 5pi zu allen früheren PZPpi signifikant höhere Dichten CD3-positiver Zellen auf.
Zudem waren an den ersten 4 PZPpi signifikant mehr CD3-positive Zellen im
intratumoralen als im peritumoralen Kompartiment zu finden (Abb. 28 B).
Im paarweisen Vergleich der persistierend infizierten und nicht-infizierten Tumoren
wiesen die DH82CDVpi-Tumoren an den ersten 3 PZPpi signifikant mehr CD3-

Ergebnisse 103
positive Zellen im peritumoralen Kompartiment auf als die Kontrollen (Abb. 28 C). Im
intratumoralen Kompartiment ergaben sich keine signifikanten Unterschiede (Abb. 28
D).

104
Ergebnisse
Abb. 28:
CD3-positive intra- und peritumorale Fläche in den DH82CDVpiund
DH82-Tumoren
A: Vergleich der intratumoralen (grau schraffiert) und peritumoralen (grau) CD3-positiven Fläche bei
den DH82CDVpi-Tumoren; B: Vergleich der intratumoralen (weiß schraffiert) und peritumoralen (weiß)
CD3-positiven Fläche bei den DH82-Tumoren; C: Vergleich der peritumoralen CD3-positiven Fläche
bei den DH82CDVpi-Tumoren (grau) und den DH82-Tumoren (weiß); D: Vergleich der intratumoralen
CD3-positiven Fläche bei den DH82CDVpi-Tumoren (grau schraffiert) und den DH82-Tumoren (weiß
schraffiert); Legende: CD = cluster of differentiation; DH82CDVpi = persistierend CDV-infizierte DH82-
Zellen; ° p ≤ 0,05 * p ≤ 0,01

Ergebnisse 105
4.2.3.6.3 CD45R-positive Zellen
Das Vorliegen muriner CD45R-tragender Zellen im peri- und intratumoralen
Kompartiment wurde im Rahmen morphometrischer Auswertungen von,
immunhistochemisch mit einem Antikörper gegen CD45R markierten Schnitten,
beurteilt (Abb. 29, 30). Die circa 15-20 µm im Durchmesser betragenden, runden bis
rund-ovalen, CD45R-positiven murinen Zellen besaßen einen zentral gelegenen,
runden, ungefärbten Zellkern, ein Kern-Zytoplasma-Verhältnis von circa 1:2 und
zeichneten sich durch eine zellmembranöse, grobschollige Chromogenmarkierung
aus. Die geringgradige Färbung von Talgdrüsen wurde als unspezifisch interpretiert
und von der morphometrischen Auswertung ausgeschlossen. Die DH82CDVpi- und
DH82-Zellen blieben ungefärbt (Abb. 29). Die Dichte CD45R-positiver Zellen wurde
als CD45R-positive Fläche in % der Tumorgesamtfläche (intratumorales
Kompartiment) bzw. in % der Tumorperipheriefläche (peritumorales Kompartiment)
ausgedrückt (Abb. 30).
Die DH82CDVpi-Transplantate wiesen über die gesamte Untersuchungsdauer
keine signifikanten Veränderungen innerhalb des intratumoralen oder peritumoralen
Kompartimentes auf. An den ersten 3 PZPpi waren jedoch signifikant mehr CD45Rpositive
Zellen im intratumoralen als im peritumoralen Kompartiment vorhanden. Am
PZP 4pi waren nur noch 2 Umfangsvermehrungen feststellbar. Daher waren zu
diesem Zeitpunkt, weder im Vergleich der PZPpi innerhalb des Kompartimentes,
noch im paarweisen Vergleich zwischen den Kompartimenten, noch im paarweisen
Vergleich der persistierend infizierten und nicht-infizierten Tumoren innerhalb eines
Kompartimentes (siehe unten) signifikante Unterschiede errechenbar (Abb. 30 A).
Im intratumoralen Kompartiment der DH82-Transplanate kam es über die gesamte
Untersuchungsdauer zu einem Rückgang CD45R-positiver Zellen, welcher zwischen
den einzelnen PZPpi größtenteils signifikant war. Ein signifikanter Rückgang im
peritumoralen Kompartiment ließ sich ebenfalls im Vergleich des PZP 1pi zum PZP
2pi und 3pi feststellen. Weiterhin waren an den ersten 3 PZPpi im intratumoralen
Kompartiment signifikant mehr CD45R-positive Zellen vorhanden als im
peritumoralen (Abb. 30 B).

106
Ergebnisse
Im paarweisen Vergleich der persistierend infizierten und nicht-infizierten Tumoren
lagen bei den DH82CDVpi-Transplantaten in beiden Kompartimenten jeweils zu den
ersten 3 PZPpi signifikant mehr CD45R-positive Zellen vor als bei den nichtinfizierten
Transplantaten (Abb. 30 C und D).

Ergebnisse 107
Abb. 30: CD45R-positive intra- und peritumorale Fläche in den DH82CDVpiund
DH82-Tumoren
A: Vergleich der intratumoralen (grau schraffiert) und peritumoralen (grau) CD45R-positiven Fläche
bei den DH82CDVpi-Tumoren; B: Vergleich der intratumoralen (weiß schraffiert) und peritumoralen
(weiß) CD45R-positiven Fläche bei den DH82-Tumoren; C: Vergleich der peritumoralen CD45Rpositiven
Fläche bei den DH82CDVpi-Tumoren (grau) und den DH82-Tumoren (weiß); D: Vergleich
der intratumoralen CD45R-positiven Fläche bei den DH82CDVpi-Tumoren (grau schraffiert) und den
DH82-Tumoren (weiß schraffiert); Legende: CD = cluster of differentiation; DH82CDVpi =
persistierend CDV-infizierte DH82-Zellen; ° p ≤0,05 * p ≤ 0,01

108
Ergebnisse
4.2.3.6.4 Vergleich der Entzündungsparameter
Es wurden bei den persistierend infizierten und nicht-infizierten Tumoren die
einzelnen, wie oben erläutert ausgewerteten, Entzündungsparameter im intra- und
peritumoralen Kompartiment zum jeweiligen PZPpi verglichen.
Bei den DH82CDVpi-Transplantaten (Abb. 31) waren am PZP 1pi (Abb. 31 A) im
intra- wie im peritumoralen Kompartiment signifikant mehr Mac 3-positive Zellen
vorhanden als CD3- und CD45R-positive Zellen. Ferner lagen in beiden
Kompartimenten signifikant mehr CD3-positive Zellen als CD45R-positive Zellen vor.
Am PZP 2pi (Abb. 31 B) dominierten im intratumoralen Kompartiment wiederum die
Mac 3-positiven Zellen signifikant die CD3- und CD45R-positiven Zellen. Im
peritumoralen Segment überwogen, allerdings auf wesentlich geringerem Niveau, die
CD3-positiven Zellen signifikant im Vergleich zu den Mac 3- und CD45R-positiven
Zellen. Zwischen der Menge der CD3- und CD45R-positiven Zellen im intratumoralen
Kompartiment bestand kein signifikanter Unterschied.
Am PZP 3pi (Abb. 31 C) bestanden signifikante Unterschiede lediglich im
peritumoralen Kompartiment. Hier überwogen Mac 3- und CD3-positive Zellen
jeweils im Vergleich zu CD45R-positiven Zellen.
Am PZP 4pi (Abb. 31 D) waren nur noch 2 Umfangsvermehrungen feststellbar.
Daher waren zu diesem Zeitpunkt im Vergleich der Entzündungsparameter keine
signifikanten Unterschiede errechenbar.

Ergebnisse 109
Abb. 31:
Zusammenfassender Vergleich der intra- und peritumoralen
Infiltration der DH82CDVpi- Tumoren
A
40
30
intratumoral
peritumoral
B
40
30
intratumoral
peritumoral
*
*
positive Fläche in %
C
20
10
0
Mac 3
°
°
*
CD 3
CD 45R
Entzündungszellen 7 Tage nach Transpl.
40 intratumoral
peritumoral
*
°
*
positive Fläche in %
D
20
10
0
40
Mac 3
CD 3
CD 45R
Entzündungszellen 14 Tage nach Transpl.
intratumoral
peritumoral
* *
30
30
positive Fläche in %
20
10
°
°
positive Fläche in %
20
10
0
0
Mac 3
CD 3
CD 45R
Entzündungszellen 21 Tage nach Transpl.
Mac 3
CD 3
CD 45R
Entzündungszellen 35 Tage nach Transpl.
Intratumorale (grau schraffiert) und peritumorale (grau) Infiltration mit Mac 3-, CD3- und CD45Rpositiven
Zellen bei den DH82CDVpi-Tumoren. A: PZP 1pi (7 Tage nach Transplantation); B: PZP 2pi
(14 Tage nach Transplantation); C: PZP 3pi (21 Tage nach Transplantation); D: PZP 4pi (35 Tage
nach Transplantation);
Legende: CD = cluster of differentiation; DH82CDVpi = persistierend CDV-infizierte DH82-Zellen; PZP
= Probennahmezeitpunkt ° p ≤0,05 * p ≤ 0,01

110
Ergebnisse
Bei den DH82-Transplantaten (Abb. 32) war am PZP 1pi (Abb. 32 A) das Verhältnis
zwischen Mac 3- und CD3-positiven Zellen im intratumoralen Kompartiment
ausgeglichen. Allerdings überwogen hier Mac 3- als auch CD3-positive Zellen über
CD45R-positiven Zellen. Im peritumoralen Kompartiment dominierten die Mac 3-
positiven Zellen. So waren diese im Vergleich zu CD3- als auch zu CD45R-positiven
Zellen signifikant vermehrt. Ferner waren hier signifikant mehr CD3-positive Zellen
als CD45R-positiven Zellen anwesend.
Am PZP 2pi (Abb. 32 B) kam es zu einem Rückgang Mac 3-positiver Zellen, sodass
CD3-positive Zellen nun Mac 3- und CD45R-positive Zellen im intratumoralen
Kompartiment signifikant dominierten. Es lagen hier jedoch noch immer mehr Mac 3-
als CD45R-positive Zellen vor. Im peritumoralen Kompartiment überwogen wiederum
Mac 3- und CD3-positive Zellen über CD45R-positiven Zellen. Das Verhältnis
zwischen den beiden erstgenannten war jetzt jedoch ausgeglichen.
Am PZP 3 und 4pi (Abb. 32 C und D) stellte sich die Situation ähnlich der zum PZP
2pi dar. An diesen beiden Zeitpunkten dominierten die CD3-positiven Zellen den
Entzündungsprozess im intratumoralen Kompartiment. Hier bestand nun, durch
weiteren Rückgang Mac 3-positiver Zellen, kein signifikanter Unterschied mehr zur
Dichte CD45R-positiver Zellen. Im peritumoralen Kompartiment ergaben sich keine
Veränderungen zu PZP 2pi.
Am PZP 5pi (Abb. 32 E) kam es vor Allem im intratumoralen Segment zum
Rückgang CD3- und CD45R-positiver Zellen. Dies bewirkte nun einen Ausgleich der
Mac 3-positiven mit CD3-positiven Zellen. Beiden waren in diesem, wie auch in
peritumoralen Kompartiment im Vergleich zu den CD45R-positiven Zellen signifikant
vermehrt.

Ergebnisse 111
positive Fläche in %
A
15 intratumoral
peritumoral
10
5
*
°
*
*
B
positive Fläche in %
15
10
5
intratumoral
peritumoral
°
° *
°
*
*
0
Mac 3
CD 3
CD 45R
Entzündungszellen 7 Tage nach Transpl.
0
Mac 3
CD 3
CD 45R
Entzündungszellen 14 Tage nach Transpl.
C
15
intratumoral
peritumoral
D
15 intratumoral
peritumoral
positive Fläche in %
10
5
°
° °
°
positive Fläche in %
10
5
°
° °
°
0
Mac 3
CD 3
CD 45R
Entzündungszellen 21 Tage nach Transpl.
0
Mac 3
CD 3
CD 45R
Entzündungszellen 35 Tage nach Transpl.
E
positive Fläche in %
15
10
5
0
intratumoral
peritumoral
Mac 3
°
CD 3
CD 45R
Entzündungszellen 77 Tage nach Transpl.
°
°
°
Abb. 32: Zusammenfassender Vergleich der
intra- und peritumoralen Infiltration
der DH82-Tumoren
Intratumorale (weiß schraffiert) und peritumorale (weiß)
Infiltration mit Mac 3-/ CD3- und CD45R-positiven Zellen bei
den DH82-Tumoren. A: PZP 1pi (7 Tage nach Transplantation);
B: PZP 2pi (14 Tage nach Transplantation); C: PZP 3pi (21
Tage nach Transplantation); D: PZP 4pi (35 Tage nach
Transplantation); E: PZP 5pi (77 Tage nach Transplantation)
Legende: CD = cluster of differentiation; DH82CDVpi =
persistierend CDV-infizierte DH82-Zellen; PZP =
Probennahmezeitpunkt ° p ≤0,05 * p ≤ 0,01

112
Ergebnisse
4.2.3.7. Korrelationsanalysen
Die Überprüfungen auf Korrelation der einzelnen, in diesem Unterabschnitt
aufgeführten, Merkmale wurden mit dem Rangkorrelationsverfahren nach Spearman
durchgeführt. Es werden im Folgenden, sofern nicht anders erläutert, nur
Korrelationen aufgeführt, die sich als statistisch signifikant (p ≤ 0,05) erwiesen. Bei
einem Rangkorrelationskoeffizienten (rho, r) von 0,2 bis 0,5 wurde ein schwacher bis
mäßiger Zusammenhang angenommen. Bewegte sich r zwischen 0,5 und 0,8 wurde
der Zusammenhang als deutlich interpretiert. R größer als 0,8 und kleiner als 0,2
kamen nicht vor. Auflistungen der signifikanten Korrelationen finden sich in Tab. 21
und 22 (Unterabschnitt 9.4).
Bei den DH82CDVpi-Tumoren galt: je kleiner die Tumorgesamtfläche wurde, desto
größer erwies sich die, an der Tumorgesamtfläche anteilige, Nekrosefläche
(r = - 0,6). Ferner verringerte sich interessanterweise die Dichte aktivierter Caspase
3-positiver Zellen im Zuge der Flächenrückganges (r = 0,6). Eine signifikante
negative Abhängigkeit zwischen einem Zunehmen der anteiligen Nekrosefläche und
einem Rückgang der aktivierten Caspase 3-positiver Zellen konnte allerdings nicht
festgestellt werden. Ein Zusammenhang fand sich jedoch bei den DH82-Tumoren.
Hier korrelierte die Zunahme der anteiligen Nekrosefläche mit einer Zunahme
aktivierter Caspase 3-positiver Zellen (r = 0,5). Je größer die Tumorgesamtfläche der
DH82-Transplantate wurde, desto stärker verringerte sich die Dichte CD31-
markierter Gefäßstrukturen pro µm² Tumorfläche (r = -0,8). Signifikante
Abhängigkeiten zwischen der Dichte CD31-markierter Gefäßstrukturen und der
Größe der anteiligen Nekrosefläche ergaben sich bei den persistierend infizierten
und nicht-infizierten Tumoren nicht.
Im Zusammenspiel der Entzündungsreaktion des Wirtes und der Tumormorphologie
ergaben sich folgende statistische Abhängigkeiten: Je kleiner die Fläche der
DH82CDVpi-Tumoren wurde, desto größer war die intra- und peritumorale Dichte
CD3-positiver Zellen (r = -0,5). Dies spiegelte sich teilweise in der positiven
Korrelation der Nekrosefläche und der peritumoralen Dichte CD3-positiver Zellen
wider (r = 0,5). Je größer die peritumorale Dichte CD3-positiver Zellen wurde, desto
mehr CD45R-positive Zellen wurden auch im peritumoralen Kompartiment

Ergebnisse 113
nachgewiesen (r = 0,6). Im Zuge dessen stieg auch die intratumorale Dichte CD45Rpositiver
Zellen an (r = 0,6). Ferner stieg mit der Zunahme der Nekrosefläche die
intratumorale Dichte Mac 3-positiver Zellen an (r = 0,5). Je größer die Fläche der
DH82-Tumoren wurde, desto weniger Entzündungszellinfiltrate wurden intratumoral
nachgewiesen (Mac 3- und CD3-positive Zellen: r = -0,7; CD45R-positive Zellen: r = -
0,8). Ferner bestanden positive Zusammenhänge zwischen dem Rückgang der
Dichte CD31-markierter Gefäßstrukturen und den Entzündungszellinfiltraten (Mac 3-
und CD45R-positive Zellen: r = 0,7; CD3-positive Zellen: r = 0,5). Die Rückgänge der
Dichte der Entzündungszellen waren im intratumoralen Kompartiment zueinander
proportional (CD3- und CD45R-positive Zellen: r = 0,7; CD45R– und Mac 3-positive
Zellen: r = 0,8; CD3- und Mac 3-positive Zellen: r = 0,4). Je geringer die Dichte
CD45R-positiver Zellen im intratumoralen Kompartiment wurde, desto stärker nahm
sie jedoch im peritumoralen Kompartiment zu (r = 0,5). Zudem fand sich eine
Korrelation zwischen zunehmender Nekrosefläche und abnehmender intratumoraler
Infiltration CD3-positiver Zellen. Je größer die Fläche der DH82-Tumoren wurde,
desto mehr MHC II-positive Tumorzellen waren in diesen nachzuweisen (r = 0,6).
Korrespondierend fand sich eine Zunahme MHC II-positiver Tumorzellen, bei
Rückgang der Dichte CD31-markierter Gefäßstrukturen (r = -0,6) und der
intratumoralen Dichte Mac 3- und CD45R-positiv markierter Entzündungszellen.
4.3. Infektion einer Glioblastomzelllinie mit kaninen Viren
Weder in den, mit dem CDV-Ond / CDV-OndeGFP noch in den, mit dem CDV-R552
infizierten DGBM konnte eine Staupevirusinfektion immunfluoreszenzmikroskopisch
nachgewiesen werden. Auch die, mit dem CPiV infizierten Zellen zeigten in der
Immunfluoreszenz kein positives Signal. Ferner konnten weder in den, mit dem CDV
noch in den, mit dem CPiV infizierten Zellen zytopathogene Effekte beobachtet
werden. Die Zellen wurden daher im Fortgang dieser Untersuchungen als
alternatives Transplantationsmodell nicht berücksichtigt.

114
Ergebnisse
4.4. Antikörperetablierungen für die Immunhistologie
Die in den Tabellen 6 und 8 (Unterabschnitt 3.6) aufgeführten Antikörper (mit
Ausnahme des Antikörpers gegen das CDV-Nukleoprotein) wurden an Schnitten
eines DH82-Transplantates etabliert, an Tumorserienschnitten angewendet und, wie
in diesem Abschnitt beschrieben, ausgewertet.
Weiterhin gelang an Schnitten eines DH82-Transplantates (Tier Nr. 1.4.3) die
Etablierung der Antikörper gegen den Calretikulin N-Terminus / Vasostatin, Cortactin,
Ki 67 (Fa. DCS Innovative Diagnostik Systeme) und LC 3 (Tabellen 7 und 8 des
Unterabschnittes 3.6). Sie wurden jedoch an den Tumorserienschnitten nicht
angewendet.
Die Etablierung der Antikörper gegen den Calretikulin C-Terminus, CD68 (Fa. Dako),
CD68 (Fa. Spring Bioscience), CD161, F4/80, Ki 67 (Fa. abcam), VEGF und Von
Willebrand Faktor (Tabellen 7 und 8 des Unterabschnittes 3.6) gelang an Schnitten
eines DH82-Transplantates nicht.

Diskussion 115
5. Diskussion
Die vorliegende Studie dient der Beurteilung der onkolytischen Aktivität des CDV in
Xenotransplantaten kaniner histiozytärer Tumorzellen. Hierfür wurden zwei
unterschiedliche Ansätze gewählt.
Zum einen wurden nicht-infizierte DH82-Zellen (Makrophagen- / Monozyten-
Tumorzelllinie) subkutan in Scid-Mäuse transplantiert. Die entstandenen Tumoren
wurden daraufhin intratumoral mit dem CDV infiziert. Dieser Versuchsansatz
entspricht einer möglichen Vorgehensweise therapeutischen Eingreifens mit einem
onkolytischen viralen Agens in eine Tumorerkrankung beim tierischen oder
menschlichen Patienten. Der Erfolg der intratumoralen Injektionen wurde durch
regelmäßige Bestimmungen des Tumorvolumens innerhalb einer festgelegten
Zeitspanne dokumentiert und bewertet.
Zum anderen fanden, in methodisch analoger Vorgehensweise, Transplantationen
von persistierend CDV-infizierten DH82-Zellen (DH82CDVpi-Zellen) statt. Dieses
Verfahren entspricht nicht der klinischen Situation einer Tumorerkrankung. Allerdings
geben die daraus gewonnenen Erkenntnisse wertvolle Anhaltspunkte auf die der
Lyse der persistierend infizierten Tumorzellen zu Grunde liegenden Mechanismen.
Hieraus lassen sich wiederum Anknüpfungspunkte für Studien, die sich näher an der
klinischen Situation einer Tumorerkrankung bzw. deren Therapie befinden,
gewinnen.
Im Folgenden sollen die Ergebnisse der klinischen Entwicklung der Tumoren nach
intratumoraler Applikation von CDV und verschiedenen Plazebolösungen sowie die
klinischen, histologischen sowie immunhistologischen Ergebnisse zur Studie mit den
transplantierten virusinfizierten Zellen diskutiert werden.
5.1. DH82-Transplantate mit intratumoraler Injektion
Zunächst wurde in einem Vorversuch das Vermögen des Scid-Mausorganismus
heterotope DH82-Xenotransplantate aufzunehmen und zu erhalten untersucht.
Entsprechend den Erkenntnissen von Hudson et al. (1998) erwiesen sich diese, mit
multiplen immunologischen Defekten ausgestatteten, Mäuse für die

116
Diskussion
Xenotransplantationen als gut geeignet. Sie zeigten keine Abstoßungsreaktionen
nach Transplantation der DH82-Zellen und ermöglichten damit eine ungehinderte
Entwicklung der Zelltransplantate in einem stetig an Größe bzw. Volumen
zunehmenden Tumor. Weiterhin erwiesen sich die Tiere, trotz der immunologischen
Defekte, unter den beschriebenen keimdruckreduzierten Haltungsbedingungen und
Behandlungen als recht robust. Auch in den Langzeitstudien, welche sich circa bis
zur 18. Lebenswoche der Tiere hinzogen, waren keine vermehrten Erkrankungsbzw.
unplanmäßigen Todesfälle zu beobachten.
Die ebenfalls in einem Vorversuch untersuchte einmalige intratumorale Applikation
von CDV erwies sich, in Tumoren, die das volle, im Vorhinein festgelegte Volumen
für die intratumorale Injektion (0,06 cm³) hatten, als nicht erfolgreich. Um eine höhere
Infektionsrate der Tumorzellen mit dem CDV zu erreichen, wurde die onkolytische
Wirkung einer einmaligen intratumoralen Virusinjektion in Tumoren, die erst die
Hälfte des oben genannten Volumens erreicht hatten, getestet. Auch dieser Ansatz
erwies sich als nicht vielversprechend.
5.1.1. Volumenentwicklung und makroskopische Tumormorphologie der
DH82-Tumoren mit maximal zehnmaliger intratumoraler Injektion
In Anlehnung an die bei Grote et al. (2001) angewandte Therapiestrategie der
täglichen, 10-maligen intratumoralen Virusapplikation wurde daraufhin das
Therapieregime für den Hauptversuch auf 10-malige, alle 2 Tage statt findende,
intratumorale Applikationen modifiziert. Vähä-Koskela et al. (2006) bewerten
wiederholte, intratumorale oder systemische Applikationen des onkolytischen Virus
als die wichtigste Strategie zur Gewährleistung einer hohen Infektionsrate der
Tumorzellen und sehen darin ferner eine Möglichkeit zur Überwältigung einer
möglichen präexistenten Immunität gegen das onkolytische Agens. Currier et al.
(2005) verglichen die einmalige, intratumorale Applikationen zweier humaner Herpes
simplex-Viren in Rhabdomyosarkomtransplantaten mit fraktionierten Gaben der
gleichen, wie in der einmaligen Applikation injizierten, Virusmenge. Es ergaben sich
nach einmaligen, jedoch auf 5 Lokalisationen im Tumor verteilten Applikationen
signifikant höhere Regressionsraten. Zu gleichen Ergebnissen gelangten sie durch
Fraktionierung der Virusmenge auf 10, dreimal wöchentlich gegebene Einzeldosen.

