Consulter le texte intégral de la thèse - Université de Poitiers

T H E S E
Pour l’obtention du Grade de
D O C T E U R D E L ’ U N I V E R S I T É D E P O I T I E R S
(Faculté des Sciences Fondamentales et Appliquées)
(Diplôme National – arrêté du 7 août 2006)
École Doctorale : Biologie Santé
Secteur de Recherche : Biomolécules, pharmacologie, thérapeutique
Présentée par
Johanna BERTRAND
********************
Approches pharmacologiques de CFTR et de CaCC
dans la mucoviscidose
********************
Directeurs de thèse : Pr. Frédéric BECQ et Dr. Caroline Norez
********************
Soutenue le 19 Novembre 2010
devant la Commission d’Examen
********************
JURY
T. LEAL Docteur en Médecine, Cliniques St Luc, Belgique Rapporteur
V. CHAPPE Associate Professor, Université de Dalhousie, Canada Rapporteur
A. BOURON Directeur de Recherche, CEA de Grenoble, France Examinateur
JF. FAIVRE Professeur des Universités, Université de Poitiers, France Examinateur
C. NOREZ Maître de Conférences, Université de Poitiers, France Examinateur
F. BECQ Professeur des Universités, Université de Poitiers, France Examinateur
6

A maman, Gwenaëlle et Doudou :
Je vous aime tant.
« En famille on n'est jamais seul à posséder son univers, à se
posséder !
En famille on est toujours là pour quelqu'un ! »
Michel Dallaire
7

REMERCIEMENTS
Ce travail a été effectué anciennement dans l’équipe Canaux Ioniques et Epithélium dirigée
par le Pr. Frédéric Becq et depuis janvier 2008 dans l’équipe Physiopathologie et
Pharmacologie des canaux ioniques (PPCI) dirigée par le Dr. Christian Cognard. Cette équipe
fait partie de l’Institut de Physiologie et Biologie Cellulaires dirigé par le Pr. Frédéric Becq.
Je remercie tout d’abord le Dr. Teresinha Leal et le Dr. Valérie Chappe d’avoir
accepté d’être les rapporteurs de ce manuscrit. J’associe à ces remerciements le Pr. Jean-
François Faivre et le Dr. Alexandre Bouron pour avoir accepté de juger ce travail et de me
faire l’honneur de participer à ce jury.
Ce travail a été effectué sous la co-direction du Pr. Frédéric Becq et du Dr. Caroline
Norez. Je tiens donc à remercier le Pr. Frédéric Becq de m’avoir accueillie dans son équipe,
de m’avoir permis d’assister à de nombreux congrès et de m’avoir fait confiance. Merci de
m’avoir fait découvrir le domaine de la mucoviscidose.
Je tiens à exprimer ma profonde gratitude au Dr. Caroline Norez, merci de m’avoir
guidée tout au long de ma thèse, merci pour ton aide scientifique, ta disponibilité et tes
conseils avisés. Merci pour le soutien que tu m’as apporté dans le travail mais aussi en dehors.
Merci pour toutes les discussions scientifiques ou non (allez Bastien !!!, les soirées d’samedi
soir…). Tu es pour moi un exemple à suivre, et j’espère avoir été à la hauteur.
Merci à tous les membres de l’équipe PPCI, anciens ou présents, qui m’ont aidée et
accompagnée tout au long de ma thèse :
Je remercie le Pr. Christian Cognard de m’avoir accueillie au sein de l’équipe PPCI.
Un grand merci au Dr. Clarisse Vandebrouck pour sa gentillesse et ses précieux
conseils scientifiques. Merci Clarisse de m’avoir soutenue tout au long de ma thèse.
Merci au Dr. Claire Louault pour sa participation à mon projet de thèse, et pour sa
bonne humeur.
Merci au Dr. Thierry Ferreira pour sa gentillesse et les discussions passionnantes,
scientifiques ou non que nous avons partagé. Merci Jenny pour ta gentillesse.
8

Do, ma do, merci d’avoir partagé avec moi les doutes, les bonheurs, les joies et les
déceptions qui accompagnent souvent une thèse. Merci pour les petites pauses thé et
cigarettes, pour les soirées PG, pour toutes les discussions et les fous rires que nous avons
partagé. Même si nous n’avons pas encore écrit notre livre, je ne risque pas d’oublier toutes
les aventures de Do et Jo. Bonne chance pour l’année prochaine, je serai la pour te soutenir.
Arnaud, merci pour ta gentillesse et tes conseils. Bon courage pour ta thèse. Je te
souhaite beaucoup de réussite et de bonheur avec ta petite famille.
Merci Luc de m’avoir permis d’acquérir plusieurs techniques et de m’avoir fait rire. Je
n’ai qu’une chose à te dire, vive les 79!!!
Merci Fabrice pour ton aide, ta gentillesse et ta bonne humeur. Merci pour le travail
important que tu as réalisé sur les TRP pendant ta thèse et qui m’a permis d’avoir des bases
solides.
Merci Sandra, pour ton aide technique, ta bonne humeur, ta gentillesse. Sous tes airs
extravertis, j’ai découvert une personne avec un grand cœur et une grande générosité. Gros
bisous à toi et à tes deux bouts de chou, Ezéchiel et Zacharie.
Merci Mathilde pour ta simplicité, ta gentillesse et ta bonne humeur. J’espère pouvoir
encore mieux te connaître.
Merci Charlotte pour ton soutien et ta gentillesse.
Merci aux nombreuses personnes, ingénieurs, doctorants, techniciens ou stagiaires qui
sont passés dans l’équipe et qui m’ont tous apportée quelque choses : Patricia, Sabrina,
Ludivine, Jessica, Najete, Nathalie, Eve, Charles, Véronique, Claire, Boris, Myriam, et ma
petite Elise qui va bientôt revenir parmi nous, je l’espère.
Merci au Dr. Vincent Thoreau pour son aide scientifique avec la technique de RT-PCR
quantitative. Merci au Dr. Anne Cantereau pour son aide au microscope confocal. Merci à
Claudine Combes et Khadra Escriva de s’être occupées de mes petites souris. Je remercie
également tous les personnels de l’UMR 6187 qui ont facilité mon séjour au sein du
laboratoire.
Je remercie le professeur Hugo DeJonge (Erasmus University Medical Center,
Rotterdam, Pays-Bas) de m’avoir permis de séjourner dans son laboratoire. Merci au docteur
Martina Wilke pour son aide précieuse au cours de mon séjour.
9

Merci au Dr. Corinne Huchet Cadiou de m’avoir permis d’entrer dans le monde de la
recherche, et d’avoir cru en moi. Nos chemins se sont séparés mais je n’ai pas oublié mes
petites souris mdx. Merci également à Aude, Alexandra, Sophie et Pascal, pour leurs
gentillesses. J’espère que vous allez tous bien.
Merci Claudia et Claire pour tous les petits restos, les soirées, les fous rires que nous
avons partagés. Je vous souhaite beaucoup de bonheur et de réussite pour la suite.
Merci ma petite Marie pour tous mes petits séjours sympas à Paris.
Merci Flavien, pour ton amour et ton soutien de tous les jours, tout simplement merci
d’embellir ma vie.
Je remercie mon père et marie, pour leur soutien et leur confiance en moi.
Je remercie ma sœur Gwenaëlle, Jean-Louis, Martin et le futur petit Montastier, merci
d’avoir toujours été la pour moi. Je remercie le deuxième homme de ma vie, mon petit frère
Brice-Edouard, pour le bonheur qu’il m’apporte tous les jours. Enfin, merci maman pour tout
l’amour, le soutien et la confiance que tu m’as apporté. Merci à vous pour tout l’amour que
vous me donnez. Je vous aime tant.
Je remercie également Stéphane Mathieu et l’association « Mucovie », pour son
soutien financier durant ces trois années de thèse.
10

Petit Papa Noël,
Je te demande juste deux choses :
un jour de répit sans traitement ni maladie et
un médicament miracle pour guérir la mucoviscidose,
qui ne demande rien n'a rien et oui les miracles
existent...
Paroles d’une adolescente atteinte de mucoviscidose.
Ces paroles prononcées par une jeune patiente atteinte de mucoviscidose, résume
l’espoir que fondent les patients sur la découverte d’un traitement curatif de la mucoviscidose.
En effet, malgré la découverte du gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance
Regulator) et les progrès effectués en matière de soins médicaux, la mucoviscidose reste une
maladie incurable et l’espérance de vie moyenne des personnes atteintes, bien qu’ayant été
fortement augmentée durant les dernières années, n’excède toujours pas à l’heure actuelle
l’âge de 46 ans.
Le dysfonctionnement de la protéine CFTR induit principalement un épaississement
du mucus au niveau des poumons qui ne peut plus être éliminé par l’organisme et qui va
contribuer à un environnement favorable au développement d’infections bactériennes. Pour
fluidifier le mucus, il est nécessaire de restaurer la sécrétion chlorure dépendante du CFTR,
et/ou d’activer une voie alternative de sécrétion chlorure à la membrane apicale des
épithéliums respiratoires.
Le travail présenté dans ce manuscrit s’inscrit dans une thématique pharmacologique
axée autour de la recherche de modulateurs de la protéine CFTR et d’une thérapie alternative
de sécrétion des ions chlorure. Cette approche a pour objectif d’approfondir nos
connaissances sur les canaux présents à la membrane apicale des épithéliums afin de
découvrir des agents pharmacologiques susceptibles d’être utilisés dans un traitement de la
mucoviscidose.
11

Remerciements
Avant-propos
Sommaire
Liste des figures
Liste des tableaux
Liste des abréviations
Historique
SOMMAIRE
I/ La mucoviscidose 13
1. Historique et généralités 13
2. Physiopathologie et manifestations cliniques 14
2.1 Manifestations pulmonaires 15
2.2 Manifestations intestinales 15
2.3 Manifestations pancréatiques 15
2.4 Manifestations hépato-biliaire 16
2.5 Manifestations génitales 16
2.6 Autres manifestations 16
3. Diagnostic et Dépistage 17
3.1 Diagnostic 17
a. Test de la sueur 17
b. Mesure de la différence de potentiel nasal 17
c. Diagnostic différentiel 18
3.2 Dépistage 18
a. Dépistage néonatal 18
b. Dépistage prénatal 19
4. Traitements pallilatifs actuels 19
II/ Les transports épithéliaux 22
III/ Le CFTR 25
1. Voie de biosynthèse de la protéine CFTR sauvage 25
2. Structure de la protéine CFTR sauvage 26
2.1 Les domaines transmembranaires TMD1 et TMD2 27
2.2 Le domaine de régulation R 27
2.3 Les domaines de liaison aux nucléotides NBD1 et NBD2 28
2.4 Les boucles intra-cytoplasmiques et extracellulaires 28
12
1
2
6
9
10
13

3. Fonction de la protéine CFTR sauvage 29
3.1 CFTR : une protéine régulatrice 29
3.2 CFTR : un canal chlorure 32
a. Conductance et sélectivité du canal CFTR 32
b. Mécanisme d’ouverture et de fermeture du canal CFTR 32
c. Phosphorylation du canal CFTR par les PKA et les PKC 33
d. Régulation du canal CFTR par les protéines phosphatases 34
e. Régulation du canal CFTR par l’ATP 34
f. Régulation du canal CFTR par les seconds messagers 35
4. Pharmacologie de la protéine CFTR 35
4.1 Activateurs et potentiateur du CFTR 35
a. Les activateurs et potentiateurs indirects du CFTR 35
b. Les activateurs et potentiateurs directs du CFTR 36
4.2 Inhibiteurs du CFTR 37
5. Les différentes mutations de la protéine CFTR 40
6. Stratégies de thérapies curatives 44
6.1 Thérapie génique 44
6.2 Thérapie cellulaire 44
6.3 Thérapie pharmacologique 45
a. Thérapie pharmacologique du CFTR 45
. Thérapie pharmacologique adaptée aux mutations de classe I 46
. Thérapie pharmacologique adaptée aux mutations de classe II 47
. Thérapie adaptée aux mutations de classe II à V 49
. Molécules à doubles-activitées 51
b. Thérapie pharmacologique par l’activation d’une voie 52
alternative CaCC-dépendante
IV/ Les canaux chlorure calcium dépendant (CaCC) 55
1. Fonction des CaCC 55
1.1 Rôle physiologique des CaCC 55
1.2 Caractérisation et régulation des CaCC 55
a. Régulation par le Ca 2+ et la CAMKII 44 56
b. Régulation par l'IP4 et les annexines 45 57
c. Régulation par le CFTR 45 57
d. Autres régulation 46 58
1.3 Pharmacologie des CaCC 58
a. Activateurs du CaCC 46 58
b. Inhibiteurs des CaCC 59
2. Candidats moléculaires des CaCC 60
2.1 Les SLC26 62
2.2 Les bestrophines 63
2.3 Les TMEM16 66
a. TMEM16a 54 66
b. TMEM16b 58 69
c. Les autres TMEM16 58 70
Problématiques et objectifs
13
71

I/ Contexte scientifique et objectifs 71
1. GPact-11a 71
2. Guanabenz 72
II/ Présentation des études 72
Matériels et méthodes
I/ Matériels utilisés 74
1. Le matériel cellulaire 74
1.1 Cellules primaires humaines 74
a. Origine des prélèvements 44 74
b. Isolement des cellules 45 75
1.2 Lignées cellulaires 75
a. Les cellules CF-KM4 et MM39 44 75
b. Entretien des lignées cellulaires 45 76
c. La congélation et décongélation des lignées cellulaires 44 76
2. Les modèles animaux 45 77
II/ Techniques d’études in vitro 78
1. Les techniques de biologie moléculaire et de biochimie 78
1.1 Technique de transfection par « small interfering RNA » (siRNA) 78
a. Principe 44 78
b. Protocole de transfection 45 78
1.2 Technique de Western Blot 79
a. Principe 44 79
b. Extraction et dosage des protéines 45 79
c. Electrophorèse et transfert sur membrane 44 80
d. Saturation et hybridation de la membrane 44 82
e. Révélation 45 82
2. Technique de physiologie cellulaire 83
2.1 Mesure de l’activité calcique intracellulaire 83
a. Principe de la sonde Fluo-4 44 83
b. Protocole de charge 45 84
c. Analyse des résultats 44 84
2.2 Mesure du potentiel membranaire 85
a. Principe de la sonde oxonol 44 85
b. Protocole de charge 45 86
c. Analyse des résultats 44 86
2.3 Efflux d’iodure 87
a. Principe 44 87
b. Protocole 45 88
c. Analyse des résultats 44 89
III/ Techniques d’études ex vivo et in vivo 91
1. La technique de chambre de Ussing 90
14
74

1.1 Principe 90
1.2 Système expérimentale 90
1.3 Préparation des tissus 91
1.4 Protocole de dépolarisation 92
2. Mesure de la sécrétion salivaire 93
2.1 Principe 93
2.2 Protocole et analyse 93
IV/ Méthodes statistiques 94
Résultats
I/ Identification d’une nouvelle famille d’activateurs de CFTR 95
1. Contexte de travail 95
2. Etude d’un nouvel activateur de CFTR : le GPact-11a 97
2.1 Article 97
2.2 Résultats complémentaires 110
a. Accessibilité du GPact-11a 44 110
b. Effet du GPact-11a sur les mutants de classe III 45 113
3. Etude de structure-activité 44 114
4. Discussion 116
II/ Etude d’une nouvelle voie d’activation du CaCC 120
1. Contexte de travail 120
2. Contexte bibliographique 121
2.2 TRPV 121
2.3 TRPC 122
3. Effet du guanabenz in vitro, ex vivo et in vivo 124
3.1 Effet du guanabenz in vitro 124
3.2 Effet du guanabenz ex vivo 127
3.3 Effet du guanabenz in vivo 127
4. Mécanisme d’action du guanabenz 129
4.1 Le guanabenz : un agoniste 2-adrénergique 129
4.2 Effet du guanabenz sur les canaux TRPC et TRPV 130
a. Effet des inhibiteurs des canaux TRPC et TRPV 44 130
b. Effet du guanabenz sur les canaux TRPC1 45 131
c. Effet du guanabenz sur les canaux TRPC6 44 134
4.3 Identification d’une nouvelle voie d’activation des CaCC 136
5. Discussion 137
Conclusion générales et perspectives
Bibliographie
Annexes
15
95
141
146

LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Les différents organes atteints lors de la mucoviscidose. ..................................................... 24
Figure 2 : Mesure de ddp chez un patient CF et non-CF lors de l’administration sur la muqueuse nasale
d’amiloride, d’une solution sans chlorure et d’ATP.............................................................................. 28
Figure 3 : Essais cliniques en cours dans le traitement palliatif de la mucoviscidose........................... 31
Figure 4 : Représentation schématique des principaux transports présents à la membrane d’une cellule
épithéliale de voies respiratoires. .......................................................................................................... 32
Figure 5 : Le CFTR du gène à la protéine............................................................................................. 35
Figure 6 : Biogenèse et routage intracellulaire de la protéine CFTR sauvage. ..................................... 36
Figure 7 : Schéma illustrant l’organisation de la protéine CFTR.......................................................... 37
Figure 8 : Modélisation de la structure tridimensionnelle de la protéine CFTR dans une conformation
canal ouvert, proposé par le Dr Callebaut. ............................................................................................ 39
Figure 9: Rôles présumés de la protéine CFTR dans la cellule épithéliale. .......................................... 40
Figure 10 : Modèle simplifié de l’activité du canal CFTR régulée par la phosphorylation de son
domaine régulateur et la fixation d’ATP sur ses domaines NBDs........................................................ 43
Figure 11 : Régulation du CFTR par les récepteurs adénosine et purinergique (P2Y2)....................... 45
Figure 12 : Structure chimique du CFTRinh-172. .................................................................................. 50
Figure 13 : Répartitions des mutations du gène CFTR.......................................................................... 51
Figure 14 : Classification des mutations du gène CFTR. ...................................................................... 51
Figure 15 : Tracés caractéristiques obtenus en canal unitaire, après stimulation par de la forskoline,
pour la protéine CFTR sauvage ou mutée F508del............................................................................... 52
Figure 16 : Schéma explicatif du fonctionnement de l’Ataluren........................................................... 56
Figure 17 : Action du miglustat sur le cycle de la calnexine................................................................. 58
Figure 18 : Stratégie de création d’une molécule hybride à double activités correctrice et
potentiatrice du CFTR........................................................................................................................... 62
Figure 19 : Représentation schématique de l’importance du CaCC dans les transports ioniques d’une
cellule épithéliale................................................................................................................................... 63
Figure 20 : Schéma récapitulatif de l’activation du CaCC par le calcium. ........................................... 66
Figure 21 : Schéma récapitulatifs des mécanismes de régulation des CaCCs....................................... 67
Figure 22 : Voie de signalisation intracellulaire induite par l’activation des récepteurs P2Y2............. 69
Figure 23 : Arbres phylogénétique de la famille des SLC26…………………………………………..72
Figure 24 : Récapitulatif des différentes bestrophines des vertébrés. ................................................... 73
Figure 25 : Modèle présumé de la topologie de la bestrophine 2.......................................................... 74
Figure 26 : Rôles présumés de la bestrophine 1 dans les cellules. ........................................................ 75
16

Figure 27 : Arbres phylogénétique de l’expression des membres de la famille TMEM16……………76
Figure 28 : Modèle présumé de la topologie de la protéine TMEM16A............................................... 77
Figure 29 : Expression de la protéine TMEM16A dans les tissus de souris. ........................................ 78
Figure 30 : Structure chimique du GPact-11a. ...................................................................................... 81
Figure 31 : Structure chimique du guanabenz....................................................................................... 82
Figure 32 : Représentation schématique des transports ioniques d’une cellule épithéliale................... 83
Figure 33 : Souris C57Bl/6 et 129/FVB utilisées dans nos études........................................................ 87
Figure 34 : Structure de la sonde Fluo-4-AM. ...................................................................................... 93
Figure 35 : Principe de l’entrée de la sonde Fluo-4-AM dans les cellules............................................ 93
Figure 36 : Tracés et images XY représentant l’évolution de fluorescence de la sonde Fluo-4 en
fonction du temps suite à l’application d’un agoniste........................................................................... 95
Figure 37 : Structure de la sonde [DiSBAC2(3)]................................................................................... 95
Figure 38 : Tracés et images XY représentant l’évolution de fluorescence de la sonde [DiSBAC2(3)]
en fonction du temps suite à l’application d’un agoniste et d’un inhibiteur.......................................... 97
Figure 39 : Représentation graphique des efflux d’iodures................................................................... 99
Figure 40 : Chambre de Ussing........................................................................................................... 101
Figure 41 : Représentation schématique d’une chambre de Ussing.................................................... 101
Figure 42 : Schéma de régulation des glandes salivaires .................................................................... 103
Figure 43 : Réaction entre le méthylglyoxal et l’-aminoazahétérocycle........................................... 105
Figure 44 : Exemples de tracés d’efflux iodure représentant la potentialisation par le GPact-11a et
l’inhibition par le GPinh-5a de la réponse forskoline (Fsk) dans des cellules CHO-CFTRwt (n = 4).106
Figure 45 : Structure chimique du GPinh-5a et du GPact-11a............................................................ 107
Figure 46: Effet du GPact-11a sur la membrane de l’épithélium colonique. ...................................... 120
Figure 47 : Effet du GPact-11a sur l’épithélium colonique en présence et en absence de DTT. ........ 121
Figure 48 : Effet du GPact-11a sur le colon en présence de DTT, de cystéine et de -cyclodextrine. 122
Figure 49: Effet du GPact-11a sur des mutants de classe III............................................................... 123
Figure 50 : Evolution de la structure du GPact-11a vers le GPact-26a............................................... 124
Figure 51 : Evaluation de l’effet du GPact-26a sur les cellules CHO-CFTRwt…………………...…114
Figure 52 : Effet du GPact-26a sur les cellules MM39 par la technique d’oxonol…………………115
Figure 53 : Sécrétion salivaire induite par le GPact-26a sur les souris cftr +/+ . .................................... 126
Figure 54 : Structure chimique du GPinh-5a et du GPact-11a............................................................ 127
Figure 55 : Motif structural minimum du pharmacophore supposé. ................................................... 128
Figure 56 : Structure chimique des quinolizium. ................................................................................ 128
Figure 57 : Effet du guanabenz sur l’activation du CaCC dans les cellules CF15……...................... 130
Figure 58 : Arbre phylogénétique de la famille des canaux TRP humains. ........................................ 131
Figure 59 : Effet du guanabenz sur l’activation des CaCC dans les cellules CF15, CF-KM4 et MM39.
............................................................................................................................................................. 134
17

Figure 60 : Effet du guanabenz sur l’activation des CaCC sur des cellules pulmonaires humaines... 135
Figure 61 : Effet du guanabenz sur l’activation des CaCC sur des cellules pulmonaires polarisées non-
CF………………… ............................................................................................................................ 136
Figure 62 : Effet du guanabenz sur l’épithélium colonique de souris cftr -/- . ....................................... 137
Figure 63 : Sécrétion salivaire induite par le guanabenz sur des souris cftr -/- . .................................... 138
Figure 64 : Sécrétion salivaire induite par le guanabenz sur des souris cftr -/- . .................................... 138
Figure 65 : Comparaison des effets du guanabenz, de la clonidine et de la cirazoline
sur l’activation des CaCC.................................................................................................................... 140
Figure 66 : Effet du guanabenz sur l’activation des CaCC en présence de rouge de ruthénium ou de
SKF...................................................................................................................................................... 141
Figure 67 : Effet du siRNA contrôle et TRPC1 sur l’expression de la protéine TRPC1 dans les cellules
CF-KM4, en comparaison avec une protéine de référence…………………………………………...132
Figure 68 : Effet de l’extinction de TRPC1 sur la mobilisation calcique induite par le guanabenz sur
les cellules CF-KM4 transfectées avec un siRNA contrôle ou un siRNA TRPC1…………………...132
Figure 69 : Effet de l’extinction de TRPC1 sur l’activation des CaCC par le guanabenz dans des
cellules CF-KM4 transfectées ou non avec un siRNA contrôle ou un siRNA TRPC1………………133
Figure 70 : Effet du siRNA contrôle et TRPC6 sur l’expression de la protéine TRPC6 dans les cellules
CF-KM4, en comparaison avec une protéine de référence……………………………………...……134
Figure 71 : Effet de l’extinction de TRPC6 sur la mobilisation calcique induite par le guanabenz sur
les cellules CF-KM4 transfectées avec un siRNA contrôle ou un siRNA TRPC6……...……………135
Figure 72 : Effet de l’extinction de TRPC6 sur l’activation des CaCC par le guanabenz dans des
cellules CF-KM4 transfectées ou non avec un siRNA contrôle ou un siRNA TRPC6………………135
Figure 73 : Exemple de tracé représentatif de la mobilisation calcique induite par l’OAG et inhibée par
le SKF96365 dans les cellules CF-KM4. ............................................................................................ 147
Figure 74 : Effet de l’OAG sur l’activation des CaCC sur les cellules CF-KM4…….………………137
Figure 75 : Structure chimique du guanabenz, du DAG et d’un dérivé actif de l’hyperforine. ......... 149
Figure 76 : Répresentation schématique de l’effet du guanabenz, du GPact11a et du GPact-26a
sur les transports ioniques à la surface d’une cellule........................................................................... 151
Figure 77 : Structure chimique du GPinh-5a, GPact-11a et GPact-26a. ............................................. 153
Figure 78 : Schéma représentatif des molécules pharmacologiques existantes dans le traitement de la
mucoviscidose. .................................................................................................................................... 155
18

LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Traitements palliatifs de la mucoviscidose. 30
Tableau 2 : Exemples de régulations envisagées entre le CFTR et d’autres protéines. 41
Tableau 3 : Tableau non-exhaustif des potentiateurs et activateurs de CFTR. 48
Tableau 4 : Tableau récapitulatif des inhibiteurs de CFTR. 49
Tableau 5 : Tableau récapitulatif des correcteurs de CFTR. 57
Tableau 6 : Récapitulatifs des molécules utilisables en thérapie pharmacologique. 60
Tableau 7: Tableau récapitulatif des différentes molécules inhibitrices du CaCC. 70
Tableau 8 : Composition des solutions A et B nécessaires à la transfection des cellules par
siRNA. 88
Tableau 9 : Composition du tampon de lyse. 90
Tableau 10 : Composition du cocktail d’inhibiteurs de protéases. 90
Tableau 11 : Composition du tampon de laemmli 2X. 90
Tableau 12 : Composition des gels de polyacrylamide. 91
Tableau 13 : Composition du tampon d’électrophorèse 10X. 91
Tableau 14 : Composition du tampon de transfert. 91
Tableau 15 : Récapitulatif des anticorps primaires utilisés. 92
Tableau 16 : Récapitulatif des anticorps secondaire utilisés. 92
Tableau 17 : Composition de la solution de Krebs. 94
Tableau 18 : Composition de la solution de Krebs sans Cl - . 96
Tableau 19 : Composition du milieu d’efflux pour les systèmes d’expression endogènes. 99
Tableau 20 : Composition de la solution de Krebs « normal ». 102
Tableau 21 : Détermination de l’IC50 (concentration du composé inhibant 50 % de l'effet
observé) des adduits méthylglyoxal les plus efficaces, testés en efflux d’iodure. 106
Tableau 22: Résumé des caractéristiques d’activation et d’inhibition des canaux TRPV. 132
Tableau 23 : Résumé des caractéristiques d’activation et d’inhibition des canaux TRPC. 133
19

4-PBA 4-phenylbutyrate
LISTE DES ABREVIATIONS
A9C Acide anthracène-9-Carboxylique
ABC ATP-binding Cassette
ADN Acide DésoxyriboNucléique
ADNc ADN complémentaire
ADO Récepteur adénosine
AIF Apoptotic Inducing Factor
AMPc Adenosine MonoPhosphate cyclique
Anx Annexine
ARN Acide Ribonucléique
ARNm ARN messager
ATP Adenosine TriPhosphate
CACC Canal chlorure activé par le Ca 2+
CAM-kinase Calmoduline kinase
CHIP C-terminus of Hsc70 Interacting Protein
CF Cystic fibrosis
CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator
CFTR wt CFTR wild-type ou CFTR sauvage
DAG DiacylGlycérol
ddp Différence De Potentiel
DHFR Dihydrofolate reductase
DIDS Acide 4,4’-diisothiocyanato-stilbene-2,2’-disulfonique
DMSO Diméthylsulfoxyde
DO Densité Optique
Domaine PDZ Domaine PSD-95/D1g/Zo-1
Domaine R Domaine regulateur de CFTR
DPC Acide diphenylamine-2-carboxylique
DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylen Diamine Tetraacetic Acid
EGTA Ethylen Glycol Tetraacetic Acid
ENaC Epithelial Na + Channel
ERAD ER Associated Degradation
ERC ER Compartment
A
C
D
E
20

ERQC ER Quality Control
F508del deletion d’une phenylalanine en position 508
FFA Acide Flufénamique
Fluo-4-AM Fluo-4-acetoxymethyl ester
Fsk Forskoline
Glc Glucose
GMPc Guanidine MonoPhosphate cyclique
Gst Génistéine
Hsc Heat Shock Cognate
Hsp Heat Shock Protein
IBMX Isobutylméthylxanthine
IP3
Inositol tris phosphate
IP4
Inositol tetrakisphosphate
KO Knock Out
MPB Sels de benzo[c]quinolizinium
MSD Membrane Spanning Domain
F
G
H
I
K
M
NBD Nucleotide Binding Domain
NB-DNJ N-Butyl deoxynojirimycin, miglustat
NFA Acide Niflumique
ORCC Outwardly rectifying Chloride Channel
OAG Oleoyl-2-Acetyl-sn-Glycerol
P2Y2 Récepteur purinergique de type 2
PIP2 Phosphatidyl-inositol-diphosphate
PKA Protéine Kinase A
PKC Protéine Kinase C
N
O
P
21

PLC Phospholipase C
PPase Phosphatase
RAC Receptor Activated Channel
RE Réticulum Endoplasmique
ROMK Renal Outer Medullary K + channel
RT-PCR Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction
Rte Résistance transépitheliale
RR Rouge de Ruthénium
SDS Sodium Dodecyl Sulfate
siRNA Short Interfering RNA sequence
SITS Acide 4-acetamido-4’-isothiocyanatostilbene-2,2’-disulfonique
SOC Store Operated Channel
STIM Stromal Interacting Molecule
SVF Sérum de veaux fœtal
TMD Domaine Transmembranaire
TRPC Transient Receptor Potential Canonical
TRPV Transient Receptor Potential Vanilloid
TRPM Transient Receptor Potential Melanostatin
Ubc Ubiquitine
UTP Uridine TriPhosphate
WT Wild Type
R
S
T
U
W
22

I/ La mucoviscidose
1. Historique et généralités
La mucoviscidose est la maladie génétique héréditaire à transmission autosomique
récessive la plus fréquente dans les populations européennes. En France, un nouveau-né sur
4600 est atteint de mucoviscidose. Elle touche principalement les organes respiratoires et
digestifs.
Dès le Moyen Âge, on connaissait le sort funeste du nouveau-né dont la mère
remarquait le « baiser salé », c'est-à-dire le goût salé laissé par un baiser sur le front de
l'enfant. Mais c'est en 1936, que la maladie est décrite pour la première fois sous le nom de
« fibrose kystique du pancréas et bronchectasie » par le pédiatre Guido Fanconi (Fanconi et
al., 1936). Elle ne fut considérée comme une entité pathologique distincte qu'en 1938 grâce au
Dr Dorothy Hansine Andersen (Andersen et al., 1938). Le terme de mucoviscidose créé à
partir des termes « mucus » et « visqueux », fut utilisé pour la première fois en 1943 par le Dr.
Sydney Farber (Farber et al., 1945). C’est en 1953 que le docteur Paul di Sant' Agnese
découvre les anomalies électrolytiques dans la sueur des malades (augmentation importante
du chlorure et du sodium et moins marquée du potassium), permettant d'envisager un
diagnostic spécifique à la maladie : le test de la sueur. En 1983, Quinton décrit le défaut de
perméabilité aux ions chlorure au niveau des cellules épithéliales des glandes sudoripares
(Quinton, 1983). La même année Knowles observe le même phénomène au niveau de
l’épithélium pulmonaire (Knowles et al., 1983). En 1989, le gène impliqué dans la
mucoviscidose est isolé par les équipes de Lap-Chee Tsui, Francis Collins et John Riordan. Il
s'agit d'un gène localisé sur le chromosome 7 contenant 27 exons et codant un canal chlorure
transmembranaire appelé CFTR pour Cystic Fibrosis Transmenbrane conductance Regulator
(Kerem et al., 1989; Riordan et al., 1989; Rommens et al., 1989).
Bien que le gène ait été découvert il y a plus de 20 ans, il n’existe toujours pas de
traitement capable de soigner la maladie mais les progrès dans la prise en charge des malades
ont permis d’augmenter la qualité et l’espérance de vie des patients. En effet, pour les enfants
qui naissent en 2008, l’espérance de vie est de 46 ans, alors qu'elle n’était que de 7 ans en
1965.
23

2. Physiopathologie et manifestations cliniques
La mucoviscidose touche l’ensemble des tissus épithéliaux de l’organisme. Ces tissus
se retrouvent dans de nombreux organes : les voies respiratoires, le pancréas, le foie, l’arbre
biliaire, l’intestin grêle, les canaux déférents des organes génitaux masculins et les glandes
sudoripares de la peau (Figure 1).
Figure 1 : Les différents organes atteints lors de la mucoviscidose.
(D’après Welsh, 1995 ; modifiée par Renaud Dérand, 2001)
La sévérité des manifestations cliniques varie selon les mutations du gène CFTR, mais aussi
selon des facteurs génétiques et environnementaux.
24

