Der GMOfinder - DLR Online: Deutsche Lebensmittel Rundschau

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Zucker- und Alkoholgehalten auf die Trennleistung der optimierten
Bestimmungsmethode untersucht.
Material und Methoden
Chemikalien
Die Standards Gallussäure, Protocatechusäure, Tyrosol,
Protocatechualdehyd, (+)-Catechinhydrat, Vanillinsäure,
Syringasäure, (–)-Epicatechin, Kaffeesäure, p-Cumarsäure,
Syringaaldehyd, Ferulasäure und trans-Resveratrol wurden
von Sigma Aldrich (Taufkirchen), (–)-Epicatechingallat von
AppliChem (Darmstadt) und die Caftarsäure von Phyto-
Plan (Heidelberg) erworben. Ethanol p. a. (Merck, Darmstadt)
wurde zur Herstellung der Kalibrierlösungen verwendet.
Acetonitril (HPLC-grade, Prolabo, Darmstadt)
und Phosphorsäure (85 %, Merck, Darmstadt) wurden zur
Fließmittelherstellung verwendet.
Weine
Zur Überprüfung der Eignung der Kinetex-PFP-Säule zur
Bestimmung des Polyphenolgehaltes im Weißwein wurden
folgende Weine unterschiedlicher Rebsorten und Alkoholgehalte
herangezogen: Bernkasteler Badstube Riesling trocken
(2010, 11,5 %Vol., 8,1 g/L Restzucker), Riesling feinherb
(2010, 11 %Vol., 22,1 g/L Restzucker), Riesling
Zeltinger Schlossberg fruchtsüß (2010, 11 %Vol., 69,7 g/L
Restzucker), Rivaner QbA trocken (2011, 12 %Vol.,
6,4 g/L Restzucker), Blanc de Noir QbA trocken (2011,
13 %Vol., 7,7 g/L Restzucker), Gewürztraminer QbA trocken
(2011, 13,5 %Vol., 1,8 g/L Restzucker).
Analytische Methode
Die Chromatografie der Polyphenole erfolgte an einem
Agilent Technologies System der Serie 1200 mit UV-Detektor.
Zur Trennung der einzelnen Polyphenole wurde
eine Kinetex-PFP-Säule (75 × 4,6 mm; 2,6 μm; TMS encapped)
der Fa. Phenomenex verwendet. Als Fließmittel
A wurde Wasser/Phosphorsäure (99,5/0,5 %; v/v; pH 1,6)
und als Fließmittel B Acetonitril/Wasser/Phosphorsäure
(50/49,5/0,5 %; v/v; pH 1,9) verwendet (Rechner et al.,
1998; Bonerz et al., 2008). In Tabelle 1 ist das verwendete
Stufen-Gradientensystem wiedergegeben. Die Flussrate
betrug 1 mL/min; das Injektionsvolumen lag bei
20 μL. Die Chromatogramme wurden bei den Wellenlängen
280 und 320 nm aufgenommen.
Tab. 1 Gradientenprogramm
Time [min] % A % B
0 90 10
13 62 38
20 60 40
22 0 100
27 0 100
28 90 10
35 90 10
Probenvorbereitung
Die Proben und Kalibrierstandards wurden membranfiltriert
(Cellulose-Acetat-Membran; 0,45 μm; VWR, Darmstadt,
Deutschland) und anschließend direkt injiziert.
Validierungsparameter
Die Kalibrierstandards wurden im Bereich von 0,1 bis
200 mg/L je Analyt in einer 10 %igen Ethanollösung p. a.
angesetzt. Die Zuordnung der Polyphenole im Wein erfolgte
anhand der Retentionszeiten der Peaks der entsprechenden
Standards. Zur Untersuchung der Matrixeinflüsse
des Weines wurde zusätzlich eine Weinprobe mit 10 mg/L
der aufgeführten Polyphenole aufdotiert und die Retentionszeiten
verglichen. Die Quantifizierung erfolgte mittels
linearer Regression der Peakflächen der Kalibrierstandards
und wurde als Konzentration in mg/L angegeben. Zur Ermittlung
der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen wurde
ein Signal/Rausch-Verhältnis von 3:1 bzw. 10:1 beim
kleinsten Standard herangezogen (Kromidas, 1999). Zur
Ermittlung der Wiederfindungsraten der verwendeten Polyphenole
wurde der Kalibrierstandard der Konzentration
10 mg/L gemessen. Zur Ermittlung der Verfahrens-Standardabweichungen
der Polyphenole wurde die mit 10 mg/L
aufdotierte Weinprobe zehnfach gemessen.
Ergebnisse und Diskussion
Chromatografische Trennung
Bei dieser Methode wird eine Säule mit einer Pentafluorphenyl-Phase
(Abb. 1) eingesetzt, die aufgrund ihres Aufbaus
mit den aromatischen und polaren Molekülbestandteilen
der Polyphenole Wechselwirkungen ausbilden kann.
Weiterhin zeichnet sich die verwendete Kinetex-Säule
durch die kurze Trennlänge (75 μm) und die geringe Partikelgröße
der stationären Phase (2,6 μm) aus, wodurch eine
verkürzte Trenndauer der Polyphenole erreicht werden
kann. Im Gegensatz zu vollporösen Partikeln bestehen die
Partikel der verwendeten Kinetex-Säule aus einem festen
Kern mit einer porösen Hülle. Dadurch wird eine reduzierte
Diffusionsstrecke der Analyten erreicht, was zu einer
verbesserten Auflösung und einer verkürzten Trenndauer
führt (Phenomenex, Torrance, CA/USA).
Bei den bisher in der Literatur beschriebenen Methoden
wurden meist Säulen mit C18- bzw. Fluofix-Phasen (vollporöse
Partikel, 5 μm Partikelgröße) mit einer Länge von
250 mm verwendet, bei denen die Trennung der Polyphenole
pro Lauf zwischen 45 und 70 Minuten dauert.
Durch die Verwendung der Kinetex-PFP-Säule konnte die
Trenndauer der Polyphenole auf weniger als 20 Minuten
verkürzt werden. Die anschließenden 15 Minuten des Gradientenprogramms
dienen der Spülung der Säule.
Die verwendeten Eluenten Wasser/Phosphorsäure (99,5/
0,5 % v/v; pH 1,6) und Acetonitril/Wasser/Phosphorsäure
(50/49,5/0,5 % v/v; pH 1,9; Rechner et al. 1998; Bonerz et
al., 2008) haben sich im Gegensatz zu anderen in der Literatur
beschriebenen Eluenten aus beispielsweise Wasser
» 108. Jahrgang | Dezember 2012 | DLR