R E P O R T Abb. 2: Verfahrensablauf beim sekundären Labeling mit Fluorophor-Markern oder Metall- Nanopartikeln Denn das Fluoreszenzsignal hängt nicht nur von Intensität und Wellenlänge des Anregungslichtes und der Dichte der gebundenen Farbstoffmoleküle ab, sondern auch von der chemischen Umgebung der Farbstoffmoleküle. Umgebungsabhängige Quantenausbeuten schränken die Übertragbarkeit und Reproduzierbarkeit von Meßergebnissen deutlich ein. Die elektronische Anregung der Farbstoffmoleküle durch die absorbierten Photonen führt zugleich zu Nebenprozessen. Neben der strahlungslosen thermischen Relaxation findet in einem gewissen Umfang auch eine chemische Umwandlung aus dem angeregten Zustand statt. Dadurch werden Chromophore zerstört, so daß während der Messung die Zahl der absorbierenden und fluoreszierenden Moleküle abnimmt. Diese Strahlungsdegradation – auch Photobleichung genannt – ist ihrerseits von der chemischen Umgebung abhängig. Sie trägt zur Unsicherheit bei der quantitativen Bewertung von Fluoreszenzsignalen bei. Die Farbstoffmoleküle sind auch bei längerfristiger Lagerung nicht ohne weiteres stabil, da sie neben dem raschen photochemischem Abbau auch einem thermischen Abbau unterliegen, der allerdings deutlich langsamer verläuft. Farbstoffmarkierte Biochips können deshalb nur bedingt archiviert werden. Oberflächenfunktionalisierte Metall-Nanoteilchen Die Schwierigkeiten bei der Anwendung von Fluoreszenzfarbstoffen für die Markierung von Biochips können vermieden werden, wenn an ihrer Stelle Nanopartikel zum Einsatz kommen 3 . Nanopartikel vereinigen in sich Eigenschaften von Festkörpern und von Molekülen. Sie sind typische Vertreter sogenannter mesoskopischer Systeme, deren Verhalten im Grenzbereich zwischen Quantensystemen und makroskopischen Systemen angesiedelt ist. Die Wechselwirkung größerer Partikel mit Festkörperoberflächen wird zumeist von unspezifischen Wechselwirkungen dominiert. Dies erklärt sich dadurch, daß bei Kontaktflächen, die nicht nur einzelne Atome oder funktionelle Gruppen betreffen, sondern ausgedehntere Ensembles einbeziehen, die Summe vieler schwächerer unspezifischer Wechselwirkungen, wie etwa van-der- Waals-Bindungen und Dipol/Dipol-Effekte, eine einzelne oder einige wenige spezifische Bindungen dominiert. Reduziert man den Durchmesser von Partikeln, so können diese mit bestimmten chemischen Oberflächengruppen spezifische Wechselwirkungen mit komplementär bindenden Gruppen einer Festkörperoberfläche eingehen, wobei die stärkeren spezifischen Wechselwirkungen die Summe der unspezifischen Wechselwirkungen übertrifft. Eine hochspezifische Wechselwirkung kann durch die Hybridisierung zueinander komplementärer Nukleinsäuresegmente (Oligonukleotide) erreicht werden, von denen der eine Typ eine an eine planare Festkörperoberfläche gebunden ist, der komplementäre an einen Nanopartikel (Abb. 1). Dazu werden Oligonukleotide mit einer Thiolgruppe versehen. So thiolierte Oligonukleotide bilden auf Goldoberflächen selbstassemblierende molekulare Filme aus, wobei die Thiolgruppe eine feste Verbindung mit der Metalloberfläche eingeht. Untersuchungen zum Bindeverhalten von Gold-Nanopartikeln, die mit Oligonukleotiden funktionalisiert waren, zeigten, daß bei Partikeldurchmessern zwischen 15 und 60 nm noch gut eine spezifische Bindung an Chipoberflächen erreicht werden konnte, die mit den komplementären Oligonukleotiden bedeckt waren. Oberflächen, die mit nicht-komplementären DNA-Segmenten versehen waren, zeigten keine oder zumindest eine signifikant schwächere Affinität gegenüber den entsprechenden Nanopartikeln. Damit werden Metallteilchen, die immerhin noch einige Hunderttausend bis Millionen Atome enthalten, wie Moleküle chemisch selektiv gekuppelt 4,5 . Die Kopplung funktioniert auch, wenn die Dichte der komplementär bindenden Moleküle auf der Festkörperoberfläche verringert wird. Wahrscheinlich genügen einige wenige, vielleicht sogar nur eine einzige Bindung, um das Metallteilchen auf der Oberfläche zu fixieren. Damit wird ein enorm günstiges Verhältnis von gekoppelten Atomen zu koppelnder Bindung erreicht. Wahr- scheinlich liegt dieses Verhältnis im Bereich zwischen 10 4 und 10 6 . Allein diese große Zahl bedeutet einen signifikanten Verstärkungseffekt. Neben der Zahl der Atome spielt aber ihre Art eine noch viel bedeutsamere Rolle. Metallische Nanopartikel sind elektronenleitfähig und gehen mit elektromagnetischer Strahlung intensive Wechselwirkungen durch Streuung, Absorption oder Reflexion ein. Besonders attraktiv sind sie aufgrund ihrer starken, Partikelgrößen-abhängigen Absorption von Licht im Bereich der Plasmonenresonanzfrequenz. Partikel aus Edelmetall können außerdem in einfachen Redoxprozessen katalytisch wirken. Dieser Effekt ist aus der Fotografie bekannt. Dort werden metallische Primärkeime, die im Extremfall aus nur vier Silberatomen bestehen durch einen Redoxprozeß verstärkt, in dem Elektronen aus einem Reduktionsmittel (dem Entwickler) auf Silberkationen übertragen werden. Während für einen solchen Verstärkungsprozeß in der Fotografie Silberhalogenidkristalle als Silberionenspender fungieren, kann für die metallkatalysierte Verstärkung an oberflächenimmobilisierten Goldpartikeln das Silber auch in Form von gelösten Silberionen zugeführt werden. Mit einem solchen Prozeß ist eine rasche chemische Verstärkung von einmal fixierten Goldpartikeln möglich: (Au Ag + + Reduktionsmittel kat ) Ag Abb. 3: Ausbildung einer scharfen Kante der Nanopartikelbedeckung auf einer Chipoberfläche an der Grenze zwischen einem bindenden und einem nichtbindenden molekularen Oberflächenfilm (SFM-Aufnahme) Will man ein solches Verstärkungsverfahren einsetzen, so brauchen die spezifisch zu bindenden Metallpartikel, also die eigentlichen Markierungselemente, nicht maximiert zu werden. Man kann ihre Größe den Erfordernissen der selektiven Oberflächenreaktion anpassen. Der Einsatz von Metallpartikel für die Markierung von molekularen Bindeereignissen greift die bewährten Prinzipien der Radioisotopmarkierung bzw. der Fluoreszenzmarkierung auf. Es bleibt die Reihenfolge der wesentlichen Prozeßschritte erhalten (Abb. 2): Inkubation eines Testchips mit der Probenflüssigkeit Spülprozeß Kennziffer 13 LW 03/www.biocom.de Info 6 | Nr. III/2001 |transkript LABORWELT
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