2.1 Manifestations pulmonaires
Les manifestations pulmonaires sont la cause majeure de mortalité. L’absence de
CFTR à la membrane entraine la déshydratation et l’augmentation de la viscosité du mucus
qui conduisent à une obstruction chronique des bronches. Les poussières et les bactéries sont
difficilement évacuées et les propriétés antibactériennes du mucus sont diminuées. Tous ces
éléments favorisent l’apparition d’une infection précoce devenant rapidement chronique
associée à une réaction inflammatoire (Doring, 1996). Les premiers germes colonisant les
voies ariennes sont Haemophilus influenzae et Staphylococcus aureus, puis Pseudomonas
aeruginosa à un stade plus avancé. Le cercle vicieux inflammation chronique et surinfection
bactérienne aboutit à la fibrose sévère du tissu pulmonaire et en conséquence à une
insuffisance respiratoire majeure.
2.2 Manifestations intestinales
L’obstruction intestinale caractéristique de cette pathologie se manifeste dès les
premiers jours de vie chez 10 à 20% des nouveaux-nés par un ileus méconial (rétention des
selles primitives). Le syndrome de l’occlusion intestinale distale peut également survenir chez
l’enfant malade. Ces obstructions sont liées à une mauvaise hydratation des selles.
2.3 Manifestations pancréatiques
L’insuffisance pancréatique exocrine est présente chez environ 90% des patients. Chez
les malades les canaux pancréatiques se bouchent et les enzymes du pancréas (lipase,
trypsine…) sont peu excrétées dans la lumière intestinale. Ces enzymes agressent alors le
tissu pancréatique et induisent la fibrose. Tous ces éléments sont responsables d’un défaut
d’absorption des graisses, des protéines et des vitamines liposolubles (Davis et al., 1996). La
malabsorption entraine alors une diarrhée chronique graisseuse, des insuffisances de
croissance, un retard pubertaire, une anémie et des troubles carentiels.
Un diabète « insulinoprive » peut également survenir à l’âge adulte, il touche environ
15% des malades. Il est causé par la destruction des cellules ß des ilots de Langerhans
conduisant à un défaut de sécrétion d’insuline.
25

2.4 Manifestations hépato-biliaire
L’élévation de la viscosité de la bile induit l’obstruction des canaux hépatiques et
empêche son évacuation vers la vésicule biliaire. Elle se traduit dans 10 à 15% des cas par une
cirrhose biliaire. Une stéatose hépatique (accumulation des triglycerides), une hépatite
néonatale et parfois même une hépatomégalie (atrophie hepatique) peuvent aussi être
observées. De plus, la vésicule biliaire est fréquemment atrophiée et on retrouve également
dans certains cas une lithiase vésiculaire.
2.5 Manifestations génitales
Les manifestations génitales posent un problème de plus en plus important avec
l'amélioration de la survie des patients. Chez la femme, une hypofertilité due à des
modifications de la glaire cervicale (Oppenheimer et al., 1970) est observée, néanmoins les
grossesses de femmes atteintes ne sont plus rares. Chez l'homme, une stérilité causée par
l’atrésie bilatérale des canaux déférents est décrite. L'atrophie des voies excrétrices des
spermatozoïdes (canal déférent et vésicules séminales) entraîne une azoospermie ou
oligospermie sévère.
2.6 Autres manifestations
Les affections rhino-sinusiennes sont fréquentes. L’inflammation et l’infection
chronique du mucus entraînent une sinusite chronique et la formation de polypes nasaux. Une
déshydratation causée par perte de sel au niveau de la peau peut apparaitre lors de l’effort ou
de forte chaleur. Une cardiomyopathie probablement d'origine carentielle peut être décrite
ainsi qu'une hypertension artérielle pulmonaire.
26

3. Diagnostic et dépistage
3.1 Diagnostic
a. Test de la sueur
Le test de la sueur a été décrit pour la première fois en 1959 par Gibson et Cooke
(GIBSON & COOKE, 1959). Chez les malades, les glandes sudoripares ont une teneur
augmentée en ions sodium, potassium et chlorure. Le dosage des ions chlorure dans la sueur
des patients représente donc l’examen le plus fiable pour le dépistage de la mucoviscidose. La
sueur est obtenue grâce au passage d’un faible courant à travers la peau entre deux électrodes
et à l’application d’un tampon de pilocarpine. Cette molécule est un activateur des voies
cholinergiques, elle stimule la sécrétion de sueur ensuite recueillie sur un papier filtre (Chinet
et al., 2000).
Lorsque la concentration d’ions chlorure dans la sueur est supérieure à 60 mmol/l, le test est
positif. Il doit être positif à deux reprises pour affirmer le diagnostic de mucoviscidose. Une
concentration inférieure à 40 mmol/l est normale. Enfin, pour une concentration d’ions
chlorure intermédiaire comprise entre 40 mmol/l et 60 mmol/l, le test est dit « limite » et
nécessite des examens complémentaires (Davis et al., 1996; Chinet et al., 2000). Le test de la
sueur est fiable et sensible, il est positif dans plus de 98% des cas de mucoviscidose (2% de
faux positif).
b. Mesure de la différence de potentiel nasal
Cette technique mise au point par Knowles (Knowles et al., 1995) puis standardisée
consiste à mesurer la différence de potentiel (DDP) de l'épithélium nasal et permet l'étude in
vivo des transports ioniques transépithéliaux. En effet, la valeur basale de la DDP nasale est
plus électronégative chez les malades et sa variation lors de l’administration au niveau de la
muqueuse nasale d’amiloride, un inhibiteur des canaux sodiques, est plus élevée (Figure 2).
27

amiloride
Figure 2 : Mesure de ddp chez un patient CF et non-CF lors de l’administration sur la muqueuse nasale
d’amiloride, d’une solution sans chlorure et d’ATP.
(Modifiée d’après Taylor et al., 2009)
La méthode de mesure de la DDP nasale pour le diagnostic de la mucoviscidose est simple
d’emploi, peu couteuse et facile à maitriser mais n'a pas d'intérêt dans les formes typiques de
la maladie. Par contre, elle est intéressante dans les formes cliniques atypiques associées à des
tests de la sueur « limites » ou pour un diagnostic précoce chez le nouveau-né.
c. Diagnostic différentiel
En cas d’affections respiratoires récidivantes ou chez les hommes présentant une
azoospermie, une hypoplasie des vésicules séminales et/ou des canaux déférents, la recherche
de mutations du gène CFTR peut être envisagée (Moskowitz et al., 1993).
3.2 Dépistage
Patient CF Patient non-CF
a. Dépistage néonatal
ATP
amiloride
-Cl - -Cl -
Le dépistage néonatal de la mucoviscidose est systématique en France depuis
novembre 2002. Ce test est fiable et permet la prise en charge précoce des enfants atteints. Il
consiste à doser la trypsine immuno-réactive, une proenzyme secrétée par le pancréas et
circulant dans le sang (Pitt, 2010). Il est réalisé à partir d’une goutte de sang séchée 3 jours
ATP
28

après la naissance de l’enfant. La détection d’un niveau de trypsine anormalement élevé
(>60µg/l) conduit à réaliser un génotypage afin de rechercher les mutations les plus
fréquentes du CFTR. Lorsqu’une ou deux mutations du CFTR sont mises en évidence, les
enfants subissent un test de la sueur, dans le mois suivant leur naissance.
b. Dépistage prénatal
L’analyse de l’ADN du fœtus par une biopsie des villosités choriales peut être réalisée
de façon fiable à 10 semaines d’aménorrhée. Si cette analyse moléculaire est impossible, une
amniocentèse peut être pratiquée à 18 semaines. Le dépistage prénatal est recommandé
uniquement chez les couples à risques, dans le cas d’antécédents familiaux ou de la
connaissance de l’hétérozygotie d’un membre du couple. Elle peut également être demandée
dans le cas de la découverte d’une obstruction intestinale ou de l’absence de visualisation de
la vésicule biliaire lors d’une écographie (Moskowitz et al., 1993).
4. Traitements palliatifs actuels
Actuellement, il n’existe pas de traitement curatif de la mucoviscidose. Les traitements
proposés sont des traitements palliatifs multiples, destinés à soulager les symptômes de la
maladie. Bien qu’ils aient permis d’augmenter de manière significative l’espérance et la
qualité de vie des patients, ils restent assez contraignants et nécessitent un suivi quotidien.
Par exemple, la kinésithérapie respiratoire est l’un des traitements essentiels de la
mucoviscidose. Elle a pour objectif d'évacuer le mucus épais et visqueux qui obstrue les
bronches des malades. Le kinésithérapeute pratique des techniques d'accélération de flux
respiratoire, il rééduque la toux pour qu'elle devienne plus efficace et apprend au patient les
techniques de drainage postural et de toilette bronchique qu'il faut pratiquer plusieurs fois par
jour. De plus, l’utilisation d’un gilet gonflable vibrant peut également être prescrite. Le gilet
est relié à un générateur et permet la compression de la cage thoracique des patients 5 à 20
fois par seconde afin de facilité la liquéfaction du mucus. En résumé, la kinésithérapie permet
de désencombrer l’arbre bronchique de manière efficace et non-douloureuse mais reste
29

particulièrement astreignante pour les patients car elle doit être effectuée à raison d’une heure
une à deux fois par jour.
En plus de la kinésithérapie respiratoire, de nombreux traitements palliatifs
supplémentaires sont développés actuellement dans le but de soulager les troubles
respiratoires et digestifs des patients. Ils sont résumés dans le Tableau 1.
Manifestations
pulmonaires
Manifestations
digestives
Traitements Médications
Kinésithérapie respiratoire Gilet gonflable
Fluidification du mucus
Pulmozyme, solution saline
hypertonique
Anti-inflammatoires Ibuprofène
Antibiothérapie TOBI, azithromycine, Cayston
Vitamines AquADEKs
Enzymes pancréatiques Pancrealipase
Tableau 1 : Traitements palliatifs de la mucoviscidose.
(D’après http://www.cff.org)
Ces traitements palliatifs continuent de représenter un large champ d’investigation et des
essais cliniques peuvent être menés.
Par exemple, un essai clinique de phase II permettant d’évaluer l’effet anti-inflammatoire du
sildénafil (Dormer et al., 2005) est actuellement en cours aux Etats-Unis. Il inclut des patients
de plus de 14 ans atteint de mucoviscidose. Le sildenafil est administré à une concentration de
20 mg, 3 fois par jours pendant 28 jours. L’effet anti-inflammatoire du sildenafil est évalué en
mesurant le taux d’interleukine 8 et d’élastase présent dans les expectorations des malades.
Les premiers résultats seront connus en mai 2011 (http://clinicaltrials.gov). Il ne s’agit que
d’un exemple, actuellement de nombreux essais cliniques sont en cours (Figure 3).
30

Ces traitements palliatifs continuent de représenter un large champ d’investigation et
de nombreux essais cliniques sont en cours ().
Fluidifiants
Mucolytique
Antiinflammatoires
Anti-infectieux
Anti-rejet
Supplémentation
nutritionnelle
Figure 3 : Essais cliniques en cours dans le traitement palliatif de la mucoviscidose.
(Modifiées d’après la Cystic Fibrosis Foundation)
Cependant, les traitements palliatifs visent à soigner seulement les conséquences de la
mucoviscidose. Un espoir de traitement curatif repose sur le fait d’identifier les différents
transporteurs impliqués dans la déshydratation du mucus qui aboutit à la fibrose sévère des
poumons dans la mucoviscidose.
Essais cliniques
Pré-clinique Phase 1 Phase 2 Phase 3 Au patient
GS9411
N-acétylcystéine orale
DHA
Sildénafil
Glutathion inhalé
GSK SB 656933
Ploglitazone
Hydroxychloroquine
Simvastatin
GS 9310/11
BAY G3939
Solution saline hypertonique
Denufosol
Bronchitol
SPI-8811
Moli 1901
Arikace
KB001
MP-376
TIP
Cyclosporine inhalé
Liprotamase
Pulmozyme
Ibuprofen
TOBI
Azithromycine
Cayston
AquADEKs
Pancrealipase
31

II/ Les transports épithéliaux
Les cellules épithéliales des voies aériennes possèdent des fonctions d’échanges très
spécialisées grâce à l’expression de protéines de transport. Ces protéines sont responsables de
flux net d’ions et d’eau ainsi que du transport de petites molécules, d’acides aminés et de
sucres. La distribution des transporteurs à la membrane des cellules épithéliales des voies
aériennes est asymétrique et participe à la fluidification du mucus (Figure 4).
ATP ADP
Figure 4 : Représentation schématique des principaux transports présents à la membrane d’une cellule
épithéliale de voies respiratoires.
(ER : réticulum endoplasmique, IP3 : Inositol tris phosphate, P2Y2R : Récepteur purinergique de type 2)
(D’après www.abpi.org.uk)
Ainsi, le rôle des canaux ioniques tels que CFTR (Cystic Fibrosis Transmenbrane
conductance Regulator), ENaC (Epithelial Na + Channel), les canaux potassiques et des
transporteurs comme les aquaporines est maintenant bien établi.
Noyau
Voies aériennes
Tissu pulmonaire
Les canaux potassiques : Il existe deux types de canaux potassiques dans la membrane
basolatérale : le canal de type SK4 et le canal KvLQT1. Le canal de type SK4 est activé par le
Ca 2+ mais également par des agents pharmacologiques tels que le 1-EBIO et le chlorzoxazone
(Warth et al., 1999). Le canal KvLQT1 est homologue d’un canal potassium cardiaque
32

impliqué dans le syndrome du long Q-T. Il est aussi activé par le Ca 2+ mais surtout par
phosphorylation par la PKA. Il est sélectivement inhibé par le chromanol 293B (Bleich et al.,
1997). Il existe également des canaux potassiques à la membrane apicale des cellules
épithéliales, ils sont activés par l’augmentation de la concentration intracellulaire en ions Ca 2+
et inhibés par le barium.
La pompe Na + /K + -ATPase : Elle est indispensable à tous les transports ioniques épithéliaux.
Elle induit l’accumulation d’ions K + dans le cytoplasme et extrudent les ions Na + . Elle est
inhibée par les digitaliques tels que l’ouabaïne.
Le co-transport Na + /K + /2Cl - : Il est spécifique des cellules épithéliales et constitutivement
actif. Il permet l’influx simultané d’un ion Na + , d’un ion K + et de deux ions Cl - . Il conditionne
la sécrétion apicale d’ions chlorure en permettant l’accumulation de ces ions dans le
cytoplasme, il est spécifiquement inhibé par les diurétiques (bumétanide, furosémide).
Les aquaporines : Ces protéines tétramériques sont des protéines membranaires spécialisées
dans le transport des molécules d’eau. Les aquaporines permettent le passage de l'eau de part
et d'autre de la membrane tout en empêchant les ions de pénétrer dans la cellule. Elles
permettent aux cellules des organes d'absorber, conserver ou excréter l’eau et jouent un rôle
majeur dans le contrôle de l'hydratation mucus.
Le canal sodium ENaC : Le canal ENaC a été cloné en 1994 (Canessa et al., 1994), il
constitue la voie d’entrée des ions sodium dans les épithéliums du tube collecteur du rein, des
voies aériennes et du tractus digestif. Dans les poumons, le transport de sodium est essentiel
pour le contrôle du volume et de la composition du liquide de surface des voies aériennes
(Mall et al., 2004).
Les canaux chlorure : Dans les cellules épithéliales polarisées, ils sont exclusivement présents
dans la membrane apicale. Les canaux chlorure dépendant du potentiel (ClC) sont largement
exprimés dans l’organisme. Ils participent au maintien du potentiel de membrane et régulent
les transports transépithéliaux. Le canal chlorure activé par le calcium (CaCC) et le canal
CFTR sont les deux protéines responsables de la sécrétion des ions chlorure vers la lumière de
33

l’épithélium. Ces deux types de canaux participent activement au contrôle de la composition
du liquide de surface des voies aériennes et de la salive (Tarran et al., 2002).
Dans ce manuscrit, nous décrirons plus particulièrement les canaux CFTR dans le
chapitre III et les canaux CaCC dans le chapitre IV. En effet, la restauration d’une sécrétion
chlorure au niveau des épithéliums respiratoire représente un enjeu majeur pour le
développement de thérapie pharmacologique de la mucoviscidose.
34

III/ Le CFTR
La protéine CFTR appartient à la superfamille des transporteurs ABC (ATP Binding
Cassette). Les membres de cette famille de transporteurs sont retrouvés dans toutes les
espèces, allant des procaryotes aux eucaryotes. L’analyse des séquences et les éléments
communs semblent indiquer que les transporteurs ABC proviennent d'une protéine ancestrale
commune (Saurin et al., 1999). En utilisant l'hydrolyse de l'ATP, ces transporteurs sont
capables de transporter à travers les membranes cellulaires des éléments très variables tels que
des acides aminés, des peptides, des protéines, des ions organiques et inorganiques, certaines
toxines, voir même des antibiotiques (Dean et al., 2001).
1. Voie de biosynthèse de la protéine CFTR sauvage
Le gène codant pour la protéine CFTR, localisé sur le chromosome 7, mesure 250 kb
et comprend 27 exons. Dans les cellules épithéliales, l’ARNm du canal CFTR est traduit en
une protéine membranaire de 1480 acides aminés (Figure 5).
Figure 5 : Le CFTR du gène à la protéine.
R
35

