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B L I T Z L I C H T Der DNA-Prozessor ist in vier voneinander unabhängige Subräume untergliedert, die zwar alle parallel synthetisiert werden, aber später jeder für sich als individuelle Arrays oder wahlweise alle vier zusammen als ein großer Array verwendet werden können. Ein wesentlicher Vorteil der Geniom-Technologie besteht darin, daß sich das Array- Design den Anwender-Bedürfnissen individuell anpassen läßt. Durch die Flexibilität beim Aufbau des Arrays, können unter anderem die Länge der Oligonukleotid-Sonden, die Zahl der pro Gen verwendeten Sonden, interne Kontrollsonden sowie Perfect Match/Mismatch-Strategien auf das jeweilige Experiment optimal abgestimmt werden. Array-Hybridisierung und -Analyse Nach der Array-Synthese wird die zu untersuchende markierte Probe über ein Probenzugabeventil zugegeben. Hierbei können vom Anwender softwaregesteuert Hybridisierungparameter wie Zeit, Temperatur, Puffer und Durchmischung sehr genau kontrolliert werden. Peltiergesteuert steht dem Anwender ein breiter Temperaturbereich von 10 bis 95 °C zur Verfügung. Hervorzuheben ist auch das für die Hybridisierung benötigte Probenvolumen, das durch das verschwindend geringe Innenvolumen des DNA-Prozessors gegeben ist. Pro Hybridisierungs-Assay werden 15-20 µl Probenvolumen benötigt, das durch eine kontrollierte Bewegung während des Hybridisierungsvorganges immer wieder an den Oligonukleotid-Sonden aktiv vorbeigeführt wird und so zu einer Verbesserung der Hybridisierungskinetik führt. Die durch die Hybridisierung erzeugten Fluoreszenzsignale werden mit einer CCD- Kamera detektiert. Der Anwender ist durch Verwendung eines Filterrades nicht an einen bestimmten Farbstoff gebunden. Es können sowohl Einfarben- als auch Mehrfarben-Experimente durchgeführt werden, Abb. 3: Anwendungsbeispiele. (a) Expression- Profiling (Hefe, 30.000 Sonden, 25mere). (b) Genotypisierung von HPV- Stämmen. (c) Mutations- Analyse (20 Sonden pro SNP; auch bei einem geringen Abstand von 7 bp zwischen zwei SNPs ist die Mutation eindeutig zu bestimmen) bei denen zum Beispiel zwei Transkriptionszustände direkt auf dem gleichen Array vergleichbar sin. Da für die Experimente mit der Geniom- Technologie nur digitale Daten als Input benötigt bzw. digitale Daten als Output erzeugt werden, ist es durch intelligente Bioinformatiksoftware möglich, das im vorangegangenen Experiment erlangte Wissen am nächsten Tag sofort für ein verbessertes Chipdesign umzusetzen. Applikationen Die hohe Flexibilität der in situ-Synthese, jedes mögliche Muster von DNA-Sonden, das in digitaler Form als Sonden-Sequenzdatei definiert wird, auf dem Array herzustellen, wirkt sich besonders auf die Anzahl verfügbarer Applikationen aus. Die Palette reicht von Expressions-Studien und Resequenzierungen bis hin zu Genotypisierungs-Anwendungen wie der SNP-Detektion und Mutationsanalysen. Abbildung 3 zeigt eine Auswahl von Anwendungen, die auf der Geniom-Plattform durchgeführt wurden. Momentan umfaßt der Informationsgehalt eines DNA-Prozessors 40.000 Oligonukleotid-Sonden, wobei durch die Unterteilung in Subräume wahlweise vier unterschiedliche Proben mit jeweils 10.000 Sonden oder eine Probe gegen alle 40.000 Sonden untersucht werden kann. Bei Expressionsstudien kann der