Diskussion 117
Die Autoren sehen diese Erfolge in der besseren initialen Verteilung des Virus im
Tumor begründet, welche sie, neben der Erhöhung der injizierten Virusmenge, als
einen wichtigen Anknüpfungspunkt zur Effizienzsteigerung intratumoral gegebener
onkolytischer Viren bewerten. Im Rahmen dieser Studie wurden vergleichbare
Beobachtungen gemacht. Zwar vergrößerten sich die Tumorvolumina der mehrfach
mit dem CDV injizierten, wie auch die Tumorvolumina der Plazebo-injizierten und die
der nicht-injizierten Kontrolltumoren über die gesamte Untersuchungsdauer von 42
Tagen nach der ersten Applikation signifikant. Verglichen mit den Plazebo 1- und
Plazebo 2-injizierten Tumoren blieben die Volumina der CDV-injizierten Tumoren
jedoch über längere Zeit signifikant kleiner. An Tag 70 bestanden, trotz höherem
mittleren Tumorvolumen der Plazebo 2 (Zellkulturmedium)-injizierten Tumoren,
signifikante Unterschiede jedoch nur zu den Plazebo 1 (UV-inaktiviertes Virus)-
injizierten Tumoren. Dies liegt höchstwahrscheinlich darin begründet, dass es in der
erstgenannten Gruppe ein Tier gab, welches nach der 4. intratumoralen Injektion
eine komplette Tumorregression aufwies und statistisch als negativer Ausreißer in
die Auswertung einging. Gleichzeitig kam es bei den CDV-injizierten Tumoren zu
einer leichten Volumenzunahme. Interessanterweise blieben jedoch auch die nichtinjizierten
Kontrolltumoren im Vergleich zu den Plazebo-injizierten Tumoren deutlich
und teilweise signifikant in ihrer Volumenprogression zurück. Diese Ergebnisse
unterstreichen die Rolle des intratumoralen Vorliegens von CDV als Ursache der
Volumenstagnation insofern, als dass damit eventuelle mechanischinjektionsbedingte
zelluläre Schädigungen als Grund einer Volumenstagnation
ausgeschlossen werden können. Ferner lag das injizierte CDV in Lösung in dem,
auch für Plazebo 2 verwendeten, Zellkulturmedium vor. Ginge man also von einem
„Fütterungseffekt“ für die Tumoren der Plazebo 2-Gruppe durch das injizierte
Zellkulturmedium aus, müsste das im gleichen Zellkulturmedium vorliegende CDV
diesen Effekt im Rahmen seiner zytolytischen Aktivität auf die Tumorzellen
ausgeglichen haben. Bei den CDV-injizierten Tumoren kam es also zu einer, bis zum
65. Tag nach Transplantation, recht lang anhaltenden, jedoch vorübergehenden
Stagnation des mittleren Tumorvolumens.

118
Diskussion
Vergleicht man diese Ergebnisse mit den Erkenntnissen der Studie von Grote et al.
(2001), ergeben sich deutliche Parallelen. Die Autoren injizierten Masernvirus in
subkutane Xenotransplantate zweier humaner Lymphomzelllinien. Während die
Tumorvolumina der mit infektiösem Virus injizierten Transplantate im gesamten
Verlauf der Untersuchung konstant klein blieben, zeigten die mit UV-inaktiviertem
Virus injizierten Tumoren eine stetige Volumenprogression. Anders als in der
vorliegenden Studie wiesen die nicht-injizierten Kontrolltumoren jedoch ebenso eine
Tumorvolumenprogression auf, die derjenigen, der mit UV-inaktiviertem Virus
injizierten, Tumoren vergleichbar war. Ferner wurden in 4 Fällen beträchtliche
Regressionen bis hin zur Nichtnachweisbarkeit der mit aktivem Virus injizierten
Tumoren beobachtet.
Der maximale Therapieerfolg einer vollständigen Tumorregression konnte im
Rahmen dieser Studie nicht erreicht werden. Allerdings macht die transiente
Volumenstagnation Hoffnung, dass diese durch Optimierung des Versuchsansatzes
gelingen könnte. Mögliche Optimierungsansätze können sich unter anderem in einer
Veränderung des Virus (z.B. durch Transgenexpression zur Erhöhung der
Infektiosität, Tumorzellselektivität und –spezifität) und / oder der Applikationsstrategie
ergeben. Nakamura et al. (2005) entwickelten ein Transgen-exprimierendes
Masernvirus, welches durch Expression von Antikörpern gegen tumorspezifisches
CD38 bzw. epidermal growth factor receptor eine selektive Rezeptor-vermittelte
Antitumoraktivität aufwies. Currier et al. (2005) beschreiben, über die Fraktionierung
der Gesamtvirusdosis in Mehrfachinjektionen hinaus, die Möglichkeit deren
fraktionierter Applikation in verschiedene Lokalisationen innerhalb des Tumors.
Zudem könnte die Erhöhung der injizierten Virusmenge oder die Vorbehandlung der
Tumoren (z.B. mit matrixdegradierenden Enzymen) mit dem Ziel der Erleichterung
der Virusausbreitung im Tumor Erfolg versprechend sein (McKee et al., 2006;
Schäfer et al., 2012). Weiterhin könnte der Schlüssel zum Therapieerfolg in der
Balance zwischen Ausnutzung bzw. Steigerung der wirtseigenen, antitumoralen und
antiviralen Immunantwort liegen (Melcher et al., 2011). Aus diesem Grund werden an
den Proben der intratumoral injizierten Tumoren in Zukunft die gleichen und
weiterführende histologische und immunhistologische Untersuchungen wie für die, im

Diskussion 119
folgenden Abschnitt diskutierten, persistierend infizierten Tumoren angestrengt
werden.
Die klinischen Befunde, die Volumina der injizierten Tumoren betreffend, ließen sich
bei der makroskopischen, postmortalen Begutachtung der Tumoren reproduzieren.
Die CDV-injizierten Transplantate waren deutlich kleiner. Die injizierten Tumoren
zeigten häufig intratumorale Blutungen und Spaltbildungen, was
höchstwahrscheinlich auf die wiederholte, mechanische Traumatisierung im Zuge der
Injektionen zurückzuführen ist. Unterschiede zwischen den weiteren während der
Sektion protokollierten Eigenschaften, wie z.B. Konsistenz und Farbe, bestanden
jedoch nicht.
5.2. DH82CDVpi-Transplantate
5.2.1. Volumenentwicklung und makroskopische Tumormorphologie
Im Rahmen dieses Versuches wurde, in methodisch zu den nicht-infizierten
Transplantaten analoger Vorgehensweise, zunächst die klinische Entwicklung der
Volumina der Tumoren, die aus den persistierend mit dem CDV infizierten DH82-
Zellen hervorgegangen waren (DH82CDVpi-Tumoren), protokolliert und bewertet.
Hierbei ergab sich, dass diese Tumoren während der ersten 10 bis 14 Tage nach der
Transplantation der Zellen stetig vorhanden und keinen wesentlichen
Volumenschwankungen unterworfen waren. Die nicht-infizierten Kontrolltransplantate
hingegen wiesen sehr stark schwankende Volumenentwicklungen auf. Ab circa dem
14. Tag nach der Transplantation zeigten die DH82CDVpi-Tumoren eine stetige
Regression bis hin zur letzten Nachweisbarkeit zweier Tumoren am 35. Tag nach der
Transplantation. Interessanterweise fiel dieser Zeitpunkt auf den gleichen Tag wie
das Erreichen des mittleren Tumorvolumens (0,06 cm³) für die erste intratumorale
Injektion für die im vorherigen Abschnitt diskutieren Tumoren. Die nicht-infizierten
Kontrolltumoren wiesen, wie auch schon in dem im vorherigen Abschnitt diskutierten
Versuchsansatz, eine kontinuierliche Volumenprogression auf. Ähnliche
Beobachtungen wurden im Rahmen von Transplantationsexperimenten mit
persistierend virusinfizierten Tumorzellen von Reid et al. (1979), Minato et al. (1979),
Schattner et al. (1985), Vandepol und Holland (1986) sowie Alain et al. (2006)

120
Diskussion
gemacht. Interessanterweise beobachteten Schattner et al. (1985) im Gegensatz zu
dieser Studie keine initiale Tumorpräsenz mit nachfolgender Regression sondern ein
Wachstum kleiner Tumoren nach einer tumorfreien Latenzzeit von 35 Tagen. Die
Autoren Schattner et al. (1985) und Alain et al. (2006) stellen vergleichende
Untersuchungen zur in vitro-Verdopplungszeit der persistierend infizierten Zellen zu
ihren nicht-infizierten Ausgangszellen an. Hierbei fanden sich keine verminderten
bzw. geringgradig verminderte Proliferationsgeschwindigkeiten. Vergleichbare
Ergebnisse beschreibt Sayed-Ahmed (2011) im Vergleich der DH82CDVpi- zu den
DH82-Zellen. Es wurden weder im Rahmen der Untersuchung zur Zellverdopplung
noch in Untersuchungen zur BrdU-Inkorporation durch die Zellen signifikante
Unterschiede des in vitro-Proliferationsverhaltens festgestellt. Daraus lässt sich im
Zusammenhang mit den klinischen Ergebnissen dieser vorliegenden Studie
schließen, dass die Hemmung der Proliferation der Zellen bzw. deren kompletter
Schwund in vivo andere Gründe als die durch eine Virusinfektion herabgesetzte
Zellvitalität haben muss.
Auch in dieser Untersuchung waren die klinischen Befunde bei der
makroskopischen, postmortalen Begutachtung der Tumoren reproduzierbar. Die
DH82CDVpi-Tumoren ähnelten den DH82-Tumoren in Größe und Farbe an den PZP
1pi und 2pi (7 und 14 Tage nach Transplantation). Häufig waren sie jedoch besser
zum umliegenden Gewebe abgrenzbar. Deutlich wurden Veränderungen am PZP 3pi
und 4pi (21 und 35 Tage nach Transplantation). Während die DH82CDVpi-Tumoren
klein und gut abgegrenzt blieben, erstreckten sich die DH82-Tumoren zunehmend
flächig in das umliegende Gewebe und nahmen stark an Größe zu. Vergleichbare
Befunde erhoben Reid et al. (1979) in Transplantationsexperimenten mit dem VSV
persistierend infizierten baby hamster kindney (BHK) 21-Zellen und HeLa-Zellen.
Sofern nachweisbar, bildeten die Zellen derbe, kleine, „benigne“ Knötchen während
nicht-infizierte Kontrollzellen eine Progression hin zu großen Tumoren aufwiesen.
In den sich anschließenden histologischen und immunhistologischen Beurteilungen
der DH82CDVpi- im Vergleich zu den nicht-infizierten DH82-Tumoren wurde daher
angestrebt den markanten klinischen Befunden auf den Grund zu gehen und
Rückschlüsse auf den Mechanismus der Regression zu ziehen.

Diskussion 121
5.2.2. Histologische und immunhistologische Tumormorphologie
5.2.2.1. Nachweis von Staupevirusantigen
Der immunhistologische Nachweis von CDV-Nukleoprotein verlief in allen
DH82CDVpi-Transplantaten positiv. Zudem wiesen nahezu 100% der Zellen in den
Tumoren eine positive Markierung auf. Zu vergleichbaren in vitro Ergebnissen kamen
Puff et al. (2009) und Sayed-Ahmed (2011). Die Autoren wiesen
immunfluoreszenzmikroskopisch mit Antikörpern gegen CDV-Nukleoprotein ein
positives Signal in 85-95% bzw. 93-100% der kultivierten DH82CDVpi-Zellen nach.
Ferner bestätigten Reid et al. (1979) und Minato et al. (1979) sowie Alain et al.
(2006) in vivo erhaltene Infektionen der transplantierten, mit unterschiedlichen Viren
persistierend infizierten Zellen.
5.2.2.2. Tumormorphologie
Sayed-Ahmed (2011) beschrieb ein vergleichbares Proliferationsverhalten der
DH82CDVpi- und DH82-Zellen sowie deren vergleichbare Morphologie in vitro. Diese
Befunde konnten in vivo nachvollzogen werden. So stellten sich die intakten
Tumorzellen in Hämatoxylin-Eosin (HE)-übersichtsgefärbten Schnitten an den ersten
beiden PZPpi in Bezug auf morphologische Eigenschaften wie z.B. Größe, Form,
Anisozytose-, Anisokaryose- sowie Mitoserate ähnlich dar. Deutliche Unterschiede
ergaben sich jedoch ab Beginn der Untersuchung in der Reaktion des Wirtsgewebes
auf die persistierend infizierten und nicht-infizierten Tumoren. Während die
DH82CDVpi-Tumoren ohne nennenswerten bindegewebigen, gefäßführenden
Grundstock blieben, zeigten die DH82-Tumoren deutliche Ausbildungen von
Tumorstromata, von welchen aus die Vaskularisation erfolgte. Diese Feststellung
findet sich auch in der Studie von Reid et al. (1979) wieder. Die Autoren beschrieben
die, aus den persistierend infizierten Zellen hervorgegangenen „Knötchen“ als
vergleichsweise schlecht vaskularisiert. Ein weiterer gravierender Unterschied ergab
sich in der vorliegenden Studie in der Induktion einer Entzündungszellinfiltration.
Während sich die DH82CDVpi-Tumoren von Beginn der Untersuchungen an stark
mit Entzündungszellen durchsetzt darstellten, wirkten die DH82-Tumoren, trotz
teilweise starker Infiltration der Tumorzellen in die umliegenden Wirtsgewebe, in den

122
Diskussion
übersichtsgefärbten Schnitten nahezu inert. Einen ähnlichen Befund erhoben Minato
et al. (1979). Sie zeigten eine markante mononukleäre Zellinfiltration in der
Peripherie transplantierter, mit dem VSV persistierend infizierter BHK 21-Zellen.
Analog den Beobachtungen in persistierend mit dem Reovirus infizierten
Lymphomtransplantaten (Alain et al., 2006), war in der vorliegenden Studie ferner
das frühe Vorliegen großflächiger Nekroseareale und degenerierender Zellen in den
DH82CDVpi-Tumoren auffällig. Gleichartige Veränderungen fehlten bei den DH82-
Tumoren nahezu vollständig. Erst am PZP 5pi (77 Tage nach Transplantation)
konnten auch in den DH82-Tumoren, vermutlich hypoxisch, durch das rapide
Tumorwachstum bedingte Nekroseherde nachgewiesen werden.
Aus der Tatsache heraus, dass der verwendete Antikörper gegen CD44 spezifisch
gegen das von DH82-Zellen exprimierte CD44 entwickelt wurde (Alldinger et al.,
1999), fand der Antikörper im Zuge der vorliegenden Studie Anwendung zur
Abgrenzung und damit besseren Darstellung der transplantierten Zellen in der
Unterhaut des tumortragenden, nicht mit diesem Antikörper anfärbbaren
Mausgewebes. Unabhängig von diesem praktisch orientierten Umstand ergaben sich
jedoch im Färbeverhalten der persistierend infizierten und nicht-infizierten Tumoren
interessante Erkenntnisse. Die Tumorzellen beider zeigten während der ersten 3
PZPpi keine Unterschiede im Expressionsverhalten von CD44. Stets waren 100%
der intakten Tumorzellen mit dem Antikörper anfärbbar. Dieser Befund setzte sich
auch in den Residuen der DH82CDVpi-Tumoren am PZP 4pi fort. Zum gleichen
Zeitpunkt und am PZP 5pi wurde jedoch in den DH82-Tumoren eine nachlassende
Anfärbbarkeit der, im Wesentlichen, tumorzentral gelegenen Zellen beobachtet.
CD44 vermittelt die Bindung der Zelle an Hyaluronsäure, einem bedeutendem
Glykosaminoglykan der extrazellulären Matrix (EZM; Borland et al., 1998). Obwohl
unbestritten, dass CD44 ein wichtiger Mediator von Tumorzell-EZM-Interaktionen,
Tumorzellproliferation und -migration ist, bestehen in der Einschätzung seiner
Bedeutung zur Dignitätsbeurteilung eines Tumors wesentliche Kontroversen (Paltian
et al., 2009). Während aus einer Studie von Kaufmann et al. (1995) hervorgeht, dass
eine hohe Expression von CD44-Epitopen auf humanen Primärtumoren des
Mammadrüsengewebes sowie deren Lymphknotenmetastasen mit einer niedrigen

Diskussion 123
Überlebensrate korreliert ist, zeigten Herrlich et al. (2000) einen möglichen
Mechanismus einer Tumorsuppessoraktivität dieses Moleküls. Sie argumentierten
weiterhin, dass seine jeweilige Aktivität von der Art des vorwiegend exprimierten
Epitops sowie der Beschaffenheit der EZM abhängig ist. Aus den
immunhistologischen Befunden der vorliegenden Studie lässt sich ableiten, dass die
transplantierten DH82CDVpi- als auch DH82-Zellen zu Beginn der Untersuchungen
gleiche Voraussetzungen der CD44-vermittelten EZM-Interaktion der Zellen
mitbrachten. Inwiefern die Interaktion von kaninem CD44 mit muriner EZM möglich
ist, bleibt jedoch spekulativ. Die nachlassende Expression der tumorzentral
gelegenen Zellen in den DH82-Tumoren an den PZP 4pi und 5pi könnte durch eine
sterisch bedingte Hinderung des Tumorzell-EZM-Kontaktes bedingt sein oder auf
eine verstärkte Proliferations- und Migrationsaktivität der peripher gelegenen Zellen
hinweisen. Vergleichbare Ergebnisse fanden sich bei Serra et al. (2004). In einer
Studie mit kaninen Melanomen wiesen die Autoren eine tendenziell stärkere CD44-
Expression in peripher gelegenen Zellen maligner Melanome nach, während sich in
der Lokalisation der CD44-Expression in den benignen Varianten keine Unterschiede
ergaben.
Die Ursache der festgestellten fehlenden MHC II-Expression durch die
transplantierten DH82CDVpi-Zellen sowie der sehr geringen, mit der gemessenen
Tumorfläche jedoch zunehmenden MHC II-Expression der Zellen der DH82-
Transplantate bleibt unklar und spekulativ. Die Makrophagen- / Monozyten-Zelllinie
DH82 entstammt ursprünglich einem histiozytären Sarkom eines Hundes (Wellmann
et al., 1988). Damit sind die Zellen Verwandte antigenpräsentierender Zellen. Im
Rahmen eines erhaltenen typischen Phänotyps wäre daher eine MHC II-Expression
zu erwarten (Tizard und Schubot, 2008). Wasserman et al. (2012) stellten eine MHC
II-Expression auf 13,5% der, mittels Durchflusszytometrie untersuchten, DH82-Zellen
fest. Zu unterschiedlichen Ergebnissen kommen Harrus et al. (2003). Sie
beobachteten, ebenfalls durchflusszytometrisch, eine MHC II-Expression auf 46,9 %
der DH82-Zellen. Interessanterweise stellen sie jedoch auch einen vollständigen
Verlust der Expression auf Ehrlichia canis-infizierten DH82-Zellen fest und
postulieren darin eine Strategie der Immunevasion dieses Organismus.

