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B L I T Z L I C H T
werden konnte, daß durch noch längere Oligonukleotide
die Spezifität nicht erhöht wird.
In einem theoretischen Versuch wurden für
90 zufällig aus Saccharomyces cerevisiae ausgewählte
Gene nicht sequenzüberlappende Oligonukleotide
verschiedener Länge berechnet.
Die Sequenzen der gefundenen Oligonukleotide
wurden dann mittels eines Smith-
Waterman-Alignments mit allen offenen Leserastern
(open reading frames, ORF) der
Hefe verglichen. Dabei wurde überprüft, wie
oft die Sequenz eines einzelnen Oligonukleotids
bestimmter Länge nochmals im Hefegenom
mit einer definierten Ähnlichkeit gefunden
werden kann. Die dabei ermittelte Anzahl
der Treffer wurde durch die Anzahl der
Oligonukleotide der gegebenen Länge dividiert,
um so der Tatsache Rechnung zu tragen,
daß für ein gegebenes Gen zahlenmäßig
mehr kürzere als längere Oligonukleotide
entworfen werden können und somit auch
eine größere Zahl von Treffern gelandet werden
kann. Dem Experiment wird die Beobachtung
zugrundegelegt, daß zwei Transkripte
mit einer Ähnlichkeit größer gleich 75%
über 50 bp nicht mehr durch Hybridisierung
auf einem Oligonukleotid- oder cDNA-Array
voneinander unterschieden werden können 5 .
Wie in Abbildung 2 zu erkennen ist, sind
50mer Oligonukleotide spezifisch, da die Anzahl
der Treffer bei 75% Ähnlichkeit und höher
durch noch längere Oligonukleotide nicht
stärker abnimmt als bei 50mer Oligonukleotiden.
Längere Oligonukleotide sind somit nicht
spezifischer als 50mer-Oligonukleotide. Diese
Annahme wurde in Experimenten in der
Praxis bestätigt, wobei eine optimale Oligonukleotidlänge
von 55 Basen ermittelt wurde
7 . Essentiell beim Design von Oligonukleotiden
ist, daß die Sequenz eines Oligonukleotids
keine 15 Nukleotide oder mehr am Stück
enthalten darf, die zu einem Nicht-Ziel-Transkript
exakt komplementär sind, da dies sonst
zu Kreuzhybridisierung führt 5, 6 .
Qualitätskontrolle bei Microarrays
Abb. 2: Anzahl der Übereinstimmungen,
mit der die Oligonukleotide
für 90 zufällig
ausgewählte Hefegene mit
entsprechender Ähnlichkeit im
Hefegenom nochmals gefunden
werden konnten. Erläuterungen
siehe Text. Die Spezifität
kann durch Oligonukleotide
länger als 50 Basen nicht
mehr erhöht werden, da die
Anzahl der Sequenzübereinstimmungen
75% von längeren
Oligonukleotiden im
Vergleich zu 50meren nicht
mehr reduziert werden kann.
Für die meisten potentiellen DNA-Microarray-Anwender
stellt sich die Frage, ob ein auf
PCR-Produkten basierender oder ein auf Oligonukleotiden
basierender Microarray das Instrument
der Wahl ist. Für eine Massenproduktion
eines DNA-Microarrays ist es essentiell,
daß alle dafür verwendeten Komponenten
eine gleichbleibende Qualität besitzen. Bei
Microarrays auf PCR-Produkt-Basis (auch
cDNA-Arrays genannt) werden die PCR-Produkte
oder deren zugrundeliegende Template-DNA
nur in wenigen Fällen durch Sequenzierung
auf ihre Identität überprüft. Meist
werden die erhaltenen PCR-Produkte auf einem
Agarose-Gel aufgetrennt und hinsichtlich
ihrer zu erwartenden Größe und deren Homogenität
kontrolliert. Dieser Gel-Check ist unabdingbar,
da nicht jede PCR-Reaktion erfolgreich
ist und die Ausbeute sowie die Uniformität
an Produkt von Reaktion zu Reaktion beträchtlich
variieren können. PCR-Produkte mit
unscharfen Banden oder Mehrfachbanden
müssen eliminiert werden. In manchen Fällen
stellt die Abtrennung von PCR-Primer-Multimeren
vom gewünschten Produkt ein nicht zu
unterschätzendes Problem dar, vor allem bei
der Aufreinigung durch Ultrafiltration.