La biosynthèse de la protéine CFTR débute par la création de la chaîne protéique au
niveau du complexe ribosomique vers le réticulum endoplasmique (RE ; Figure 6, étape 1).
Figure 6 : Biogenèse et routage intracellulaire de la protéine CFTR sauvage.
Une fois la protéine CFTR synthétisée, elle acquiert sa conformation de protéine canal par des
modifications post-traductionnelles qui vont lui permettre de quitter le RE (Figure 6, étape 2)
ou, en cas de déficience, d’être dirigée vers la voie de dégradation protéolytique (Figure 6,
étape 3). Durant sa maturation dans le réticulum endoplasmique la protéine CFTR est associée
à des protéines chaperonnes qui vont prévenir les erreurs de repliements. Elles ne vont pas
directement altérer le repliement mais plutôt le retarder, pour prévenir le phénomène
d’agrégation et permettre ainsi un meilleur assemblage des sous-unités de la protéine CFTR.
Ensuite, au niveau de l’appareil de Golgi, la maturation finale de la protéine CFTR est
réalisée. Elle consiste en l’ajout de deux glycanes sur les asparagines en position 894 et 900
de la quatrième boucle extracellulaire de la protéine. Ce CFTR mature est dirigé par un
système de vésicules vers la membrane plasmique (Figure 6, étape 4). Enfin, à la membrane
plasmique, la protéine CFTR est rapidement internalisée en une réserve de protéines
subapicales (Figure 6, étape 5) qui pourra être recyclé (Figure 6, étape 6) ou envoyé vers une
voie de dégradation lysosomale (Figure 6, étape 7) en fonction des besoins de la cellule.
2. Structure de la protéine CFTR sauvage
La protéine CFTR est composée de deux fois six segments transmembranaires (TMD),
et de trois domaines intracellulaires : deux domaines de liaison aux nucléotides notés NBD1
36

et NBD2 (Nucleotide Binding Domain), et un domaine régulateur (Sheppard et al., 1999;
Figure 7).
Figure 7 : Schéma illustrant l’organisation de la protéine CFTR.
MSD 1&2 : Membrane Spanning Domain 1&2 (domaines transmembranaires),
NBD 1&2 : Nucleotide Binding Domain 1&2 (domaines de fixation des nucléotides),
R : Regulatory Domain (domaine régulateur),
P : Sites de phosphorylation par les protéines kinases A et C.
(D’apres http://physpharm.ohsu.edu/faculty/Dawson Lab)
2.1 Les domaines transmembranaires TMD1 et TMD2
Les deux domaines transmembranaires interviennent dans la formation du pore. Le
domaine TMD1 joue un rôle important dans la conductance et dans la sélectivité du canal
CFTR (Davis et al., 1996). Les segments membranaires M1, M5, M6, et M12 sont impliqués
dans la zone formant le pore (Tabcharani et al., 1992; McDonough et al., 1994; Schwiebert et
al., 1998). Des changements de conformation du segment M6 (passage d’une hélice à un
feuillet ß) influent sur la sélectivité et l'ouverture du canal (Wigley et al., 1998).
2.2 Le domaine de régulation R
Ce domaine correspond aux résidus 590 à 831 codés par l’exon 13. Il est spécifique du
canal CFTR. La phosphorylation du domaine R par les protéines kinases A et C (Yurko-
Mauro & Reenstra, 1998) est nécessaire à l'ouverture du canal par le MgATP (Riordan et al.,
37

1989). L’état déphosphorylé du domaine R maintient le canal fermé alors que des
modifications de conformation interviennent dans le passage à l’état ouvert (Cotten & Welsh,
1997). Ce domaine est en fait composé de deux sous-domaines :
- le sous domaine RD1, allant des résidus 590 à 672. Cette séquence est impliquée
dans la maturation de la protéine ainsi que dans l'ouverture du canal en modulant des
interactions entre le domaine NBD1 et les sites de phosphorylation du domaine R (Pasyk et
al., 1998).
- le sous domaine RD2, allant des résidus 672 à 831. Cette portion du domaine R est
constituée des résidus sérines phosphorylables qui jouent un rôle important dans le
fonctionnement du canal CFTR (Dulhanty & Riordan, 1994).
2.3 Les domaines de liaison aux nucléotides NBD1 et NBD2
Dans la séquence des NBD se trouvent les sites consensus de liaison à l'ATP, Walker
A et B (Walker et al., 1982), ainsi qu’une séquence commune à tous les transporteurs ABC :
LSGGQXQR (ou motif C).
Le motif C est situé à la surface des domaines NBD, proche des sites de liaison de l'ATP
(Clancy et al., 1997). Selon les auteurs, les limites des domaines NBD1 et NBD2 varient
légèrement. Pour NBD1 la limite inférieure varie du résidu F434 (codé par l'exon 9) à L441,
et la limite supérieure est comprise entre I586 (codé par l'exon 12) et K684 avec une
extension possible jusqu'à F650. Le domaine NBD2 est formé des résidus L1127 à L1480
(Bianchet et al., 1997). Les deux domaines NBD coopèrent dans la régulation des
mécanismes d'ouverture et de fermeture ATP-dépendants du canal CFTR. L’ouverture du
canal nécessite la liaison d’une molécule d’ATP sur les deux domaines mais seule l’hydrolyse
de la molécule d’ATP lié au NBD2 est impliquée dans l’ouverture du canal (Berger et al.,
2005a).
2.4 Les boucles intra-cytoplasmiques et extracellulaires
Les boucles intracytoplasmiques qui relient les segments transmembranaires impliqués
dans la formation du pore, ne participent pas directement aux mouvements ioniques. A
38

l’inverse, les résidus de la boucle extracellulaire 1, influencent la sélectivité du canal (Seibert
et al., 1997).
Enfin, des études de modélisation moléculaire sont menées. Depuis quelques années, afin
d’identifier la structure tridimensionnel du CFTR. Tout d’abord, elles ont permis de proposer
différents modèles de structure pour le domaine NBD1 (Callebaut et al., 2004; Lewis et al.,
2004) puis pour la protéine entière (Mornon et al., 2008; Serohijos et al., 2008). Récemment,
le Dr Callebaut a proposé un modèle de structure fermée et ouverte du CFTR (Mornon et al.,
2009; Figure 8).
Figure 8 : Modélisation de la structure tridimensionnelle de la protéine CFTR dans une conformation
canal ouvert, proposé par le Dr Callebaut.
MSD 1&2 : Membrane Spanning Domain 1&2 (domaines transmembranaires),
NBD 1&2 : Nucleotide Binding Domain 1&2 (domaines de fixation des nucléotides),
(D’après Callebaut, 2009)
Ces prédictions sont intéressantes car elles fournissent une base moléculaire pour une
meilleure compréhension du fonctionnement de la protéine CFTR.
3. Fonction de la protéine CFTR sauvage
3.1 CFTR : une protéine régulatrice
39

Avant qu’on ne lui reconnaisse des fonctions de canal chlorure, il était attribué au
CFTR surtout des propriétés de régulation des conductances membranaires (Egan et al.,
1995). En effet, de nombreuses anomalies ont été observées au sein des épithélia CF, incluant
entre autre, une régulation altérée des canaux chlorure ORCC (outwardly rectifying chloride
channel) et une hyperabsorption des ions sodium (Figure 9).
Figure 9: Rôles présumés de la protéine CFTR dans la cellule épithéliale.
ORCC : Outwardly Rectifying Chloride Channel (canal chlorure rectifiant sortant),
CFTR : Cystic fibrosis Transmembrane conductance Regulator
ENaC : Epithelial Na + channel (canal sodique épithélial),
ROMK : Renal Outer Medullary K + channel (canal potassique médullaire externe),
+ : activation ; - : inhibition.
(Modifiée d’après Schwiebert et al., 1999)
En effet, dans les poumons CF, le défaut de transport des ions chlorure associé à une
hyperabsorption des ions sodium contribuent à la déshydratation du mucus respiratoire
(Boucher et al., 1986; Knowles et al., 1983). La régulation du canal sodique ENaC par le
CFTR a été observée dans les tissus épithéliaux d’origine humaine au niveau des voies
aériennes et du côlon (Mall et al., 1998; Mall et al., 1999). Le transport de chlorure semble
avoir un rôle crucial dans l’inhibition d’ENaC. Mais le mécanisme sous-jacent de la
régulation du canal ENaC par le CFTR est toujours discuté et reste encore incertain.
Plus récemment, une étude réalisée dans notre laboratoire, a mis en évidence, par des
techniques de co-immunoprécipitation et par l’extinction en siRNA, l’existence d’un couplage
entre le canal CFTR et un canal calcique appartenant à la famille des canaux TRP (Transient
40

Receptor Potential), le TRPC6. Il a été démontré que l’absence de couplage entre TRPC6 et le
CFTR dans les cellules CF induisait un influx calcique anormal (Antigny et al., 2010).
D'autres fonctions régulatrices de CFTR ont été décrites (transport d’ATP, modulation
des phénomènes d'exocytose/endocytose ou encore régulation du pH des organelles
intracellulaires...). Cependant, en dépit de nombreuses cibles potentielles, peu de détails sur
les mécanismes moléculaires impliqués ont été publiés (Tableau 2).
Protéine ou
processus
régulé
Fonction de la
protéine
Aquaporine Canal H2O AQP3
Libération de
l’ATP
ORCC
Conduite de
nucléotides
ICl - régulé par
AMPc
CaCC IClCa
Sécrétion de
HCO3 -
Conductibilité et
échange de HCO3 -
NHE3 Echangeur Na + /H -
Gène Rôle physiopathologique
Inconnu
Inconnu
TMEM16 ?
Bestrophine ?
SLC26
Perturbation de la perméabilité
à l’eau
Perturbation du signal
paracrine
Réduction de la conductance
chlorure
Conductance chlorure
alternative
Diminution de l’alcalinité des
secrétions
NHE3 Hyperabsorption sodique
ROMK Canal K + KCNJ1 Recyclage du K + rénal
TRPV4 Entrée de Ca 2+ TRPV4
TRPC6 Entrée de Ca 2+ TRPC6
ENaC Canal Na + SCNN1A,B,D
et G
Expression de
cytokine
Médiateurs de
l’inflammation
Régulation du volume
cellulaire
Régulation du volume
vasculaire et de la sécrétion de
mucus
Déshydratation du liquide de
surface respiratoire (ASL)
Tableau 2 : Exemples de régulations envisagées entre le CFTR et d’autres protéines.
Mécanisme de
régulation proposé
Inconnu
Inconnu
Mécanisme
autocrine/paracrine
Inconnu
Direct et indirect
Protéine
d’échafaudage,
indirect
Protéine
d’échafaudage
NHERF
Inconnu
Inconnu
Direct, indirect par
le flux Cl -
multiple Maladie du poumon Inconnu
41

La protéine CFTR sauvage semble réguler de nombreux autres canaux ioniques, notamment
via la formation de complexes multiprotéiques avec comme partenaires protéiques
intermédiaires privilégiés des protéines à domaines PDZ. Cependant, il semble que toutes les
associations protéiques existantes impliquant CFTR ne soient pas encore déterminées in vivo.
3.2 CFTR : un canal chlorure
a. Conductance et sélectivité du canal CFTR
Le CFTR est un canal sélectif pour les anions permettant la diffusion passive d’ions
chlorure. Les boucles intracytoplasmiques qui relient les segments transmembranaires
impliqués dans la formation du pore, ne participent pas directement aux mouvements des ions.
À l’inverse, les résidus de la première boucle extracellulaire, influencent la sélectivité du
canal (Seibert et al., 1997). La partie du pore la plus resserrée a un diamètre d'environ 5,3 Å
(Hanrahan et al., 1998).
La conductance du canal varie entre 6 et 11pS en fonction du type cellulaire, de la
température, et de la concentration des ions. La séquence de perméabilité du canal CFTR est :
Br - >Cl - >I - >F - . Cette séquence distingue CFTR des autres canaux chlorure épithéliaux, dans
lesquels la perméabilité de l'iodure est plus importante que celle du chlorure (Sheppard &
Welsh, 1999).
b. Mécanisme d’ouverture et de fermeture du canal CFTR
La durée d'ouverture du canal est variable en fonction de la température et du modèle
cellulaire considéré. Pour des températures physiologiques (35°C) la durée d’ouverture du
canal est comprise entre 100 et 250 ms (Hanrahan et al., 1998).
On distingue deux étapes dans l’ouverture du canal :
- la phosphorylation du domaine R. Son degré de phosphorylation détermine la
probabilité d’ouverture. Bien que les résidus phosphorylables du domaine R soient connus, les
résidus impliqués dans les mécanismes d’ouverture et de fermeture du canal sont incertains
(Hwang et al.,1993; Hwang et al., 1994; Figure 10).
42

Figure 10 : Modèle simplifié de l’activité du canal CFTR régulée par la phosphorylation de son domaine
régulateur et la fixation d’ATP sur ses domaines NBDs.
MSD 1&2 : Membrane Spanning Domain 1&2 (domaines transmembranaires),
NBD 1&2 : Nucleotide Binding Domain 1&2 (domaines de fixation des nucléotides),
R : Regulatory Domain (domaine régulateur)
PKA : protéine kinase A, PPases : phosphatases
P : Sites de phosphorylation par la PKA
(D’après Chen, 2006)
- la liaison et l’hydrolyse de l’ATP sur les sites NBD. Elle entraîne une modification
conformationnelle des domaines transmembranaires du canal CFTR. L’hydrolyse des
nucléotides triphosphates est indispensable à l’ouverture du canal, et la phosphorylation
préalable par la PKA augmente cette réaction. Le canal déphosphorylé est incapable
d'hydrolyser l'ATP. L'hydrolyse de l'ATP représente l’étape limitante à la fois pour
l’ouverture et la fermeture du canal. Ces deux événements interviennent sur des sites
différents d'une même molécule. Le domaine NBD1 est le site d’hydrolyse de l'ATP couplé à
l'ouverture du canal et le domaine NBD2 est le site d’hydrolyse de l'ATP permettant la
fermeture du canal.
c. Phosphorylation du canal CFTR par les PKA et les PKC
La première étape de l’activation du canal CFTR passe par la phosphorylation par les
protéines kinases A (Naren et al., 2003) de cinq résidus serines situés dans le domaine R. De
plus, l'inhibition de la phosphorylation du CFTR par les protéines kinases C (Yurko-Mauro &
Reenstra, 1998), prévient une phosphorylation ultérieure par la PKA. La phosphorylation du
CFTR par les PKC semble donc stimuler la phosphorylation par la PKA (Yurko-Mauro &
43

Reenstra, 1998). Par conséquent, une phosphorylation de base par les PKA et les PKC est
nécessaire à l'activation du CFTR.
d. Régulation du canal CFTR par les protéines phosphatases
Très rapidement, après phosphorylation par les PKA, la déphosphorylation par des
protéines phosphatases inactive le canal. A l’inverse, l’inhibition des protéines phosphatases
endogènes, augmente l'efficacité de stimulation du canal CFTR et ralentit son retour à l'état
désactivé.
Chez les eucaryotes, les quatre principaux types de protéines phosphatases
sérine/thréonine solubles sont les protéines phosphatases PP1, PP2A, PP2B et PP2C. Les
phosphatases PP2A et PP2C sont critiques pour la régulation du canal CFTR. Ces enzymes
comportent des motifs d'ancrage à la membrane, permettant la co-localisation avec CFTR
(Becq et al., 1993). La protéine PP2A provoque une déphosphorylation quasi complète du
canal CFTR et les phosphatases PP2C sont des régulateurs puissants de l'activité du canal
CFTR. L’association de plusieurs phosphatases est donc nécessaire pour la désactivation
complète du canal CFTR (Luo et al., 1998).
e. Régulation du canal CFTR par l’ATP
Une fois phosphorylé, l'ouverture du canal CFTR nécessite de l'ATP cytosolique et du
magnésium. L’ADP et les analogues non-hydrolysables de l’ATP inhibent l’activation par
l’ATP de manière compétitive, par interaction spécifique sur le domaine NBD2 (Riordan,
1993).
Bien que, la probabilité d'ouverture du canal augmente en fonction de la concentration en
ATP intracellulaire, c’est le rapport entre ATP et ADP qui est le plus important dans la
régulation du canal CFTR. Des changements dans l'état métabolique de la cellule qui
modifient ce ratio régulent l'activité du canal (Welsh & Smith, 1993).
44

f. Régulation du canal CFTR par les seconds messagers
L'activation du canal CFTR par la PKA est stimulée par l'AMPc. Le niveau d'AMPc
est contrôlé par la balance entre sa synthèse par les adénylate-cyclases et son hydrolyse par les
phosphodiestérases. Dans les cellules provenant d'épithéliums respiratoires, l'activité du canal
CFTR sauvage est particulièrement sensible à l'activité de la phosphodiestérase de type III.
L'inhibition de ce type de phosphodiestérase élève considérablement le niveau d'AMPc
intracellulaire, entraînant une augmentation importante de l'efflux de chlorure (Kelley et al.,
1995).
Il est également possible d’activer le canal CFTR par des mécanismes indépendants de
l’AMPc. Une étude menée dans des cellules provenant de carcinomes mammaires de souris,
transfectées avec le gène codant pour le canal CFTR humain, a montré que l’ATP
extracellulaire peut activer le transport de chlorure. La stimulation du canal CFTR par des
analogues de l'ATP suggère une stimulation impliquant les récepteurs adénosine et les
récepteurs purinergiques P2Y2 (Lazarowski & Boucher, 2009; Figure 11).
Voies aériennes
Figure 11 : Régulation du CFTR par les récepteurs adénosine (ANO) et par les récepteurs
purinergique (P2Y2).
(Modifiée d’après Lazarowski et al., 2009)
La recherche d’agents pharmacologiques modulant l’activité du CFTR est donc basée
sur l’étude de molécules agissant sur les différentes étapes de régulation de la protéine.
45