124
Diskussion
Möglicherweise stellt, die in der vorliegenden Studie beobachtete, reduzierte MHC II-
Expression eine Strategie der Immunevasion der Tumorzellen bzw. virusinfizierten
Tumorzellen dar. Alternativ könnte die MHC II-Expression im Zuge des Übergangs
der Zellen in eine immortalisierte, permanente Zelllinie reduziert worden sein.
Im Folgenden werden die mittels morphometrischer und quantitativer Auswertung
gewonnen Ergebnisse diskutiert. Hierbei sollte beachtet werden, dass der
statistische Vergleich der Ergebnisse der DH82CDVpi-Tumoren zu denen der DH82-
Tumoren am PZP4pi und 5pi nicht möglich war. Am PZP4pi wurden nur noch 2
DH82CDVpi-Tumoren nachgewiesen. Am PZP 5pi war kein DH82CDVpi-Tumor
mehr vorhanden. An beiden Zeitpunkten erfolgte hingegen die Auswertung von
jeweils 5 DH82-Tumoren
Um die an HE-gefärbten Schnitten beobachteten Diskrepanzen bezüglich der
Ausdehnung der Nekroseflächen zu objektivieren, wurden diese bei den
persistierend infizierten und nicht-infizierten Tumoren morphometrisch ermittelt und
als prozentualer Anteil der, ebenfalls morphometrisch bestimmten, Tumorfläche
ausgedrückt. Im Zuge dieser Untersuchungen konnte der bei der deskriptiven
Beurteilung der Schnitte gewonnene Eindruck bestätigt werden. Trotz vergleichbarer
Tumorflächen an den PZP 1pi und 2pi wiesen die DH82CDVpi-Tumoren signifikant
größere Nekroseflächen auf. Auch am PZP 3pi setzte sich die Beobachtung in dieser
Weise fort. Hier hatten jedoch die Flächen der DH82-Tumoren im Vergleich zu den
DH82CDVpi-Tumoren auch schon signifikant an Größe zugenommen. Obwohl nicht
signifikant, zeichnete sich bei den DH82-Tumoren ein leichter Rückgang der
mittleren anteiligen Nekrosefläche vom PZP 1pi bis zum PZP 3pi ab. Dies lässt sich
gegebenenfalls mit dem initialen Zugrundegehen einiger transplantierter Zellen vor
der Herstellung des Tumorzell-EZM-Kontaktes und Etablierung einer vollständigen
Blutgefäßversorgung des Tumors erklären. Möglicherweise ist dieser Umstand auch
Ursache der an den ersten 3 PZPpi bzw. bis circa zum 24. Tag nach Transplantation
klinisch beobachteten Stagnation der Tumorflächen- bzw. –volumenprogression. Die
deutliche Zunahme der Nekroseflächen der DH82-Tumoren am PZP 5pi ist, wie
schon oben erwähnt, wahrscheinlich bedingt durch das immense Tumorwachstum,
welches sich in einer signifikanten Tumorflächenzunahme in Vergleich zu den

Diskussion 125
früheren PZPpi widerspiegelt. Eine detaillierte Analyse der Fläche nekrotischer
Areale in Transplantaten persistierend virusinfizierter Tumorzellen fehlt in der
Literatur. Allerdings ergab sich in einer ähnlichen Studie von Naik et al. (2012) im
Rahmen einer semiquantitativen Analyse der Nekroseflächen subkutaner muriner
Myelomtransplantate ein maßgeblich erhöhter Anteil nekrotischer Areale in
virusbehandelten Tumoren als in den Tumoren, deren Wirte eine PBS-Applikation
erhielten. Die Therapiestrategie in jener Studie beinhaltete eine systemische,
einmalige Applikation eines INF-β-exprimierenden VSV.
Zur Beurteilung der degenerativen Veränderungen in den Tumoren wurde neben der
Quantifizierung der Nekrosefläche auch das Vorliegen apoptotischer Zellen beurteilt.
Hierfür wurden Tumorschnitte mit einem Antikörper gegen aktivierte Caspase 3
markiert. Die Aktivierung von Caspase 3 stellt, neben der Aktivierung von Caspase 6
und 7, den entscheidenden Schritt der Effektorphase der Apoptosekaskase dar
(Huppertz et al., 1999). Ihr Nachweis eignet sich, neben der TUNEL-Methode zur
Darstellung der, durch die aktivierte Caspase 3 hervorgerufenen, DNS-
Fragmentierungen, daher ideal zum Nachweis apoptotischer Zellen (Huppertz et al.,
1999). Apoptotische Zellen waren in den DH82CDVpi-Tumoren prominenter
vorhanden, obwohl sie sich im Vergleich zu den DH82-Tumoren signifikant vermehrt
nur am PZP 2pi darstellten. Eine detaillierte Analyse der aktivierten Caspase 3-
Expression in Transplantaten persistierend virusinfizierter Tumorzellen fehlt in der
Literatur. Jedoch wiesen Boisgerault et al. (2013) eine, mit der
Tumorgrößenstagnation korrelierte, starke Caspase 3-Expression bei den
virusinfizierten Tumoren auf. Die Studie beinhaltete die Untersuchung der
onkolytischen Aktivität des Maservirus auf Xenotransplantate einer humanen
kolorektalen Adenokarzinomzelllinie. Im Verlauf der vorliegenden Untersuchung ließ
sich jedoch eine Tendenz abnehmender aktivierter Caspase 3-Aktivität in den
DH82CDVpi-Tumoren feststellen. Bei den DH82-Tumoren war ihr Rückgang
signifikant, jedoch kam es am PZP 4pi und 5pi wieder zu einer Steigerung der
aktivierten Caspase 3-Aktivität. In den DH82-Tumoren korrelierte die Größe der
Nekroseareale mit der aktivierten Caspase 3-Aktivität. Beide Parameter zeigen mit

126
Diskussion
dem anfänglichen Rückgang und späteren Zunahme einen ähnlichen Verlauf.
Vermutlich ist das Vorliegen aktivierter Caspase 3-positiver Zellen in den DH82-
Tumoren zu Anfang und zum Ende daher ähnlicher Genese wie die Zunahme der
Nekrosefläche, also Ausdruck noch bzw. wieder (in Folge raschen Tumorwachstums)
insuffizienter vaskulärer Versorgung einiger Tumorareale. Zu vergleichbaren
Ergebnissen kommen auch Boisgerault et al. (2013). Die Autoren beobachteten eine
tumorzentrale Caspase 3-Expression in, mit PBS injizierten, Kontrolltransplantaten.
Sie diskutieren als Grund für eine erhöhte tumorzentrale Apoptoseaktivität ebenfalls
einen Nähr- und Sauerstoffmangel. Zwischen aktivierter Caspase 3-Aktivität und
Größe der Nekrosefläche in den DH82CDVpi-Tumoren fehlte eine Korrelation.
Möglicherweise liegt das in der Tatsache begründet, dass Nekroseareale eine
geringe Zellularität aufweisen. Aktivierte Caspase 3 wird jedoch, zwar in
degenerierenden, jedoch noch intakten Zellen nachgewiesen.
5.2.2.3. Tumormikromilieu
Zieht man die beschriebenen morphologischen Ähnlichkeiten der persistierend
infizierten und nicht-infizierten Zellen in Betracht, sind die frühzeitig im Verlauf der
Untersuchung auffällig vermehrten und ausgedehnten Nekroseareale der
DH82CDVpi-Tumoren also höchstwahrscheinlich Tumormikromilieu-bedingt. Daher
werden im Folgenden Wechselwirkungen zwischen virusinfizierten Tumorzellen bzw.
nicht-infizierten Tumorzellen und dem, durch den Wirtsorganismus gestellten,
Tumormikromilieu diskutiert. Hierbei sollen die Tumorvaskularisation, die
differenzierten Entzündungszellinfiltrationen und mögliche bedeutsame lösliche
Faktoren des Tumormikromilieus (Zytokine) im Mittelpunkt der Erörterung stehen.
Um die im Zuge der deskriptiven histologischen Beurteilung der Tumoren
festgestellte schlechtere Vaskularisation der DH82CDVpi-Tumoren zu objektivieren,
wurden Schnitte der persistierend infizierten und nicht-infizierten Tumoren mit einem
Antikörper gegen CD31 markiert. CD31 / PECAM (platelet endothelial cell adhesion
molecule) wird auf der Oberfläche von Endothelzellen, vornehmlich im Bereich der
tight junctions, sowie diffus auf Leukozyten exprimiert (Muller et al., 2003). Es dient
dem Transmigrationsprozess dieser während der Migration aus der Blutbahn in die

Diskussion 127
Gewebe (Muller et al., 1993; Rijcken et al., 2007). Mit dem Ziel möglichst spezifisch
auch kleinste Blutgefäßstrukturen darzustellen, repräsentiert CD31 somit ein ideales
immunhistochemisch zu markierendes Antigen. Die DH82-Tumoren wiesen an den
ersten 3 PZPpi signifikant und deutlich mehr CD31-markierte Gefäße auf. Breitbach
et al. (2007 und 2011) beschreiben in ihren Transplantationsstudien mit
Kolonkarzinomzelllinien vergleichbare Resultate. Nach systemischer Gabe eines
VSV und eines Vacciniavirus beobachteten die Autoren einen Verlust der
intratumoralen Durchblutung, welche mit einer massiven Apoptoseinduktion
einherging. Einen weiteren Hinweis auf den Mechanismus der Tumorgefäßdepletion
findet sich bei Brunner et al. (2012). Die Autoren beobachteten nach einer CDV-
Infektion von Verozellen eine Externalisierung des N-terminalen
Calretikulinfragments Vasostatin aus den endoplasmatischen Retikula an die
Zellmembran. Vasostatin wurde von Pike et al. (1998 und 1999) als potenter
Angiogeneseinhibitor identifiziert.
Solide Tumoren können ohne eine eigene Blutgefäßversorgung zur Versorgung mit
Sauerstoff und Nährstoffen sowie dem Abtransport von Abfallprodukten nicht größer
werden als 1 bis 2 mm im Durchmesser (Kumar et al., 2010). Zum Zweck weiteren
Tumorwachstums ist entweder das Einsprossen von Gefäßen aus der Umgebung
(Neoangiogenese) oder die Rekrutierung von Endothelvorläuferzellen aus dem
Knochenmark und der dadurch bedingten de novo Entstehung von Tumorgefäßen
(Vaskulogenese) nötig (Kumar et al., 2010; Weis und Cheresh, 2011).
Möglicherweise liegt daher ein Teil des Mechanismus der Regression bzw. der
frühen Entstehung der Nekroseareale in den DH82CDVpi-Tumoren in einer
unterdrückten Angio- / Vaskulogenese begründet.
In der vorliegenden Studie waren in den DH82-Tumoren an den ersten 3 PZPpi
signifikant mehr Gefäße als zu den späteren PZPpi nachweisbar. Wahrscheinlich
liegt der Grund hierfür wiederum im immensen Wachstum der DH82-Tumoren
begründet, welches die Effizienz der intratumoralen Angio- / Vaskulogenese
überschritt. Bestätigt wird diese Vermutung in der negativen Korrelation der Dichte
CD31-markierter Strukturen mit der Tumorfläche. Die Unterschiede der Gefäßdichten
der DH82CDVpi-Tumoren erwiesen sich zwischen den einzelnen PZPpi als nicht

128
Diskussion
signifikant. Am PZP 3pi wurde jedoch eine Zunahme der Gefäßdichte festgestellt.
Möglicherweise spiegelt sie den beginnenden Organisationsprozess der immer
stärker an Zellularität abnehmenden DH82CDVpi-Tumoren wider. Vergleichbar den
DH82-Tumoren konnte auch hier keine Korrelation zwischen der Dichte CD31-
markierter Gefäße und der Größe der Nekrosefläche festgestellt werden. Diese
Feststellung gibt Anlass zu der Vermutung, dass nicht allein die unzureichende
Gefäßdichte für das Auftreten der, in den DH82CDVpi-Tumoren ausgedehnten,
Nekroseareale verantwortlich sein kann. Daher wurde in einem nächsten Schritt
angestrebt den weiteren augenscheinlichen Unterschied in der Reaktion des
Tumormikromilieus zwischen den persistierend infizierten und nicht-infizierten
Tumoren, die Entzündungszellinfiltration, zu charakterisieren und zu quantifizieren.
Murine Makrophagen wurden immunhistochemisch mit einem Antikörper gegen Mac
3 dargestellt. Das mit dem Antikörper markierte transmembranöse Glykoprotein
(auch bekannt als CD107b oder LAMP 2; lysosome-associated membrane protein 2)
ist in lysosomalen Membranen phagozytierender Zellen lokalisiert (Eskelinen et al.,
2005) und wurde in der Vergangenheit zur immunhistochemischen Markierung
muriner Makrophagen verwendet (Klein, 2010).
Weiterhin wurden Tumorschnitte mit einem Antikörper gegen CD3 markiert. CD3
besitzt als Teil des T-Zell-Rezeptors die Aufgabe der Signaltransduktion nach
Antigenbindung und ist damit auf allen T-Zellen vorhanden (Tizard und Schubot,
2008). Ferner lässt sich CD3 auf NKT-Zellen (Singh et al., 2013) nachweisen.
Schließlich erfolgte die Markierung von Tumorschnitten mit Antikörpern gegen
CD45R. CD45R (auch bekannt als B220) wird im Wesentlichen auf der Zellmembran
von B-Zellen aller Entwicklungsstadien exprimiert (Hathcock et al., 1992). Ballas et
al. (1993) wiesen CD45R zudem auf Lymphokin-aktivierten reifen NK-Zellen nach.
Guimont-Desrochers et al. (2012) diskutierten jedoch, dass es sich bei CD45Rpositiven
bzw. B220-positiven NK-Zellen nicht um reife NK-Zellen handelt, die erst
nach Aktivierung CD45R exprimieren, sondern, dass diese Zellen vielmehr
Vorläuferzellen einer separaten, stark INF-γ-produzierenden und tumorizid
wirksamen so genannten Interferon-produzierenden Killer-dendritischen Zelllinie
darstellen.

Diskussion 129
In der Studie von Klein (2010) wurden die Antikörper gegen CD3 und CD45R als
Marker für murine T- und B-Zellen verwendet.
Im Rahmen der Auswertung der Entzündungsparameter ergab sich, dass die
stärkste Reaktion die intratumorale Infiltration der DH82CDVpi-Tumoren mit
Makrophagen darstellte. Der Unterschied zur Ausprägung der intratumoralen
Infiltration der DH82-Tumoren war an PZP 2pi und 3pi signifikant. Mit Ausnahme des
PZP 1pi spielte die Makrophageninfiltration der DH82-Tumoren im intra- wie auch im
peritumoralen Kompartiment nur eine sehr untergeordnete Rolle. Die Infiltration mit
CD3-positiven Zellen war im Reaktionsgeschehen insgesamt weniger bedeutsam.
Interessant ist jedoch, dass trotz im Allgemeinen sehr viel weniger ausgeprägter
Entzündungszellinfiltration der DH82-Tumoren, das im Wesentlichen intratumorale
Vorliegen CD3-positiver Zellen mit dem der DH82CDVpi-Tumoren vergleichbar, bzw.
an den ersten beiden PZPpi sogar leicht erhöht war. Die Infiltration mit CD3-positiven
Zellen der DH82CDVpi-Tumoren stieg im Verlauf der Untersuchung, während die
Makrophageninfiltration, auf hohem Niveau, weitgehend unverändert blieb. Die
Infiltration mit CD45R-positiven Zellen spielte wiederum bei den DH82CDVpi-
Tumoren eine größere Rolle als bei den nicht-infizierten Kontrolltumoren. Die
Unterschiede waren in beiden Kompartimenten an den ersten 3 PZPpi signifikant.
Insgesamt kam der Infiltration mit CD45R-positiven Zellen jedoch die geringste
Bedeutung zu. Gravierende Unterschiede zwischen den beiden untersuchten
Kompartimenten ergaben sich nur bei der Infiltration mit CD3 positiven Zellen in den
DH82-Tumoren, die zu allen PZPpi im intratumoralen Segment signifikant vermehrt
vorlagen. Die Ergebnisse der Korrelationsanalysen können einen Hinweis auf die
Entstehung der ausgedehnten Nekroseareale im Zusammenhang mit der
Entzündungszellinfiltration geben, denn es ergab sich eine möglicherweise
pathogenetisch relevante Korrelation der Makrophageninfiltration bei den
DH82CDVpi-Tumoren mit der Größe der Nekrosefläche.
Nach der Feststellung, dass es in der Regel zu Abstoßung oder Regression der
Transplantate, nach Implantation persistierend infizierter Zellen, kommt, wurden
entsprechende Transplantationsstudien im Wesentlichen für die Beurteilung
ursächlicher immunvermittelter Mechanismen genutzt. Reid et al. (1979) schlossen

130
Diskussion
aus den Ergebnissen vergleichender Transplantationen persistierend mit dem VSV
infizierter Zellen in bestrahlte sowie nicht-bestrahlte Nacktmäuse, dass die
Transplantatregression nicht primär durch virusbedingte Tumorzellschädigung,
sondern durch die noch intakte angeborene Immunantwort der Nacktmäuse
vermittelt wird. Die bestrahlten Tiere waren nicht in der Lage die persistierend
infizierten Transplantate abzustoßen. Somit sind die aus den bisherigen Ergebnissen
der vorliegenden Studie gezogenen Rückschlüsse, dass die Nekrosen eine Folge der
vermehrten Entzündungszellinfiltration sind, den Ergebnissen von Reid et al. (1979)
vergleichbar. In weiterführenden Untersuchungen stellten Minato et al. (1979) und
Schattner et al. (1985) sowie Vandepol und Holland (1986) NK-Zellen als die von
Reid et al. (1979) vermutete, zur Tumorregression im Wesentlichen beitragende,
zelluläre Komponente heraus. Die immunhistologische Darstellung der murinen NK-
Zellen wurde daher im Rahmen der vorliegenden Studie angestrebt, gelang jedoch
nicht in zufrieden stellendem Maße. Scid-Mäuse weisen eine nahezu vollständige
Abwesenheit funktioneller B- und T-Lymphozyten auf (Schuler et al., 1986).
Myeloische Zellen sowie NK-Zellen werden in normaler Anzahl und Funktion
angetroffen (Dorshkind et al., 1984). Custer et al. (1985) wiesen mittels
Durchflusszytometrie T-Lymphozyten in Thymus und Milz nach, deren Funktionalität
die Autoren auf Grund der Morphologie der Zellen jedoch in Frage stellen. Ferner
beobachteten sie keine B-Zellen. Schuler et al. (1986) und Bosma et al. (1988)
beschreiben klonale Expansionen und damit die Ausbildung funktioneller T-Zellen in
Folge zufälliger produktiver Rekombinationen. Ferner zeigten in einer detaillierten
Studie von Bosma et al. (1988) 2-23% der untersuchten Tiere den so genannten
leaky–Phänotyp. Zieht man das Gesagte gesamthaft in Betracht, bleibt unklar, um
welchen Zelltyp es sich bei den, mit den Antiköpern gegen CD3 und CD45R
markierten Zellen handelt. Handelte es sich um NKT- / NK-Zellen, würden die
Aussagen der Autoren Minato et al. (1979), Schattner et al. (1985) und Vandepol und
Holland (1986) nur teilweise bestätigt, in dem die NK-Zellantwort hier zwar eine,
jedoch den Makrophagen untergeordnete, Rolle spielt. Die Möglichkeit, dass es sich
bei den markierten Zellen um funktionale T- / B-Zellen handelt, wird, im
Zusammenhang mit den Erkenntnissen von Dorshkind et al. (1984), Custer et al.

Diskussion 131
(1985), Schuler et al., (1986) und Bosma et al. (1988), als unwahrscheinlich
interpretiert. Eher bestünde die Möglichkeit, dass es bei den DH82CDVpi-Tumoren
und bei den DH82-Tumoren gleichermaßen zu einer recht ausgeglichenen Infiltration
mit CD3-positiven NKT-Zellen gekommen ist, was einer, im Rahmen einer zu
erwartenden, anti-tumoralen Immunantwort entspräche (Smyth et al., 2000).
Die DH82CDVpi-Tumoren wurden jedoch, angeregt durch einen unabhängigen
Stimulus, zusätzlich vermehrt mit Makrophagen infiltriert. Eine Vielzahl von Studien
assoziieren einen hohen Gehalt Tumor-assoziierter Makrophagen (TAMs) mit
Tumorprogression, Angiogenese und Metastasierung (Tong Ding et al.; 2008;
Fujiwara et al., 2011; Zhang et al.; 2011). Es gilt als gesichert, dass TAMs, nach ihrer
Rekrutierung zum Ort des neoplastischen Geschehens, angeregt und vermittelt
durch zahlreiche Zytokine, Transkriptionsfaktoren und Signalwege der Zellen des
Tumormikromilieus, ihren Phänotyp von der M1- zur M2-Polarisierung hin verändern
(Mantovani et al., 2002 und 2004; Allavena et al., 2008; Sica et al., 2008; Schmieder
et al., 2012). Allerdings werden Makrophagen angeregt durch IFN-γ, IL-12 und IL-18
zu M1-Makrophagen polarisiert (Dalton et al., 1993; Gordon, 2003; Martinez et al.,
2008). Diese vermitteln im Wesentlichen die Immunreaktionen gegen intrazelluläre
Pathogene und Tumoren, indem sie pro-inflammatorische und tumorizide Faktoren
wie z.B. TNF, IL-12, Stickstoffmonoxid (NO) bzw. induzierbare
Stickstoffmonoxidsynthase (iNOS) und reaktive Sauerstoffspezies ausschütten
(Schmid und Varner, 2010). Die Modulation der TAMs vom M2- in den M1-Phänotyp
führte in einer Studie von Hagemann et al. (2008) zur Regression fortgeschrittener
Tumorstadien im Mausmodell.
Während es bei einer natürlichen CDV-Infektion zu Apoptosen und Lysen der
infizierten Lymphozyten und einer, noch nach Beendigung der Virämie,
langanhaltenden Störung der Lymphozytenhomöostase kommt (Moro et al., 2003;
Schobesberger et al., 2005), bewirkt die Infektion von Makrophagen eher eine
Steigerung der zellulären Funktionen wie Phagozytose, Antigenpräsentation,
Kostimulation von NK-Zellen und Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies
(Brügger et al., 1992; Stein et al., 2008). In den Makrophagen- / Monozytenverwandten
DH82-Zellen kam es in einer Studie von Gröne et al. (2002) nach

132
Diskussion
Infektion mit dem CDV zu einer gesteigerten Ausschüttung pro-inflammatorischer
Zytokine (IL 1, IL 6, TNF). Daher liegt die Vermutung nahe, dass es angeregt durch
Ausschüttung dieser durch die transplantierten DH82CDVpi-Zellen zur Anlockung
muriner Makrophagen und Aktivierung von NK- / NKT-Zellen gekommen ist. Die
Präsenz von viralem und unter Umständen auch Tumorantigen könnte zusätzlich die
vermehrte Ausschüttung von INF-γ durch die Zellen des Tumormikromilieus bewirkt
haben, was wiederum zu einer Aktivitätssteigerung der NK- / NKT-Zellen und
Makrophagen zur Folge gehabt hätte. Interferone besitzen zudem einen per se antiproliferativen
Effekt (Johns et al., 1992; Qin et al., 1997). Ferner besteht eine enge
Verbindung zwischen INF-γ und der Angiogenesehemmung. Yao et al. (1999)
beschrieben eine Tumor-assoziierte, IL-12-vermittelte IFN-γ-Ausschüttung durch
residente NK-Zellen, die zur Produktion von Interferon-induzierbarem Protein-10 (IP-
10) führte. IP-10 bewirkte eine ausgesprochene zytolytische Aktivität von NK-Zellen
auf benachbarte Endothelzellen und damit eine herabgesetzte Vaskularisation von
Tumoren. Ferner wurde von Pike et al. (1998 und 1999) Vasostatin, das N-terminale
Spaltprodukt des Hitzeschockproteins Calretikulin, als potenter Angiogeneseinhibitor
identifiziert. Brunner et al. (2012) beschreiben die Abspaltung des Calretikulin-N-
Terminus und dessen Externalisierung als Vasostatin nach einer
Staupevirusinfektion von Verozellen. Diese Erkenntnisse könnten eine Erklärung für
die markant reduzierte vaskuläre Dichte in den DH82CDVpi-Tumoren darstellen.
Möglicherweise ist es durch ein komplexes Zusammenwirken der genannten
Faktoren zu einem Überwiegen anti- über proangiogenetischer Faktoren gekommen.
Zusammenfassend lässt sich als Ursache der Tumorregression und des Vorliegens
ausgedehnter Nekroseareale ein komplexes Zusammenspiel aus tumorzelleigenen
Faktoren und Faktoren des Tumormikromilieus postulieren, die zur
Angiogenesehemmung und zur tumoriziden Wirkung der assoziierten Makrophagen
geführt hat. Besonders reizvoll ist hierbei die Überlegung, dass es gelungen sein
könnte, die TAMs durch virusinduzierte INF-γ-Ausschüttung zu Makrophagen des
M1-Phänotyps zu polarisieren, die durch die Ausschüttung pro-inflammatorischer und
tumorizider Faktoren wie z.B. TNF, IL-12, Stickstoffmonoxid (NO) bzw. induzierbare
Stickstoffmonoxidsynthase (iNOS) und reaktive Sauerstoffspezies (Schmid und

