PDF Download - Laborwelt

R E P O R T
Nanobiotechnologie
Fluoreszenz-freie Markierung
und Detektion von DNA-Biochips
durch Nanobead-Labeling
J. MICHAEL KÖHLER UND WOLFGANG FRITZSCHE,
INSTITUT FÜR PHYSIKALISCHE HOCHTECHNOLOGIE JENA
Biochips als
Informationsschnittstelle
Die Datenmenge, die heute in PCs, auf CDs
und auf Festplatten gespeichert wird, bewegt
sich in der gleichen Größenordnung
wie die Datenmenge, die komplexe Genome
enthalten (ca. 10 9 - 10 10 bits). In beiden Fällen
werden die einzelnen Informationselemente
vorzugsweise linear abgelegt oder adressiert.
Doch die Mechanismen der biologischen
und die Natur der technischen Informationsspeicherung
unterscheiden sich beträchtlich.
Im einen Fall sind die Daten als
optisch oder magnetisch auslesbare Spots
auf einer Festkörperoberfläche eingeschrieben,
im anderen Fall als Abfolge von Modulen
in einer molekularen Kette. Die technische
Lösung besitzt den Vorzug sehr hoher
Lese- und Schreibgeschwindigkeiten, die
biologische den Vorteil extrem kleinen
Raumbedarfs und der direkten Ankopplung
an synthesechemische Maschinerien. Die
Herstellungs-, aber auch die Auslese- und
Schreibperipherie beider Systeme unterscheidet
sich drastisch. Deshalb ist die Entwicklung
von Schnittstellen zwischen den
digital-elektronischen, magnetischen oder
optischen Speichersystemen und den biomolekularen
von höchstem Interesse.
Biochips dienen der schnellen Übertragung
biomolekularer in digital-elektronische Information.
Dazu verbinden sie eine primäre
Transduktion durch eine selektive stoffliche
Erkennung mit einer universellen sekundären
Transduktion mit Hilfe eines hochparallel
anwendbaren physikalischen Ausleseprinzips.
Eine parallele Auslesung gewährleistet
eine hohe Rate der Datenübertragung.
Die hohe Parallelität wird durch eine Vielzahl
von Oberflächenspots erreicht, von denen
jeder eine bestimmte chemische Spezies
trägt, so daß in der Summe aller auf einem
Chip enthaltenen Spots eine oberflächengekoppelte
Substanzbibliothek realisiert ist. In
dieser können die einzelnen chemischen
Spezies durch ihre Koordinaten eindeutig
bestimmten Spots zugeordnet werden. Die
primäre Transduktion besteht damit in einer
ortsspezifischen chemischen Erkennung 1,2 .
Dabei sind sehr große Parallelisierungsgrade
erreichbar. Bei Rastermaßen von 400 µm
können etwa 2.500 Spots auf einem 5 mm
breiten Chip untergebracht werden. Könnte
man die lithographische Auflösung der fortgeschrittensten
Fertigungsverfahren der Mikroelektronik
ausnutzen, so wären Spotraster
bis herab zu etwa 400 nm möglich. Damit
könnten 600 Millionen Spots auf einem
Chip von einem Quadratzentimeter Fläche
untergebracht werden.
Die Geschwindigkeit der Signalgewinnung
hängt zum einen vom Zeitbedarf für die spezifische
molekulare Wechselwirkung und die
damit verbundenen Stofftransportprozesse
in der Umgebung der Chipoberfläche ab. Zum
anderen ist sie Funktion der Geschwindigkeit
der sekundären Transduktion, also der
Ermittlung der Spots auf denen Bindeereignisse
stattgefunden haben. Erstes ist im wesentlichen
ein physikochemisches Problem,
das von der chemischen Natur der beteiligten
Moleküle, der Bindungskinetik sowie der
Diffusion und Konvektion in der mobilen
Abb. 1: Bindung von
oberflächenfunktionalisierten
Nanopartikeln an eine
Chipoberfläche mit
komplementärer
Bindungsfunktion
(schematisch)
Phase abhängt. Da die molekulare Wechselwirkung
an allen Spots gleichzeitig stattfinden
kann, ist die Geschwindigkeit nicht vom
Parallelisierungsgrad abhängig. Das zweite
Problem ist im wesentlichen meßtechnischer
Natur. Bei serieller Auslesung wächst der
Zeitbedarf mit dem Parallelisierungsgrad.
Für ein rasches Auslesen großer Arrays sind
seriell arbeitende Verfahren deshalb indiskutabel.
Es werden bildgebende Verfahren
favorisiert, bei denen viele Spots gleichzeitig
erfaßt werden können. Da heute sehr
empfindliche bildgebende Detektoren kostengünstig
verfügbar sind, bieten sich optische
Meßtechniken für das Auslesen an. Die
direkte Auslesung der Anlagerung von
Molekülen auf Oberflächen ist relativ zeitintensiv
und apparativ aufwendig. An einer
Verbesserung solcher Verfahren wird zwar
gearbeitet, eine bald in der Breite nutzbare
und kostengünstige Lösung ist jedoch nicht
abzusehen.
Für ein hochempfindliches und hochparalleles
Auslesen molekularer Bindeereignisse
haben sich Markierungstechniken bewährt.
Während anfangs wegen ihrer hohen Empfindlichkeit
Radionuklid-Markierungen zum
Einsatz kamen, werden inzwischen überwiegend
Fluoreszenzfarbstoffmarkierungen
eingesetzt. Diese besitzen den Vorteil einer
hohen Empfindlichkeit bei arbeits- und umweltschutztechnisch
einfacherer Handhabung.
Gegenüber einfachen photometrischen
Techniken zeichnen sie sich dadurch aus,
daß durch eine räumliche, spektrale und
gegebenenfalls zusätzlich noch durch eine
zeitliche Entkopplung von Fluoreszenzanregung
und Fluoreszenz-Emissions-Messung
kleine Signale praktisch hintergrundfrei
detektiert werden können.
Probleme der Markierung
mit Fluoreszenzfarbstoffen
Die Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen
bringt jedoch eine Reihe von Problemen mit
sich. Vom Standpunkt des Arbeits- und
Umweltschutzes sind Fluoreszenzfarbstoffe
nicht unbedenklich. Farbstoffe etwa, die
als Interkalatoren zur Messung der Konzentration
doppelsträngiger Nukleinsäuren eingesetzt
werden, lagern sich in die molekulare
Kette des Erbgutträgers ein und verursachen
Fehler bei dessen Replikation oder Transkription.
Diese können zu Mutationen oder
Störungen in der Proteinbiosynthese führen
und Krebs auslösen oder begünstigen. Auch
nicht-interkalierende Farbstoffe, die sich
chemisch an DNA oder RNA koppeln lassen,
können mutagen wirken.
Aber auch meßtechnisch bringt die Fluoreszenzfarbstoffmarkierung
Probleme mit sich.
Kennziffer 12 LW 03/www.biocom.de Info
4 | Nr. III/2001 |transkript LABORWELT