Anwender zwischen einem Setup unter Verwendung langer (typischerweise 50 bis 60mere) oder einem mit kurzen Oligonukleotid-Sonden wählen. Die erste Variante erlaubt die Simulation gespotteter cDNA-Arrays, wobei ein Gen typischerweise durch einige wenige lange Oligonukleotid-Sonden repräsentiert wird 7 . Bei Verwendung kurzer Sonden werden für ein Gen klassischerweise 16 bis 20 Oligonukleotide (20-25mere) benutzt und durch einen ebenso großen Satz von Mismatch-Oligonukleotiden ergänzt. Das Design spezieller Assays zum Aufspüren von Splice-Varianten von Genen ist auf der Geniom-Plattform sowohl mit langen und mit kurzen Oligomeren- Arrays möglich. Abbildung 3a zeigt eine Expressionsstudie, die mit 30.000 Hefe-spezischen Oligonukleotid-Sonden realisiert wurde. Hierbei wurden jeweils 16 Oligonukleotid-Sonden mit den jeweils zugehörigen Mismatch-Sonden für die Repräsentation eines Gens benutzt. Weiterhin lassen sich auf der Geniom-Plattform alle Assays durchführen, die Mutationen mit einer Sensitivität bis hin zu einem Einezlbasenpaaraustausch detektieren. Sollen bislang unbekannte Mutationen gefunden werden, wird die zu untersuchende Sequenz klassischerweise als Tiling-Array auf den Array aufgebracht und per Hybridisierung Base für Base resequenziert. So wurden hohe Ausbeuten (>97%) bei der Resequenzierung von Fragmenten bislang bis zu einer Länge von 2 kb erzielt. Bekannte Mutationen können durch mutationsspezifische Oligonukleotid-Sonden effektiv nachgewiesen werden. Auf der Geniom- Plattform hat sich ein Assay-Format, das bis zu 20 spezifische Oligonukleotid-Sonden zur Detektion einer Mutation verwendet, als äußerst effektiv erwiesen, selbst wenn zwei Mutationen sehr eng zueinander positioniert sind (Abb. 3c). Im Hinblick auf Genotypisierungs-Assays konnten beispielsweise unterschiedliche Stämme des Humanen Papillom-Virus (HPV) eindeutig charakterisiert werden. Hierbei fanden spezifische Oligonukleotid-Sonden Verwendung, die es ermöglichen, gezielt zum Beispiel HPV2b neben anderen HPV-Stämmen nachzuweisen (Abb. 3b). Literatur 1. Lemieux B., Aharoni A., Schena M., Mol. Breeding, 4, 277-289, (1998) 2. Schena M., Shallon D., Davis R., Brown P., Science, 270, 467-470, (1995) 3. Southern E., Maskos U., Elder R., Genomics, 13, 1008-1017, (1992) 4. Pease A.C., et.al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91, 5022-5026, (1994) 5. Lockhart D. et.al., Nat. Biotechnol., 14, 1675-1680, (1996) 6. Cronin M.T., et.al., Human Mutation, 7, 244-255, (1996) 7. Hughes T.R. et.al., Nat. Biotechnol, 19, 342-347, (2001) Kontaktadresse febit gmbh Käfertalerstr. 190 68167 Mannheim Tel.: 0621-3804-0 Fax: 0621-3804-400 Wissenschaftliche Korrespondenz: Peer Stähler, Chief Scientific Officer eMail: peer.staehler@febit.de 38 | Nr. III/2001 |transkript LABORWELT
B L I T Z L I C H T Oligonukleotid-Arrays Sequenzoptimierte Longmer- Oligonukleotide für DNA-Microarrays CHRIS SEIDEL 1 , SAJEEV BATRA 1 , DR. RALF HUCH 2 UND DR. PETER SCHÜSSLER 3 , 1 OPERON INC., ALAMEDA (CA), USA, 2 QIAGEN GMBH, HILDEN, 3 OPERON EUROPE, KÖLN DNA-Microarrays ermöglichen die parallele Expressionsanalyse einer großen Anzahl von Genen in einem Experiment. Dabei können die zu untersuchenden Gene durch Oligonukleotide oder PCR-Fragmente auf dem DNA-Microarray repräsentiert werden. Bei