Diskussion 133
Varner, 2010) maßgeblich zu den ausgedehnten Tumorgewebeuntergängen
beigetragen haben könnten. Hinweis auf das Vorliegen gewebetoxischer Stoffe
gaben zudem die nekrotisierenden Veränderungen des umliegenden, präexistenten
murinen Gewebes.
5.2.3. Eignung des Scid-Mausmodells in der viralen Onkolyseforschung
Xenotransplantate humaner Tumoren in immunsupprimierte Mausstämme spielen
eine wichtige Rolle in der Erforschung und Prüfung von Onkotherapeutika (Céspedes
et al., 2006). Aus der Verwendung von Mausstämmen mit unterschiedlichen
Defekten ihres Immunsystems (Nude, SCID, NOD/SCID, Rag-1-defizient) ergeben
sich verbesserte Tumoraufnahmen und die Möglichkeit der Evaluierung des
Wirkungsmechanismus eines Therapeutikums unter Vernachlässigung des adaptiven
Immunsystems (Hudson et al., 1998; Céspedes et al., 2006). Wie aus den
Erkenntnissen der vorliegenden Studie evident wird, kann und darf die Rolle des
Immunsystems im Rahmen der Therapie mit onkolytischen Viren nicht vernachlässigt
werden. Neben den CD8-exprimierenden, zytotoxischen und CD4-exprimierenden,
kostimulativen T-Zellen, kommt dem angeborenen Immunsystem die wesentliche
Bedeutung in der Tumorimmunität zu (Shankaran et al., 2001). Aus diesem Grund,
spielen die, allein mit der Möglichkeit zur angeborenen Immunantwort befähigten,
Scid-Mäuse eine wichtige Rolle als Modell zur Erforschung ebensolcher Reaktionen.
Natürlich kann jedoch nur einen Bruchteil der Reaktionen eines immunkompetenten
und mit vielfachen Antigenen in Kontakt gekommenen, tierischen oder menschlichen
Patienten widergespiegelt werden.
5.2.4. Eignung des Staupevirus als onkolytisches Agens beim histiozytären
Sarkom des Hundes
Studien von von Messling et al. (2004) sowie Stein et al. (2008) haben gezeigt, dass,
im Vergleich zu lymphozytären Zellen, die Infektion von Makrophagen bzw.
Monozyten mit dem CDV eingeschränkt bleibt. Gleichzeitig kommt es in diesen
jedoch zu einer Aktivitätssteigerung, die mit einer Erhöhung der phagozytären,
Antigen-präsentierenden und T-Zell-stimulativen Funktion einhergeht (Stein et al.,
2008). Daraus lässt sich zum einen ableiten, dass eine Schwierigkeit der CDV-

134
Diskussion
Therapie histiozytärer Sarkome darin bestehen könnte, eine ausreichende
Infektionsrate der Zellen eines Tumors mit dem CDV zu erreichen. Andererseits ließe
sich dadurch eventuell eine markante tumorizide, bystander-Immunreaktion
erzeugen, welche zudem eine Immunisierung gegen Tumorantigene bewirken und
damit, neben dem angeborenen, das adaptive Immunsystem in den Prozess der
Tumorbekämpfung einbeziehen könnte. Ähnliche Erkenntnisse gewannen Donelly et
al. (2011). Sie beobachteten bei der Therapie humaner Melanome mit einem
onkolytischen Masernvirus Tumorregressionen, die stark mit inflammatorischen
Prozessen assoziiert waren. Im Zuge dessen kam es außerdem zur Entwicklung
einer Melanom-spezifischen, adaptiven Immunantwort. Auch Prestwich et al. (2008)
gelangten zu vergleichbaren Ergebnissen. Sie erreichten eine Melanom-spezifische
T-Zell-Aktivierung nachdem Reovirus-infizierte Melanomzellen zur Prägung
dendritischer Zellen auf ein Tumor-assoziiertes Antigen geführt hatten. Eine
entsprechende Prägung mit nicht-infizierten Melanomzellen gelang nicht. Die
Aktivierung dendritischer Zellen erfolgt neben proinflammatorischen Zytokinen und
mikrobiellen Produkten auch durch Virus-RNS (Tizard und Schubot, 2008). Diese
Gegebenheiten können vor Allem vor dem Hintergrund des Vorliegens CDVneutralisierender
Antikörper in der heutigen Hundepopulation von Relevanz sein.
Lemay et al. (2012) betonen die für erfolgreiche Tumorregressionen wichtige
Fortführung der Immunstimulation nach Antikörper-bedingter Beseitigung des Virus
aus dem Wirtsorganismus. Melcher et al. (2011) geben einen umfassenden
Überblick über Ansätze, die Tumorimmuntherapien mit onkolytischen Virustherapien
kombinieren.
Ferner müsste, auf Grund des multizentrischen Charakters des disseminierten
histiozytären Sarkoms des Hundes, eine systemische Therapie angestrebt werden.

Diskussion 135
5.3. Schlussbetrachtung
Tumorerkrankungen stellen beim Hund, wie auch beim Menschen, eine der
häufigsten Todesursachen dar. Die Schwierigkeit der Behandlungen von
Tumorerkrankungen besteht mitunter im Fehlen einer universellen Therapie. Meist
kommen Einzel- und Kombinationstherapien aus chirurgischer Resektion, Chemo-,
Radio- und Immuntherapie zur Anwendung. Ein weiteres, in den letzten zwei bis drei
Jahrzehnten vermehrt wahrgenommenes Konzept ist die Therapie proliferativer
Erkrankungen mit viralen Organismen. Die Erforschung onkolytischer Virustherapien
für kanine Tumorerkrankungen befindet sich noch in ihren Anfängen. In der
Humanmedizin sind Erfolg versprechende Therapieansätze mit onkolytischen Viren
schon mehrfach in klinische Studien eingegangen. Teilweise sind sie als
Therapeutika kommerziell verfügbar (z.B. Reolysin ® ). Wesentliche
Herausforderungen bestehen in der Infektion möglichst vieler Zellen eines Tumors
mit dem onkolytischen Virus, sowie der Möglichkeit der systemischen Gabe bei
vernachlässigbarer Toxizität. Vorteile der Virotherapie ergeben sich in diesem
Zusammenhang vor Allem in der artifiziellen Veränderbarkeit des Virusgenoms und
damit der Möglichkeit der Expression, spezifisch ausgewählter viraler oder
transgener Proteine durch das onkolytische Virus. Transgene Veränderungen von
Viren können z.B. die Benutzung eines bestimmten, durch die Tumorzelle
überexprimierten, Oberflächenmoleküls zur Bindung des Virus an die Zelle
ermöglichen. Dadurch würde eine Grundlage für erhöhte Infektiosität und
Tumorselektivität bzw. –spezifität des Virus geschaffen. Weiterhin können
onkolytische Viren als Vehikel für zytolytisch wirksame Substanzen dienen, die nach
spezifischer Infektion der Tumorzelle nur in dieser exprimiert werden. Ferner kann
neben der per se zytolytischen Wirkung eines onkolytischen Virus auf eine
Tumorzelle auch der Induktion einer antiviralen und / oder antitumoralen
Immunreaktion wesentliche Bedeutung im Zuge der angestrebten Tumorregression
zukommen.
Im Rahmen der vorliegenden Studie ergaben sich im Mausmodell ermutigende erste
Ergebnisse der Therapie histiozytärer Sarkome des Hundes mit dem CDV. Es wurde

136
Diskussion
eine transient stagnierende und insgesamt verminderte Volumenprogression der
CDV-injizierten Tumoren erreicht. Ferner wurde im Zuge der Transplantation
persistierend-infizierter Tumorzellen eine vollständige Regression der Transplantate
beobachtet. In diesem Zusammenhang ließen sich die Reaktionen des
Tumormikromilieus (Induktion einer tumorassoziierten und gegebenenfalls
tumoriziden Immunantwort, Angiogenesehemmung) als wahrscheinliche
Mechanismen der Regression herausstellen. Somit ergeben sich für die Erforschung
und Weiterentwicklung des CDV als onkolytisches Agens interessante
Anknüpfungspunkte. Im Rahmen laufender Analysen wird die Pathogenese der, im
Rahmen der intratumoralen CDV-Injektionen erhobenen, klinischen Befunde zur
verminderten Volumenprogression untersucht.
Für zukünftige, vergleichbare und weiterführende Untersuchungen könnte
gegebenenfalls durch eine Optimierung des Virus (z.B. durch Transgenexpression)
eine verbesserte Infektiosität, Tumorzellselektivität und -spezifität erreicht werden.
Weiterhin wäre, zum Ziel der weiteren Erforschung des immunvermittelten
Regressionsmechanismus, auch die Verwendung von zum einen NK-Zelldepletierten
(NOD-Scid) und zum anderen vollständig immunkompetenten Mäusen
interessant.

Zusammenfassung 137
6. Zusammenfassung
In vivo Untersuchungen über die onkolytische Wirkung des Staupevirus bei
dem disseminierten histiozytären Sarkom des Hundes in einem Mausmodell
Stefanie Lapp
Tumorerkrankungen repräsentieren beim Hund, wie auch beim Menschen, eine der
häufigsten Todesursachen. Insbesondere das disseminierte histiozytäre Sarkom
stellt eine, wenngleich in der Gesamthundepopulation vergleichsweise selten
diagnostizierte, stets mit einer vorsichtigen bis schlechten Prognose assoziierte
Tumorerkrankung dar. Das kanine Staupevirus (CDV) ist als Morbillivirus eng
verwandt mit dem Masernvirus. Das onkolytische Potenzial des letzteren wurde und
wird intensiv erforscht. Beide Viren sind charakterisiert durch die Induktion einer
ausgeprägten Immunsuppression durch Zytolyse vornehmlich lymphozytärer Zellen.
Die vorliegende Untersuchung stellt die erste Beschreibung einer in vivo CDVassoziierten
Onkolyse einer kaninen Neoplasie dar.
Die Literaturübersicht gibt einen Überblick über das Konzept der viralen Onkolyse
und dessen historischen Hintergrund. Gegenwärtig im Fokus der
humanmedizinischen Forschung stehende onkolytische Viren werden, mit
besonderem Augenmerk auf das Maservirus, vorgestellt sowie erste Schritte der
veterinärmedizinisch-relevanten viralen Onkolyseforschung erläutert. Ferner wird ein
Einblick in die Herausforderungen und Begrenzungen der Virotherapie gegeben. Es
folgt ein Überblick über histiozytäre, proliferative Erkrankungen, die Vorstellung der,
in der Studie verwandten, histiozytären Tumorzelllinie DH82 sowie der
Staupeerkrankung und des Staupevirus als potenzielles onkolytisches Agens.
Weiterhin werden Mausmodelle, wie sie in der onkologischen und
virotherapeutischen Forschung vielfach verwendet werden, vorgestellt. Ein weiterer
Abschnitt befasst sich mit der Auswirkung des Tumormikromilieus auf die
Tumorprogression sowie dessen Bedeutung im Rahmen virotherapeutischer
Behandlungen. Hierbei wird der Fokus insbesondere auf die Tumorvaskularisation

138
Zusammenfassung
sowie die tumorassozierte Immunreaktion gelegt. Abschließend werden die Arten
des Zelluntergangs sowie deren morphologische Nachweismethoden beleuchtet.
Im Rahmen dieser Studie wurden zum einen subkutane Transplantate der DH82-
Zelllinie in Scid-Mäusen generiert, welche nach Erreichen eines im Vorhinein
festgelegten Tumorvolumens intratumoral mit dem CDV sowie unterschiedlichen
Plazebolösungen injiziert wurden. Es erfolgte die Dokumentation der
Tumorvolumenprogression im Vergleich zu nicht-injizierten Kontrolltransplantaten. In
einem alternativen Versuchsansatz wurden, in methodisch analoger
Vorgehensweise, Transplantate persistierend mit dem CDV infizierter DH82-Zellen
(DH82CDVpi-Zellen) erzeugt. Zusätzlich zur Dokumentation der Volumenentwicklung
der Tumoren im Vergleich zu nicht-infizierten Kontrolltransplantaten erfolgte die
histologische und immunhistologische Aufarbeitung des Tumorgewebes. Im Zuge
dessen wurde die CDV-Infektion der DH82CDVpi-Transplantate
immunhistochemisch mit einem Antikörper gegen das CDV-Nukleoprotein bestätigt.
Ferner wurden die Tumoren anhand der Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung, sowie der
immunhistologischen Markierung des CD44-Antigens sowie des MHC II-Antigens
morphologisch charakterisiert. Zudem wurde die Größe der lichtmikroskopisch
nachweisbaren Nekroseflächen HE-gefärbter Tumorschnitte morphometrisch
bestimmt sowie der intratumorale Anteil apoptotischer Zellen mittels einer
immunhistochemischen Markierung mit Antikörpern gegen aktivierte Caspase 3
determiniert. Es schlossen sich Untersuchungen des Tumormikromilieus an. Hierfür
wurde die intratumorale Gefäßdichte durch immunhistochemische Markierung der
Tumorgefäße mit einem Antikörper gegen CD31 evaluiert. Ferner erfolgte die
immunhistochemische Charakterisierung der peri- und intratumoralen
Immunreaktion. Hierfür wurden Antikörper, die gegen murines Mac 3 / CD107b, CD3
und CD45R gerichtet waren, verwendet.
Die intratumoralen Injektionen mit dem CDV bewirkten eine transiente Stagnation der
Tumorvolumenprogression. Die mit den Plazebolösungen injizierten sowie die
Kontrolltumoren zeigten dagegen ab Beginn des Untersuchungszeitraumes eine
stetige Volumenprogression. Ungefähr im letzten Drittel des

Zusammenfassung 139
Untersuchungszeitraumes kam es auch bei den mit dem CDV injizierten Tumoren zu
einer Volumenzunahme. Nichtsdestotrotz blieben die Volumina dieser Tumoren im
Vergleich zu den Volumina der mit den Plazebolösungen injizierten sowie der
Kontrolltumoren maßgeblich kleiner.
DH82CDVpi-Transplantate zeigten im Gegensatz zu den nicht-infizierten
Kontrolltumoren eine Volumenabnahme bis hin zur Nichtnachweisbarkeit im Rahmen
der makroskopischen wie histologischen Untersuchungen. Als Ursache hierfür
wurden markante, großflächige Nekrosen der DH82CDVpi-Tumorareale
herausgestellt. Diese traten schon ab dem 7. Tag nach der Transplantation auf.
Gleichartige Veränderungen konnten bei den Kontrolltumoren erst zum 77. Tag nach
der Transplantation festgestellt werden. Ferner erwies sich die Vaskularisation der
DH82CDVpi-Tumoren als signifikant geringer ausgeprägt. Die Charakterisierung der
Immunreaktion ergab eine augenscheinlich erhöhte Immunogenität der DH82CDVpi-
Tumoren. Bei der differenzierten Betrachtung der Immunreaktion ergab sich ein
Makrophagen-dominiertes Geschehen. Größtenteils signifikant geringgradiger stellte
sich die Infiltration CD3- und CD45R-positiver Zellen dar. Ihre nichtsdestotrotz
potenzielle Bedeutung im Rahmen des Regressionsgeschehens wird diskutiert.
Abschließend lässt sich feststellen, dass dem CDV eine onkolytische Wirkung auf
Transplantate histiozytärer Tumorzellen in immunsupprimierten Mäusen
zugesprochen werden kann. Diese verdeutlichte sich in einer transienten
Volumenstagnation der intratumoral infizierten Transplantate sowie in der
vollständigen Regression der persistierend CDV-infizierten Tumoren. Die Ergebnisse
der immunhistologischen Untersuchungen zeigen, dass die Pathogenese dieser
Regressionen mit einer unterdrückten Tumorvaskularisation und der assoziierten
Immunreaktion im Zusammenhang steht.

140
Zusammenfassung

Summary 141
7. Summary
In vivo study on the oncolytic effect of canine distemper virus upon the canine
disseminated histiocytic sarcoma in a mouse model
Stefanie Lapp
Neoplastic diseases represent one of the most common causes of death in dogs as
well as in humans. Particularly the canine disseminated histiocytic sarcoma
constitutes a neoplastic disorder that is commonly associated with a guarded or poor
prognosis, though, in reference to the total dog population, it remains infrequently
diagnosed. The canine distemper virus (CDV) is, being a morbillivirus, closely related
to the measles virus. The oncolytic potential of the latter is and has been intensively
studied. Both viruses are characterized by the induction of a marked
immunosuppression mainly caused by cytolysis of lymphocytic cells. The present
study represents the first in vivo description of CDV-associated oncolysis of a canine
tumor.
The literature review provides an overview of the viral oncolysis concept and its
historical background. Oncolytic viruses that are at the focus of many current studies
are introduced. Herein special attention is given to oncolytic measles viruses as well
as to first attempts of viral oncolysis in veterinary oncology. Furthermore challenges
and restraints of virotherapies are explained. An overview of proliferative histiocytic
disorders follows. The canine histiocytic cell line DH82, which is applied in the course
of this study is introduced as well as CDV as a potential oncolytic agent. In addition
mouse models frequently used in oncology and virotherapy research are described.
A further section deals with the influence of the tumor microenvironment on tumor
progression and its relevance to virotherapeutic treatments. Within this context
special attention is given to tumor angiogenesis and tumor-associated immune
reactions. Concluding, various aspects of cellular degeneration as well as different
methods of its detection are highlighted.
In the course of this investigation, subcutaneous xenografts of DH82 cells were
generated in scid mice, which received intratumoral injections of CDV and different

142
Summary
placebos respectively, after the tumor had reached the a priori defined tumor volume.
Tumor volumes were measured and documented in comparison to non-injected
control DH82 grafts. Furthermore, an alternative approach was applied, which
involved the grafting of DH82 cells that were persistently infected with CDV
(DH82CDVpi cells). In addition to measurement and documentation of tumor
volumes, tumor specimens were analyzed by histology and immunohistochemistry.
Thus, the CDV-infection of the DH82CDVpi-grafts was confirmed. Tumor tissue was
stained with hematoxylin and eosin (HE) as well as with antibodies directed against
CD44 and MHC class II-antigen. Moreover, microscopically detectable areas of
necrosis were morphometrically measured and intratumoral fractions of apoptotic
cells evaluated by immunohistochemical staining applying an antibody directed
against cleaved caspase 3. Furthermore, intratumoral vessel density was evaluated
by CD31 immunohistochemical staining and counting of intratumoral vessels.
Furthermore the peri- and intratumoral immune reaction was immunohistochemically
characterized applying antibodies directed against murine Mac 3 / CD107b, CD3 and
CD45R.
Intratumoral CDV injections lead to a transient stagnation of tumor volume
progression, whereas placebo-injected tumors displayed a constant volume
increment. Approximately within the last third of the observation period also CDVinjected
tumors showed increasing volumes. Nevertheless these tumors remained
significantly smaller compared to placebo-injected or non-injected control tumors.
DH82CDVpi tumors, in contrast to non-infected control tumors, macroscopically and
histologically showed a constant reduction in tumor volume up to nondetectability.
Marked and widespread necroses within DH82CDVpi tumor areas were reasoned to
be the cause for this phenomenon. These were detected as early as 7 days after
transplantation, whereas in non-infected control tumors necrotic areas increased only
on day 77 post transplantation. Moreover, intratumoral vascular density proved to be
significantly less developed. The characterization of the tumor-associated immune
reaction demonstrated that the DH82CDVpi tumors appear to be more immunogenic.
A differential analysis of the immune reaction revealed, that the inflammatory
response is dominated by macrophages. The infiltration by CD3- and CD45R-positive

Summary 143
cells was less pronounced. Nevertheless these cells might be of importance
regarding the regression process. The according relevance is being discussed.
Concluding, it can be assumed that CDV has an oncolytic potential upon xenografts
arising from canine histiocytic tumor cells in immunosuppressed mice. This potential
is represented by a transient stagnation of intratumorally CDV-injected grafts as well
as by persistently CDV-infected grafts displaying complete regressions.
Immunohistochemical studies upon the tumor microenvironment reveal the
pathogenesis of regression to be associated with inhibited angiogenesis and the
accompanying immune reaction.

