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M A R K T Ü B E R S I C H T
SNP-Analyse
Varian Helix-System: Schnelles
Detektieren und vollautomatisches
Screenen von Punktmutationen
IRIS FROHWEIN, VARIAN DEUTSCHLAND GMBH, DARMSTADT
Mit dem Varian Helix TM -System können Punktmutationen (SNPs) detektiert und DNA-Fragmente
bequem und kostengünstig analysiert werden. Das Helix TM -System basiert auf der Technik der
denaturierenden HPLC (d-HPLC) und bietet entscheidende Vorteile: Durch Einsatz eines Autosamplers
für 96er- und 384er-Platten kann man vollautomatisch bis zu 140 Proben in 24 Stunden
analysieren. Es ist damit ein echtes „Walk Away-System“, das zudem reproduzierbare und quantitative
Ergebnisse liefert.
Hier setzt das Helix d-HPLC-System (siehe
Abb. 2) ein: Aus der so vorbereiteten Probe
werden 2,5 – 5 µL mit einem Autosampler auf
eine Säule injiziert, dies entspricht nur ca. 20-
50 ng des PCR-Produktes. Die Säule ist mit
festem Trägermaterial als Trennphase gefüllt
und wird über Gradientenpumpen mit einer
Puffersalzlösung in Wasser und Acetonitril
gespült. Die Puffersalzionen wirken hierbei
als Mittler zwischen den „Amplikonen“ und
der Trennphase. Die Heteroduplexe sind aufgrund
des Mismatches (T-C bzw. G-A liegen
sich gegenüber) etwas instabiler als die Homoduplexe
(T-G bzw. G-C). Über einen Säulenofen
wird nun die Temperatur eingestellt,
die zum Aufschmelzen der DNA-Helix der
Heteroduplexe führt. Die Folge ist, daß diese
schneller über die Säule laufen als die Homoduplexe.
Zum Auffinden neuer Mutationen
muß zuvor die Denaturierungs-Temperatur
für das zu untersuchende DNA-Fragment
ermittelt werden. Die Puffersalzsubstanz
TEAA (Triethylammoniumacetat) stabilisiert
hierbei die Schmelzbereiche, so daß die mutationstypische
Schmelztemperatur innerhalb
eines engen Bereiches liegt. Das Auffinden
der passenden Temperatur wird durch das
Melt-Programm (zu finden unter http://
insertion.stanford.edu/melt. html) erleich-
In der Genomforschung spielt das Detektieren
und Screenen von SNPs („Single Nucleotide
Polymorphisms“, Punktmutationen) in
pflanzlicher und tierischer DNA eine sehr
wichtige Rolle. In mehreren Forschungsfeldern
kommt den Punktmutationen eine enorme
Bedeutung zu, unter anderem:
In Populationsstudien, in denen SNPs
Rückschlüsse auf genetische Zuordnungen
erlauben
In der Erforschung der genetischen Ursachen
von Krankheiten
In pharmakogenetischen Untersuchungen
und bei der Targetvalidierung, also der
Frage, ob bestimmte Mutationen die Wirksamkeit
von Medikamenten bei entsprechenden
Personen beeinflussen.
Beim Neuauffinden von Detektionen und
dem Screenen von Mutationen, auch bei verschiedenen
Spezies, erweist sich die denaturierende
HPLC (d-HPLC) als eine hochempfindliche
und sehr leistungsfähige Methode.
Varian bietet hierzu ein ausgereiftes d-HPLC-
System an.
Das Prinzip dieser Technik ist recht einfach:
Das auf die Mutation zu untersuchende DNA-
Fragment wird amplifiziert und im Falle homozygoter
Proben anschließend mit Wild-
Typ-DNA versetzt. Heterozygote Proben können
ohne Zusatz von Wild-Typ-Standard eingesetzt
werden. Dann folgt ein Aufheiz- und
Abkühlschritt, der zur Hybrisierung der Probe
mit dem Wild-Typ-Standard führt. Im Falle
einer Mutation erfolgt hierbei die Bildung von
Homo- oder Heteroduplexen (siehe Abb. 1).
Abb. 1: Prinzip der d-HPLC
Abb. 2: Schema des
Varian Helix-Systems
tert. Nach der Auftrennung ergeben sich dann
für Mutationen charakteristische Mehrpeakprofile,
die mittels eines UV-Detektors gemessen
werden (siehe Abb. 3). Diese Peakprofile
werden als Chromatogramme abgespeichert,
hierbei handelt es sich um sogenannte
RUN-Files; diese können über die
mitgelieferte Varian Star-Software problemlos
ausgewertet werden.
Es können mit dem Helix-System Mutationen
in Amplikonen in der Größe 50 bis 700
Basenpaare detektiert werden. Die Wahrscheinlichkeit,
mit der d-HPLC neue Mutationen
zu finden, liegt bei 95% – bei entsprechendem
Primerdesign oder Einsatz anderer
DNA-Fragmente besteht sogar nahezu 100%
Detektionswahrscheinlichkeit. SNPs, die mittels
d-HPLC aufgefunden wurden und bei
denen die Denaturierungstemperatur bestimmt
wurde, lassen sich mit 100%iger Wahrscheinlichkeit
in Proben finden. Es können
bis zu 140 Proben pro Tag gescreent werden,
bei Einsatz entsprechender Poolingmethoden
sogar wesentlich mehr.
Die Firma Varian hat seit Anfang des Jahres
2001 eine neue Helix-Trennsäule auf den
Markt gebracht, mit der sich mindestens 3.000
Proben messen lassen. Diese Säule hat einen
Durchmesser von nur 3 mm. Die Peakprofile
sind dadurch erhöht, was zu einer verbesserten
Empfindlichkeit und einem geringeren
24 | Nr. III/2001 |transkript LABORWELT