(19) 대한민국특허청(KR) (12) 등록특허공보(B1) - Questel

접합체를 시퀀싱하였다.
1.4 PCR 및 RT-PCR
클로닝된 유전자 또는 유전자 단편에 대해 특이적인 올리고뉴클레오타이드를 합성했는데, 이들 중 일부는 몇몇
경우 그들의 5' 말단에 증폭된 단편의 클로닝을 용이하게 하는 제한 자리를 함유하였다. 표준 방법(Sambrook
et al., 1989)에 따라 역전사(RT) 반응 및 폴리머라이제 사슬연장 반응(PCR)을 수행하였다.
1.5 플라스미드의 대규모 정제
세슘 클로라이드-에티듐 브로마이드 구배법(Sambrook et al., 1989)을 이용하여 백신 조성물에 첨가되는 약 10
mg 규모의 정제된 플라스미드를 제조하였다.
실시예 2: 기본 플라스미드 구조체
플라스미드 pVR1012(WO-A-9803199의 도 1 및 실시예 7)로부터 유래된 진핵 생물 발현 플라스미드 pVR1020(C.J.
Luke et al., J. of Infectious Disease, 1997, 175, 95-97)은 인간 조직 플라스미노겐 활성화인자(tPA)의 신
호 서열의 코딩상을 함유한다.
여러 클로닝 자리(BamHI, NotI, EcoRI, XbaI, PmlI, PstI, BglⅡ)를 함유하고 하기 올리고뉴클레오타이드의 짝
짓기(pairing)로부터 얻어진 서열의 BamHI-BglⅡ 분해 및 삽입을 통해 플라스미드 pVR1020을 변형시켰다:
PB326(40량체; SEQ ID NO 1)
PB329(40량체; SEQ ID NO 2)
이렇게 얻어진 약 5105개 염기쌍(또는 bp) 크기를 갖는 벡터를 pAB110(도 2)으로 칭하였다.
주형으로서 토끼 말초 혈액 세포의 게놈 DNA를 사용하여 하기 올리고뉴클레오타이드를 이용한 PCR을 통해 상응
하는 DNA 단편을 제작한 후, 토끼 β-글로빈 유전자의 인트론 Ⅱ를 벡터 pCRⅡ(Invitrogen, Carlsbad, CA,
USA) 내로 클로닝하였다:
SB090(20량체; SEQ ID NO 3)
SB091(21량체; SEQ ID NO 4)
얻어진 플라스미드를 pNS050으로 지정하였다.
및
조직 플라스미노겐 활성화인자(tPA) 신호 펩타이드의 ATG 상류에 위치하는 SalI 자리로 토끼 글로빈 유전자의
인트론 Ⅱ의 서열을 도입하여 발현 플라스미드 pAB110을 변형시켰다. 토끼 글로빈 유전자의 인트론 Ⅱ의 서열
을 하기 올리고뉴클레오타이드를 이용해 플라스미드 pNS050으로부터 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 증폭시켰
다:
LF001(30량체; SEQ ID NO 5)
LF002(30량체; SEQ ID NO 6)
PCR 산물(573 염기쌍 또는 bp)을 SalI을 이용해 분해시키고, SalI에 의해 사전 선형화된 플라스미드 pAB110 내
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및
및
등록특허 10-0820893