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B L I T Z L I C H T
dafür sind eine Kontamination der Probe beim
Befüllen der Microtiterplatten, die sich unter
ungünstigen Umständen selbst mit einem
Pipettierroboter ereignen kann, oder ein nicht
vollständiges Reinigen des Arrayers nach der
zuletzt gespotteten Probe.
Immobilisierungskontrolle
Einige Arrayer-Systeme sind mit einer CCD-
Kamera ausgerüstet und kontrollieren bereits
beim Spotten der Arrays das ordnungsgemäße
Absetzen der Proben, dagegen nicht
deren korrekte Immobilisierung auf der Trägeroberfläche.
Eine andere Möglichkeit, das
Aufbringen der Probe auf die Trägeroberfläche
zu überprüfen, beruht auf der Beobachtung,
daß unter bestimmten Bedingungen
DNA durch Streuung von Laserlicht beim
Einscannen mit einem Arrayscanner des noch
nicht prozessierten Arrays visualisiert werden
kann. Die Güte der Proben-Immobilisation
kann nach dem Prozessieren der Microarrays
durch unspezifisches Hybridisieren des
Arrays mit fluoreszenzmarkierter DNA getestet
werden (Abb. 3). Auch eine Visualisierung
der immobilisierten DNA durch Anfärben
des Arrays mit einem nukleinsäurebindenden
Fluoreszenzfarbstoffes 8 ist eine gängige
Methode bei der Qualitätskontrolle. Die
aufwendigste, aber auch eine der effektivsten
Methoden bei der Immobilisierungskontrolle
ist die Hybridisierung mit einer markierten
komplexen cDNA- oder cRNA-Probe. Bei diesem
Kontrollexperiment müssen dieselben
Expressionswerte für jede einzelne DNA-Sonde
wiedergefunden werden, wie sie bei der
Entwicklung und Validierung des Arrays ermittelt
worden sind. Voraussetzung dafür ist
aber die Verwendung eines „goldenen Standards“
als Hybridisierungsprobe. Diese doch
aufwendige und teure Qualitätskontrolle wird
meist dann eingesetzt, wenn eine neue Charge
von Oligonukleotiden oder PCR-Produkten
bei der Arrayherstellung verwendet wurde.
Auch die Hybridisierung von Arrays mit
fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden, die
zu den immobilisierten Sonden komplementär
sind, wird aus Kostengründen kaum
durchgeführt. Die Kosten für diese Art von
Qualitätskontrolle können allerdings drastisch
gesenkt werden, wenn der komplementäre
fluoreszenzmarkierten Gegenstrang
in einer enzymatischen Reaktion unter Verwendung
des Klenow-Fragmentes, dNTPs,
Random-Primer und von DNA (Oligonukleotide
oder PCR-Produkte) hergestellt wird,
die dieselbe Sequenz hat, wie die auf dem
Array immobilisierte DNA.
Alle Immobilisierungskontrollen werden aus
Zeit- und Kostengründen und nicht zuletzt
aufgrund der anfallenden riesigen Datenmengen
nur stichprobenartig durchgeführt.
Dabei hat es sich als sinnvoll erwiesen, Arrays
vom Anfang sowie von der Mitte und
dem Ende eines jeden Arrayverlaufs zu kontrollieren.
Ausblick
Trotz der hohen Herstellungsqualität gibt es
noch keine praktikable automatisierte Methode
zur Qualitätskontrolle von DNA-Arrays.
Die meisten QC-Methoden sind verläßlich,
doch mit einigem Arbeits- und Kostenaufwand
verbunden. Bedingt durch die unterschiedlichsten
Herstellungsverfahren von
DNA-Arrays ist auch in unmittelbarer Zukunft
nicht mit einem Standard-QC-Verfahren
zu rechnen. Bezüglich des Austausches
und Vergleiches experimenteller Microarray-
Daten ist trotz einiger Bemühungen in nächster
Zeit mit keinem Standard zu rechnen, da
ein Vergleich von Microarray-Daten sehr von
der Art und Qualität der Arrays abhängt.
Dagegen zeichnet sich ein Trend weg von
den cDNA-Arrays und hin zu den Oligonukleotid-Arrays
ab. Bedingt wird dies durch
die qualitativ hochwertige und im größeren
Maßstab durchführbare Oligonukleotidsynthese.
