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B L I T Z L I C H T Abb. 3: Entdeckung und Validierung von Biomarkern. Die ProteinChip ® -Software ermöglicht die vergleichende Analyse vieler verschiedener Spektren. Zur Verdeutlichung sind hier nur vier Spektren eines ausgewählten Molekulargewichtsbereiches gezeigt, jeweils zwei Spektren gehören einer Gruppe („H“ oder „D“) an. Der Gel-view hilft dabei, Unterschiede in den Spektren schon mit bloßem Auge schnell zu erkennen. Die Spektren können nahzu beliebig miteinander kombiniert werden, Mittelwertbildungen, Subtraktionen etc. sind einfach durchzuführen. Hier ist als Beispiel das Ergebnis einer Analyse gezeigt, in der Intensitätsunterschiede von peaks gleicher Molekulargewichte zwischen unterschiedlichen Spektren berechnet wurden. Das Ergebnis dieser Clusteranalyse weist auf drei Peaks mit deutlich unterschiedlichen Signalintensitäten hin. Rechts ist ein Overlay-view dieses Bereiches wiedergegeben. Diese drei Proteine sind also in der Gruppe „D“ wesentlich höher konzentriert als in der Gruppe „H“ und können somit als potentielle Marker für das entsprechende Krankheitsbild der „D“-Gruppe angesehen werden. amyloiden Peptide nachgewiesen 13,14 . In dem letztgenannten Beispiel werden auf dem Array Antikörper gekoppelt, die am N-terminalen Bereich der β-amyloiden Peptide binden. Anschließend lassen sich alle C-terminal verkürzten Peptide in biologischen Proben (Cerebrospinalflüssigkeit, Serum, Zellkulturen) nachweisen. Dieser Test kann jetzt auch mit einem ready to use-Kit durchgeführt werden. Man erhält also nicht nur ein Positiv/Negativ- Ergebnis, sondern die Analyse zeigt auch, welche Fragmente vorhanden sind, da alle an den Antikörpern gebundenen Peptide mit ihren Molekulargewichten dargestellt werden. Neben dem vergleichenden Protein Profiling und den Bindungsstudien ist noch ein drittes Feld zu nennen, in dem sich das ProteinChip ® - System bereits bewährt hat: der Nachweis kovalenter Proteinmodifikationen, wie sie beispielsweise durch Glykosylierungen 15 oder Phosphorylierungen verursacht werden. Da sich diese Veränderungen auf das Molekulargewicht der Proteine auswirken, sind sie ebenfalls im ProteinChip ® -Reader nachweisbar. bekannten MALDI (matrix assisted laser desorption/ionization)-Verfahren. Ein Vorteil des SELDI-Verfahrens besteht in der gleichmäßigen Verteilung der Proteine auf der Spot- Oberfläche und der homogenen Kristallisation nach Zugabe der energieabsorbierenden Matrix. Der die Ionisierung der Proteine auslösende Laserstrahl trifft beim Abrastern der Spot-Oberfläche immer auf einen repräsentativen Querschnitt der vorhandenen Moleküle, was eine Quantifizierung der in der Probe vorhandenen Proteinmengen ermöglicht. Nach Eichung mit Verdünnungsreihen kann die Konzentrationsangabe in absoluten Zahlen erfolgen. Die Steuerung des ProteinChip ® -Readers und die Auswertung der von ihm generierten Daten erfolgt durch die ProteinChip ® -Software, die eine einfache Bedienbarkeit des Gerätes gewährleistet und sowohl die Einzelanalyse als auch die vergleichende und kombinatorische Auswertung sehr vieler Spektren ermöglicht. Das schnelle Auffinden von Biomarkern und Biomarker-Mustern – also gruppenspezifischen Veränderungen im Proteinmuster mit diagnostischem oder therapeutischem Wert – wird dadurch ermöglicht (Abb. 3). Notwendige Vorkenntnisse Zum Erlernen einer profesionellen Handhabung des Systems bietet Ciphergen seinen Kunden ein fünftägiges Einführungstraining an. Darüber hinaus können, zur Vertiefung der Kenntnisse oder für neue Mitarbeiter, Fortbildungsveranstaltungen in der sogenannten ProteinChip ® -University in Fremont, Kalifornien, gebucht werden. Die mehrtägigen Kurse werden von erfahrenen Wissenschaftlern des Unternehmens geleitet und betreut. Anwendungsbeispiele Die genannten Vorzüge des ProteinChip ® -Systems bei der schnellen und reproduzierbaren Durchführung vergleichender Protein Profiling-Studien sind der Grund dafür, daß es schon