4. Pharmacologie de la protéine CFTR
La mutation du gène CFTR induit un défaut de la sécrétion chlorure à la membrane
apicale des cellules épithéliales. Afin de corriger ces altérations de transport ionique, l’une des
approches consiste à développer des composés pharmacologiques agissant sur la protéine
CFTR.
4.1 Activateurs et potentiateur du CFTR
Il est possible de moduler le CFTR : soit en agissant sur son système de régulation,
soit en agissant directement sur le canal.
a. Les activateurs et potentiateurs indirects du CFTR
Le CFTR peut être activé par des agents qui augmentent le taux d’AMPc, tel que les
activateurs de l’adenylate cyclase. Par exemple, la forskoline est un activateur connu du
CFTR, issue de l'extrait d’une plante : Coleus forskohlii. Elle est très utilisée comme outil
pharmacologique en Recherche.
Le taux d’AMPc dans une cellule peut également être augmenté par des inhibiteurs de
phosphodiesterases, qui inhibent sa dégradation. Le rôle des phosphodiesterases dans
l’activation du CFTR a été démontré grâce à l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques des
phosphodiesterases tel que le rolipram (inhibiteur de la phosphodiesterase de type IV), la
milrinone et l’amrinone (inhibiteurs de la phosphodiesterase de type III). Les études réalisées
sur ces molécules sont contradictoires. En effet, des travaux ont mis en évidence l’activation
du CFTR sauvage et muté par la milrinone et l’amrinone sur des cellules CF issues de
l’épithélium respiratoire murin et humain (Al Nakkash & Hwang, 1999; Kelley et al., 1996;
Kelley et al., 1997). Cependant, il a également été rapporté l’absence d’effet in vivo de la
milrinone sur les voies aériennes CF murines et humaines (Smith et al., 1999). L’ensemble de
ces résultats suggèrent un faible potentiel des inhibiteurs de phosphodiesterases de type III et
IV en tant que modulateurs du CFTR.
46

Dans le même temps, une deuxième alternative pour activer le CFTR a été identifiée.
En 1991, John W.Hanrahan et collaborateurs ont mis en évidence le contrôle du CFTR par des
phosphates membranaires (Tabcharani et al., 1991). Plusieurs molécules commerciales ont
alors été testées pour leurs capacités à activer le CFTR par l’intermédiaire de l’inhibition des
phosphatases. Par exemple, le levamisole et le bromotetramisole ont été identifiés comme des
activateurs du CFTR sauvage grâce à l’inhibition de phosphatases membranaire (Becq et al.,
1993; Becq et al., 1994; Becq et al., 1996). Ces molécules sont surtout utilisées comme outils
pharmacologiques.
b. Les activateurs et potentiateurs directs du CFTR
Le premier activateur direct de CFTR a été décrit en 1994 par Gribkoff et
collaborateurs, il s’agit d’un composé benzimidazolone : le NS004 (Gribkoff et al., 1994). Le
NS004 n’a pas d’effet sur le taux d’AMPc, ni sur les phosphodiesterases ou les phosphates. Il
a été rapporté que le NS004 stimule l’activité du CFTR sauvage dans des cellules épithéliales
(Devor et al., 1996) et des cellules recombinantes (Derand et al., 2003), avec une plus forte
affinité pour le CFTR phosphorylé.
Une étude structure-activité a permis de mettre en évidence des dérivés benzimidazolones
capables de stimuler la sécrétion chlorure en chambre de Ussing via l’activation de canaux
potassique h1K1 et du CFTR : 1-EBIO (1-ethyl-2-benzimidazolinone), DCEBIO (5, 6-
dichloro-1-ethyl-1, 3-dihydro-2H-benzimidazol-2-one) et UCCF-853 (1-(3-chlorophenyl)-5-
trifluorométhyl-3-hydrobenzimidazol-2-one). Ces dérivés benzimidazolones représentent des
outils intéressants pour la pharmacologie du CFTR.
Depuis 1994, de nombreux activateurs et potentiateurs de CFTR ont été décrits dans la
littérature, certains ont été mis en évidence par des approches conventionnelles mais la plupart
d’entre eux ont été découverts grâce au criblage à haut débit de banques de molécules
chimiques ou naturelles, le mécanisme d’action de ces molécules n’est pas toujours élucidé
(Tableau 3).
47

Familles Molécules Mécanisme d’action Références
Xanthines
Benzimidazolones
Flavonoïdes
IBMX, théophiline,
aminophylline, DPMX,
pentoxifylline, X-33,
CPX et DAX
NS004, 1-EBIO,
DCEBIO et UCCF-853
Genistéine,
phytoflavones, et
benzoflavones
Tableau 3 : Tableau non-exhaustif des potentiateurs et activateurs de CFTR.
4.2 Inhibiteurs du CFTR
Inhibition des
phosphodiesterases et action
directe sur le domaine NBD1
du CFTR
Activation des canaux
potassiques et mécanisme
direct sur CFTR inconnu
Action directe sur les sites
G551 et G1349 du CFTR
Il existe deux types d’inhibiteurs agissant par liaison directe sur le CFTR : des
inhibiteurs allostériques qui vont entrainer la fermeture du canal et des inhibiteurs qui vont
pénétrer dans le canal CFTR lorsque celui-ci est en position ouverte et empêcher le passage
des ions chlorure, ils sont appelées « open-channel blocker ». Pour certaines molécules
inhibitrices de CFTR, le mécanisme d’action reste encore inconnu (Tableau 4).
(Becq et al., 1994;
Drumm et al., 1991)
(Gribkoff et al., 1994)
(Illek et al., 1995)
Benzoquinolizinium MPB Action direct sur G622 (Billet et al., 2010)
Phloxine B
Phénanthroline et
benzoquinoline
Anesthésiques
généraux
Dihydropyridine
Phloxine B
1, 10 phénantroline,
5, 6 benzoquinoline
Inhibition des canaux
potassique et mécanisme
direct sur le CFTR sur les
sites G551 et G1349
Inhibition des
phosphodiesterases
et mécanisme direct sur le
CFTR inconnu
(Cuthbert et al., 2003)
(Cuthbert et al., 2003;
Duszyk et al., 2001;
Szkotak et al., 2004)
Octanol Inconnu (Marcet et al., 2004)
Nifédipine,nicardipine,
nimodipine, isradine,
nitrendipine, félodipine
et niguldipine
Activation des canaux
calciques voltage-dépendant
et mécanisme direct sur le
CFTR inconnu
(Pedemonte et al., 2005a)
Dérivés NPPB NPPB-AM Inconnu (Wang et al., 2005)
Isoxazolones et
isoxazolines
3-(2-benzyloxyphenyl)
isoxazoles, et
isoxazolines
Inconnu
(Berger et al., 2005;
Wang et al., 2007)
48

Molécules Mécanisme d’action Références
ADP, AMP et ions
pyrophosphates
Tableau 4 : Tableau récapitulatif des inhibiteurs de CFTR.
Parmi ces molécules, le Gly-H101, le GPinh-5a et le CFTRinh-172 sont les composés
les plus sélectifs du CFTR.
(Anderson & Welsh, 1992)
Flavonoïdes Inhibiteurs allostériques
(Melin et al., 2004)
Toxine peptidique
(Fuller et al., 2007)
DPC (Cunningham et al., 1992)
Glibenclamide et tolbutamide (Sheppard & Welsh, 1992)
DIDS, DNDS et MOPS (Schultz et al., 1999)
Phloxine B Bloqueur du canal ouvert
(Cuthbert, 2003)
GlyH-101 (Muanprasat et al., 2004)
NPPB (Wang et al., 2005)
Acide niflumique et
flufénamique
(Verkman & Galietta, 2009)
Ibuprofène (Devor & Schultz, 1998)
Fluoxétine (Maertens et al., 1999)
Furosémide, bumétanide (Reddy & Quinton, 1999)
Suramine (Bachmann et al., 1999)
DIAO (Ito et al., 2001)
Inconnu
CFTRinh-172 (Ma et al., 2002)
INH1 et INH2 (Muanprasat et al., 2007)
GPinh-5a (Routaboul et al., 2007)
Stéviol (Pariwat et al., 2008)
PPQ-102
(Tradtrantip et al., 2009)
49

Pour exemple, en 2002, le criblage de 50000 molécules chimiques réalisé par l’équipe
du Pr Verkman a permis l’identification d’une nouvelle famille d’inhibiteurs de CFTR : les
composés 2-thioxo-4-thiazolidinone. Le composé le plus efficace, le CFTRinh-172 présente un
IC50 de 300 nM (Ma et al., 2002).
Figure 12 : Structure chimique du CFTRinh-172.
Cette molécule est un inhibiteur très éfficace sélectif du CFTR (Ma et al., 2002). Cependant le
CFTRinh-172 n’est pas soluble de l’eau et sa dissolution dans le DMSO (diméthylsulfoxyde)
induit des problèmes de toxicité à fortes concentrations.
En conclusion, la pharmacologie des modulateurs du CFTR est très riche et comporte
de nombreuses familles de molécules différentes. Cette diversité reflète la complexité de la
protéine CFTR et de ses différentes voies d’activations.
5. Les différentes mutations de la protéine CFTR
Depuis la découverte du gène codant pour la protéine CFTR en 1989, plus de 1700
mutations ont été recensées. La plupart des mutations sont des mutations ponctuelles qui
impliquent seulement quelques nucléotides. La fréquence des mutations varie selon les
populations avec une distribution reflétant probablement des différences dans leurs
apparitions durant l'évolution, dans les pressions de sélection exercées et dans la migration
des populations. Parmi les 1700 mutations recensées du gène CFTR, environ 40% sont des
mutations faux-sens, 9% des mutations non-sens, 17% des mutations entrainants un décalage
du cadre de lecture, 12% des mutations altérant les codons essentiels pour l’épissage, 14% des
mutations induisant des variations dans la séquence du CFTR et les 7% restant incluent des
mutations au niveau du promoteur et des délétions inconnues (Figure 13).
50

Figure 13 : Répartitions des mutations du gène CFTR.
(D’après http://www.genet.sickkids.on.ca/Home.html)
Bien que cela soit rare, on peut trouver plusieurs mutations peuvent apparaître sur le
même chromosome et deux changements sur le même allèle peuvent provoquer des
phénotypes plus sévères ou au contraire avoir un effet de compensation.
Au vue du grand nombre de mutations du gène CFTR, il était important de les classer
en catégorie. En 1993, Welsh et Smith proposent une classification de ces anomalies par
rapport à la fonction canal chlorure (Welsh, 1993; Figure 14).
Figure 14 : Classification des mutations du gène CFTR.
(Modifiée d’après Welsh, 1993)
Les mutations de classes I à III sont les plus sévères, les épithéliums affectés par ce
type de mutations ne présentent peu ou pas d’activité de la protéine CFTR et ne répondent pas
aux agonistes dépendant de l’AMPc.
51

Les mutations de classe I : Cette classe inclut les mutations non-sens et les mutations
produisant un codon stop prématuré (mutation du site d’épissage ou mutation décalant la
phase de lecture). Par exemple, les mutations G542X, R553X et W1282X sont des mutations
stop qui produisent un ARNm instable et rapidement dégradé. Ces mutations résultent en une
absence totale ou partielle de la protéine.
Les mutations de classe II : Ces mutations perturbent le processus de maturation
cellulaire de la protéine et son ciblage vers la membrane plasmique. Ainsi, la protéine est soit
absente, soit présente en quantité réduite au niveau de la membrane apicale (Cheng et al.,
1990a). Cette classe inclut la mutation la plus fréquente dans la mucoviscidose, la délétion
d’une phénylalanine en position 508 du domaine NBD1 du CFTR : F508del-CFTR. Ces
mutations de classe II perturbent le repliement post-traductionnel de la protéine CFTR et
cause son accumulation puis sa dégradation par le protéasome. Lorsque cette protéine est
réadressée à la membrane plasmique par le biais d’agents pharmacologiques, elle est capable
de fonctionner comme un canal chlorure. Cependant la probabilité d’ouverture du canal est
fortement réduite (Haws et al., 1996; Hwang et al., 1997). De plus, il semble que le taux
d’activation du F508del-CFTR après phosphorylation soit sept fois plus faible que celui du
CFTR sauvage (Wang et al., 2000; Figure 15).
Figure 15 : Tracés caractéristiques obtenus en canal unitaire, après stimulation par de la forskoline, pour
la protéine CFTR sauvage ou mutée F508del.
(D’après Chen et al., 2004)
La protéine F508del-CFTR présente donc à la fois un défaut d’adressage et d’activation. Dans
les populations caucasiennes et nord-européennes, la mutation F508del-CFTR est retrouvée
chez 92% des patients et 70% des patients sont homozygotes pour cette délétion. Cette
52

mutation représente 48% des allèles CF dans la population afro-américaine et 30% dans les
populations américaines d’origine asiatique.
Les mutations de classe III : Les protéines mutées sont correctement localisées à la
membrane apicale des cellules mais présentent un défaut d’activation (Cutting et al., 1990;
Becq et al., 1994). Par exemple, dans la classe III sont incluent les mutants G551D ou
G1349D, ils sont situées respectivement dans le domaine NBD1 et NBD2 et modifient la
liaison et l’hydrolyse de l’ATP ainsi que la phosphorylation du domaine R.
Les patients présentant des mutations de classes IV à VI développent généralement un
phénotype intermédiaire et moins sévère que pour les trois classes de mutations précédentes.
Les mutations de classe IV : Certains segments des domaines transmembranaires
participent à la formation du pore ionique. Les mutations faux-sens situées dans ces régions
produisent une protéine correctement positionnée, qui présente une activité de sécrétion
chlorure (Sheppard et al., 1993). Cependant, les caractéristiques de ces canaux sont
différentes de celles du canal CFTR endogène avec une diminution du flux d'ions et une
sélectivité modifiée. Par exemple, les mutations R117H, R334W et R234P font parties de la
classe III.
Depuis la classification de Welsh et Smith, d'autres classes de mutations ont été
proposées afin de disséquer les défauts biochimiques associés aux diverses mutations. La
classe I a ainsi été subdivisé en classe V et en classe VI.
Les mutations de classe V : Les mutations de cette classe sont responsables de la
production d’une protéine avec une activité et une régulation normale mais avec un taux de
synthèse diminué. Cette classe inclut des mutations dans le promoteur et des mutations qui
modifient l’épissage alternatif et provoquent une synthèse inefficace de la protéine.
Les mutations de classe VI : Cette classe de mutation produit un CFTR tronqué dans
son domaine C-terminal. Le CFTR muté est internalisé plus rapidement à la membrane
apicale (Haardt et al., 1999).
53

Ce type de classification permet de prédire le phénotype des patients CF en accord
avec leur génotype. Elle permet donc de proposer un type de médication adapté et
personnalisé pour chaque groupe de patients.
6. Stratégies de thérapies curatives
Bien qu’actuellement, il n’existe aucun traitement curatif de la mucoviscidose,
différentes stratégies thérapeutiques sont mise en place.
6.1 Thérapie génique
Elle consiste à introduire une ou plusieurs copies du gène CFTR normal dans les
cellules du patient. Les copies du gène peuvent être intégrées dans des vecteurs viraux ou
synthétiques. Les vecteurs viraux permettent d’incorporer le gène de manière efficace dans les
cellules mais peuvent déclencher des réactions immunitaires contre les cellules de l’hôte
ayant intégrées le virus. Il faut donc diminuer l’immunogénicité de ces vecteurs avant de
pouvoir les utiliser.
L’utilisation de vecteurs synthétiques totalement artificiels représente donc une bonne
alternative pour l’intégration du gène car ils ont l’avantage d’être moins toxiques et moins
immunogènes pour les cellules. Cependant leur stabilité est faible et la quantité de copies du
gène intégrée dans les cellules du patient ainsi que son expression au cours du temps restent
limitée (Kennedy, 2002; Weiss & Pilewski, 2003).
6.2 Thérapie cellulaire
L’application de la thérapie cellulaire à la mucoviscidose reste encore lointaine. Elle
consiste à implanter des cellules épithéliales saines dans le système respiratoire des patients
ou à corriger les cellules pathologiques par transfert de gène ex vivo et réimplantation. Pour
cela, l’utilisation de cellules souches d’origines embryonnaires ou adultes est nécessaire et
pose encore des problèmes éthiques.
54