144
Summary

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Anhang 165
9. Anhang
9.1. Bezugsquellen für Antikörper, Chemikalien, Reagenzien,
Tiere, Viren und Zellen
Abcam plc, Cambridge, GB
LC 3 A/B, polyklonaler Antikörper, Kaninchen anti-Maus, ab58610
Ki 67, polyklonaler Antikörper, Kaninchen anti-Human, ab15580
AbD Serotec / Bio-Rad AbD Serotec GmbH, Puchheim
Mac 3 / CD107b-biotinilierter, monoklonaler Antikörper Ratte anti-Maus, Klon M3/84,
MCA2293B
F4/80, monoklonaler Antikörper, Ratte anti-Maus, Klon A3-1, MCAP497
Acris Antibodies GmbH, Herford
CD31 / PECAM1 (C-Terminus), polyklonaler Antikörper Kaninchen anti-Human,
AP15436PU-M
VEGF-A (N-Term), polyklonaler Antikörper, Kaninchen anti-Human / Maus / Ratte,
AP23353PU-N
BD Biosciences, Heidelberg
CD45R / B220-biotiniliert, monoklonaler Antikörper Ratte anti-Maus, 553085
Biochrom AG, Berlin
Fetales Kälberserum, S0115
BioLogo, Dr. Hartmut Schultheiß e.K., Immunologische Produkte, Kronshagen
Aszitesflüssigkeit von nicht-immunisierten Balb/cJ-Mäusen, CL8100
Bioss Inc., Woburn, USA
CD161 / NK1.1, polyklonaler Antikörper, Kaninchen anti-Maus / Ratte, bs-4682R
Calbiochem / Merck Millipore KG, Darmstadt
Calreticulin (405-417), polyklonaler Antikörper, Kaninchen anti-Human / Maus / Ratte
/ Hund, 208910

166
Anhang
Cell SignalingTechnology, Inc., Danvers, USA
cleaved Caspase 3 (Asp175) polyklonaler Antikörper Kaninchen anti-Human / Maus /
Ratte, 9661
Charles River Wiga Deutschland GmbH, Sulzfeld
Scid-Mäuse (CB17/lcr-Prkdc scid/Crl)
Dako Deutschland GmbH, Hamburg
CD3 (A 0452) polyklonaler Antikörper, Kaninchen, anti-Human, A 0452
CD68, monoklonaler Antikörper, Maus anti-Human, MO81, KP14
Von Willebrand Faktor, polyklonaler Antikörper, Kaninchen anti-Human, A0082
DCS Innovative Diagnostik-Systeme Dr. Christian Sartori GmbH & Co. KG,
Hamburg
Ki 67, polyklonaler Antikörper, Kaninchen anti-Human, SP6, KI681C01
European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, GB
DH82, kanine Makrophagen- / Monozytenzelllinie, 94062922
Gibco life technologies GmbH, Darmstadt
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), 41965039
Graph Pad Software Inc., San Diego, USA
Graph Pad Prism 5 für Windows (Version 5.04)
Henry Schein Vet GmbH, Hamburg (Lieferant für Artikel von B. Braun Melsungen
AG; edding International GmbH, Ahrensburg; TEN-PACK GmbH, Erlangen,
Unigloves GmbH, Troisdorf-Spich)
Isotonische Natriumchlorid-Lösung 0,9% ad us. Vet., 500 ml, B. Braun Melsungen
AG, 777500
Kremmer E., GSF, Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit, München
CD44-Antikörper, monoklonal Ratte anti-Hund, Klon 2D10
MHC II dog26, monoklonal Ratte anti-Hund

Anhang 167
Menno Chemie Vertriebsges. mbH, Norderstedt
Venno-Vet 1 super
Merck Millipore KG, Darmstadt (auch Chemicon Millipore)
Kalziumchlorid-Dihydrat (CaCl 2 x 2 H 2 O), 1023820500
Negativkontrollserum, Mouse IgG1, CBL600
PAA Laboratories GmbH, Cölbe
Minimal Essential Medium (MEM) mit Earle’s Salzen und L-Glutamin, E15-825
R&D Systems GmbH, Wiesbaden-Nordenstadt
Negativkontrollserum, Rat IgG2A, Isotyp Kontrolle, Klon 54447, MAB006
Negativkontrollserum, Rat IgG1, Isotyp Kontrolle, Klon 43414, MAB005
Roth C. GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Essigsäurebutylester (EBE). 4600.7
Ethanol, Rotipuran ® , 9065
Ethanol, vergällt, K928.2
Formaldehyd 37%, 7398
Hämatoxylin, 3816
Isopentan, 2-Methylbutan, 3927-2
Isopropanol, Rotipuran ® , 6752
Kaliumchlorid (KCl)
Kaliumdihydrogenphosphat (KH 2 PO 4 )
Magnesiumchlorid-Hexahydrat (MgCl 2 x 6 H 2 O)
Mayers Hämatoxylinlösung, T865
Natriumchlorid (NaCl), P029.2
Natriumhydroxid, p.a., 6771
Roticlear ® , A538.3
Roti ® -Histol, A6640
Roti ® Histo kit II, T160.2
Salzsäure Rotipuran ® 25% p.a., 6331.3
Zitronensäuremonohydrat, p.a., 3958.1

168
Anhang
Sakura Finetek Germany GmbH, Staufen
Tissue Tec ® -O.C.T TM -compound, 4583
Santa Cruz Biotechnology Inc, Heidelberg
Cortactin (H-191), polyklonaler Antikörper, Kaninchen anti-Human, sc-11408
SAS Institute Inc, Heidelberg
Statistical Analysis System (SAS) für Windows, Version 9.3
Sigma Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
3,3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid (DAB), 32750
Bovines Serumalbumin (BSA), A-3059
CALR / Calreticulin N-Terminal (Vasostatin), polyklonaler Antikörper, Kaninchen anti-
Human / Maus / Ratte, SAB4503222
Kaninchenserum R4505
nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA), M7145
Trypsin (Pancreas, Schwein), 93613
Spring Bioscience Inc., Pleasanton, USA
CD68 (E19160), polyklonaler Antikörper, Kaninchen anti-Human, E19190
Tierärztliche Hochschule Hannover, Klinik für kleine Klauentiere, Hannover
Ziegennormalserum
Universität Bern, Veterinärmedizinische Fakultät (Vetsuisse-Fakultät), Prof. Dr.
A. Zurbriggen
CDV D110, monoklonaler Antikörper Maus anti-CDV
Universität Zürich, Veterinärmedizinische Fakultät, Institut für Virologie, Dr.
Metzler
CDV-Ond X (22.5.2006)

Anhang 169
Vector Laboratories, Inc., Burlingame, USA
Biotiniliertes Ziege-anti-Kaninchen-Immunglobulin, BA 1000
Biotiniliertes Ziege-anti-Maus-Immunoglobulin, BA 9200
Biotiniliertes Kaninchen-anti-Ratte-Immunglobulin, BA 4001
Vectastain Elite ABC kit, PK-6100
Vogel GmbH & Co. KG, Gießen
Histo-Comp ® Einbettmedium, VO-5-1002
VWR International GmbH, Darmstadt
Wasserstoffperoxid (H 2 O 2 ; Merck Millipore), 1.07209.0250
Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat, p.a., 1.06580.1000
Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan
Asialo GM1, polyklonaler Antikörper, Kaninchen anti-Maus / Ratte, 986-10001
Wirtschaftsgenossenschaft deutscher Tierärzte (WDT) eG, Garbsen (Lieferant
für Artikel von Pfizer und WDT)
Domitor ® 10 ml, Pfizer Karlsruhe, 20020
Ketamin 10% 10 ml, WDT, Garbsen, 02946
9.2. Bezugsquellen für Geräte und Einmalartikel
Altromin Spezialfutter GmbH & Co. KG, Lage
Haltungsfutter Ratte / Maus Total Pathogen-Frei, 1324 TPF
Biozym Diagnostik GmbH, Hessisch Oldendorf
Safeseal-Tips 1000 µl, 692079
Safeseal-Tips 200 µl, 692069
Safeseal-Tips 100 µl, 692066
Safeseal-Tips 20 µl, 692151
Safeseal-Tips 10 µl, 693010

170
Anhang
Carl Zeiss Microscopy GmbH, Göttingen
Lichtmikroskopes Axiostar plus
Eppendorf AG, Hamburg
Pipette Reference 10 µl
Pipette Reference 100 µl
Pipette Reference 1000 µl
Pipette Research 20 µl
Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen (Vertriebspartner: Diagonal GmbH & Co.
KG, Münster)
Zellkulturflaschen, 175 cm 2 , 661160
Zentrifugenröhrchen, 15 ml, 188271
Zentrifugenröhrchen, 50 ml, 227261
Henry Schein Vet GmbH, Hamburg (Lieferant für Artikel von B. Braun Melsungen
AG; edding International GmbH, Ahrensburg; TEN-PACK GmbH, Erlangen,
Unigloves GmbH, Troisdorf-Spich)
edding ® Hautmarker rot und blau, edding 8020
Einmalfeindosierungsspritzen Omnican ® F, B. Braun Melsungen AG, 212651
gebogene Präparierschere nach Metzenbaum, 145 mm, 310918
moll ® zell-Alkoholtupfer, TEN-PACK GmbH, 235433
OP-Handschuhe, Unigloves Garant, z.B.Größe 7 371252
OP-Haube, 371071
OP-Kompressen, unsteril 5 x 5 cm, 221210
OP-Wickelkittel, grün, z.B. Größe 44-46, 5300540
Gesichtsmasken, 1002686
Zählkammer nach Neubauer, 7116206

Anhang 171
Hettich A., Tuttlingen
Kühlzentrifuge Rotina 48 RC
Holger Veith Handelsvertretungen, Westerau
Philips UV-Entkeimungslampe, TUV TL-D 15W G13 (G15T8), 1095100
Jürgens, Bremen
Magnetischer Rührer Ika-Combimag RTC
Leica Biosystems Nussloch GmbH, Nussloch
Rotationsmikrotom Leica RM2035
Färbegerät Leica ST 4040
Medite Medizintechnik, Burgdorf
Eindeckautomat, Promountes ® RCM2000
Memmert GmbH & Co. KG, Schwabach
Wasserbad WB 22
Wasserbad WB 45
Messmittelonline C. Schulz measuring instruments
Schieblehre Nonius Präzisionskleinmessschieber 70mm, 6007
Olympus Optical Co. Europe GmbH, Hamburg
Kameramikroskop Olympus BX-51
Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Münster
Analysis 3.1-Software
Cell-D 3.2-imaging Software
Roth C. GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Rotiprotect® Nitrilhandschuhe, P777.1

172
Anhang
Sarstedt AG& Co., Nümbrecht
Reaktionsgefäße 1,5 ml, 72690
Reaktionsgefäße 2,0 ml, 72695
Sartorius AG, Göttingen
Elektrische Präzisionswaage TE13S-DS und PT210
Sigma Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
Zellschaber, C2802
Ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest
Ssniff bedding Faser spez., sterilisiert, 25kGy, vakuumverpackt
Systec GmbH, Wettenberg
Autoklav 3850 ELC
Tecniplast Deutschland GmbH, Hohenpeißenberg
SlimLine-Gebläseeinheit, BOXUNCP04
Sealsafe ® IVC-Systemgestell, 2H30MAC
Sealsafe ® Käfig (Polysulfon) Eurostandard: Typ III H, 1291H
Edelstahl Gitterdeckel, 1290D016
SealSafe ® Haube, 1290D400SU
Tränkeflasche 400 ml, ACBT0402
Tränkekappe, ACCP6521
Edelstahl-Kartenhalter, ACPC10575VS
Mouse house, ACRE010
Thermo Electron Ltd., Dreieich, Germany
Shandon Coverplates®, 72110013
Shandon Sequenza® Slide Racks, 7331017

Anhang 173
Thermo Fisher Scientific, Langensebold (ABgene ® , Advanced Biotechnologies,
Heraeus, Kendro Laboratory Products GmbH und Nunc TM GmbH & Co. KG,
Wiesbaden; Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig; Vertriebspartner: LAT-Laborund
Analysetechnik GmbH, Garbsen und Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co. KG,
Gehrden)
96 Well Zellkulturplatten, F96, Nunclon TM Surface, 10058820
HERAcell ® 150 CO 2 Incubator
Heraeus Function Line, Begasungsbrutschrank, BK5060
Heraeus LaminAir ® Sterilwerkbank, HLB 2472 GS
Heraeus Multifuge 1 S-R
Heraeus Wärmeschrank, ST6200
Heraeus Wärmeschrank, B6030
Heraeus Wärmeschrank, UT 6
Heraeus Zentrifuge Biofuge 13
HERAsafe mikrobiologische Sicherheitswerkbank, KS 18
SuperFrost ® / SuperFrost ® Plus Slides, Menzel GmbH & Co KG
Zellkulturflaschen, 75 cm 2 , 156367
W. Knittel Glasbearbeitungs GmbH, Braunschweig
Deckgläschen (24 x 50 mm), # 1,5

174
Anhang
9.3. Lösungen und Puffer für die Immunhistologie
9.3.1. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)
40 g NaCl und 8,97 g NaH 2 PO 4 werden in 5 L Aqua dest. aufgelöst und mit 1 M
NaOH und 1 M HCl auf pH 7,1 eingestellt.
9.3.2. Zitratpuffer
2,1 g Zitronensäuremonohydrat werden in 1 L Aqua dest. aufgelöst und mit 1 M
NaOH und 1 M HCl auf pH 6,0 eingestellt
9.3.3. Trypsin
Die Herstellung einer trypsinhaltigen Lösung erfolgte durch die Zugabe von 0,5 g
Trypsin (Fluka / Sigma-Aldrich Chemie GmbH) und 0,04 g CaCl 2 x 2 H 2 O (Merck
Millipore) zu 200 ml auf 37°C im Wasserbad vorgewärmtem PBS. Die Lösung wurde
mittels 1-molarer NaOH-Lösung auf pH 7,6 justiert.
9.3.4. 3,3´-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid-Lösung (DAB)
Die Lösung ist direkt vor Benutzung herzustellen. Es werden 0.1 g 3.3'-
Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid abgewogen und in 200 ml PBS unter Rühren
gelöst. Vor Immersion der zu färbenden Schnitte erfolgt die Zugabe von 200 μl einer
30%igen Wasserstoffperoxidlösung (H 2 O 2 )

Anhang 175
9.4. Tabellen
Tab. 10: Absolute Tumorvolumina in mm³ der DH82-Tumoren mit zehnfacher und einfacher intratumoraler
Injektion, einfacher intratumoraler Injektion bei halben Tumorvolumen sowie der DH82-Tumoren
ohne intratumorale Injektion und der Mocktransplantate (Gruppenkodierung siehe Abschnitt
3.1.1/ 3.1.2)
Tag p.tr.
Tier Gruppenkodierung
5.1 5.2 5.3 5.4 7.1 7.2 7.3 7.4 8.1 8.2 8.3 8.4 1.1 1.2 1.3 1.4 2.4 4.4 6.4 9
2 1 . . . 7,8 . . . . . . . . . . . 0 . . 8,8 .
2 2 . . . 13,5 . . . . . . . . . . . 21,4 . . 14,9 .
2 3 . . . 12,2 . . . . . . . . . . . 0 . . 11 .
2 4 . . . 13,5 . . . . . . . . . . . 0 . . 13,5 .
2 5 . . . 13,5 . . . . . . . . . . . 0 . . 7,8 .
2 6 . . . 0 . . . . . . . . . . . 32 . . 11 .
3 1 11,1 9,8 18,4 . 30 20,2 18,5 10 10,5 14,4 13,7 6,5 3,9 4,8 8,7 . . . . 0
3 2 19,9 15 10,3 . 10,4 14,5 22,5 11,4 10,9 6,1 12,8 7,1 9,2 9,8 15,3 . . . . 0
3 3 20,5 20,8 17,2 . 13,5 18,9 16,4 18 12,2 6,5 13,5 8,8 7,7 10,7 9,1 . . . . 0
3 4 10,8 0 4 . 11,1 15,6 18,5 12,8 13 10,8 13 13,5 12,5 8,8 11,7 . . . . 0
3 5 6,7 11 24,6 . 16,1 17,8 12,5 14,9 0 5,3 14,6 11,5 8,1 12,5 16,4 . . . . 0
3 6 18,4 16,4 4,9 . 13,5 0 15,8 11,1 14 14,9 20,5 3,4 9,4 16,4 9 . . . . 0
4 1 . . . 15,5 . . . . . . . . . . . 21,4 18 18 13,5 .
4 2 . . . 13,5 . . . . . . . . . . . 33,2 21,4 19,6 13,5 .
4 3 . . . 13,5 . . . . . . . . . . . 0 18 32 13,5 .
4 4 . . . 13,5 . . . . . . . . . . . 33,2 4 18 13,5 .
4 5 . . . 13,5 . . . . . . . . . . . 18 28,9 18 13,5 .
4 6 . . . 6 . . . . . . . . . . . 9,8 0 13,5 8,8 .
7 1 11,2 6,5 11,6 4 6,6 8,1 12,6 7,8 8,5 12,7 9,5 6,4 6,6 8,9 10,4 33,2 0 4 13,5 0
7 2 13 7,5 11 6,1 7,3 7,4 9 10,8 0 7,5 14,9 9 10,4 7,3 9,8 33,2 0 13,5 9,8 0
7 3 8,3 9,3 16,4 13,5 9,8 9,8 7,4 9,8 9,3 5,4 5,6 10,2 9,2 6,9 12,2 0 4 32 5,3 0
7 4 13,7 5 9,4 1,7 12,2 8 8,6 15 12 12,5 8,7 6,1 11 5 11 33,2 0 18 4,6 0
7 5 7,3 8,3 13,5 11 12,8 0 12,2 8,9 2 9,6 4 9,5 7,2 11,7 4,2 18,8 4 18 7,4 0
7 6 6,9 8,9 5,3 0 7 8,4 13,5 10,6 4,7 9,9 8,8 5,1 5,4 6,5 4,6 18,8 0 4 7,8 0
9 1 . . . . . . . . . . . . . . . 6,1 0 0 . .
9 2 . . . . . . . . . . . . . . . 22,4 0 4 . .
9 3 . . . . . . . . . . . . . . . 6,2 0 4 . .
9 4 . . . . . . . . . . . . . . . 13,5 0 0 . .
9 5 . . . . . . . . . . . . . . . 14,9 0 0 . .
9 6 . . . . . . . . . . . . . . . 21,4 0 0 . .

176
Anhang
Fortsetzung Tab. 10
Tag p.tr.
Tier Gruppenkodierung
5.1 5.2 5.3 5.4 7.1 7.2 7.3 7.4 8.1 8.2 8.3 8.4 1.1 1.2 1.3 1.4 2.4 4.4 6.4 9
10 1 7,8 0 0 . 0 0 0 0 0 0 2,7 2,1 0 3 0 . . . . 0
10 2 9 0 0 . 3,7 10,1 0 0 0 9,7 0 4,2 0 4 0 . . . . 0
10 3 6,2 8,8 5,6 . 6,5 0 0 8,6 13,5 0 0 7,8 0 0 0 . . . . 0
10 4 0 0 0 . 7,8 0 9,4 6,4 3,9 4 0 0 4,6 0 5,3 . . . . 0
10 5 4,7 5,3 10,1 . 0 6,3 0 0 0 0 5 5,5 13,1 5,3 0 . . . . 0
10 6 0 7,3 7,2 . 0 5,3 5,3 10,1 0 0 9,3 0 0 0 0 . . . . 0
11 1 . . . 0 . . . . . . . . . . . 11 . . 0 .
11 2 . . . 0 . . . . . . . . . . . 8,3 . . 0 .
11 3 . . . 0 . . . . . . . . . . . 0 . . 0 .
11 4 . . . 0 . . . . . . . . . . . 9,8 . . 0 .
11 5 . . . 0 . . . . . . . . . . . 23,3 . . 0 .
11 6 . . . 0 . . . . . . . . . . . 17,9 8,8 .
14 1 11,6 0 5,3 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 15,7 0 0 0 0
14 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0
14 3 0 0 0 0 0 0 0 0 8 3,4 0 0 0 0 4 1 0 0 0 0
14 4 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 8,8 0 0 0 0
14 5 0 4 1,9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9,3 0 0 0 0
14 6 0 0 0 0 0 0 0 5,8 0 0 0 1,2 24,3 0 0 6,8 0 0 1,7 0
16 1 . . . . . . . . . . . . . . . 13,3 . . . .
16 2 . . . . . . . . . . . . . . . 0 . . . .
16 3 . . . . . . . . . . . . . . . 2 . . . .
16 4 . . . . . . . . . . . . . . . 29,7 . . . .
16 5 . . . . . . . . . . . . . . . 10,4 . . . .
16 6 . . . . . . . . . . . . . . . 11 . . . .
17 1 0 0 0 . 0 0 0 0 0 0 0 0 5,5 9,3 8,8 . . . . 0
17 2 0 0 0 . 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,9 0 . . . . 0
17 3 0 0 0 . 0 0 0 0 16,4 0 0 0 0 0 4 . . . . 0
17 4 0 0 0 . 0 0 0 4,6 0 0 0 4,8 0 0 0 . . . . 0
17 5 0 4 0 . 0 6,9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 . . . . 0
17 6 0 0 0 . 0 0 6,9 2,2 0 0 0 3,7 25,9 0 0 . . . . 0

Anhang 177
Fortsetzung Tab. 10
Tag
p.tr.
Tier Gruppenkodierung
5.1 5.2 5.3 5.4 7.1 7.2 7.3 7.4 8.1 8.2 8.3 8.4 1.1 1.2 1.3 1.4 2.4 4.4 6.4 9
18 1 . . . 0 . . . . . . . . . . . 22,4 . . 0 .
18 2 . . . 0 . . . . . . . . . . . 0 . . 0 .
18 3 . . . 0 . . . . . . . . . . . 36,9 . . 0 .
18 4 . . . 0 . . . . . . . . . . . 4,7 . . 0 .
18 5 . . . 0 . . . . . . . . . . . 0 . . 0 .
18 6 . . . 0 . . . . . . . . . . . 8,8 . . 0 .
21 1 1,9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3,7 0 0 0 15,5 0 0 0 0
21 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 27,4 12,2 0 0 0 0 4 0 0 0 0
21 3 0 0 0 0 0 0 0 0 14,7 4 0 0 0 0 8,6 0 0 0 0 0
21 4 0 0 3,4 0 0 0 13,5 3,7 0 0 0 2 0 0 0 37 0 0 0 0
21 5 0 6,5 1,4 0 0 0 0 0 2,9 0 1,7 0 7,8 0 0 13,5 0 0 0 0
21 6 0 0 0 0 0 0 0 2,6 0 0 5,4 2,4 14,9 0 2,5 16,7 0 0 0 0
23 1 . . . . . . . . . . . . . . . 18,7 . . . .
23 2 . . . . . . . . . . . . . . . 0 . . . .
23 3 . . . . . . . . . . . . . . . 0 . . . .
23 4 . . . . . . . . . . . . . . . 21,4 . . . .
23 5 . . . . . . . . . . . . . . . 14,9 . . . .
23 6 . . . . . . . . . . . . . . . 13,5 . . . .
24 1 8,8 0 0 . 0 0 0 0 0 0 0 6 3,8 0 0 . . . . 0
24 2 0 0 0 . 0 0 0 0 0 28,5 0 5,7 0 0 1,9 . . . . 0
24 3 0 0 0 . 0 0 0 0 23,3 9,4 11 0 0 0 7,4 . . . . 0
24 4 0 0 8,8 . 1,7 0 0 3 7,9 0 0 7,3 0 6,9 11 . . . . 0
24 5 0 0 0 . 0 0 0 2,9 0 0 4,3 0 14,9 0 0 . . . . 0
24 6 0 0 0 . 0 0 0 6,9 7,9 0 16,3 9,8 5,7 0 0 . . . . 0
25 1 . . . 0 . . . . . . . . . . . 9,8 48,1 23,3 0 .
25 2 . . . 0 . . . . . . . . . . . 11 0 8 2,7 .
25 3 . . . 0 . . . . . . . . . . . 6,5 1,7 0 0 .
25 4 . . . 0 . . . . . . . . . . . 25,6 0 0 0 .
25 5 . . . 0 . . . . . . . . . . . 14,9 0 21,4 0 .
25 6 . . . 0 . . . . . . . . . . . 128 0 4 0 .