besonders häufig zur Entdeckung neuer diagnostischer Marker oder potentieller therapeutischer Targets eingesetzt wurde 1,2 . Das Spektrum reicht dabei von der Tumordiagnostik 3,4 , der Diagnose von physiologischen Funktionsstörungen 5 , dem Nachweis von Faktoren, die an Wundheilung und Regeneration beteiligt sind 6 , bis hin zur Identifizierung bakterieller Virulenzfaktoren 7 . In allen eben genannten Fällen wurden die chromatographischen Arrays eingesetzt. Meist wurde Probenmaterial benutzt, das nicht (Urin) oder wenig (Blut) invasiv entnommen wurde. Ist eine Gewebeentnahme unumgänglich, so reichen geringste Mengen an Zellmaterial aus 8,9 . Spezifische Bindungsereignisse können mit den voraktivierten Arrays untersucht werden. Bindungsproteine, Antikörper oder Nukleinsäuren werden auf den Spots gekoppelt. Anschließend werden Proteinlösungen, die die potentiellen Bindungspartner (Rezeptoren, Liganden, Antigene, DNA/RNA-Bindungsproteine) enthalten, auf den Spots inkubiert. Nachfolgende Waschschritte gewährleisten die Entfernung nicht gebundener Moleküle, direkt anschließend werden die Bindungspartner im ProteinChip ® -Reader nachgewiesen (Abb. 4). Mit dieser Vorgehensweise wurden Rezeptoren für Wachstumsfaktoren 10 , Bindungsdomänen bakterieller Oberflächenproteine für humanes Plasminogen 11 , bakterielle Bindungsproteine für extrazelluläre Matrixproteine 12 oder auch die im Verlauf der Alzheimerkrankheit verstärkt auftretenden β- Reinigung und Identifizierung von Proteinen In allen genannten Anwendungsbeispielen ist das vorläufige Ergebnis der Analyse das genaue Molekulargewicht des Biomarkers, Bindungsmoleküls oder der kovalent veränderten Proteinvariante. Die Identifizierung der jeweiligen Proteine ist meist das sich anschließende Ziel der Untersuchung. Dazu wird das interessierende Protein zunächst so weit wie möglich gereinigt. Falls es unter stringenten Waschbedingungen auf dem Spot verbleibt, während die anderen Moleküle dabei entfernt werden, erfolgt dies direkt auf dem Array. Gelingt das nicht, so kann man eine Reinigung über Mini-Säulen (werden ebenfalls von Ciphergen angeboten) oder über präparative Säulenchromatographie vornehmen. In beiden Fällen profitiert man von den aus der Analyse mit dem ProteinChip ® -System gewonnenen Erkenntnissen: Da man das genaue Molekulargewicht und die Bindungseigenschaften des Proteins bereits kennt, können geeignete Separationsmethoden schnell entwickelt werden. Den Erfolg der Reinigung kann man zudem mit dem ProteinChip ® -System laufend verfolgen. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, das Protein zumindest soweit in der Probe anzureichern, daß es in einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Coomassie-Färbung darstellbar ist. Man schneidet dann die entsprechende Bande aus und benutzt das Gelstück für die weitere Analyse. Nachdem das Protein gereinigt vorliegt, wird es enzymatisch gespalten. Meist verwendet man dazu Trypsin, eine Protease, die sich für diesen Zweck vielfach bewährt hat. Das Protein wird dadurch in Fragmente zerlegt. Die einzelnen Teilstücke weisen eine charakteristische Molekulargewichtsverteilung auf, da 48 | Nr. III/2001 |transkript LABORWELT
B L I T Z L I C H T das Enzym an bestimmten Aminosäurepositionen bevorzugt schneidet. Mit diesem „Fingerabdruck“ kann man dann in online-Datenbanken recherchieren und erhält als Ergebnis die Identität des Proteins zusammen mit dem Wahrscheinlichkeitsgrad der Richtigkeit dieser Zuordnung. Die ProteinChip ® -Software bietet vorgefertigte Internet-Verbindungen an, die den Nutzer sofort nach der Analyse in die Recherche-Datenbanken weiterleiten. Tritt der (zumindest bei humanen Proteinen) seltene Fall ein, daß das Protein in der Datenbank nicht vorhanden ist, oder ist der Anwender aus anderen Gründen an einer weitergehenden Charakterisierung interessiert, so besteht auch die Möglichkeit, die Peptide zu sequenzieren. Dazu werden die ProteinChip ® - Arrays über ein Interface an ein