Der GMOfinder - DLR Online: Deutsche Lebensmittel Rundschau

642 Sonderthema: Mikrobiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik «
Logarithmus der Zellzahl
Anlauf
lag-
Phase
Trophophase
exponentielle
lag-Phase
t 1
Abb. 2
Wachstumskurve der
Hefe [5]
Diese Studie wird gefördert
durch das Zentrale
Innovationsprogramm
Mittelstand
(ZIM) des Bundesministeriums
für Wirtschaft
und Technologie
(BMWi) (Förderkennzeichen
KF2132320SK1).
Abb. 3
Teilabschnitt der rRNA-
Gene (partial 18S rRNA
gene – ITS1 – 5.8S rRNA
gene – ITS2 – partial 28S
rRNA gene)
ITS1
18S
rDNA
lnx t2
Idiophase
lnx t1
lnx t0
t 2
ITS1
stationäre
Phase
fugiert. Von der so extrahierten Proteinlösung
werden 1 µL auf das „polished
steel“ Target (Bruker Daltronics) aufgetragen
und mit 1,5 µL Matrix Cyano-
4-hydroxyzimtsäure (HCCA α-cyano-4-
hydroxycinnamic acid) überschichtet.
MALDI-TOF-MS
Absterbe-
Phase
lnx max
Zeit
Die präparierte Targetplatte wird in das
MALDI-TOF-MS-System (Bruker Daltonics)
eingeschleust und analysiert. Für den festgelegten
Massenbereich von 2–20 kDa
wird im „linear positiv“ Modus gemessen.
In diesem Bereich können überwiegend
ribosomale Proteine erfasst werden, welche
der Identifikation der unterschiedlichen
Hefestämme dienen. Durch einen
Escherichia coli-Teststandard wird der gewählte
Massenbereich kalibriert. Weitere
Geräteparameter sind in Tabelle 3 aufgeführt.
ITS3
5.8S
rRNA
ITS2
ITS2
28S
rDNA
ITS4
PCR-Sequenzierung
Für die Validierung der MALDI-TOF-MS-
Analytik dient das molekularbiologische
PCR-Verfahren mit anschließender Nukleotidsequenzierung
als Referenzsystematik.
Ein Teilabschnitt der rDNA-Gene (partial
18S rRNA gene – ITS1 – 5.8S rRNA gene
– ITS2 – partial 28S rRNA gene) wird zur
Unterscheidung der Hefen verwendet.
Amplifiziert wird mit den universellen
ITS1- und ITS4-Primern [6] (Abb. 3). Nach
anschließender Sequenzierung erfolgt ein
Vergleich der Basenpaare zur Unterscheidung
der unterschiedlichen Hefen.
In der Abbildung 4 ist ein Sequenzabgleich
von vier verschiedenen Stämmen
der Nicht-Saccharomyces-Fremdhefen und
Saccharomyces-Hefen dargestellt. Mithilfe
der Sequenzierungsdaten können
Unterschiede bzw. Gemeinsamkeiten auf
Gattungsebene sicher festgestellt werden.
Auswertung der Ergebnisse
Die generierten Spektren, wie beispielhaft
in Abbildung 5 dargestellt, werden
nach der Methodenvalidierung mithilfe
der MALDI-Biotyper-Software (Bruker
Daltonics) in einer neu angelegten Hefedatenbank
erfasst.
Aufgrund der hohen Anzahl an spektralen
Variablen, welche ein mehrvariables
Problem darstellen, muss diese mathematische
Diskrepanz durch eine multivariate
bzw. chemometrische Methode gelöst
werden.
Mithilfe der CAMO Software „The
Unscrambler ® X“ wird eine Hauptkomponentenanalyse
(PCA – Principal Component
Analysis) durchgeführt, bei der die
MALDI-TOF-MS-Datenpunkte mit vielen
Eigenschaften auf einige wenige potente
Komponenten reduziert werden. Die Reduktion
der Dimensionalität erlaubt es,
Zusammenhänge mit wesentlich weniger
Variablen zu beschreiben. Zudem dient sie
zur Identifizierung von Ausreißern und
der Erkennung von typischen Mustern.
In einer PCA-Darstellung gibt es d-
Dimensionen (Messgrößen/Signalintensität)
und n-Objekte (Messungen/Spek-
» Dezember 2012 | DLR