6.3 Thérapie pharmacologique
Différentes approches pharmacologiques sont développées actuellement pour le
traitement de la mucoviscidose. La première consiste à corriger le défaut de sécrétion chlorure
dépendante du CFTR. La seconde consiste à activer une voie alternative de sécrétion d’ions
chlorures non-dépendante du CFTR (cf figure 12).
a. Thérapie pharmacologique du CFTR
La classification de Welsh et Smith (Welsh & Smith, 1993) permet de prédire le
phénotype des patients CF. La thérapie pharmacologique de la mucoviscidose va donc
s’orienter vers la recherche de médications adaptées et personnalisées pour chaque groupe de
patients. En effet, pour les mutations de classe II, l’identification d’agents pharmacologiques
permettant de corriger l’adressage de la protéine CFTR est nécessaire. De la même façon, les
molécules qui stimulent l’activité du CFTR muté sont plus adaptées pour les mutations de
classe III et IV ou pour les mutations de classe II en combinaison avec un correcteur.
. Thérapie pharmacologique adaptée aux mutations de classe I
Les mutations de classe I incluent des mutations non-sens et des mutations produisant
un codon stop prématuré. Pour les patients présentant ce type de mutation, la découverte de
molécule permettant de supprimer cet arrêt précoce de la transcription présente un intérêt
thérapeutique majeur. Ces recherches ont été initiées avec la gentamicine, un aminoglycoside
bactérien (Bedwell et al., 1997; Wilschanski et al., 2003) qui se lie à l’ARN ribosomique de
la cellule hôte et augmente le taux d’erreur de lecture par le ribosome. Il a été démontré, par
des mesures de la différence de potentiel nasal, que l’exposition à court terme de l’épithélium
nasal à la gentamicine corrige les anomalies éléctrophysiologiques chez les patients présentant
un codon stop (Wilschanski et al., 2003).
Plus récemment, PTC-thérapeutique a développé une petite molécule pharmacologique, le
PTC-124 (acide benzoïque 3-[5-(2-fluorophenyl)-1,2,4-oxadiazol-3-yl]) renommé ataluren.
Cette molécule a été dessinée dans le but de diminuer la sensibilité des ribosomes afin qu’ils
ignorent le codon stop prématuré. Récemment, une étude clinique a été réalisée en France afin
55

d’évaluer les effets, la pharmacodisponibilité et la toxicité de l’ataluren chez des enfants
présentant des mutations de classe I. Les premiers résultats ont mis en évidence que la
molécule a été bien tolérée par les enfants. De plus, il a été démontré que le traitement avec
Ataluren permet la production d’un CFTR fonctionnel localisé à la membrane apicale des
cellules (Sermet-Gaudelus et al., 2010). Cette molécule apparaît donc très intéressante pour le
traitement des patients portant des mutations de classe I (Figure 16).
Transcription
normal
Transcription
Transcription incomplète
incomplète
Transcription facilitée par Ataluren
Signal stop prématuré
Signal stop normal
Ataluren facilite la transcription
Signal stop normal
Signal stop normal
Figure 16 : Schéma explicatif du fonctionnement de l’Ataluren
(Modifié d’après www.ptcbio.com)
. Thérapie pharmacologique adaptée aux mutations de classe II
La mutation de classe II F508del-CFTR est la plus fréquemment retrouvée chez les
patients. Cette mutation perturbe la maturation de la protéine CFTR et induit sa dégradation
par le protéasome. Cependant, lorsque cette protéine est adressée à la membrane apicale, elle
est capable de fonctionner comme un canal chlorure. Les efforts se concentrent donc à la
recherche de composés pouvant augmenter la quantité de protéines CFTR à la membrane des
cellules, ces molécules sont appelées correcteur de CFTR (Tableau 5).
Protéine fonctionnelle
Protéine tronquée
Protéine fonctionnelle
56

Molécules Mécanisme d’action Références
IBMX, sildenafil, vardenafil,
zaprinast et KM11060
Thapsigargine et curcumin
4-PBA, deoxyspergualine,
geldanamycine et herbimycine A
Inhibiteurs des phosphodiesterases
Inhibiteurs de la pompe calcium
ATP-ase
Inhibiteurs des protéines
chaperonnes
Miglustat Inhibiteurs de glucosidases
Tableau 5 : Tableau récapitulatif des correcteurs de CFTR.
Pour exemple, en 2006, notre laboratoire a identifié une nouvelle molécule capable de
corriger l’adressage défectueux de la protéine F508del-CFTR, il s’agit du miglustat ou NB-
DNJ (N-butyldeoxynojirimcyn ; Norez et al., 2006). Cette molécule également appelée
Zavesca ® est déjà indiquée pour le traitement des patients atteints de la maladie de Gaucher de
type 1 (Ficicioglu, 2008). Le miglustat est un inhibiteur de l’-1,2 glucosidase du réticulum
endoplasmique (McCormack & Goa, 2003). Le fait d’inhiber l’-1,2 glucosidase provoque
une accumulation du CFTR muté sous sa forme glycosylée GlcNAc2Man9Glc3. Cette forme
n’est alors pas reconnue par les protéines chaperonnes telle que la calnexine, ce qui lui permet
de sortir du réticulum endoplasmique (Figure 17).
(Drumm et al., 1991;
Dormer et al., 2005;
Lubamba et al., 2008;
Poschet et al., 2007;
Robert et al., 2008)
(Egan et al., 2002;
Egan et al., 2004)
(Rubenstein et al., 1997;
Choo-Kang & Zeitlin, 2001;
Jiang et al., 1998;
Norez et al., 2008b;
Norez et al., 2008a)
(Norez et al., 2006;
Norez et al., 2009;
Lubamba et al., 2009)
Dynasore Inhibiteurs de l’endocytose (Young et al., 2009)
Bortezomib Inhibiteur du protéasome (Vij et al., 2006)
Correcteurs 2a, 3a, 4a et 4b (Pedemonte et al., 2005b)
Bithiazoles et pyrazolythiazoles (Ye et al., 2010)
Inconnu
Acide anthranlilque et glafénine (Robert et al., 2010)
VX-325 ET VX-809
(Van Goor et al., 2006;
Rowe et al., 2010)
57

Mannose
Glucose
ERp57
Glucosidases
I and II
Site ER de sortie exit site du RE
Calnexine
Glucosidase II
Figure 17 : Action du miglustat sur le cycle de la calnexine.
(Modifiée d’après Ellgaard, 2003)
Une fois cette étape franchie, la protéine F508del-CFTR va suivre le cheminement du CFTR
non-muté jusqu’à la membrane plasmique.
Ribosome
Complexe du translocon
Chaîne protéique
N-glycanes
UDP-glycoprotein
glucosyltransferase
a1,2-mannosidase I
EDEM
ERAD
Complexe du
translocon
Récemment, il a été démontré que l’exposition journalière de cellules nasales humaines CF à
100 µM de miglustat pendant 2 mois induisait une correction stable, progressive et réversible
du F508-CFTR (Norez et al., 2009). De plus, il a été mis en évidence que le miglustat inhibe
l’hyperabsorption de sodium (Noel et al., 2008) et régule l’homéostasie calcique (Antigny et
al., 2008). L’efficacité du miglustat a également été démontrée in vivo sur un modèle de
souris cftr F508del/F508del . En effet, l’administration intra-nasale de miglustat normalise les
conductances sodium et chlorure (Lubamba et al., 2009). Des investigations supplémentaires
ont mis en évidence que le miglustat diminue l’expression de l’interleukine-8 et des molécules
d’adhésions ICAM-1 dans les cellules bronchiques CF infectées par Pseudomonas aeruginosa
58

(Dechecchi et al., 2008). Le miglustat est actuellement en essai clinique de phase II
(http://www.actelion.com).
Les composés quinzoline identifiés lors du screening d’une librairie de composés
développés par Vertex Pharmaceutique présentent également des propriétés intéressantes en
vue d’un développement clinique. En effet, il a été décrit que l’incubation de 10 µmol/L du
composés quinzoline VRT-325 pendant 16 heures corrige la réponse forskoline du F508del-
CFTR. Cette réponse est maintenue pendant 36 heures après l’élimination de la molécule puis
diminue (Van Goor et al., 2006). Il a été démontré récemment que le composé VRT-325
augmente la sécrétion chlorure sur un modèle de cellules polarisés de tyroïde de rat (FRT),
alors qu’il n’a pas d’effet sur un modèle de cellules épithéliales bronchiques humaines
polarisées (Bebok et al., 2005; Rowe et al., 2010). Ce travail suggère l’importance du modèle
utilisé pour la détection du réadressage du F508del-CFTR. Le composé VRT-325 ne fait pas
encore l’objet d’un essai clinique.
Par contre, le composé VX-809 également développé par Vertex Pharmaceutique et formulé
pour une administration orale fait l’objet d’un essai clinque de phase II débuté en mars 2009.
Il s’agit d’un essai clinique multicentrique (Etats-Unis, Canada, Belgique, Allemagne et Pays-
Bas) randomisé et en double aveugle incluant 90 patients porteurs de la mutation F508del-
CFTR. Les résultats de cet essai ne sont pas encore disponibles mais il a été rapporté que le
VX-809 restore la fonction du F508del-CFTR (http://www.vpharm.com).
. Thérapie pharmacologique adaptée aux mutations de classe II à V
Il existe de nombreuses molécules capables de stimuler la fonction de la protéine
CFTR (cf 4.1 activateurs et potentiateurs du CFTR) mais seulement un petit nombre non
toxiques et spécifiques du CFTR pourraient être utilisées en thérapie pharmacologique
(Tableau 6).
59

Familles Molécules Potentialisation Stade Publications
Ginsenoside,
limonoide et
vitamine C
Epices
Dérivé sulfamoylé
et Phenylglycine
substittuée
Ginsenoside,
limonoide et
vitamine C
Curcumin et
capaisine
SF-03 et PG-01
Pyrrolopyrazines RP107 et RP108
Hydroxybenzoate
Analogue de
l’ATP
Butyl-phydroxybenzoate
Analogue de
l’ATP
wt-, G551D- et
F508del-CFTR
wt-, G551D- et
F508del-CFTR
wt-, G551D- et
F508del-CFTR
wt-, G551D- et
F508del-CFTR
wt- et F508del-
CFTR
wt-, G551D- et
F508del-CFTR
Tableau 6 : Récapitulatifs des molécules potentiellement utilisables en thérapie pharmacologique.
Pour exemple, Vertex Pharmaceutique a identifié des pyrazoles capables de stimuler la
fonction du canal CFTR, ces molécules peuvent donc agir sur les mutations de classe III, IV,
V et sur les mutations de classe II préalablement réadressées à la membrane par un correcteur
de CFTR. Par exemple, il a été décrit que le pyrazole VX-770 augmente, in vitro, la
probabilité d’ouverture et la conductance chlorure du G551D-CFTR. Le VX-770 est le
premier potentiateur de CFTR en essai clinique sur des patients CF portant des mutations de
classe III. L’essai clinique de phase IIa a été conduit sur des patients portant la mutation
G551D. Il s’agit d’un essai randomisé, en double aveugle sur deux périodes de 14 jours. Au
bout de seulement 14 jours de traitement avec 150 mg de VX-770, les premiers résultats
communiqués montrent une diminution de la concentration des ions chlorure dans la sueur,
une augmentation significative du potentiel nasal, et du volume expiratoire forcé en 1 seconde
(FEV1) par rapport aux patients placebo. De plus, le composé a été bien toléré chez
l’ensemble des patients traités (http://www.vpharm.com).
Préclinique
Préclinique
(Sousa et al., 2007;
DeCarvalho et al., 2002;
Fischer et al., 2004)
(Ai et al., 2004;
Berger et al., 2005b)
Préclinique (Pedemonte et al., 2005c)
Préclinique (Noel et al., 2006)
Préclinique (Ge et al., 2009)
Préclinique (Miki et al., 2010)
Pyrazole VX-770 G551D-CFTR Phase IIa (http://www.vpharm.com)
60

. Molécules à double-activité
Le criblage de petit composé ciblant le CFTR, a permis d’identifier des agents ayant
une double action sur le CFTR, à la fois correcteur et potentiateur du F508del-CFTR. En
effet, ces molécules sont capables à la fois de corriger l’adressage de F508del-CFTR et de
stimuler la sécrétion d’ions chlorure par le F508del-CFTR. Parmi eux, quelques molécules
présentent des propriétés intéressantes telles que les aminoarylthiazoles et la famille des
benzoquinolizinium (Derand et al., 2001).
Il a été démontré que les composés aminoarylthiazoles augmentent la réponse à la forskoline
du F508del-CFTR (Becq, 2010). Des effets similaires sont observés sur les mutants de classe
III, G551D, G1349D et D1152H. Cependant, les aminoarylthiazoles ne sont pas capables
d’activer le CFTR en absence de forskoline. Au contraire, les dérivés MPB sont des
activateurs directs du CFTR sauvage et du CFTR portant des mutations de classe II (F508del)
et de classe III (G551D) (Becq et al., 1999; Derand et al., 2001; Dormer et al., 2001;
Marivingt-Mounir et al., 2004; Norez et al., 2008a). Certains MPB sont également des
correcteurs efficaces du F508del-CFTR. Ils inhibent la dégradation du CFTR muté et
favorisent donc sa relocalisation à la membrane apicale des cellules épithéliales CF (Stratford
et al., 2003; Norez et al., 2008a). Ces agents présentent un intérêt thérapeutique majeur car ils
peuvent à la fois restaurer le F508-CFTR à la membrane mais également stimuler son activité,
cependant certains d’entre eux présentent une toxicité élevée.
Des travaux récents montrent la possibilité de combiner une molécule potentiatrice et
une molécule correctrices de CFTR afin d’obtenir un agent à double-activité. En 2009, une
molécule hybride contenant un fragment du potentiateur PG-01 et un fragment du correcteur
corr4a relié par un pont ester a été crée par Mills et collaborateurs (Figure 18). Le clivage de
la molécule hybride par les enzymes intestinales dans les conditions physiologiques permet de
libérer le potentiateur et le correcteur actifs (Mills et al., 2010).
61

Figure 18 : Stratégie de création d’une molécule hybride à double activités correctrice et
potentiatrice du CFTR.
(Modifiée d’après Mills, 2010)
Ces premier résultats ont mis en évidence l’intérêt de créer des molécules multiligands
dans le développement de thérapie pour les patients portant une mutation F508del-CFTR qui
représentent plus de 90% des patients CF.
En conclusion, ces résultats sont très encourageants car ils démontrent qu’une
pharmacothérapie personnalisée de la protéine CFTR adaptée à la classe de mutations peut
être efficace et mesurable. Mais, il existe encore d’autres moyens de restaurer la sécrétion
chlorure au niveau des épithéliums, notamment par l’activation de voies alternatives de
sécrétion d’ions chlorures non-dépendante du CFTR.
dépendante
Fragment correcteur Fragment potentiateur
b. Thérapie pharmacologique par l’activation d’une voie alternative CaCC-
L’utilisation d’activateurs des canaux chlorure calcium-dépendant (CaCC) s’inscrit
dans cette seconde stratégie, en effet ils ont la capacité d’activer la sécrétion de chlorure dans
les tissus mucoviscidosiques (Figure 19). Le chapitre III présentera les CaCC en détails.
62

CaCC
Figure 19 : Représentation schématique de l’importance du CaCC dans les transports ioniques d’une
cellule épithéliale.
En 2003, Molichem Medicines a obtenu une autorisation de traitement des patients CF
avec un peptide polycyclique appelé Moli1901 (déjà connu sous le nom de duramycine ou de
2622U90). Moli 1901 augmente la sécrétion d’ions chlorure lorsqu’il est appliqué à la surface
apicale de l’épithélium respiratoire. Le peptide interagit avec les phospholipides
membranaires et augmente la concentration de calcium intracellulaire qui active la voie
alternative de sécrétion chlorure. Les résultats des essais cliniques de phase I et II montrent
que la molécule stimule le transport des ions chlorures in vivo au niveau de l’épithélium nasal.
De plus, ce traitement apparaît sans danger pour les patients adolescents et adultes présentant
une altération modéré de leur fonction pulmonaire (Grasemann et al., 2007; Zeitlin et al.,
2004). En 2009, une nouvelle étude clinique de phase II a été annoncée afin d’évaluer le
traitement de patients CF avec une solution inhalée de Moli1901. Il s’agit d’une étude en
double-aveugle, conduite dans 9 pays européens, qui inclue des adolescents et des adultes.
L’efficacité et la tolérance du traitement, avec 3 concentrations différentes de la molécule sur
une période de 8 semaines suivie d’une période de 4 semaines sans traitement va être évaluée
De plus, le denufosol, un agoniste des récepteurs purinergique P2Y2, stimulant la
sécrétion de chlorure via l’activation du CaCC a été proposé. Cette molécule a été évaluée au
cours d’un essai clinique de phase II, dans 14 centres clinques aux Etats-Unis, sur 90 patients
présentant un phénotype CF intermédiaire. Après 4 semaines de traitement avec 20 à 60 mg
CFTR
63

de denufosol, il a été décrit une augmentation significative de la fonction pulmonaire des
patients traités par rapport aux patients placebo. En novembre 2009, Inspire Pharmaceuticals a
débuté un essai clinique randomisé de phase III. Les 450 patients enrôlés dans l’essai clinique
présentent une fonction pulmonaire relativement bonne. Les patients sont traités avec 60 mg
de denufosol, 3 fois par jours ou avec le placebo. Les résultats seront connus début 2011. Au
vu des résultats encourageants obtenus dans les essais clinques de phase II, cet agent parait
très intéressant, cependant son action sur des patients présentant des dysfonctions pulmonaires
sévères reste encore inconnue.
ISM therapeutic développe actuellement un analogue de l’inositol polyphosphate : la
prodrogue INO-4995. Une prodrogue est une substance pharmacologique administrée sous
une forme inactive et métabolisée in vivo en une molécule active. L’INO-4995 est un
régulateur des canaux ioniques, il inhibe l’absorption de sodium, augmente l’activité des
canaux CaCC dans les cellules épithéliales CF (Rudolf et al., 2003). L’INO-4995 est une
petite molécule avec une durée d’action longue (plus de 24 heures après l’administration). La
molécule a été décrite comme étant non toxique et bien tolérée sur les modèles animaux. De
plus, il a été démontré que l’effet de l’INO-4995 sur le courant de court-circuit est plus
important dans les tissus issu de patients CF que de donneur non-CF. Les auteurs proposent
que l’INO-4995 peut-être utilisé en combinaison avec d’autres traitements existants, comme
le denufosol. Un essai clinique préliminaire de phase II sur les patients CF a été initié.
Ces premiers résultats encourageants confirment que la découverte de modulateurs des
CaCC représente une approche contournée intéressante dans la découverte de traitements
pharmacologiques pour la mucoviscidose.
64