178
Anhang
Fortsetzung Tab. 10
Tag
p.tr.
Tier Gruppenkodierung
5.1 5.2 5.3 5.4 7.1 7.2 7.3 7.4 8.1 8.2 8.3 8.4 1.1 1.2 1.3 1.4 2.4 4.4 6.4 9
28 1 35,5 48,1 0 0 13,5 0 0 0 20,5 8,8 5,3 2,9 19,9 0 4 15,1 22,5 0 0 0
28 2 0 0 0 0 0 42,8 11,7 0 0 53 27,2 0 0 11,3 5,4 23,3 11,3 13,5 0 0
28 3 0 0 0 0 0 0 0 8,8 33,8 4,5 18,8 25,8 0 0 13,5 32,4 13,5 0 0 0
28 4 37 0 17,9 0 10,4 0 23,3 6,1 22,3 0 0 14,2 0 11 8,6 18,5 13,5 21,4 8,8 0
28 5 0 10,4 3,2 0 38 0 0 5,3 12,2 0 19,5 0 15,6 0 18 8,5 15,3 0 7,8 0
28 6 0 0 9,8 0 0 0 18,4 11 30,6 15,6 55,3 9,1 19,4 0 14,2 19,7 0 13,5 0 0
30 1 . . . 0 . . . . . . . . . . . 25,3 . . 34,5 .
30 2 . . . 0 . . . . . . . . . . . 28,5 . . 18 .
30 3 . . . 0 . . . . . . . . . . . 37 . . 0 .
30 4 . . . 0 . . . . . . . . . . . 24,9 . . 8,3 .
30 5 . . . 0 . . . . . . . . . . . 14,6 . . 11 .
30 6 . . . 0 . . . . . . . . . . . 23,3 . . 0 .
31 1 58,7 95,3 6,1 . 16,4 40,6 19 14,3 30,8 0 16,9 25,1 22,5 15,4 26,4 . . . . 0
31 2 39,2 10,4 0 . 0 31,6 63,2 27,4 0 83,8 38,8 0 20,5 27,4 16,6 . . . . 0
31 3 0 0 38,8 . 0 7,8 0 18,4 55,3 14,9 41,6 44,1 26,4 22,6 14,3 . . . . 0
31 4 75,7 39,9 44,5 . 11 0 71 14,9 28,8 0 0 24 15,6 28,9 39,2 . . . . 0
31 5 0 36,6 5,3 . 45,6 0 0 16,1 66 0 31,8 8,3 16,7 17,6 37 . . . . 0
31 6 0 44,5 5 . 0 0 0 24,6 89,7 102,7 0 21,4 43,9 42,6 34,2 . . . . 0
32 1 . . . 0 . . . . . . . . . . . 32,8 55,7 31,8 18 .
32 2 . . . 0 . . . . . . . . . . . 32 2,7 25,3 16,4 .
32 3 . . . 0 . . . . . . . . . . . 40 23,3 45,4 16,4 .
32 4 . . . 0 . . . . . . . . . . . 24,5 35,6 48,7 27,4 .
32 5 . . . 19,7 . . . . . . . . . . . 22,5 32,9 26,6 12,2 .
32 6 . . . 13,5 . . . . . . . . . . . 25,1 0 30,5 0 .
35 1 88,6 192 32 5 74,1 98,4 99,1 56,1 62,5 64,1 24,6 44,5 94,8 55,3 38,4 31,5 57,3 71,3 32 0
35 2 69,7 34,4 58,2 23,4 22 158,7 149,7 70,6 97,5 197,1 56,4 62,5 48,1 90,8 59,2 62,5 48,4 37 27,7 0
35 3 25,3 28,9 90,4 0 31,9 33,1 35,2 57,6 167,4 66,2 94,1 86,4 67,5 72 55 100 31,1 84,6 27,4 0
35 4 108 61,6 115,3 15,3 26,2 65,6 143,4 34,6 63,8 54,1 82,4 54,5 52,9 66,2 83,8 37 43,3 34,4 44,1 0
35 5 25,1 101,7 13,6 25,4 135,2 116 60 48,6 90,2 48,3 95,8 21,4 66,2 72,7 125,9 27,9 51,8 31 28,5 0
35 6 39,8 88,4 38,6 34,5 38,8 92,3 50,1 77,1 162,9 150,3 55,3 56,9 66,3 74,4 90,8 48,7 51,9 30,9 0 0

Anhang 179
Fortsetzung Tab. 10
Tag
p.tr.
Tier Gruppenkodierung
5.1 5.2 5.3 5.4 7.1 7.2 7.3 7.4 8.1 8.2 8.3 8.4 1.1 1.2 1.3 1.4 2.4 4.4 6.4 9
37 1 181,8 254,6 0 20,5 71,4 202,5 107,9 68,2 113,3 123,9 57,6 50 203,8 73 50,8 31,1 86,9 70 49,7 0
37 2 93,4 27,4 60 50,4 25,9 124,8 168,8 92,3 166,5 258,6 144,2 57,5 72 164 49,7 97,6 117 34,4 46 0
37 3 36,6 45,5 61,6 0 176,2 51,3 0 78,7 216,3 83,8 111,6 177 183,8 105 39,7 87,5 52,9 84,7 18,2 0
37 4 115,2 97,6 109,8 41,3 32,1 45,2 278,8 121,3 134,3 73,8 76,9 65,4 100 123 118,4 69,6 91,3 40,8 83,2 0
37 5 8,3 167,6 39,7 51,6 143,6 130,7 83,2 99,1 161,2 62,4 170,6 72,9 105,9 74,8 166,1 47,1 51,9 26,6 31,9 0
37 6 81,7 116,5 36 38,8 58,8 90,2 59,2 122,1 301,4 202,5 66,2 61,3 133,6 83,2 91,9 36,1 60,5 44,6 0 0
39 1 175,1 264,8 11,8 117 106,5 117,7 83,2 173,9 178,9 104,7 119,2 190,3 117,2 120,2 27,4 86,9 170,6 58,1 .
39 2 113,3 21,4 47,5 105 75,7 175,2 183,3 107 146,4 324,8 164,2 21,9 74,4 238,1 87,8 78 117 75,6 69,4 .
39 3 62,5 45,6 101,8 0 102,7 44,8 63,4 89,3 222,9 143,7 161,2 134,9 171,7 173,2 78,8 132,1 52,9 108 47,5 .
39 4 159,5 131,1 177,5 32 74,4 73,6 214,7 107,5 189,2 135,9 135,2 77,2 134 141,4 138,2 81,6 91,3 56 134,1 .
39 5 11 125 18,4 56,4 296,4 91,7 65,1 116,3 237,3 160,3 174,2 85,9 149,2 143,1 204,5 51,7 51,9 67,2 46,2 .
39 6 72,3 97 68,5 58,7 71,4 97 63,9 121 277,2 329,3 58,2 101,7 125,4 153,8 128,4 79,5 60,5 65 0 .
41 1 209,2 291,2 18,6 157,1 254,5 122,1 126,7 202,5 239 160,2 108,8 278,5 148,9 113,5 . . . . .
41 2 126,9 42,6 53,6 78 82,7 266,5 286,7 169 228,6 372,2 170,2 76,9 116,6 246,1 101,7 . . . . .
41 3 81,7 60,6 69,4 0 213,7 57,5 84,1 86 292,5 121,1 180,4 202,9 180,7 208 107,4 . . . . .
41 4 223,7 142,1 128,3 24,6 86,9 92,6 211,8 78 231 123 132,1 164,3 200,4 168,8 224,8 . . . . .
41 5 30,3 144,4 39,2 63,5 186,2 246,4 114 142,5 212,2 127,7 201,9 118,8 200,7 112,9 356,4 . . . . .
41 6 60,4 67 106 55,2 76,3 148 95,1 135,1 433,4 303,9 94,7 131,7 214,7 75,7 214,7 . . . . .
42 1 . . . . . . . . . . . . . . . 27,9 171,1 139,3 110,5 0
42 2 . . . . . . . . . . . . . . . 137,4 205,4 73,7 104,3 0
42 3 . . . . . . . . . . . . . . . 295,7 87,8 156,3 48,7 0
42 4 . . . . . . . . . . . . . . . 122,3 144 97,5 189 0
42 5 . . . . . . . . . . . . . . . 100 78,4 69,6 73,5 0
42 6 . . . . . . . . . . . . . . . 95,1 147,2 152,9 0 0
43 1 212,9 406,1 9,8 198,1 330,7 149,2 168,8 198,4 205,8 175,1 154,8 312,3 145,6 108,3 . . . . .
43 2 125,1 71,3 81,6 92,3 100,8 255,3 339 226,5 283,2 453,4 292,8 13,5 140,5 308,5 141,8 . . . . .
43 3 64,4 67,5 80,6 0 194,3 90 56,4 109,7 344,5 225,3 221,5 226,5 280,7 268,4 94 . . . . .
43 4 178,5 166,1 191,7 45,3 94,2 99,9 287,6 156 217,2 125 174 195,5 385,1 219,5 191,7 . . . . .
43 5 21,4 213,1 56,4 71,9 228,2 131 142,7 210,5 317,7 162,5 198,5 86,9 243,7 186,6 299,5 . . . . .
43 6 94,3 138 117 58,7 93,8 175 115,2 176,4 629,7 458,5 115,2 163,3 270,3 158,1 313,4 . . . . .

180
Anhang
Fortsetzung Tab. 10
Tag
p.tr.
Tier Gruppenkodierung
5.1 5.2 5.3 5.4 7.1 7.2 7.3 7.4 8.1 8.2 8.3 8.4 1.1 1.2 1.3 1.4 2.4 4.4 6.4 9
44 1 190,4 . . . 174,1 . . . 208,1 . . . 427,2 . . 39,5 202 204,8 140,4 .
44 2 105,1 . . . 71,3 . . . 292,8 . . . 147,8 . . 173,2 344,6 98,5 126,9 .
44 3 35 . . . 139,1 . . . 444,6 . . . 260,8 . . 390 171,8 148,8 86,9 .
44 4 159,7 . . . 112,9 . . . 210,7 . . . 321,7 . . 100,4 196 101,4 184,8 .
44 5 11,4 . . . 303,3 . . . 329,9 . . . 253,7 . . 89,9 97,2 113,4 84,6 .
44 6 54,5 . . . 80,2 . . . 609,4 . . . 326,4 . . 113,5 133,1 159 0 .
45 1 546,2 13,2 295,2 207 166,6 226,9 187,3 177,5 231,2 140,4 . . . . 0
45 2 168 63,7 87,3 321,3 463,9 290,3 642,7 340,6 0 393,3 190,5 . . . . 0
45 3 83,8 101,9 0 101,7 73,6 217,8 287,5 255,9 300,8 376,7 149,9 . . . . 0
45 4 181,4 183,8 57 88,7 318 244,6 143,4 210,7 311,7 292,5 . . . . 0
45 5 226,5 44,1 75,6 270,4 117,9 289,3 211,2 294,6 162,2 310,5 515,1 . . . . 0
45 6 182,6 240,1 55,3 217,8 177,3 208,1 503,7 170,2 189,2 222,4 392,9 . . . . 0
46 1 . . . . . . . . . . . 37 257,1 211,7 190,8 .
46 2 . . . . . . . . . . . 245,8 244,6 94,8 139,9 .
46 3 . . . . . . . . . . . 751,6 166,6 198,2 99 .
46 4 . . . . . . . . . . . 194,5 127,1 115,3 223,8 .
46 5 . . . . . . . . . . . 134,8 116 101,1 106,9 .
46 6 . . . . . . . . . . . 161,8 180,3 187,4 0 .
47 1 587,2 0 402 210,9 176,2 279,3 171,1 212,5 168,4 257,3 . . . . .
47 2 78,3 98,3 151,2 353,4 384,4 319,3 651,8 320,7 0 439,4 213,6 . . . . .
47 3 73,5 216,5 0 119,1 95,8 218,5 280,4 331,1 320 346,3 257,4 . . . . .
47 4 217,8 243,4 40,2 189,2 350,4 291,1 228,2 237,2 289,1 280,1 299,6 . . . . .
47 5 426,5 67,7 71,3 285 183 209,2 245,5 303,3 205,2 317,7 530,6 . . . . .
47 6 165,5 153,1 62,5 223,8 219,5 223,1 462,7 147,5 171,7 297,5 433,7 . . . . .
49 1 522,5 0 638,1 254,3 213 315,5 244,4 276,2 356,4 290,2 44,5 280,5 285,8 207 0
49 2 184 68,4 84,5 435,3 637,9 321 630 387,9 0 465,4 265,2 318 396,9 118 198,3 0
49 3 81,1 225,3 0 119,9 110,1 223,8 270,3 368,1 340,3 495 238,3 1087,2 310 388,8 125,5 0
49 4 232,7 181,3 55,3 178 347,6 310,3 260,6 206,1 356,4 470,5 447,6 189,6 245 143,3 295,1 0
49 5 363,3 61,8 92,5 362,4 158,7 415,2 254,2 378,8 198,5 433,8 690 149,7 147 119,6 160,7 0
49 6 240,3 252,1 52,9 292,7 172,8 206,7 508,1 289 268,8 347,6 435,4 241,9 258,3 246,5 0 0

Anhang 181
Fortsetzung Tab. 10
Tag
p.tr.
Tier Gruppenkodierung
5.1 5.2 5.3 5.4 7.1 7.2 7.3 7.4 8.1 8.2 8.3 8.4 1.1 1.2 1.3 1.4 2.4 4.4 6.4 9
51 1 597,5 2,9 438,9 323,6 162,6 372,1 320 353,4 465,6 339,3 43 302,7 421,6 319,3 .
51 2 181,3 141,5 171,1 521,5 560 439 778,5 421,2 0 592,5 299,9 336,5 385,1 178,9 257 .
51 3 99,6 216,3 0 100,4 132,3 301,7 348,5 570 390,8 560 268,8 1016,4 239,1 376,6 181,2 .
51 4 216,3 185 67 252,8 474,6 361,4 234,2 265,7 467 680,2 498,7 237,3 330,4 169 405,8 .
51 5 464,2 48,1 116,,9 311 263,7 388,8 355 444,7 306,6 470,5 743,2 181 262,4 153,2 213,4 .
51 6 303,2 193,2 75,8 329,1 249,3 331,2 834,3 265 272,7 446,9 562,7 162,2 296,2 275,2 0 .
53 1 743,6 8,8 629,4 319,8 217,8 417,1 305,6 352,2 515 331,2 21,4 422,9 543,7 382,9 0
53 2 210,8 115,2 153,9 737,4 634,2 461,7 891,1 502,9 0 602,5 356,4 470,6 429,5 171 278,7 0
53 3 123 291,1 0 202,6 147,5 345,1 458,4 593,6 550 692,7 352 1260,8 336,8 437,7 173,7 0
53 4 298,1 409,9 78,7 270,6 459,5 387,2 321,5 268,8 556,2 968,3 580,7 355,7 446,6 239,1 432,5 0
53 5 481,6 79,8 111,4 399,9 215,5 449,7 481,6 485,1 442,4 635,6 743,8 138,5 222,2 225,4 285,4 0
53 6 379 347,9 78,7 264 291,1 372,3 830,9 299,2 317,2 530 605 289,1 325,1 352,8 0 0
54 1 835 . . 777 . . 397,7 . . 626,7 . . . . . .
54 2 135,8 . . 807,5 . . 933,8 . . 862,9 . . . . . .
54 3 84,4 . . 187,8 . . 525,7 . . 632,7 . . . . . .
54 4 250,2 . . 230,6 . . 312,2 . . 953,1 . . . . . .
54 5 515,7 . . 535,6 . . 296,5 . . 786,3 . . . . . .
54 6 497,2 . . 221,1 . . 1037,2 . . 736,6 . . . . . .
55 1 . . . . . . . . . . .
55 2 . 242,6 . . . . . . . . . .
55 3 . 0 . . . . . . . . . .
55 4 . 94,6 . . . . . . . . . .
55 5 . 85,9 . . . . . . . . . .
55 6 . 84,7 . . . . . . . . . .
56 1 0 427 318 600,8 443,3 632 62,5 814,5 614,6 471,1 0
56 2 162,7 267,9 1138,3 495 569,2 0 594,9 446,7 537,1 246,2 370,1 0
56 3 313,1 0 217,4 439,6 757,7 692,9 445,4 1637,7 440 516,1 325,1 0
56 4 220,3 71,5 892,8 556,6 307,1 592,2 622,9 455,8 608,4 368,6 524,7 0
56 5 55,1 107 343,6 621,1 711,9 437,1 1015,6 239,1 344,6 275,7 380,8 0
56 6 248,8 69 366,5 497,2 364 396,1 825,9 355 337,6 413 0 0

182
Anhang
Fortsetzung Tab. 10
Tag
p.tr.
Tier Gruppenkodierung
5.1 5.2 5.3 5.4 7.1 7.2 7.3 7.4 8.1 8.2 8.3 8.4 1.1 1.2 1.3 1.4 2.4 4.4 6.4 9
58 1 . . . . . . 62,5 374,3 599,4 445,1 .
58 2 . 264,6 . . . . . 701,8 621,1 255,6 475,2 .
58 3 . 0 . . . . . 1897,1 436,4 647,5 253,6 .
58 4 . 64,1 . . . . . 430,8 645 283 524,4 .
58 5 . 97,6 . . . . . 295,7 370,4 365,1 533,1 .
58 6 . 77,1 . . . . . 318,2 500 422,3 0 .
59 1 0 . 461,7 398,9 721,4 566,8 702,4 . . . . 0
59 2 166,4 . 894,7 618 594,5 15,3 726,9 . . . . 0
59 3 328,7 . 288,3 518,4 726 907,2 595,6 . . . . 0
59 4 361,3 . 726 667,8 441,8 822,7 911,4 . . . . 0
59 5 46,1 . 370,3 878,4 824,2 655,5 953,3 . . . . 0
59 6 371,9 . 444,7 569,6 441,8 527,6 819,4 . . . . 0
60 1 . . . . . . 66,3 522,1 751,6 596,8 .
60 2 . 485,7 . . . . . 799,3 682,6 251,1 560 .
60 3 . 0 . . . . . 2170 561,1 615 439,2 .
60 4 . 71,6 . . . . . 498,7 998,3 329,4 587,1 .
60 5 . 135,2 . . . . . 365,1 412,5 433,9 567,8 .
60 6 . 103,6 . . . . . 421,1 550 441,8 0 .
63 1 0 665,1 583,8 792,6 715 869,8 51,9 975,8 1045,6 656,8 0
63 2 279,3 275,8 1468,5 950,4 737,7 4 919,1 871,2 645 259,6 576 0
63 3 378,7 0 365,8 816,1 1331,7 1125 928,2 807,4 749,4 451,7 0
63 4 409,9 99,2 1008 949,6 699,2 1192,1 1231,3 513,8 860,9 534,6 785,8 0
63 5 63,5 151 504,2 1176,3 1124 825,9 1347,9 339,4 570,9 521,4 542,5 0
63 6 473,6 99,9 814,6 926,3 720,4 787,1 1298,5 490,9 674,2 485,1 0 0
65 1 . . 41 722,2 867,5 575,8
65 2 269,5 . . 835,4 689,6 406,8 769,3
65 3 0 . . 777,7 1042,8 725,8
65 4 105,1 . . 740,1 701 497,1 673,2
65 5 163,8 . . 475,3 705,1 560,9 724,2
65 6 128 . . 545,9 756,9 579,5 0

Anhang 183
Fortsetzung Tab. 10
Tag
p.tr.
Tier Gruppenkodierung
5.1 5.2 5.3 5.4 7.1 7.2 7.3 7.4 8.1 8.2 8.3 8.4 1.1 1.2 1.3 1.4 2.4 4.4 6.4 9
66 1 . 700,4 973,8 . . . .
66 2 . 1175,5 0 . . . .
66 3 . 847 1235,6 . . . .
66 4 . 1062,9 1620 . . . .
66 5 . 1576,9 1127,4 . . . .
66 6 . 1230,2 813,2 . . . .
67 1 . . 46,2 848,9 1085,9 600,9
67 2 403,5 . . 906,3 934,3 376,2 670,7
67 3 0 . . 900,5 1249,3 722,3
67 4 102,5 . . 751,6 1130,4 635,6 737,4
67 5 197,2 . . 650,5 713,4 710 748,5
67 6 125 . . 835 912,7 667,4 0
70 1 796 1094,4 46,2 1180,8 1278,5 723,2
70 2 457,9 1819,8 0 1114,9 1150,6 503 757
70 3 0 1274,2 2060 999,4 1592,1 628,5
70 4 120 1107,8 2192 744,2 1031,5 642,7 1128,1
70 5 232,7 1864 1623,2 708,1 874,6 883,2 964,7
70 6 138,4 1446,8 1582,9 603,6 980,4 677,2 0
72 1 44,1 1481 1378 804,4
72 2 522,4 1176,3 1377,7 602,2 844,4
72 3 0 933,8 1264,7 744,3
72 4 153,7 649 1284,9 985,3 1568
72 5 220,9 496 1021,7 909,6 874,8
72 6 164,7 696 1174,6 760,1 0
74 1 39,8 1666 1361,6 1048,6
74 2 550,8 1318,8 1713,9 710,7 923,8
74 3 0 1149,8 1537,5 1169,9
74 4 223,7 834,7 1525,6 1086,5
74 5 277,2 560 966,9 1532,3 851,2
74 6 196,8 795 1401,1 874,1 0

184
Anhang
Fortsetzung Tab. 10
Tag
p.tr.
Tier Gruppenkodierung
5.1 5.2 5.3 5.4 7.1 7.2 7.3 7.4 8.1 8.2 8.3 8.4 1.1 1.2 1.3 1.4 2.4 4.4 6.4 9
77 1 36,1 2025 1829
77 2 574,8 1520,3 1790,5 836,4
77 3 0 1082,8 1766,5
77 4 230,3 1106,6 1522,2 1214,7
77 5 275,7 762,3 1556 1149,3
77 6 230,3 953,7 1543,9 1009,9
79 1 10,9 2958,2 2048
79 2 1085,2 2090,1 997,2
79 3 1757,3 1678,5
79 4 772,8 1898,9 1324,7
79 5 890,2 1990,9 1470
79 6 832,7 1965,1 1051,3
81 1 2092,4
81 2 588,1 1274,9
81 3 0 2716,8
81 4 231,2 2067,8
81 5 387,2 1730,5
81 6 282,4 1287,1
Legende: Tag p.tr., Tag nach Transplantation; 5.1/ 5.2/ 5.3/ 5.4, DH82-Transplantate mit zehnmaliger Injektion von CDV; 7.1/ 7.2/ 7.3/ 7.4,
DH82-Transplantate mit zehnmaliger Injektion von UV-inaktiviertem CDV; 8.1/ 8.2/ 8.3/ 8.4, DH82-Transplantate mit zehnmaliger Injektion von
Zellkulturmedium; 1.1/ 1.2/ 1.3/ 1.4, DH82-Transplantate ohne Injektion; 2.4, DH82-Transplantate mit einmaliger Injektion mit CDV; 4.4, DH82-
Transplantate mit einmaliger Injektion mit Zellkulturmedium; 6.4, DH82-Transplantate mit einmaliger Injektion mit CDV bei halber Tumorgröße;
9, Mocktransplantat (Zellkulturmedium); ., fehlender Messwert; †, Zeitpunkt nach i.d.R. planmäßiger Tötung des Tieres; alle Werte in mm³