QQ- TOF(Quadrupol/Quadrupol-time of flight)- Massenspektrometer angeschlossen. Hier werden einzelne Peptide aus dem Fragmentgemisch selektiert, in weitere Fragmente zerlegt und aus den Flugzeiten der Teilstücke dann die Sequenz des Peptids ermittelt. Diese Arbeiten können für Ciphergen-Kunden in einem der drei biomarker discovery center – in den USA oder Dänemark – durchgeführt werden. Ciphergen bietet zudem ein Interface für das PE-Sciex QStar-MS an. Bei Zugang zu einem solchen Gerät, können die Sequenzanalysen dann auch vom Kunden selbst vorgenommen werden. Vergleich zur 2D(zweidimensionalen) Gelelektrophorese Jeder, der sich für die Analyse komplexer Proteingemische interessiert, kennt die 2D-Gelelektrophorese als wichtige Methode zur möglichst umfassenden Auftrennung aller in einer Probe enthaltenen Proteine. In den meisten Fällen werden die Moleküle zunächst nach ihrem isolelektrischen Punkt (1. Dimension) und anschließend nach ihrer elektrophoretischen Beweglichkeit (2. Dimension) in einem Polyacrylamidgel getrennt und angefärbt. Die dadurch sichtbar gewordenen Proteine können direkt aus dem Gel entnommen und weiter analysiert werden. Im Gegensatz zum Nutzer der 2D-Gelelektrophorese, verfolgt der Anwender des Protein- Chip ® -Systems fast nie das Ziel, alle Proteine in der Probe gleichzeitig darstellen zu wollen. Vielmehr nutzt er den Vorteil aus, daß jeder Array-Typ in Kombination mit definierten Waschbedingungen auf reproduzierbare Weise bestimmte Protein-Subpopulationen aus der Probe trennt, der Analyseprozeß also gleichzeitig mit einer chromatographischen Separation verknüpft ist. Neben der Tatsache, daß eine weniger komplexe Probe natürlich leichter analysiert werden kann, ist dabei eine andere Konsequenz noch wichtiger: Viele Proteine, die zuvor aufgrund ihrer geringen Konzentration bei klassischen Analyseverfahren nicht detektiert wurden, treten dadurch überhaupt erst in Erscheinung. Gerade beim vergleichenden Protein Profiling zur Entdeckung von Biomarkern erlangt dieses Phänomen eine hohe Bedeutung. Andere Unterschiede zwischen der 2D-Gelelektrophorese und dem ProteinChip ® -System liegen in der Analysetechnik begründet. So sind Peptide, hydrophobe Proteine oder solche mit extremen isolelektrischen Punkten in der 2D-Gelelektrophorese nur schlecht oder gar nicht darstellbar. Insbesondere regulatorisch und inflammatorisch bedeutsame Proteine weisen aber häufig zumindest eine dieser Eigenschaften auf. Das ProteinChip ® -System dagegen kann Peptide besonders gut darstellen und ist von den chemischen Eigenschaften der Proteine weitgehend unabhängig. Die gute Auftrennung größerer Proteine und das Arbeiten im präparativen Maßstab ist ein unbestreitbarer Vorteil der 2D-Technik. Die dort benötigten Proteinmengen sind allerdings dann ein Hindernis, wenn man möglichst viele Proben in kurzer Zeit vergleichend analysieren möchte. Hier ist der geringe Proteinbedarf, die gute Reproduzierbarkeit und der um Größenordnungen höhere Probendurchsatz des ProteinChip ® -Systems von besonderem Wert. Das ProteinChip®-System kann also als eigenständige Einheit oder als Ergänzung zur 2D-Technik eingesetzt werden. Literatur [1] Davies, H.A., Journal of Molecular Medicine 78 (2000), B29. [2] Fung, E.T., Thulasiraman, V., Weinberger, S., Dalmasso, E.A. Current Opinion in Biotechnology 12 (2001), 65-69. [3] Vlahou, A., Schellhammer, P.F., Medrinos, S., Kondylis, F.I., Gong, L., Nasim, S., Wright, G.L. Jr., American Journal of Pathology (2001), 1491-1501. [4] Wright, G.L. Jr., Cazares, L.H., Leung, S.M., Nasim, S., Adam, B., Yip, T., Schellhammer, P.F., Gong, L. and Vlahou, A., Prostate Cancer and Prostatic Diseases 2 (2000), 264- 276. [5] Hampel, D.J., Sansome, C., Sha, M., Brodsky, S., Lawson, W.E., Goligorsky, M.S., Journal of the American Society of Nephrology 12 (2001), 1026-1035. [6] Li, X., Mohan, S., Gu, W., Miyakoshi, N., Bayling, D.J., Biochimica Biophysica Acta 1524 (2000), 102-109. 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