IV/ Les canaux chlorure calcium dépendant (CaCC)
1. Fonction des CaCC
1.1 Rôle physiologique des CaCC
Les CaCC endogènes ont été identifiés dans de nombreux types cellulaires et
contrôlent de multiples fonctions (Hartzell et al., 2005). Ils ont un rôle dans la transduction
olfactive, gustative et visuelle, ils régulent l’excitabilité cardiaque et neuronale (Frings et al.,
2000), la contraction des muscles lisses (Leblanc et al., 2005) et les fonctions endothéliales
(Kunzelmann et al., 2009). Ils sont indispensables pour la reproduction et la sécrétion
épithéliale (Kidd & Thorn, 2000).
Les cellules épithéliales des voies respiratoires coexpriment le CaCC et le CFTR au niveau de
leurs membranes apicales (Boucher et al., 1989). La sécrétion de mucus au niveau de
l’épithélium respiratoire est donc contrôlée à la fois par le CFTR et par le CaCC. Le CFTR
contrôle la quantité basale de mucus alors que le CaCC agit comme un régulateur de
l’épaisseur de la couche muqueuse (pour revue Hartzell et al., 2005).
1.2 Caractérisation et régulation des CaCC
Les canaux CaCC sont relativement non-sélectifs. Ils se caractérisent par une séquence
de perméabilité anionique SCN - > NO3 - > I - > Br - > Cl - >F - (Qu & Hartzell, 2000). Le courant
CaCC est dépendant du voltage. Les canaux CaCC s’activent lentement par dépolarisation et
sont inactivés par hyperpolarisation. Ils présentent une rectification sortante de leur relation
courant/voltage (Nilius et al., 1997).
Selon le type cellulaire la conductance unitaire des canaux peut varier de 1 à 14 pS.
Cependant, la dépendance au potentiel diminue lorsque le taux de calcium (Ca 2+ ) augmente
fortement (Arreola et al., 1995). En effet, les courants dépendants du CaCC sont également
activés par l’entrée de calcium extracellulaire, la libération de calcium du réticulum
65

endoplasmique et la phosphorylation par la protéine kinase dépendante de la calmoduline : la
CaMK II (pour revue Hartzell et al, 2005; Figure 20).
Figure 20 : Schéma récapitulatif de l’activation du CaCC par le calcium.
(Modifié d’après Hartzell, 2005)
a. Régulation par le Ca 2+ et la CaMK II
Le seuil d’activation du canal se situe entre 0.2 et 5 µM de calcium intracellulaire libre
(Hartzell et al., 2005). Les CaCC présents au niveau des cellules des glandes salivaires, des
cellules endothéliales pulmonaires, des myocytes ventriculaires, et des hépatocytes sont
activés directement par le calcium. Cela qui suggère que le CaCC possède un site de fixation
du calcium. Les CaCC peuvent également être activés par une phosphorylation via la CaMK
II. En effet, dans de nombreux types cellulaires, tels que les cellules pancréatiques CFPAC-1
et les cellules coloniques T84, le canal est stimulé directement par le calcium et indirectement
par la CaMK II. L’utilisation d’inhibiteurs de la CaMK II, tels que le calmidazomium et le
trifluoroperazine sur des cellules T84 empêche l’activation du CaCC (pour revue Hartzell et
al., 2005 ; Figure 21).
66

Figure 21 : Schéma récapitulatif des mécanismes de régulation des CaCCs.
(Modifié d’après Hartzell, 2005)
b. Régulation par l’IP4 et les annexines
La stimulation du CaCC par la CaMK II est inhibée par l’inositol 3,4,5,6-
tetrakisphosphate (IP4 ; Xie et al., 1998; Nilius et al., 1998). L’IP4 est synthétisé par la voie de
la phospholipase C (PLC). La régulation des CaCCs par l’IP4 régule la cinétique d’activation
des CaCCs (Ho et al., 2001; Figure 21).
Les annexines sont des phospholipides et des protéines fixant le calcium. Elles sont situées à
la membrane apicale des épithéliums sécrétoires (Kaetzel et al., 1994). Il a été décrit que les
annexines ont la capacité d’inhiber les CaCC dans l’oocyte de xénope (Jorgensen et al., 1997)
et au niveau des cellules épithéliales (Chan et al., 1994; Kaetzel et al., 1994). L’action des
annexines sur les CaCC est synergique avec l’effet de l’IP4. Une faible concentration en
annexine-IV (Anx-IV) augmente la capacité de l’IP4 à bloquer le courant (Xie et al., 1996;
Figure 21).
c. Régulation par le CFTR
Le CFTR interagit au moins fonctionnellement avec un grand nombre de protéines
dont le CaCC (Kunzelmann, 2001). Dans les oocytes de xénope, l’expression du CFTR réduit
le courant chlorure calcium-dépendant. De plus, il a été démontré une augmentation du
courant dans des modèles de cellules épithéliales issues des patients CF (Clarke et al., 1992).
Les auteurs montrent que la régulation du CaCC par le CFTR implique la partie C-terminal du
67

domaine R du CFTR (Wei et al., 2001) alors que son domaine PDZ n’est pas impliqué
(Kunzelmann, 2001).
d. Autres régulations
Il a été décrit que la diminution du pH intracellulaire inhibe les CaCCs (Arreola et al.,
1995). Il a également été mis en évidence que l’activation du CaCC dans un modèle de
cellules musculaires lisses de l’artère mésentérique de rat nécessite du GMPc (Matchkov et
al., 2004).
1.3 Pharmacologie des CaCC
a. Activateurs des CaCC
Les CaCC sont activés par le calcium : toutes les molécules capables d’augmenter le
taux de calcium dans le cytosol sont donc des activateurs potentiels des CaCC. Les
ionophores calciques, tel que l’A23187, sont utilisés pour l’activation des CaCC. L’A23187
est un antifongique qui permet le passage des cations divalents à travers les membranes
cellulaires grâce à la formation des pores membranaires (Abbott et al., 1979).
L’histamine est également capable d’activer les CaCC par la libération du calcium du
réticulum endoplasmique (Antigny et al., 2008).
Les CaCC sont également activés par les nucléotides triphosphate ATP et UTP, au niveau des
épithéliums respiratoires (Knowles et al., 1991; Tarran et al., 2002). Ces nucléotides stimulent
les récepteurs purinergiques P2Y2 couplés aux protéines GqP2Y. Ces protéines G activent la
PLC qui hydrolyse un phopholipide membranaire, le PIP2 (phosphatidyl-inositol-
diphosphate) en inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) et en DAG (diacylglycérol). L'IP3 se fixe
sur ses récepteurs au niveau du RE et provoque la sortie de calcium. L’activation des
protéines GpP2Y induit donc une cascade d’évènements qui abouti à l’augmentation du taux
de calcium cytosolique et par conséquent à l’activation des CaCC (Figure 22).
68

ATP ou UTP
Figure 22 : Voie de
signalisation intracellulaire induite par l’activation des récepteurs P2Y2.
PLC : phospholipase C, IP3 : inositol 1,4,5-trisphosphate, RE : reticulum endoplasmique.
b. Inhibiteurs des CaCC
(Modifié d’après www.inspirepharm.com)
L’identification d’inhibiteurs sélectifs du CaCC est nécessaire pour mieux comprendre
la structure du pore, pour analyser la distribution du canal dans les tissus et pour affiner les
méthodes de purification du canal. Cependant, il n’existe pas d’inhibiteur spécifique du
CaCC. Les inhibiteurs les plus utilisés pour inhiber le CaCC sont l’acide niflumique, l’acide
flufénamique et le DIDS (Schultz et al., 1999). Le Tableau 7 résume les principales
molécules utilisées pour inhiber les CaCC.
De plus, une étude récente a mis en évidence, grâce au criblage de produits naturels, un
nouvel inhibiteur des CaCC : l’acide tannique. Cette molécule inhibe le CaCC dans différents
modèles cellulaires, avec une IC50 de 6 µM et ne présente pas d’effet sur le CFTR. Ce
composé fait partie de la famille des gallotannins présents dans le vin rouge et le thé vert
(Namkung et al., 2010).
Récepteur P2Y 2
PLC
Cytosol Protéine G
IP 3
Ca 2+
RE
69

Inhibiteurs Tissus Mécanisme d’action Publications
NFA
FFA
DIDS
Trachéal, pulmonaire,
musculaire et neuronal
Trachéal, musculaire et
neuronal
Trachéal, pulmonaire,
musculaire, intestinal et
neuronal
SITS Musculaire et neuronal
DPC Trachéal, musculaire
A9C Musculaire
Tableau 7: Tableau récapitulatif des différentes molécules inhibitrices du CaCC.
NFA : acide niflumique, FFA : acide flufénamique, DIDS : acide 4,4’-diisothiocyanato-stilbene-2,2’-
disulfonique, SITS : acide 4-acetamido-4’-isothiocyanatostilbene-2,2’-disulfonique, DPC : acide diphenylamine-
2-carboxyl, A9C : anthracène-9-carboxylique, NPPB, Tamo : tamoxifène, Glib : glibenclamide.
La nature des canaux CaCC est encore inconnu et leur pharmacologie est peu
spécifique. Cependant, l’identification de l’identité moléculaire des CaCC pourrait permettre
de développer une pharmacologie plus efficace et plus spécifique.
2. Candidats moléculaires des CaCC
De nombreux candidats moléculaires du CaCC ont été proposés puis écartés, tels que
les canaux ClC-3 et CLCA.
blocage non voltage-dépendant du
pore du canal
(White & Aylwin, 1990;
Qu & Hartzell, 2001)
blocage non voltage-dépendant (White & Aylwin, 1990)
blocage voltage-dépendant de la
partie externe et interne du canal
(Schultz et al., 1999;
Qu & Hartzell, 2001)
(MADDY, 1964;
Cabantchik & Greger, 1992)
(Qu & Hartzell, 2001;
Baron et al., 1991)
(Qu & Hartzell, 2001;
Baron et al., 1991)
NPPB Pulmonaire (Wangemann et al., 1986)
blocage non voltage-dépendant
Tamo. Pulmonaire (Hartzell et al., 2005)
Glib. Musculaire
(Schultz et al., 1996;
Schultz et al., 1999)
Les gènes ClC ont été clonés pour la première fois à partir de l’organe électrique de la raie
Torpedo marmorata, puis identifiée chez les procaryotes et les eucaryotes. Il existe 7
70

membres de la famille des ClC, de ClC1 à 7. Le ClC-3 a plus particulièrement été étudié
comme candidat moléculaire du CaCC car il est exprimé de façon prédominante au niveau des
cellules épithéliales (pour revue Jentsch et al., 2002). De plus, des expériences réalisées sur
des souris invalidées pour le gène ClC-3 (Arreola et al., 2002) ont décrit une absence de la
conductance chlorure activée par la CaMK II dans ce modèle de souris (Robinson et al.,
2004). Cependant, le courant chlorure calcium dépendant est présent chez les souris ClCn3 -/- ,
et présente des propriétés similaires à celui observé dans le modèle de souris sauvages
(Arreola et al., 2002). D’autres études ont mis en évidence que les canaux ClC-3 participent à
l’acidification des vésicules de l’appareil de Golgi et des endosomes (Gentzsch et al., 2003).
Ces résultats suggèrent que les canaux ClC-3 ne sont pas de bons candidats moléculaires du
CaCC.
La description de la famille des canaux chlorures activés par le calcium (CLCA) en tant que
un candidat moléculaire du CaCC est très controversée (Eggermont, 2004; Jentsch et al.,
2002). En effet, la transfection d’ADNc codant pour différentes protéines CLCA, dans
différents types cellulaires, induit l’activation d’un courant calcium dépendant (Gandhi et al.,
1998; Elble et al., 1997; Gruber et al., 1998). Les protéines CLCA présentent cependant une
forte homologie de structure avec des protéines d'adhésion cellulaire, et au moins un membre
de la famille est clairement une protéine sécrétée (Pauli et al., 2000). De plus, elles présentent
des sensibilités différentes au calcium et au potentiel ainsi qu’une pharmacologie différente.
En effet, il a été décrit sur un modèle de cellules tumorales que le courant CaCC n’est pas
sensible aux agents sulfhydriles tel que le DTT (dithiothréitol) alors que le courant CLCA est
totalement bloqué par ces agents (Papassotiriou et al., 2001). Plusieurs types cellulaires
présentent le CaCC natif mais n'expriment pas de protéines CLCA (Papassotiriou et al.,
2001). Les canaux CLCA, en tant que candidat moléculaire du CaCC, ont donc été écartés.
Récemment trois familles de protéines, les SLC26, les bestrophines et les protéines
TMEM16 ont été identifiées comme de bons candidats moléculaires car elles possèdent de
nombreuses caractéristiques des canaux CaCC.
71

1.1 Les SLC26
La famille des transporteurs SLC26 est constituée de 11 membres : SLC26A1 à
SLC26A11 (pour revue Dorwart et al., 2008; Figure 23)
.
Figure 23 : Arbres phylogénétique de la famille des SLC26,
en noir chez l’homme et en rouge chez la souris.
(D’après Dorwart et al., 2008)
Parmi les membres de la famille SLC26, seul le canal SLC26A9 a été décrit comme un bon
candidat moléculaire du CaCC car il est fortement exprimé au niveau de la membrane apicale
des cellules épithéliales ciliées bronchiques et alvéolaires ainsi qu’au niveau de la muqueuse
gastrique (Lohi et al., 2003).
Le canal SLC26A9 a d’abord été décrit comme un échangeur Cl - /HCO3 - (Curci et al., 1994),
puis comme un canal chlorure avec une perméabilité faible pour le bicarbonate. Il est régulé
par les WNKs (With No lysine Kinases ; Dorwart et al., 2008). De plus, la protéine SLC26A9
présente un domaine d’interaction PDZ (Lohi et al., 2003). Des études récentes ont décrit une
interaction physique et une régulation croisée entre le SLC26A9 et le CFTR. En effet, il a été
mis en évidence sur des cellules bronchiques humaines que SLC26A9 stimule l’expression et
la fonction du CFTR (Avella et al., 2010). D’autre part, il a également été décrit que le
SLC26A9 est constitutivement actif à la membrane et nécessite un CFTR fonctionnel
(Bertrand et al., 2009). Donc même si le SLC26A9 ne constitue pas le candidat moléculaire
72

des CaCC, des études de ce canal représentent un intérêt majeur pour la compréhension de la
régulation du CFTR.
1.2 Les bestrophines
Les bestrophines ont été présentées pour la première fois comme des canaux chlorure
par Sun et collaborateurs, en 2002 (Sun et al., 2002). Précédemment, le gène Best avait été
identifié en 1992 comme responsable de dystrophie maculaire héréditaire appelée dystrophie
maculaire vitelliforme (Petrukhin et al., 1998). Il existe 4 sous types de bestrophines, de la
bestrophine 1 à la bestrophine 4 (Qu et al., 2003; Figure 24).
Figure 24 : Récapitulatif des différentes bestrophines des vertébrés.
Bestrophines de xénope (x), d’humain (h), de souris (m), de poisson lune (f), de rat (r), et de poisson zèbre (z).
(D’après Qu et al, 2003)
Les bestrophines sont exprimées dans un grand nombre de cellules épithéliales et non-
épithéliales. Les bestrophines 1 et 2 sont présentes dans les cellules épithéliales des voies
aériennes, du colon et des reins. La bestrophine 1 est exprimée en grande quantité au niveau
de la membrane basolatérale des cellules épithéliales des pigments rétiniens. On trouve la
bestrophine 2 dans les cils olfactifs des neurones sensoriels (Kunzelmann et al., 2009).
Dans les épithéliums respiratoires, le taux de bestrophine 2 est plus important que le taux de
bestrophine 1. La bestrophine 2 semble avoir un rôle particulier dans les épithéliums. Des
études bioinformatiques montrent des différences fonctionnelles entre les bestrophines 2 et 4
73

et les autres bestrophines (Milenkovic et al., 2008). En effet, une séquence C-terminal
inhibitrice est présente dans les bestrophines 3 mais pas dans les bestrophines 2 et 4.
Différents modèles contradictoires de la topologie des bestrophines ont été décrits. La
Figure 25 présente un modèle présumé de la topologie de la bestrophine 2.
Figure 25 : Modèle présumé de la topologie de la bestrophine 2.
(D’après Hartzell et al., 2008)
En 2004, les bestrophines ont été identifiées comme la nouvelle famille de canaux
CaCC dans de nombreux systèmes d’expression hétérologue (Qu & Hartzell, 2004).
Cependant, de façon surprenante, les souris knock-out (KO) bestrophines 2 ne montrent
aucune variation apparente de leur phénotype à l’exception d’une diminution de la pression
intraoculaire (Bakall et al., 2008).
De même, les souris knock-out bestrophines 1 ne présentent pas de phénotype anormal. Ces
animaux se reproduisent, grandissent normalement et ne présentent pas de problèmes
apparents à l’exception d’une légère diminution de sécrétion des ions chlorure dépendante du
calcium (Barro-Soria et al., 2008). Seule une stimulation avec de faibles concentrations
d’ATP permet de détecter une diminution de sécrétion chlorure chez les souris knock-out
bestrophines 1. En effet, une stimulation avec des concentrations en ATP plus élevées induit
une sécrétion chlorure identique chez les souris sauvages et knock-out bestrophine 1 (Barro-
Soria et al., 2008). Ces résultats suggèrent que les bestrophines joueraient plutôt un rôle de
modulateur de la sécrétion de chlorure que celui de canal ionique.
74