Anhang 185
Tab. 11: Absolute Tumorvolumina in mm³ der DH82CDVpi-Tumoren und DH82-
Kontrolltumoren (Gruppenkodierung siehe Abschnitt 3.1.2)
Tag
p.tr.
Tier
Gruppenkodierung
3.0 3.1 3.2 3.3 3.4 1.A 1.B 1.C 1.0 1.4
2 1 . . . . . . . . . 0
2 2 . . . . . . . . . 21,4
2 3 . . . . . . . . . 0
2 4 . . . . . . . . . 0
2 5 . . . . . . . . . 0
2 6 . . . . . . . . . 32
3 1 9,4 7,8 14,4 7,4 . 18 9,2 0 10,6 .
3 2 11,6 0 0 6,1 . 24,3 0 8 8,1 .
3 3 11 0 9,8 5,3 . 11 0 11,6 7,9 .
3 4 8,4 0 9 0 . 10,1 4 0 11,8 .
3 5 0 0 9,8 7 . 17,2 11 7,8 0 .
3 6 12 0 7,7 5,8 . 7,8 13,2 0 11,7 .
4 1 . . . . 0 . . . . 21,4
4 2 . . . . 45,6 . . . . 33,2
4 3 . . . . 0 . . . . 0
4 4 . . . . 25,9 . . . . 33,2
4 5 . . . . 0 . . . . 18
4 6 . . . . 19,5 . . . . 9,8
7 1 21,5 8,1 9,7 4,6 18 12,5 5,1 6,5 0 33,2
7 2 27 9 0 4 13,5 11,2 5,3 1,5 3,7 33,2
7 3 23,8 8,8 10 5 0 7,3 0 6,5 3,3 0
7 4 30,2 5 11,3 6,9 6 6,9 4,6 8,3 5,3 33,2
7 5 30,3 0 9,8 6,4 18 8,3 5 1,7 2,9 18,8
7 6 33,5 2,5 6,9 5,3 13,5 5,4 8,3 3,4 6,5 18,8
9 1 . . . . 0 . . . . 6,1
9 2 . . . . 0 . . . . 22,4
9 3 . . . . 0 . . . . 6,2
9 4 . . . . 0 . . . . 13,5
9 5 . . . . 18 . . . . 14,9
9 6 . . . . 13,5 . . . . 21,4
10 1 6,9 8,9 0,5 . 0 0 5 .
10 2 11,2 1,1 18,2 . 0 0 5,5 .
10 3 6,5 8,3 6,2 . 0 0 4,5 .
10 4 8 5,1 4,2 . 2,04 0 0 .
10 5 0 8,4 7,9 . 2,7 0 0 .
10 6 5,3 4,3 7,3 . 0 2,04 6,4 .
11 1 . . . . . . . . . 11
11 2 . . . . . . . . . 8,3
11 3 . . . . . . . . . 0
11 4 . . . . . . . . . 9,8
11 5 . . . . . . . . . 23,3
11 6 . . . . . . . . . 17,9

186
Anhang
Fortsetzung Tab. 11
Tag
p.tr.
Tier
Gruppenkodierung
3.0 3.1 3.2 3.3 3.4 1.A 1.B 1.C 1.0 1.4
14 1 13,5 4 3,2 12,9 7,2 0 0 15,7
14 2 9,5 2,7 5,3 4 8,8 0 0 0
14 3 11,1 8,5 2,1 6 2,2 0 1,7 1
14 4 9,3 4,6 3,7 13,5 1,8 0 0 8,8
14 5 13,6 7,7 4,5 13,5 10,4 0 0 9,3
14 6 11,2 3,5 4,3 11,8 9,1 0 0 6,8
16 1 . . . . . . . . . 13,3
16 2 . . . . . . . . . 0
16 3 . . . . . . . . . 2
16 4 . . . . . . . . . 29,7
16 5 . . . . . . . . . 10,4
16 6 . . . . . . . . . 11
17 1 2,7 3,2 . 0 0 .
17 2 0,5 5,4 . 0 0 .
17 3 6,9 0 . 0 2,9 .
17 4 4,1 1,5 . 0 0 .
17 5 3,2 1,1 . 0 0 .
17 6 3,8 2 . 0 0 .
18 1 . . . . . . . . . 22,4
18 2 . . . . . . . . . 0
18 3 . . . . . . . . . 36,9
18 4 . . . . . . . . . 4,7
18 5 . . . . . . . . . 0
18 6 . . . . . . . . . 8,8
21 1 7,3 2,2 0,5 11,2 0 15,5
21 2 1,6 4 1,7 12 0 4
21 3 14,7 0 0 42,8 5,1 0
21 4 2,9 0 7,1 32,1 0 37
21 5 7,7 0 6,9 41,8 0 13,5
21 6 4,5 2 4,6 13,3 0 16,7
23 1 . . . . . . . . . 18,7
23 2 . . . . . . . . . 0
23 3 . . . . . . . . . 0
23 4 . . . . . . . . . 21,4
23 5 . . . . . . . . . 14,9
23 6 . . . . . . . . . 13,5
24 1 1,1 . 13,1 .
24 2 8,8 . 10,5 .
24 3 0 . 17 .
24 4 0 . 2,7 .
24 5 2,3 . 0 .
24 6 1,1 . 0 .

Anhang 187
Fortsetzung Tab. 11
Tag
p.tr.
Tier
Gruppenkodierung
3.0 3.1 3.2 3.3 3.4 1.A 1.B 1.C 1.0 1.4
25 1 . . . . 0 . . . . 9,8
25 2 . . . . 0 . . . . 11
25 3 . . . . 0 . . . . 6,5
25 4 . . . . 4,4 . . . . 25,6
25 5 . . . . 4,2 . . . . 14,9
25 6 . . . . 5 . . . . 128
28 1 0 0 54,5 15,1
28 2 3,6 0 19,7 23,3
28 3 0 0 37,8 32,4
28 4 0 0,5 7,8 18,5
28 5 0,5 2,5 0 8,5
28 6 0 2,6 0 19,7
30 1 . . . . . . . . . 25,3
30 2 . . . . . . . . . 28,5
30 3 . . . . . . . . . 37
30 4 . . . . . . . . . 24,9
30 5 . . . . . . . . . 14,6
30 6 . . . . . . . . . 23,3
31 1 0 . 72 .
31 2 5 . 28,7 .
31 3 0 . 53,4 .
31 4 0 . 30,4 .
31 5 0 . 0 .
31 6 0 . 0 .
32 1 . . . . 0 . . . . 32,8
32 2 . . . . 0 . . . . 32
32 3 . . . . 0 . . . . 40
32 4 . . . . 0,5 . . . . 24,5
32 5 . . . . 0,25 . . . . 22,5
32 6 . . . . 4 . . . . 25,1
35 1 0 0 379 31,5
35 2 4 0 87,5 62,5
35 3 0 0 192,5 100
35 4 0 0,5 219,8 37
35 5 0,8 0,25 77,5 27,9
35 6 0 1,1 0 48,7
Legende: DH82CDVpi = persistierend CDV-infizierte DH82-Zellen; Tag p.tr. = Tag nach
Transplantation; 3.0 / 3.1 / 3.2 / 3.3, DH82CDVpi-Transplantate; 1.A / 1.B / 1.C / 1.0 / 1.4,
DH82-Transplantate ohne Injektion; . = fehlender Messwert; = Zeitpunkt nach i.d.R.
planmäßiger Tötung des Tieres; Werte der Gruppe 1.4 nach Tag 35 p.tr. siehe Tab. 10;
Werte der Gruppe 3.4 nach Tag 35 p.tr. = 0; alle Werte in mm³

188
Anhang
Tab 12: Tumorgesamtfläche in µm² der DH82CDVpi-Tumoren und DH82-
Kontrolltumoren (Gruppenkodierung siehe Abschnitt 3.1.2)
Tier
Gruppenkodierung
3.0 3.1 3.2 3.3 3.4
1 1202716,25 1080575,01 816029,89 . .
2 1253476,48 788122,75 . 126603,48 .
3 1408878,64 1052209,87 840442,24 . .
4 1655607,91 556411,06 96083,10 . .
5 1184221,26 405963,48 378411,72 . .
6 970304,91 873655,64 326433,55 70392,26 .
1.A 1.B 1.C 1.0 1.4
1 721806,52 1207094,69 . 9792017,02 5554630,54
2 1307560,10 598322,53 1189059,36 7809085,49 26424435,68
3 1092773,05 315444,02 1670183,39 9682737,97 .
4 970389,03 367482,46 2192181,42 7370256,36 70073303,27
5 1269474,03 1456846,51 1313467,84 1799831,20 22750189,52
6 1131429,54 1167095,82 1131368,15 . 30988864,97
Legende: DH82CDVpi = persistierend CDV-infizierte DH82-Zellen; 3.0 / 3.1 /
3.2 / 3.3, DH82CDVpi-Transplantate; 1.A / 1.B / 1.C / 1.0 / 1.4, DH82-
Transplantate ohne Injektion; . = fehlender Messwert; alle Werte in µm 2

Anhang 189
Tab. 13: Nekrosefläche in µm² der DH82CDVpi-Tumoren und DH82-
Kontrolltumoren (Gruppenkodierung siehe Abschnitt 3.1.2)
Tier
Gruppenkodierung
3.0 3.1 3.2 3.3 3.4
1 582368,62 688891,17 790699,89 . .
2 709186,17 465571,54 . 118181,98 .
3 872202,14 983768,95 752672,98 . .
4 638852,06 437111,37 96083,10 . .
5 986840,70 405963,48 287050,22 . .
6 418072,77 853486,01 326433,55 46348,61 .
1.A 1.B 1.C 1.0 1.4
1 0,00 0,00 . 165432,43 1938210,46
2 70123,69 12706,70 7819,24 114127,35 4261193,79
3 128376,62 0,00 6319,88 265196,75 .
4 50909,81 17512,06 10508,24 39250,57 2780538,41
5 220011,03 78123,95 126813,48 47110,76 1917362,70
6 149710,76 19262,14 9969,25 . 4497941,55
Legende: DH82CDVpi = persistierend CDV-infizierte DH82-Zellen; 3.0 / 3.1 /
3.2 / 3.3, DH82CDVpi-Transplantate; 1.A / 1.B / 1.C / 1.0 / 1.4, DH82-
Transplantate ohne Injektion; . = fehlender Messwert; alle Werte in µm 2
Tab. 14: Nekrosefläche in % der Tumorgesamtfläche der DH82CDVpi-Tumoren
und DH82-Kontrolltumoren (Gruppenkodierung siehe Abschnitt 3.1.2)
Tier
Gruppenkodierung
3.0 3.1 3.2 3.3 3.4 1.A 1.B 1.C 1.0 1.4
1 48,40 63,75 96,90 . . 0,00 0,00 . 1,69 34,89
2 56,57 59,07 . 93,34 . 5,36 2,12 0,66 1,46 16,13
3 61,90 93,50 89,56 . . 11,75 0,00 0,38 2,73 .
4 38,58 78,56 100,00 . . 5,25 4,77 0,48 0,53 3,97
5 83,33 100,00 75,86 . . 17,33 5,36 9,65 2,61 8,43
6 43,09 97,69 100,00 65,84 . 13,23 1,65 0,88 . 14,52
Legende: DH82CDVpi = persistierend CDV-infizierte DH82-Zellen; 3.0 / 3.1 / 3.2 /
3.3, DH82CDVpi-Transplantate; 1.A / 1.B / 1.C / 1.0 / 1.4, DH82-Transplantate
ohne Injektion; . = fehlender Messwert; alle Werte in %

190
Anhang
Tab. 15: MHC II-positive Fläche in % der Tumorgesamtfläche der
DH82CDVpi-Tumoren und der DH82-Kontrolltumoren
(Gruppenkodierung siehe Abschnitt 3.1.2)
Tier
Gruppenkodierung
3.0 3.1 3.2 3.3 3.4 1.A 1.B 1.C 1.0 1.4
1 0 0 0 . . 0,0012 0,0101 . 0,1043 0,0232
2 0 0 . 0 . 0,0278 0,017 0,0142 0,7821 0,1701
3 0 0 0 . . 0,0088 0,0531 0,0303 0,2010 .
4 0 0 0 . . 0,0111 0,1091 0,0130 0,2860 3,0599
5 0 0 0 . . 0,0022 0,0113 0,0729 0,0777 0,0640
6 0 0 0 0 . 0,0258 0,1193 0,1877 . 4,6513
Legende: DH82CDVpi = persistierend CDV-infizierte DH82-Zellen; 3.0 / 3.1 / 3.2 /
3.3, DH82CDVpi-Transplantate; 1.A / 1.B / 1.C / 1.0 / 1.4, DH82-Transplantate
ohne Injektion; MHC = major histocompatibility complex; . = fehlender Messwert;
alle Werte in %
Tab. 16:
aktivierte Caspase 3-positive Fläche in % der Tumorgesamtfläche
der DH82CDVpi-Tumoren und DH82-Kontrolltumoren
(Gruppenkodierung siehe Abschnitt 3.1.2)
Tier
Gruppenkodierung
3.0 3.1 3.2 3.3 3.4 1.A 1.B 1.C 1.0 1.4
1 8,22 0,29 1,25 . . 0,35 0,03 . 0,23 0,71
2 1,32 0,90 . 0,13 . 1,39 0,05 0,35 0,51 1,03
3 0,80 3,67 0,00 . . 3,26 0,07 0,41 0,01 .
4 0,96 0,92 0,19 . . 1,76 0,08 0,04 0,14 0,39
5 1,21 0,49 0,49 . . 0,19 0,08 0,04 0,59 2,79
6 0,54 1,73 0,49 0,05 . 0,99 0,06 0,07 . 0,32
Legende: DH82CDVpi = persistierend CDV-infizierte DH82-Zellen; 3.0 / 3.1 / 3.2 /
3.3, DH82CDVpi-Transplantate; 1.A / 1.B / 1.C / 1.0 / 1.4, DH82-Transplantate
ohne Injektion; . = fehlender Messwert; alle Werte in %

Anhang 191
Tab. 17:
Anzahl CD31-positiver Gefäßstrukturen pro µm² Tumorfläche der
DH82CDVpi-Tumoren und DH82-Kontrolltumoren
(Gruppenkodierung siehe Abschnitt 3.1.2)
Tier
Gruppenkodierung
3.0 3.1 3.2 3.3 3.4
1 3,33E-06 0,00E+00 0,00E+00 . .
2 7,98E-07 1,27E-06 . 1,58E-05 .
3 1,42E-06 9,50E-07 4,76E-06 . .
4 7,85E-06 1,80E-06 5,20E-05 . .
5 3,38E-06 2,46E-06 5,29E-06 . .
6 8,24E-06 3,43E-06 6,13E-06 0,00E+00 .
1.A 1.B 1.C 1.0 1.4
1 4,21E-04 1,70E-04 . 8,80E-05 3,24E-06
2 3,39E-04 2,71E-04 1,24E-04 6,77E-05 5,26E-05
3 3,94E-04 1,90E-04 7,78E-05 4,97E-05 .
4 3,82E-04 2,53E-04 9,67E-05 5,55E-05 5,35E-05
5 3,93E-04 2,02E-04 2,44E-04 5,33E-05 4,30E-05
2,22E-04 2,56E-04 1,50E-04 . 5,65E-05
Legende: CD = cluster of differentiation; DH82CDVpi = persistierend CDVinfizierte
DH82-Zellen; 3.0 / 3.1 / 3.2 / 3.3, DH82CDVpi-Transplantate; 1.A /
1.B / 1.C / 1.0 / 1.4, DH82-Transplantate ohne Injektion; . = fehlender
Messwert; alle Werte in Anzahl pro µm² Tumorfläche

192
Anhang
Tab. 18:
Tier
Mac 3-positive Fläche in % der Tumorgesamtfläche (intratumoral)
und der als Tumorperipherie definierten Fläche (peritumoral)
DH82CDVpi-Tumoren und DH82-Kontrolltumoren (Gruppenkodierung
siehe Abschnitt 3.1.2)
Gruppenkodierung
peritumoral
1 5,98 18,56 1,02 9,50 4,33 18,55 . . . .
2 3,14 2,80 0,59 19,34 . . 2,09 4,99 . .
3 4,10 6,62 0,26 17,79 3,56 1,95 . . . .
4 10,74 6,17 0,75 7,69 1,70 38,59 . . . .
5 2,91 6,38 1,24 32,12 5,82 2,63 . . . .
6 9,83 5,73 0,27 18,49 8,15 26,43 1,76 6,10 . .
peritumoral
3.0 3.1 3.2 3.3 3.4
intratumoral
tumoral tumoral tumoral tumoral tumoral tumoral
peri- intra-
peri- intra-
peri- intra-
peritumoral
intratumoral
1.A 1.B 1.C 1.0 1.4
intratumoral
tumoral tumoral tumoral tumoral tumoral tumoral
peri- intra-
peri- intra-
peri- intra-
peritumoral
intratumoral
1 1,98 6,92 1,02 2,08 . . 3,90 1,49 0,46 0,11
0,90 4,03 0,59 4,11 1,52 1,84 1,48 0,56 0,53 0,53
3 2,73 7,83 0,26 3,81 0,34 0,37 2,64 0,37 . .
4 1,91 7,41 0,75 3,32 0,25 0,60 0,95 0,71 3,55 0,20
5 2,26 3,14 1,24 2,11 0,33 0,08 0,82 1,22 . 0,99
6 2,34 7,61 0,27 0,68 0,72 1,25 . . 5,37 1,41
Legende: DH82CDVpi = persistierend CDV-infizierte DH82-Zellen; 3.0 / 3.1 / 3.2 / 3.3, DH82CDVpi-
Transplantate; 1.A / 1.B / 1.C / 1.0 / 1.4, DH82-Transplantate ohne Injektion; . = fehlender Messwert;
alle Werte in %

Anhang 193
Tier
Gruppenkodierung
peritumoral
1 1,19 2,97 2,33 3,80 2,92 2,92 . . . .
2 1,92 3,46 2,92 4,54 . . 2,06 4,02 . .
3 1,39 2,01 2,26 4,06 6,42 9,65 . . . .
4 1,37 2,76 3,45 5,80 2,64 8,15 . . . .
5 1,39 2,24 3,68 0,95 2,30 1,66 . . . .
6 3,71 5,20 2,38 5,27 4,33 10,26 1,61 22,83 . .
peritumoral
Tab. 19: CD3-positive Fläche in % der Tumorgesamtfläche (intratumoral) und
der als Tumorperipherie definierten Fläche (peritumoral) DH82CDVpi-
Tumoren und DH82-Kontrolltumoren (Gruppenkodierung siehe
Abschnitt 3.1.2)
3.0 3.1 3.2 3.3 3.4
intratumoral
tumoral tumoral tumoral tumoral tumoral tumoral
peri- intra-
peri- intra-
peri- intra-
peritumoral
intratumoral
1.A 1.B 1.C 1.0 1.4
intratumoral
tumoral tumoral tumoral tumoral tumoral tumoral
peri- intra-
peri- intra-
peri- intra-
peritumoral
intratumoral
1 1,17 6,71 1,32 9,60 . . 0,86 3,65 0,68 1,70
2 1,12 5,80 1,16 7,65 0,72 3,58 1,96 4,50 1,92 1,20
3 1,65 10,32 0,48 11,38 1,79 9,37 2,82 3,69 . .
4 1,04 9,29 0,44 3,42 0,65 3,06 1,03 2,98 0,77 0,76
5 0,16 1,78 0,67 4,46 1,16 5,70 1,19 7,78 . 0,92
6 0,84 5,09 1,09 10,32 1,04 9,77 . . 1,23 1,25
Legende: CD = cluster of differentiation; DH82CDVpi = persistierend CDV-infizierte DH82-Zellen; 3.0 /
3.1 / 3.2 / 3.3, DH82CDVpi-Transplantate; 1.A / 1.B / 1.C / 1.0 / 1.4, DH82-Transplantate ohne
Injektion; . = fehlender Messwert; alle Werte in %

194
Anhang
Tab. 20:
CD45R-positive Fläche in % der Tumorgesamtfläche (intratumoral)
und der als Tumorperipherie definierten Fläche (peritumoral)
DH82CDVpi-Tumoren und DH82-Kontrolltumoren
(Gruppenkodierung siehe Abschnitt 3.1.2)
Tier
Gruppenkodierung
peritumoral
1 0,31 2,72 0,40 0,40 0,28 0,49 . . . .
2 0,39 1,84 0,42 0,42 . . 0,35 0,38 . .
3 0,30 0,87 0,34 0,34 0,97 1,99 . . . .
4 0,39 1,51 0,41 0,41 0,17 0,97 . . . .
5 0,34 2,26 0,97 0,97 0,33 1,25 . . . .
6 0,43 2,15 0,58 0,58 0,46 3,17 0,09 1,20 . .
peritumoral
3.0 3.1 3.2 3.3 3.4
intratumoral
tumoral tumoral tumoral tumoral tumoral tumoral
peri- intra-
peri- intra-
peri- intra-
peritumoral
intratumoral
1.A 1.B 1.C 1.0 1.4
intratumoral
tumoral tumoral tumoral tumoral tumoral tumoral
peri- intra-
peri- intra-
peri- intra-
peritumoral
intratumoral
1 0,20 1,12 0,07 0,75 . . 0,16 0,54 0,02 0,02
2 0,35 0,76 0,05 0,37 0,06 0,30 0,04 0,06 0,41 0,08
3 0,15 0,80 0,10 0,95 0,12 0,39 0,23 0,31 . .
4 0,21 1,33 0,11 0,76 0,04 0,16 0,06 0,30 0,07 0,03
5 0,11 0,61 0,11 0,71 0,08 0,37 0,06 0,71 . 0,10
6 0,13 1,50 0,07 0,65 0,11 0,31 . . 0,07 0,02
Legende: CD = cluster of differentiation; DH82CDVpi = persistierend CDV-infizierte DH82-Zellen; 3.0 /
3.1 / 3.2 / 3.3, DH82CDVpi-Transplantate; 1.A / 1.B / 1.C / 1.0 / 1.4, DH82-Transplantate ohne
Injektion; . = fehlender Messwert; alle Werte in %

Anhang 195
Tab. 21: Statistisch signifikante (p ≤ 0,05) Korrelationen zwischen
Merkmalen der DH82CDvpi-Tumoren
DH82CDVpi
Rho (r)
p-Wert
Tumorgesamtfläche
Nekrosefläche
aktivierte
Caspase
3
Mac 3
intratumoral
CD3
intratumoral
CD3
peritumoral
CD45R
intratumoral
CD45R
peritumoral
Tumorgesamtfläche
Nekrosefläche
aktivierte
Caspase
3
Mac 3
intratumoral
CD3
intratumoral
CD3
peritumoral
CD45R
intratumoral
-0,5958 0,6204 -0,4737 -0,4737
0,0071 0,0046 0,0405 0,0405
-0,5958 -0,6327 0,4763
0,0071 0,0036 0,0393
0,6204
0,0046
-0,6327
0,0036
-0,4737
0,0405
-0,4737 0,4763 0,6035
0,0405 0,0393 0,0062
0,5737
0,0102
CD45R
0,6035 0,5737
peritumoral
0,0062 0,0102
Legende: Auflistung der, nach dem Rangkorrelationsverfahren nach Spearman ermittelten, statistisch
signifikanten (p ≤ 0,05) Korrelationen.
CD = cluster of differentiation; DH82CDVpi = persistierend CDV-infizierte DH82-Zellen; Rho (r),
Rangkorrelationskoeffizient;
r = 0,2 bis 0,5 = schwacher bis mäßiger Zusammenhang;
r = 0,5 bis 0,8 = deutlicher Zusammenhang;
wenn r < 0 = gegenläufiger Zusammenhang; graue Felder = keine statistisch signifikante Korrelation