Abb. 3: Überprüfung der Immobilisierung von
Oligonukleotiden auf der Chipoberfläche
durch unspezifische Hybridisierung mit fluoreszenzmarkierten
Zufallsoligonukleotiden.
Mit Pfeilen gekennzeichnet sind Oligonukleotide,
die nur unzureichend immobilisiert wurden.
Die unterschiedlichen Intensitäten der
Spots sind durch die unterschiedliche
Sequenzverteilung bei der Herstellung der
fluoreszenzmarkierten Zufallsoligonukleotide
bedingt. Zudem stehen nicht alle Zufallsoligonukleotide
infolge von Sekundärstrukuren und
Multimerbildung für eine Hybridisierung zur
Verfügung. Ist ein Punkt kaum noch oder gar
nicht mehr zu detektieren, so kann davon
ausgegangen werden, daß die Immobilisierung
der Nukleinsäure fehlerhaft erfolgte
(Pfeile).
Bei Oligonukleotiden müssen die verkürzten
Oligonukleotide und sonstigen Nebenprodukte
sowie die für die nachfolgende Oligonukleotid-Immobilisierung
störenden Salze
und aminogruppenhaltigen Komponenten
effizient von den gewünschten Vollängenprodukten
abgetrennt werden. Für eine Aufreinigung
im hohen Durchsatz ist das nicht
mehr mittels HPLC, sondern nur noch mit
geeigneten Methoden wie der MWG-eigenen
HPSF ® -Technik (highly purified, salt free) zu
bewerkstelligen.
Auch für die nachfolgende Qualitätskontrolle
der Oligonukleotide mittels MALDI-TOF-
Massenspektrometrie ist die Salzfreiheit von
Vorteil. Wie bereits erwähnt, ist die Abtrennung
von verkürzten Oligonukleotiden und
sonstigen Fehlsequenzen vom Vollängen-
Oligonukleotid bei der in situ-Synthese auf
dem Chip nicht möglich.
Sind alle zu immobilisierenden Nukleinsäuren
– ob cDNA oder Oligonukleotide – gereinigt
und liegen in der entsprechenden Konzentration
im jeweiligen Spottingpuffer vor, so
kann mit dem mechanischen Aufbringen (Spotten)
der Nukleinsäuren auf das Trägermaterial
begonnen werden. Um sicherzugehen, daß
beim Überführen der Nukleinsäuren in die
beim Spotten verwendeten Mikrotiterplatten
kein Vertauschen oder Auslassen von Kavitäten
unterlaufen ist, hat es sich als sinnvoll
erwiesen, an bestimmten Plätzen der zu spottenden
Mikrotiterplatte entsprechende Kontrollen
zu plazieren. Diese ergeben je nach
Anordnung auf dem Array ein charakteristisches
Muster, für gewöhnlich in der linken
oberen und der rechten unteren Ecke eines
jeden Subarrays sowie an bestimmten Plätzen
innerhalb des Subarrays. Fehlt dieses Muster
nach Hybridisierung des Arrays mit den markierten
und zu den Kontrollen komplementären
Gegenstrang-Oligonukleotiden, so ist während
des Befüllens der Kavitäten oder beim
Spotten ein Fehler unterlaufen und daher keine
einwandfreie Zuordnung der Sonden auf
dem Array zu den entsprechenden Genen mehr
möglich. Zudem können diese Punkte als Referenzpunkte
für die Justierung eines Gitters bei
der Arrayauswertung herangezogen werden.
Kontrollspots
Diese Kontrollspots werden auch zur Überprüfung
möglicher Probenverschleppungen
herangezogen. Leuchtet nach der Hybridisierung
der Kontrollspots mit deren markierten
Gegenstrang-Oligonukleotid auch derjenige
Spot auf, der im Anschluß an den Kontrollspot
auf den Array aufgebracht wurde – also
meist der benachbarte Spot –, so kann davon
ausgegangen werden, daß eine Verschleppung
der zuvor gespotteten Probe stattgefunden
hat. Zwei mögliche Fehlerquellen
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14 | Nr. III/2001 |transkript LABORWELT