Selbst wenn die Meinungen um die
„optimale Oligonukleotidlänge“ noch etwas
auseinander gehen, so besteht eine Tendenz
bei Oligonukleotid-Microarrays zur Verwendung
von Oligonukleotiden größer als 40
Nukleotide.
Bioinformatik
Literatur
[1] Fodor, S.P.A. et al., Science 251 (1991), 767-773.
[2] Schena, M., Shalon, D., Davis, R.W., Brown, P.O.,
Science 270 (1995), 467-470.
[3] http://www.dnachip.org/mged3/
[4] McGall, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93 (1996),
13555-13560.
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4552-4557.
[6] eigene Beobachtungen, nicht publiziert.
[7] Huges, T.R. et al., Nature Biotechnology 19 (2001),
342-347.
[8] Battaglia, C, Salani, G, Consolandi, C, Rossi Bernardi,
L, De Bellis, G., Biotechniques 29 (2000) 78-81.
[9] McGall, G. et al., J. Am. Chem. Soc. 119 (1997),
508 1-5090.
Korrespondenzadresse
Dr. Hubert Paul
MWG-Biotech AG
Abteilung Biochip / Microarray-Entwicklung
Anzinger Str. 7
85570 Ebersberg
Tel.: 08092-8289170
Fax: 08092-8289310
eMail: hpaul@mwgdna.com
www.mwg-biotech.com
Bioinformatik-gestützte Auswahl von
Sonden für DNA-Arrays mit humanen Genen
Der Transkriptionsstatus einer eukaryotischen Zelle kann mit Hilfe von DNA-Microarray-Analysen
bestimmt werden. Dabei kann die Auswahl der Gene aber nur dem
jeweiligen Stand der Wissenschaft entsprechen. Die für das Humangenom seit vorigem
Jahr vorliegenden „Draft“-Daten werden daher kontinuierlich ergänzt: Die Gesamtzahl
der menschlichen Gene wird heute auf rund 35.000 geschätzt. Etwa 20% des Humangenoms
sind vollständig entziffert, für weitere 80% der Heterochromatinregion liegen nur
unvollständige Sequenzen vor. Für etwa 40% der Gene gibt es inzwischen vollständige
Sequenzen. Im menschlichen Genom werden etwa 9 Millionen polymorphe Basenaustausche
(SNPs) erwartet. Davon sind 20% als Kandidaten in öffentlichen Datenbanken
eingetragen. Nur etwa 1.000 Genmutationen von 6.000 in der OMIM-Datenbank eingetragenen
monogen vererbten Merkmalen sind bekannt. Die Aufdeckung von Sequenzvarianten
bei genetisch komplex vererbten Krankheiten gestaltet sich weit schwieriger.
Weiterhin kann man für etwa 1.800 Gene einen Bezug zum Krebsgeschehen ableiten.
Das Phänomen des alternativen Splicings spielt eine entscheidende Rolle in der Entwicklung
und für die Gesundheit vieler höherer Organismen. In komplexen Genen kann
alternatives Splicing zu Hunderten unterschiedlicher mRNA-Isoformen aus einem einfachen
Transkript führen. Ein weiterer Aspekt sind Mutationen an Splice-Stellen, da sie
einen Beitrag zu krankheitsverursachenden Exonsprüngen, Aktivierung kryptischer Splice-Stellen
sowie Entstehung von Pseudo-Exons innerhalb eines Introns oder Intron-
Unterdrückung darstellen.
Die DNA-Microarrays (10.000 und 2000 humane Gene) werden bei der MWG-BIOTECH AG
routinemäßig innerhalb des BioGIST-Managementsystems produziert. Dabei werden spezifische
Parameter für die Optimierung der Oligonukleotide gesetzt. Die Oligonukleotide
basieren auf der MWG-eigenen Datenbank der Protein-codierenden Sequenzen (CodeSeq).
Sie dimerisieren nicht, haben keine Ähnlichkeit zu polymorphen Regionen und können in
bezug auf Länge und GC-Gehalt angepaßt werden. Außerdem werden Oligonukleotide mit
einer Homologie von mehr als 75% und Abschnitten von 15 Basen innerhalb des Oligonukleotids
mit einer Homologie von 100% ausgeschlossen, um Kreuzhybridisierungen
mit anderen Genen zu vermeiden. Die Splicevarianten werden ebenfalls berücksichtigt.
Dr. Bernd Drescher, MWG-BIOTECH AG, Director for Life Sciences IT
16 | Nr. III/2001 |transkript LABORWELT