der Genexpressionsanalyse mit Hilfe von PCR-Fragment- Microarrays (cDNA-Arrays) kommt es aufgrund von Kreuzhybridisierungen zwischen homologen DNA-Sequenzen häufig zu Schwierigkeiten, die Expressionsmuster verwandter Gene zu unterscheiden. Ebenso titativ erfaßt werden kann. In der hier beschriebenen Untersuchung werden 70mer- Microarrays mit PCR-Fragment-Microarrays hinsichtlich ihrer Fähigkeit verglichen, die durch Hitzeschock induzierte differentielle Genexpression zu analysieren. Experimentelles Vorgehen Die DNA-Microarrays zur Untersuchung des Hitzeschock- Effekts auf die Genexpression bei der Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae, Stamm S288C) Abb. 1: Untersuchungen zur Hitzeschock-Genexpression mit 70merund PCR-Fragment-Arrays. Der Einfluss einer Hitzeschock-Behandlung auf die Expression von Hefegenen wurde insgesamt vier Microarrays untersucht: zwei waren mit 70mer-Oligonukleotiden des Yeast Genome Oligo Set „gespottet“ (70mer) und zwei mit PCR-Fragmenten (PCR). Zum Vergleich sind veröffentlichte Daten mit aufgenommen (Publ; Daten aus Referenz 2). Die Expressionsverhältnisse für drei bestimmte Genfamilien sind dargestellt. schwierig ist es, auf diese Weise Gene zu untersuchen, die über differentielles Splicing für verschiedene Transkripte codieren. Darüber hinaus ist die PCR eine aufwendige Methode, um einen vollständigen Satz von DNA- Sonden für die Microarray-Produktion herzustellen. Die chemische DNA-Synthese von 70mer-Oligonukleotiden (auch Longmere genannt) ist demgegenüber ein effizientes Verfahren, DNA-Sondenmoleküle für Microarrays herzustellen, mit denen die Genexpression quanwurden entweder mit synthetischen 70mer-Oligonukleotiden des Yeast Genome Oligo Sets (Operon) oder mit PCR-Fragmenten hergestellt, die vollständige offene Leserahmen (open reading frames, ORFs) spezifischer Hefegene repräsentieren. Als feste Phase dienten Poly-L- Lysin-beschichtete Glasobjektträger, auf denen die Nukleinsäure-Sonden nach Standardmethoden 1 immobilisiert wurden. Die Hefezellen wurden in YPD- Medium bei 25 °C bis zu einer optischen Dichte (OD) von 0,8 kultiviert. Die Kultur wurde dann in zwei gleiche Volumina geteilt und die eine Hälfte einer Hitzeschock-Behandlung von 30 min bei 40 °C ausgesetzt. Anschließend wurden die mRNAs aus behandelten und unbehandelten Zellen isoliert (RNeasy ® und Oligotex ® Kits, QIAGEN) und durch reverse Transkription (Omniscript Reverse Transcriptase, QIAGEN) in cDNA umgeschrieben. Während der reversen Transkription, die für beide mRNA-Populationen getrennt verlief, wurden die cDNA-Moleküle unter Einbau Cy3- oder Cy5-gekoppelter Nukleotide markiert. Diese unterschiedlich markierten Target-cDNAs wurden gleichzeitig für die Hybridisierung der Microarrays eingesetzt. Ergebnisse und Diskussion Der Yeast Genome Oligo Set (Operon) besteht aus insgesamt 6.307 sequenzoptimierten, für Hefe-ORFs spezifischen 70mer- Bitte nutzen Sie unseren Kennziffer-Service – auch online unter www.biocom.de: Wenn Sie ein Produkt interessiert, einfach Nummer ankreuzen, Name und Adresse angeben und faxen/mailen – Sie erhalten umgehend Informationen unserer Inserenten. Kennziffer 27 LW 03/www.biocom.de Informationen? Anzeige |transkript LABORWELT Nr. III/2001 | 39
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