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B L I T Z L I C H T
Der DNA-Prozessor ist in vier voneinander
unabhängige Subräume untergliedert, die
zwar alle parallel synthetisiert werden, aber
später jeder für sich als individuelle Arrays
oder wahlweise alle vier zusammen als ein
großer Array verwendet werden können.
Ein wesentlicher Vorteil der Geniom-Technologie
besteht darin, daß sich das Array-
Design den Anwender-Bedürfnissen individuell
anpassen läßt. Durch die Flexibilität
beim Aufbau des Arrays, können unter
anderem die Länge der Oligonukleotid-Sonden,
die Zahl der pro Gen verwendeten
Sonden, interne Kontrollsonden sowie Perfect
Match/Mismatch-Strategien auf das jeweilige
Experiment optimal abgestimmt
werden.
Array-Hybridisierung
und -Analyse
Nach der Array-Synthese wird die zu untersuchende
markierte Probe über ein Probenzugabeventil
zugegeben. Hierbei können
vom Anwender softwaregesteuert Hybridisierungparameter
wie Zeit, Temperatur,
Puffer und Durchmischung sehr genau
kontrolliert werden. Peltiergesteuert steht
dem Anwender ein breiter Temperaturbereich
von 10 bis 95 °C zur Verfügung. Hervorzuheben
ist auch das für die Hybridisierung
benötigte Probenvolumen, das durch
das verschwindend geringe Innenvolumen
des DNA-Prozessors gegeben ist. Pro Hybridisierungs-Assay
werden 15-20 µl Probenvolumen
benötigt, das durch eine kontrollierte
Bewegung während des Hybridisierungsvorganges
immer wieder an den
Oligonukleotid-Sonden aktiv vorbeigeführt
wird und so zu einer Verbesserung der
Hybridisierungskinetik führt.
Die durch die Hybridisierung erzeugten
Fluoreszenzsignale werden mit einer CCD-
Kamera detektiert. Der Anwender ist durch
Verwendung eines Filterrades nicht an einen
bestimmten Farbstoff gebunden. Es
können sowohl Einfarben- als auch Mehrfarben-Experimente
durchgeführt werden,
Abb. 3: Anwendungsbeispiele.
(a) Expression-
Profiling (Hefe, 30.000
Sonden, 25mere). (b) Genotypisierung
von HPV-
Stämmen. (c) Mutations-
Analyse (20 Sonden pro
SNP; auch bei einem geringen
Abstand von 7 bp
zwischen zwei SNPs ist
die Mutation eindeutig zu
bestimmen)
bei denen zum Beispiel zwei Transkriptionszustände
direkt auf dem gleichen Array
vergleichbar sin.
Da für die Experimente mit der Geniom-
Technologie nur digitale Daten als Input
benötigt bzw. digitale Daten als Output
erzeugt werden, ist es durch intelligente
Bioinformatiksoftware möglich, das im vorangegangenen
Experiment erlangte Wissen
am nächsten Tag sofort für ein verbessertes
Chipdesign umzusetzen.
Applikationen
Die hohe Flexibilität der in situ-Synthese,
jedes mögliche Muster von DNA-Sonden,
das in digitaler Form als Sonden-Sequenzdatei
definiert wird, auf dem Array herzustellen,
wirkt sich besonders auf die Anzahl
verfügbarer Applikationen aus. Die Palette
reicht von Expressions-Studien und Resequenzierungen
bis hin zu Genotypisierungs-Anwendungen
wie der SNP-Detektion
und Mutationsanalysen. Abbildung 3
zeigt eine Auswahl von Anwendungen, die
auf der Geniom-Plattform durchgeführt
wurden. Momentan umfaßt der Informationsgehalt
eines DNA-Prozessors 40.000 Oligonukleotid-Sonden,
wobei durch die Unterteilung
in Subräume wahlweise vier unterschiedliche
Proben mit jeweils 10.000
Sonden oder eine Probe gegen alle 40.000
Sonden untersucht werden kann.
Bei Expressionsstudien kann der Anwender
zwischen einem Setup unter Verwendung
langer (typischerweise 50 bis 60mere)
oder einem mit kurzen Oligonukleotid-Sonden
wählen. Die erste Variante erlaubt die
Simulation gespotteter cDNA-Arrays, wobei
ein Gen typischerweise durch einige
wenige lange Oligonukleotid-Sonden repräsentiert
wird 7 . Bei Verwendung kurzer
Sonden werden für ein Gen klassischerweise
16 bis 20 Oligonukleotide (20-25mere)
benutzt und durch einen ebenso großen
Satz von Mismatch-Oligonukleotiden ergänzt.
Das Design spezieller Assays zum
Aufspüren von Splice-Varianten von Genen
ist auf der Geniom-Plattform sowohl
mit langen und mit kurzen Oligomeren-
Arrays möglich. Abbildung 3a zeigt eine
Expressionsstudie, die mit 30.000 Hefe-spezischen
Oligonukleotid-Sonden realisiert
wurde. Hierbei wurden jeweils 16 Oligonukleotid-Sonden
mit den jeweils zugehörigen
Mismatch-Sonden für die Repräsentation
eines Gens benutzt.
Weiterhin lassen sich auf der Geniom-Plattform
alle Assays durchführen, die Mutationen
mit einer Sensitivität bis hin zu einem
Einezlbasenpaaraustausch detektieren. Sollen
bislang unbekannte Mutationen gefunden
werden, wird die zu untersuchende
Sequenz klassischerweise als Tiling-Array
auf den Array aufgebracht und per Hybridisierung
Base für Base resequenziert. So
wurden hohe Ausbeuten (>97%) bei der
Resequenzierung von Fragmenten bislang
bis zu einer Länge von 2 kb erzielt. Bekannte
Mutationen können durch mutationsspezifische
Oligonukleotid-Sonden effektiv
nachgewiesen werden. Auf der Geniom-
Plattform hat sich ein Assay-Format, das
bis zu 20 spezifische Oligonukleotid-Sonden
zur Detektion einer Mutation verwendet,
als äußerst effektiv erwiesen, selbst
wenn zwei Mutationen sehr eng zueinander
positioniert sind (Abb. 3c). Im Hinblick
auf Genotypisierungs-Assays konnten beispielsweise
unterschiedliche Stämme des
Humanen Papillom-Virus (HPV) eindeutig
charakterisiert werden. Hierbei fanden spezifische
Oligonukleotid-Sonden Verwendung,
die es ermöglichen, gezielt zum Beispiel
HPV2b neben anderen HPV-Stämmen
nachzuweisen (Abb. 3b).
Literatur
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