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1.1 Principe 90 1.2 Système expérimentale 90 1.3 Préparation des tissus 91 1.4 Protocole de dépolarisation 92 2. Mesure de la sécrétion salivaire 93 2.1 Principe 93 2.2 Protocole et analyse 93 IV/ Méthodes statistiques 94 Résultats I/ Identification d’une nouvelle famille d’activateurs de CFTR 95 1. Contexte de travail 95 2. Etude d’un nouvel activateur de CFTR : le GPact-11a 97 2.1 Article 97 2.2 Résultats complémentaires 110 a. Accessibilité du GPact-11a 44 110 b. Effet du GPact-11a sur les mutants de classe III 45 113 3. Etude de structure-activité 44 114 4. Discussion 116 II/ Etude d’une nouvelle voie d’activation du CaCC 120 1. Contexte de travail 120 2. Contexte bibliographique 121 2.2 TRPV 121 2.3 TRPC 122 3. Effet du guanabenz in vitro, ex vivo et in vivo 124 3.1 Effet du guanabenz in vitro 124 3.2 Effet du guanabenz ex vivo 127 3.3 Effet du guanabenz in vivo 127 4. Mécanisme d’action du guanabenz 129 4.1 Le guanabenz : un agoniste 2-adrénergique 129 4.2 Effet du guanabenz sur les canaux TRPC et TRPV 130 a. Effet des inhibiteurs des canaux TRPC et TRPV 44 130 b. Effet du guanabenz sur les canaux TRPC1 45 131 c. Effet du guanabenz sur les canaux TRPC6 44 134 4.3 Identification d’une nouvelle voie d’activation des CaCC 136 5. Discussion 137 Conclusion générales et perspectives Bibliographie Annexes 15 95 141 146
LISTE DES FIGURES Figure 1 : Les différents organes atteints lors de la mucoviscidose. ..................................................... 24 Figure 2 : Mesure de ddp chez un patient CF et non-CF lors de l’administration sur la muqueuse nasale d’amiloride, d’une solution sans chlorure et d’ATP.............................................................................. 28 Figure 3 : Essais cliniques en cours dans le traitement palliatif de la mucoviscidose........................... 31 Figure 4 : Représentation schématique des principaux transports présents à la membrane d’une cellule épithéliale de voies respiratoires. .......................................................................................................... 32 Figure 5 : Le CFTR du gène à la protéine............................................................................................. 35 Figure 6 : Biogenèse et routage intracellulaire de la protéine CFTR sauvage. ..................................... 36 Figure 7 : Schéma illustrant l’organisation de la protéine CFTR.......................................................... 37 Figure 8 : Modélisation de la structure tridimensionnelle de la protéine CFTR dans une conformation canal ouvert, proposé par le Dr Callebaut. ............................................................................................ 39 Figure 9: Rôles présumés de la protéine CFTR dans la cellule épithéliale. .......................................... 40 Figure 10 : Modèle simplifié de l’activité du canal CFTR régulée par la phosphorylation de son domaine régulateur et la fixation d’ATP sur ses domaines NBDs........................................................ 43 Figure 11 : Régulation du CFTR par les récepteurs adénosine et purinergique (P2Y2)....................... 45 Figure 12 : Structure chimique du CFTRinh-172. .................................................................................. 50 Figure 13 : Répartitions des mutations du gène CFTR.......................................................................... 51 Figure 14 : Classification des mutations du gène CFTR. ...................................................................... 51 Figure 15 : Tracés caractéristiques obtenus en canal unitaire, après stimulation par de la forskoline, pour la protéine CFTR sauvage ou mutée F508del............................................................................... 52 Figure 16 : Schéma explicatif du fonctionnement de l’Ataluren........................................................... 56 Figure 17 : Action du miglustat sur le cycle de la calnexine................................................................. 58 Figure 18 : Stratégie de création d’une molécule hybride à double activités correctrice et potentiatrice du CFTR........................................................................................................................... 62 Figure 19 : Représentation schématique de l’importance du CaCC dans les transports ioniques d’une cellule épithéliale................................................................................................................................... 63 Figure 20 : Schéma récapitulatif de l’activation du CaCC par le calcium. ........................................... 66 Figure 21 : Schéma récapitulatifs des mécanismes de régulation des CaCCs....................................... 67 Figure 22 : Voie de signalisation intracellulaire induite par l’activation des récepteurs P2Y2............. 69 Figure 23 : Arbres phylogénétique de la famille des SLC26…………………………………………..72 Figure 24 : Récapitulatif des différentes bestrophines des vertébrés. ................................................... 73 Figure 25 : Modèle présumé de la topologie de la bestrophine 2.......................................................... 74 Figure 26 : Rôles présumés de la bestrophine 1 dans les cellules. ........................................................ 75 16
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