196
Anhang
Tab 22:
Statistisch signifikante (p ≤ 0,05) Korrelationen zwischen Merkmalen
der DH82-Tumoren
DH82
Rho (r)
p-Wert
Tumor-
ges.-
fläche
akt.
Casp.
3
Mac 3
it.
Mac 3
pt.
CD3
it.
CD45R
it.
CD45R
pt.
Nekrosefläche
Gefäßdichte
(CD31)
MHC
II
Tumor-
ges.-
fläche
-0,6978 -0,6978 -0,7509 -0,7900 0,5501

Anhang 197
Tab. 23: p-Werte der paarweisen Gruppenvergleiche der intra vitam
bestimmten Tumorvolumina der einfach intratumoral injizierten
DH82-Tumoren (Gruppenkodierung siehe Abschnitt 3.1.1)
Tag
nach
Transplantation
Gruppenvergleiche
2 und 4 2 und 6 2 und 1 4 und 6 4 und 1 6 und 1
32 0,5752 0,5219 0,9362 0,0222 0,3785 0,0353
35 0,5752 0,0358 0,9362 0,1207 0,8726 0,1207
37 0,0656 0,0358 0,3785 0,9273 0,4712 0,4113
39 0,2298 0,0552 0,1735 0,3153 0,9362 0,6481
42 0,3785 0,3153 0,5752 0,7842 0,9362 0,7842
44 0,3785 0,1207 0,2980 0,5228 0,6889 1,0000
46 0,3785 0,4113 0,7842 0,9273 0,5228 0,5309
49 0,2980 0,1709 0,5752 0,9273 0,8102 0,7842
51 0,4712 0,5228 0,2980 0,6481 0,9362 0,5228
53 0,8102 0,4113 0,8102 1,0000 1,0000 0,9273
56 0,3785 0,4113 0,5752 0,7842 0,8102 0,6481
58 0,3785 0,9273 0,5752 0,9273 0,8102 0,7842
60 0,2980 0,9273 0,4712 0,5228 0,8102 0,5228
63 0,1735 0,1207 0,0828 0,6481 0,4113 0,2963
65 0,3785 0,7842 0,4113 0,5228 0,5228 0,5309
67 0,2980 0,0358 0,0828 0,9273 0,9273 0,5309
70 0,4712 0,0828 0,0552 1,0000 0,5228 0,2963
72 0,1735 0,1207 0,0358 0,7842 0,1207 0,0947
74 0,2980 0,0700 0,0225 0,4555 0,0828 0,1779
77 0,2980 . 0,0225 . 0,1709 .
79 0,0306 . 0,0081 . 0,0225 .
Legende: Gruppe 2, intratumorale Injektion mit CDV (canine distemper virus); Gruppe 4,
intratumorale Injektion mit UV-inaktiviertem CDV; Gruppe 1, keine intratumorale Injektion;
Gruppe 6, intratumorale Injektion mit CDV bei halber Tumorgröße; weiße Felder = hoch
signifikant (p ≤ 0,01); hellgraue Felder = signifikant (p ≤ 0,05); dunkelgraue Felder = nicht
signifikant (p > 0,05); . = fehlender Messwert; nach Wilcoxon-Rangsummentest

198
Anhang
Tab. 24:
p-Werte der paarweisen Gruppenvergleiche der intra vitam
bestimmten Tumorvolumina der zehnfach intratumoral injizierten
DH82-Tumoren (Gruppenkodierung siehe Abschnitt 3.1.1)
Tag
nach
Transplantation
Gruppenvergleiche der Tumorvolumina
5 und 7 5 und 8 5 und 1 7 und 8 7 und 1 8 und 1
35 0,1320 0,0767 0,1561 0,5567 0,8771 0,4961
37 0,1133 0,0058 0,1159 0,2745 0,8690 0,1835
39 0,1084 0,0010 0,0142 0,0059 0,0833 0,0851
41 0,0040 0,0001 0,0006 0,0565 0,1304 0,7125
43 0,0068 0,0003 0,0002 0,0620 0,0550 0,9696
44 0,2980 0,0051 0,0549 0,0202 0,2417 0,1012
45 0,0083 0,0068 0,0020 0,7637 0,1031 0,2117
47 0,0092 0,0079 0,0015 0,6693 0,0864 0,2117
49 0,0136 0,0017 0,0016 0,5583 0,1455 0,3425
51 0,0044 0,0010 0,0018 0,3672 0,1288 0,5373
53 0,0297 0,0037 0,0028 0,1687 0,0738 0,2750
54 0,6889 0,2298 0,0306 0,3785 0,0927 0,2980
56 0,0003 0,0012 0,0014 0,8399 0,5067 0,5067
58 . . 0,1098 . . .
59 0,0032 0,0043 0,0051 0,5252 0,0277 0,0830
60 . . 0,2410 . . .
63 0,0002 0,0009 0,0028 1,0000 0,7818 0,8294
65 0,0142 0,1098 0,1779 0,9362 0,0225 0,1207
67 . . 0,1779 . . .
70 0,0142 0,1098 0,1779 0,6889 0,0225 0,1207
72 . . 0,2703 . . .
74 . . 0,1779 . . .
77 . . 0,1761 . . .
Legende: Gruppe 5, intratumorale Injektion mit CDV (canine distemper virus); Gruppe 7,
intratumorale Injektion mit UV-inaktiviertem CDV; Gruppe 8, intratumorale Injektion mit
Zellkulturmedium; Gruppe 1, keine intratumorale Injektion; weiße Felder = hoch signifikant
(p ≤ 0,01); hellgraue Felder = signifikant (p ≤ 0,05); dunkelgraue Felder = nicht signifikant
(p > 0,05); . = fehlender Messwert; nach Wilcoxon-Rangsummentest

Anhang 199
Tab. 25:
p-Werte des paarweisen Vergleichs der intra vitam bestimmten
Tumorvolumina am Tag der ersten intratumoralen Injektion (Tag
35) und dem PZP 4 (Tag 70 bei den Gruppen 7 und 8; Tag 77 bei
den Gruppen 5 und 1) der zehnfach intratumoral injizierten DH82-
Tumoren (Gruppenkodierung siehe Abschnitt 3.1.1)
Gruppe
5 7 8 1
Vergleich der
Tumorvolumina
zwischen Tag 35
0,0020 0,0002 0,0138 0,0303
und PZP 4
Legende: Gruppe 5, intratumorale Injektion mit CDV (canine
distemper virus); Gruppe 7, intratumorale Injektion mit UVinaktiviertem
CDV; Gruppe 8, intratumorale Injektion mit
Zellkulturmedium; Gruppe 1, keine intratumorale Injektion;
weiße Felder = hoch signifikant (p ≤ 0,01); nach Wilcoxon-
Rangsummentest; PZP = Probennahmezeitpunkt

200
Anhang
Tab. 26:
p-Werte der paarweisen Gruppenvergleiche der intra vitam
bestimmten Tumorvolumina der DH82CDVpi- und DH82-Tumoren
Tag nach
Transplantation
Vergleich der Tumorvolumina der
DH82CDVpi- und DH82-Tumoren
3 0,1125
4 0,6242
7 0,1491
9 0,0724
10 < 0,0001
14 < 0,0001
17 0,0002
21 0,1851
24 0,2858
25 0,0048
28 0,0012
31 0,0608
32 0,0048
35 0,0009
37 0,0028
39 0,0028
42 0,0028
44 0,0028
46 0,0028
49 0,0028
51 0,0028
53 0,0028
56 0,0028
58 0,0028
60 0,0028
63 0,0039
65 0,0039
67 0,0039
70 0,0039
72 0,0039
74 0,0039
77 0,0039
Legende: DH82CDVpi = persistierend CDV-infizierte
DH82-Zellen; weiße Felder = hoch signifikant (p ≤ 0,01);
dunkelgraue Felder = nicht signifikant (p > 0,05); nach
Wilcoxon-Rangsummentest

Anhang 201
Tab. 27:
p-Werte der paarweisen Gruppenvergleiche der histologischen
und immunhistologischen Merkmale der DH82CDVpi- und DH82-
Tumoren
PZP
Vergleich der Merkmale der DH82CDVpi- und DH82-Tumoren
MHC
II
Tumor-
ges.-
fläche
in µm²
Nekrosefläche
in
%
akt.
Caspase
3
Gefäßdichte
(CD31)
Mac 3
it.
Mac 3
pt.
CD3
it.
CD3
pt.
CD45R
it.
CD45R
pt.
1 0,0028 0,2980 0,0051 1,0000 0,0051 0,5752 0,0051 0,0927 0,0306 0,0202 0,0202
2 0,0028 0,8102 0,0050 0,0051 0,0051 0,0051 1,0000 0,1282 0,0051 0,0051 0,0051
3 0,0075 0,0122 0,0119 0,2963 0,0122 0,0122 0,0122 1,0000 0,0122 0,0122 0,0122
4 0,0786 0,0814 0,0814 0,1752 0,0814 0,0814 0,8465 0,3329 0,5613 0,3329 0,3329
Legende: akt. = aktivierte; CD = cluster of differentiation; DH82CDVpi = persistierend CDV-infizierte
DH82-Zellen; it. = intratumoral; MHC = major histocompatibility complex; pt. = peritumoral;
Tumorges.fläche = Tumorgesamtfläche; PZP = Probennahmezeitpunkt; PZP 1, 7 Tage nach
Transplantation; PZP 2, 14 Tage nach Transplantation; PZP 3, 21 Tage nach Transplantation; PZP 4, 35
Tage nach Transplantation; weiße Felder = hoch signifikant (p ≤ 0,01); hellgraue Felder = signifikant (p
≤ 0,05); dunkelgraue Felder = nicht signifikant (p > 0,05); nach Wilcoxon-Rangsummentest;

202
Anhang
Tab. 28:
p-Werte der paarweisen Gruppenvergleiche der PZP innerhalb der
histologischen und immunhistologischen Merkmale der
DH82CDVpi-Tumoren
Histologisches /
immunhistologisches
Merkmal
Vergleich der PZP der DH82CDVpi
1 und 2 1 und 3 1 und 4 2 und 3 2 und 4 3 und 4
MHC II . . . . . .
Tumorges.fläche
in µm²
0,0131 0,0081 0,0668 0,1207 0,0668 0,1752
Nekrosefläche in % 0,0306 0,0135 0,1336 0,4070 0,8676 0,3286
akt. Caspase 3 0,5752 0,0552 0,0668 0,2353 0,0668 0,3329
Gefäßdichte
(CD31)
0,2298 0,6481 1,0000 0,0996 1,0000 1,0000
Mac 3 it. 0,0306 0,7842 0,4047 1,0000 0,0668 0,8465
Mac 3 pt. 0,0051 0,6481 0,0668 0,0081 0,0668 0,3329
CD3 it. 0,1735 0,3153 0,1336 0,4113 0,6171 0,5613
CD3 pt. 0,0656 0,0358 0,4047 0,4113 0,0668 0,0814
CD45R it. 0,9362 0,5228 0,1336 0,4113 0,1336 0,3329
CD45R pt. 0,0927 0,9273 0,4047 0,3153 0,1336 0,5813
Legende: akt. = aktivierte; CD = cluster of differentiation; DH82CDVpi = persistierend
CDV-infizierte DH82-Zellen; it. = intratumoral; MHC = major histocompatibility
complex; pt. = peritumoral; Tumorges.fläche = Tumorgesamtfläche; PZP =
Probennahmezeitpunkt; PZP 1, 7 Tage nach Transplantation; PZP 2, 14 Tage nach
Transplantation; PZP 3, 21 Tage nach Transplantation; PZP 4, 35 Tage nach
Transplantation; weiße Felder = hoch signifikant (p ≤ 0,01); hellgraue Felder =
signifikant (p ≤ 0,05); dunkelgraue Felder = nicht signifikant (p > 0,05); . = kein
Vergleich möglich; nach Wilcoxon-Rangsummentest

Anhang 203
Tab. 29:
p-Werte der paarweisen Gruppenvergleiche der PZP innerhalb der
histologischen und immunhistologischen Merkmale der DH82-
Tumoren
Histologisches /
immunhistologisches
Merkmal
Vergleich der PZP der DH82
1 und
2
1 und
3
1 und
4
1 und
5
2 und
3
2 und
4
2 und
5
3 und
4
3 und
5
4 und
5
MHC II 0,0927 0,0552 0,0081 0,0225 0,7842 0,0552 0,0828 0,0367 0,2101 1,0000
Tumorges.fläche
in µm²
Nekrosefläche in
%
0,5752 0,0828 0,0081 0,0081 0,1207 0,0081 0,0081 0,0216 0,0122 0,0947
0,0756 0,1709 0,0828 0,4113 0,9271 1,0000 0,0222 0,2963 0,0367 0,0122
akt. Caspase 3 0,0051 0,0358 0,0828 0,7842 0,6481 0,0081 0,0081 0,2101 0,0601 0,0947
Gefäßdichte
(CD31)
0,0202 0,0137 0,0081 0,0081 0,0358 0,0081 0,0081 0,0216 0,0122 0,2101
Mac 3 it. 0,0306 0,0081 0,0081 0,0081 1,0000 0,0358 0,0225 0,8345 0,8345 0,4034
Mac 3 pt. 0,0131 0,0137 0,7842 1,0000 0,7842 0,0552 0,4555 0,0601 0,1779 0,9025
CD3 it. 0,5752 0,9273 0,2353 0,0081 0,4113 0,1709 0,0081 0,5309 0,0122 0,0122
CD3 pt. 0,6889 0,9273 0,3153 0,9151 0,6481 0,1709 0,3374 0,2963 0,7133 0,3913
CD45R it. 0,0927 0,0081 0,0137 0,0081 0,0225 0,0552 0,0081 0,8345 0,0122 0,0367
CD45R pt. 0,0051 0,0137 0,2353 0,2410 1,0000 0,9273 0,5940 1,0000 0,9025 0,9025
Legende: akt. = aktivierte; CD = cluster of differentiation; DH82CDVpi = persistierend CDV-infizierte
DH82-Zellen; it. = intratumoral; MHC = major histocompatibility complex; pt. = peritumoral;
Tumorges.fläche = Tumorgesamtfläche; PZP = Probennahmezeitpunkt; PZP 1, 7 Tage nach
Transplantation; PZP 2, 14 Tage nach Transplantation; PZP 3, 21 Tage nach Transplantation; PZP 4,
35 Tage nach Transplantation; weiße Felder = hoch signifikant (p ≤ 0,01); hellgraue Felder =
signifikant (p ≤ 0,05); dunkelgraue Felder = nicht signifikant (p > 0,05); nach Wilcoxon-
Rangsummentest

204
Anhang
Tab. 30:
p-Werte der paarweisen Gruppenvergleiche der Lokalisation
(intratumoral / peritumoral) der Immunreaktion der DH82CDVpi
und DH82-Tumoren
PZP
Vergleich der Lokalisation
(intratumoral / peritumoral) der
Immunreaktion der
DH82CDVpi- Tumoren
Vergleich der Lokalisation
(intratumoral / peritumoral) der
Immunreaktion der
DH82- Tumoren
Mac 3 CD3 CD45R Mac 3 CD3 CD45R
1 0,6889 0,0453 0,0051 0,0051 0,0051 0,0051
2 0,0051 0,6560 0,0051 0,0202 0,0051 0,0051
3 0,4034 0,2963 0,0216 0,6761 0,0122 0,0122
4 0,2453 0,2453 0,2453 0,1437 0,0122 0,0947
5 . . . 0,2703 0,9025 0,5403
Legende: CD = cluster of differentiation; DH82CDVpi = persistierend CDV-infizierte
DH82-Zellen; PZP = Probennahmezeitpunkt; PZP 1, 7 Tage nach Transplantation;
PZP 2, 14 Tage nach Transplantation; PZP 3, 21 Tage nach Transplantation; PZP
4, 35 Tage nach Transplantation; weiße Felder = hoch signifikant (p ≤ 0,01);
hellgraue Felder = signifikant (p ≤ 0,05); dunkelgraue Felder = nicht signifikant (p
> 0,05); nach Wilcoxon-Rangsummentest

Anhang 205
9.5. Abkürzungen
Abb.
ABC
Aqua bidest.
Aqua dest.
Abbildung
Avidin-Biotin-Komplex
Aqua bidestillata
Aqua destillata
bFGF
BHK 21
BrdU
BSA
bzw.
basic fibroblast growth factor
baby hamster kidney 21-Zellen
Bromdesoxyuridin
bovines Serumalbumin
beziehungsweise
°C Grad Celsius
CD
cluster of differentiation
CD3
CD3-Antigen
CD45R
CD45R-Antigen
CDV
canine distemper virus, kanines Staupevirus
CDV-Ond
Onderstepoort-CDV-Stamm
CDV-OndeGFP
green fluorescent protein exprimierender CDV-Ond-
Stamm
CEA carcinoembryonic antigen, karzinoembryonales
Antigen
CPiV
canine parainfluenza virus
crAd
conditionally replicating Adenovirus
DAF
DAB
DGBM
DH82
DH82CDVpi
decay accelerating factor
3,3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid
dog glioblastoma multiforme
DH82-Zelllinie
persistierend mit dem CDV infizierte DH82-Zellen

206
Anhang
DNS
Desoxyribonucleinsäure
EBE
EGF
EZM
Essigsäurebutylester
epithelial growth factor
extrazelluläre Matrix
Fa.
Firma
g
GM-CSF
GTP
Gramm
Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender
Faktor
Guanosintriphosphat
h
HCl
HE
HIF
Stunde
Salzsäure
Hämatoxylin-Eosin
Hypoxie-induzierender Faktor
INF
IL
iNOS
Interferon
Interleukin
inducible nitric oxide synthase
kGy
Kilogray
L
Liter
M
M1
M2
MV
MV-Ed
Molarität
M1-Phänotyp der Makrophagen
M2-Phänotyp der Makrophagen
Maservirus
Edmonstonstamm des Masernvirus

Anhang 207
MHC
major histocompatibility complex
Min.
Minuten
ml
Milliliter
µl Mikroliter
mm
Millimeter
µm Mikrometer
MMP
Matrixmetalloproteinase
NaCl
Natriumchlorid
NaOH
Natronlauge
NKG2D
natural killer group 2D
NK-Zellen
Natürliche Killerzellen
NKT-Zellen
Natürliche Killer-T-zellen
NO
Stickstoffmonoxid
NOD/SCID non-obese diebetic/severe combined
immunodeficiency
Nr.
Nummer
p.a.
pro analysi (für analytische Zwecke)
PBS
phosphate buffered saline, Phosphat-gepufferte
Kochsalzlösung
PDGF
platelet derived growth factor
p.tr.
post transplantationem, nach der Transplantation
PZP
Probennahmezeitpunkt
PZPpi Probennahmezeitpunkt im Versuch mit den
Transplantaten persistierend CDV-infizierter DH82-
Zellen
RAG
RAS
RNS
recombination activating gene
rat sarcoma
Ribonukleinsäure

208
Anhang
ROS
RT
reactive oxygen species, reaktive Sauerstoffspezies
Raumtemperatur
SCID
SLAM
STAT
sog.
severe combined immunodeficiency
signaling lymphocyte activation molecule
signal transducer and activator of transcription
sogenannt
Tab.
Tabelle
TAM
Tumor-assoziierte Makrophagen
TIMP
tissue inhhibitor of matrix metalloproteinases
TNF
Tumornekrosefaktor
TUNEL terminal desoxynucleotidyl transferase-mediated
dUTP nick end labeling
UV
ultraviolett
VEGF
VSV
vascular endothelial growth factor
Vesikuläres Stomatitisvirus
WDT Wirtschaftsgenossenschaft deutscher Tierärzte
(WDT) eG
z.B.
z.T.
zum Beispiel
zum Teil

Danksagung 209
10. Danksagung
Die Doktorandenzeit geht zu Ende und ich blicke zurück auf einige Jahre, die ohne die, mir zu
Teil gewordenen, wertvollen Unterstützungen und Hilfestellungen weniger reibungslos und
angenehm verlaufen wären.
Mein besonderer Dank geht an
...Herrn Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, PhD für die Bereitstellung dieses spannenden,
innovativen und überaus interessanten Projektes. Danke auch für seine intensive,
projektbezogene Betreuung sowie sein offenes Ohr und die guten Ratschläge über das Projekt
hinaus.
...Frau Dr. Christina Puff für die gute Zusammenarbeit, ihre ständige Ansprechbarkeit, die
konstruktive Kritik, den Spaß bei der Arbeit sowie die intensive und detaillierte Durchsicht
dieser Seiten.
...die Studienstiftung des Deutschen Volkes für die finanzielle und ideele Unterstützung sowie
an den Vertrauensdozenten Herrn Prof. Dr. Hagen Gasse für den Blick über den Tellerrand.
...Herrn Dr. Karl Rohn des Institutes für Biometrie, Epidemiologie und
Informationsverarbeitung für die freundliche und umfassende statistische Beratung.
...Kerstin Schöne, Caroline Schütz, Danuta Waschke und Michael Müller für die gute
Zusammenarbeit und die vielen Hilfestellungen im Rahmen des Tierversuches sowie Kerstin
Rohn, Anika Ludemann, Mohammed Sayed-Ahmed und Kathrin Becker für
verantwortungsvolles und verlässliches Einspringen, wenn Not am Mann war.

210
Danksagung
...Bettina Buck und Petra Grünig für viele Schnitte und die kompetente und schnelle
Durchführung immunhistologischer Färbungen.
...meine liebste Bürokollegin Charlotte für schöne und lustige Zeiten, auch wenn die
Anspannung mal groß war, sowie ihren wertvollen professionellen und privaten Beistand in
vielen Arbeits- und Lebenslagen und für das Putzen der Kaffeemaschine.
...alle Kollegen und Freunde des Institutes für Pathologie für die hervorragende
Arbeitsatmosphäre und insbesondere an Ina, Maja, Sofie und Ulli für Kaffee, Keks, Schwatz
und Gelächter sowie Anna-Katharina, den Hahn, Frauke, Jonas, Kristel und Pfani für die
größten Konzertabende und den aus den Beinen und dem Kopf getanzten Stress.
...alle namentlich nicht erwähnten, aber nicht minder wertgeschätzten, lieben Freunde und
Wegbegleiter für schöne Momente und die nötige Ablenkung.
...Fred.
...meine Familie und insbesondere an meine wundervollen Eltern für ihre bedingungslose
Liebe und Unterstützung in jeglicher Hinsicht.
...diejenigen, deren Leben tagtäglich in den Dienst der Forschung gestellt wird.

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