Des études supplémentaires montrent également que les bestrophines peuvent être des
régulateurs d’autres canaux ioniques tel que les canaux calciques voltage-dépendant (Yu et
al., 2008).
Des études récentes suggèrent que la bestrophine agit comme un canal chlorure au
niveau du réticulum endoplasmique afin d’équilibrer les charges négatives produites lors de la
libération et de la recapture du calcium (Barro-Soria et al., 2010). Elles joueraient également
un rôle dans le contrôle de la signalisation calcique via une interaction avec la protéine Stim1
au niveau du réticulum endoplasmique. Ceci pourrait expliquer que la bestrophines 1 est à la
fois un canal calcique activé par le calcium et un régulateur d’autres canaux ioniques (Figure
26).
Figure 26 : Rôles présumés de la bestrophine 1 dans les cellules.
P2Y2 : récepteur purinergique de type 2
PLC: phospholipase C,
SERCA : calcium ATPase du réticulum endoplasmique,
CAMK : protéine calmoduline kinase,
PAK2 et PP2A : protéine kinase et phosphatase,
Best1 : protéine bestrophine 1,
ORAI-1 et Stim1 : canaux calciques (store-operated)
(Modifiée d’après Kunzelmann et al., 2009)
75

1.3 Les TMEM16
En 2008 trois études ont proposé la protéine TMEM16A (anoctamine 1 ou ANO1)
et/ou la protéine TMEM16B (anoctamine 2 ou ANO2) comme des candidats moléculaires
potentiels (Caputo et al., 2008; Schroeder et al., 2008; Yang et al., 2008) du CaCC.
Les protéines TMEM16 font partie d’une famille de 10 protéines TMEM16
(TMEM16A-K ou ANO1-10).
Figure 27 : Arbres phylogénétique de l’expression des membres de la famille TMEM16 chez la souris.
(D’après Flores et al., 2009)
Ces protéines sont très conservées chez les eucaryotes. Les protéines TMEM16A, F, G, H, J
et K sont exprimées dans les tissus épithéliaux, les protéines TMEM16B, C, D et E sont
exprimées dans les tissus neuronaux et les muscles. Elles sont surexprimées lors de la
prolifération cellulaire et dans les cancers (pour revue Kunzelmann et al., 2009).
a. TMEM16A
En 2008, par une approche bioinformatique (Yang et al., 2008), une approche de
clonage (Schroeder et al., 2008) et une approche de génomique (Caputo et al., 2008), les
chercheurs ont mis en évidence que la protéine TMEM16A induisait une sécrétion d’ions
chlorure activée par le calcium.
76

La protéine TMEM16A présente 8 domaines transmembranaires (TMD), une boucle p
et des domaines N-terminal et C-terminal cytosoliques (Figure 28).
Figure 28 : Modèle présumé de la topologie de la protéine TMEM16A.
(D’après Hartzell et al., 2009)
La séquence de la protéine TMEM16A ne possède pas de domaine de liaison directe au
calcium. On peut donc émettre l’hypothèse que la dépendance au calcium est médiée par une
autre protéine ou par une sous-unité additionnelle encore inconnue du canal. Il est également
possible que des régions du TMEM16A riches en charge négatives soient impliquées dans la
fixation du calcium (Galietta, 2009). La protéine TMEM16A possède plusieurs isoformes
produites par un épissage alternatif du gène. Il existe une forme abc qui correspond à 70% de
la forme retrouvée dans un modèle de cellules bronchiques et une forme ac qui correspond au
30% restant. De plus, il a été démontré que la forme ac est plus sensible au calcium. Ces
résultats suggèrent que l’épissage alternatif de la protéine TMEM16A est peut-être le
mécanisme de régulation des propriétés du canal et serait à l’origine des différences de
courant et de sensibilité au calcium générés par le CaCC (Galietta, 2009).
L’expression de la protéine TMEM16A dans un oocyte de Xénope ou dans des
cellules de mammifères induit un courant chlorure calcium dépendant rassemblant les
propriétés du courant induit par les canaux CaCC. De plus, il a été décrit que la protéine
77

TMEM16A présente une séquence de perméabilité anionique NO3 – > I – > Br – > Cl – >F –
similaire à celle rapportée pour le CaCC.
La protéine TMEM16A est exprimée de façon prédominante dans les tissus
épithéliaux (Figure 29).
Figure 29 : Expression de la protéine TMEM16A dans les tissus de souris.
(D’après Kunzelmann et al., 2009)
Une étude récente basée sur la quantification des ARNm des principaux candidats
moléculaires des CaCC a mis en évidence une expression prédominante de l’ARNm
TMEM16A dans les poumons de souris CF (Braun et al., 2010). Il a aussi été décrit que la
protéine TMEM16A contribue à l’activation d’un courant et d’une sécrétion chlorure calcium-
dépendante dans les tissus épithéliaux des voies respiratoires, coloniques, pancréatiques,
salivaires et hépatocytaires chez la souris. Les souris n’exprimant pas TMEM16A
(TMEM16A -/- ) présentent un défaut de transport des ions chlorure et une pathologie similaire à
la mucoviscidose. En effet, il a été observé chez les souris TMEM16A -/- un rétrécissement et
une accumulation de mucus dans la trachée. Ces observations représentent une preuve de
l’importance de la protéine TMEM16A dans la clairance mucociliaire des voies respiratoires
chez la souris. Le défaut de TMEM16A touche également les glandes salivaires et
pancréatiques, les hépatocytes et l’intestin.
Cependant, au niveau des voies aériennes et probablement également dans les autres
épithéliums des souris TMEM16A -/- , la sécrétion chlorure calcium-dépendante n’est pas
complètement absente, ce qui suggère qu’un autre membre de la famille des TMEM16
contribue à la conductance chlorure calcium dépendante dans ces tissus (Schreiber et al.,
2010). Malheureusement, les observations à plus long terme sont impossibles, en effet, les
souris TMEM16A -/- meurent très rapidement après la naissance. A l’heure actuelle, des études
78

sont en cours sur l’extinction conditionnelle de la protéine TMEM16A grâce au système Cre-
LoxP. Il s’agit dans un premier temps de créer des souris porteuses d’un allèle dans lequel
deux sites loxP, placés dans les séquences introniques, encadrent le gène d’intérêt. Les souris
sont alors croisées avec une souris transgénique exprimant la recombinase (Cre) dans un type
cellulaire particulier. La recombinase entraîne l’excision des séquences situées entre les sites
loxP et donc induit une mutation nulle dans le type cellulaire dans lequel le transgène
s’exprime.
Des essais sont actuellement en cours, et permettront si ils aboutissent à une meilleure
compréhension du rôle de la protéine TMEM16A.
En résumé, la grande similarité entre le courant produit par la protéine TMEM16A et
le courant produit par le CaCC suggère que le TMEM16A est un bon candidat moléculaire
pour le CaCC. Cependant, bien que les résultats obtenus soit encourageants, il est nécessaire
de rester prudent. En effet, différents scenari sont possibles, TMEM16A est peut être la seule
protéine nécessaire pour former les canaux CaCC mais elle peut aussi constituer seulement
une partie du canal et nécessiter un assemblage avec d’autres protéines non identifiées.
Finalement, bien que cela soit moins probable nous ne pouvons pas exclure la possibilité que
la protéine TMEM16A ne fasse pas partie du CaCC mais serait nécessaire à l’activation ou au
transport du canal CaCC.
b. TMEM16B
Schroeder et collaborateurs ont mis en évidence que l’expression hétérologue de
TMEM16B produit un courant apparenté au courant chlorure calcium dépendant. Le
TMEM16B est exprimé au niveau des cellules olfactives et des photorécepteurs, il joue donc
un rôle important dans la transduction sensorielle.
La protéine TMEM16B présente une séquence de perméabilité anionique SCN – > I – > NO3 – >
Br – >Cl – proche de celle observée pour le CaCC. En effet ils présentent une conductance
unitaire respectivement de 0.8 pS et de 8.3 pS. De plus, la cinétique du courant produit par
TMEM16B est plus rapide, et la protéine TMEM16B est moins sensible au calcium.
Les différences entre les courants TMEM16A et B peuvent être utiles pour mieux comprendre
la relation entre la structure et la fonction de ces protéines. En effet, comparer les structures
primaires des deux protéines pourrait permettre de mettre en évidence les similarités et les
79

divergences qui peuvent être associées à l’identification de domaines de liaison au calcium, la
sensibilité au voltage et le transport des ions.
c. Les autres TMEM16
Très peu de choses sont connues sur les autres protéines TMEM16. Le TMEM16C est
particulièrement exprimé au niveau du système nerveux, mais son rôle physiologique est
encore inconnu. La mutation du TMEM16E est impliquée dans une pathologie, la dysplasie
de Gnathodiaphyseal : un syndrome de lésions fibro-osseuses des mâchoires et de fragilité des
os (Tsutsumi et al., 2004). Les protéines TMEM16F et K sont exprimées de façon ubiquitaire
et la protéine TMEM16G est exprimée au niveau de la prostate. Cependant, le rôle ou non de
ces protéines dans la conductance chlorure restent encore inconnue.
Bien que le candidat moléculaire du CaCC ne soit pas encore identifié, des pistes
encourageantes sont actuellement explorées et elles soulèvent l’intérêt de la pharmacologie du
CaCC dans le traitement de la mucoviscidose.
80

Le travail présenté dans ce manuscrit a été réalisé, sous la co-direction du Docteur
Caroline Norez et du Professeur Frédéric Becq, à l’Institut de Physiologie et Biologie
Cellulaires (IPBC, UMR 6187/CNRS) de l’Université de Poitiers, dirigé par le Professeur
Frédéric Becq. Mes travaux de thèse sont soutenus financièrement par l’association
«Mucovie».
I/ Contexte scientifique et objectifs
Le groupe CFTR de l’équipe Physiopathologie et Pharmacologie des Canaux Ioniques
dans lequel j’ai réalisé ma thèse a pour thématique principale la pharmacologie de la
mucoviscidose. Dans ce contexte, des collaborations mises en place avant mon arrivée avaient
permis l’identification de deux molécules : le GPact-11a et le guanabenz. Ces deux molécules
ont été testées grâce à une station de criblage robotisée disponible au laboratoire.
1. GPact-11a
En 2002, débutait une collaboration avec le Pr Jean-Luc Décout du Département de
Pharmacochimie Moléculaire, UMR 5063, de l’Université de Grenoble. Cette collaboration
visait à identifier les effets d’une nouvelle famille de molécules sur l’activité du CFTR : les
adduits méthylglyoxal-alpha-aminoazahétérocycle. Une première étude avait permis de mettre
en évidence le caractère inhibiteur de certains composés dont le GPinh-5a (Routaboul et al.,
2007). Lors de la poursuite du criblage de cette famille de molécules, un nouveau composé est
apparu comme présentant non pas un effet inhibiteur mais un effet potentiateur du CFTR : le
GPact-11a (Figure 30).
Figure 30 : Structure chimique du GPact-11a.
81

Le premier objectif de ma thèse a donc été de confirmer les effets in vitro, ex vivo et in vivo
du GPact-11a sur différents modèles cellulaires et animaux, puis d’identifier des pistes sur son
mécanisme d’action.
2. Guanabenz
Une collaboration avec le Pr Marc Blondel de l’unité INSERM U613, Génétique
moléculaire et génétique épidémiologique de Brest a été mise en place en 2004 afin
d’identifier l’effet du guanabenz sur les canaux chlorure. Lors du test d’efflux d’iodure, le
guanabenz (Wytensin ® ) était apparu comme un activateur du CaCC (Figure 31).
Figure 31 : Structure chimique du guanabenz.
Une première étude réalisée en 2008 par Norez et collaborateurs a décrit l’effet activateur du
CaCC du guanabenz par une entrée de Ca 2+ extracellulaire (Norez et al., 2008c). Le second
objectif de ma thèse a donc été de déterminer les effets ex vivo et in vivo du guanabenz et
d’identifier son mécanisme d’action.
II/ Présentations des études
Ce manuscrit retrace donc les principaux résultats obtenus pendant mes trois années de
thèse axées sur la caractérisation de nouvelles molécules pharmacologiques capables de
restaurer la sécrétion chlorure au niveau des épithéliums mucoviscidosiques et de chercher à
comprendre leur mécanisme d’action. L’objectif étant de déterminer de nouvelles cibles
thérapeutiques dans le cadre de la mucoviscidose.
Elle comprend deux études distinctes (Figure 32) :
- l’identification d’une nouvelle famille d’activateurs de CFTR.
- l’identification d’une nouvelle voie d’activation du CaCC.
82

Figure 32 : Représentation schématique des transports ioniques d’une cellule épithéliale.
L’étude relative à chaque famille de molécules à suivi le même protocole :
- détermination des effets in vitro de la molécule grâce aux techniques de mesure
d’efflux d’iodure radioactif et de mesure des variations du potentiel membranaire par
l’utilisation d’une sonde fluorescente. Ces expériences sont réalisées à la fois sur différentes
lignées cellulaires épithéliales mucoviscidosique ou non (MM39, CF-KM4, CF15…) et sur
des cellules issues de biopsies pulmonaires humaines obtenues grâce aux collaborations avec
le CHU La Miletrie de Poitiers (biopsies non-CF) et l’Hôpital Foch de Surnesnes (biopsies
CF).
- détermination des effets ex vivo de la molécule grâce aux mesures des courants
transépithéliaux en chambre de Ussing. Ces expériences sont réalisées sur du colon de souris
sauvages ou portant une mutation du gène CFTR.
- détermination des effets in vivo de la molécule grâce aux mesures de la sécrétion
salivaire de souris sauvages ou mutées.
- recherche du mécanisme d’action de la molécule par des études pharmacologique,
par des essais sur différents mutants de la protéine CFTR ou par l’extinction d’une protéine
d’intérêt par une stratégie de siRNA.
CaCC
CFTR
La synthèse de nos travaux sera réalisée dans la partie Discussions et Perspectives.
83

I/ Matériels utilisés
1. Le matériel cellulaire
Dans cette étude, nous avons utilisé des cellules humaines fraîchement dissociées
issues de poumon CF et non-CF. Ces cellules représentent un bon modèle d’étude mais leur
utilisation est limitée par la disponibilité réduite du matériel. Nous avons donc utilisé en
complément différentes lignées cellulaires qui ont l’avantage d’être toujours à disposition au
laboratoire.
1.1 Cellules primaires humaines
a. Origine des prélèvements
Les fragments de tissus non mucoviscidosiques sont fournis par le service de
chirurgie cardiothoracique du CHU La Miletrie de Poitiers en collaboration avec le Dr
Christophe Jayle. Ils sont prélevés lors de lobectomies indiquées généralement dans des cas
de carcinomes pulmonaires. Ils sont conservés à 4°C dans une solution dites de
« décontamination » contenant du DMEM/HAM-F12 supplémenté avec des antibiotiques : de
la pénicilline/streptomycine (1 mg/ml), de l’amphotéricine B (100 µg/ml) et de la
gentamycine (0,5 mg/ml).
Les fragments de tissus mucoviscidosiques sont fournis par le service de chirurgie
thoracique de l’Hôpital Foch de Surnesnes avec la collaboration du Dr Bonnette. Ils sont
prélevés lors de transplantations pulmonaires. Ils sont également conservés à 4°C dans la
solution de « décontamination » supplémentée avec deux antibiotiques : de la ceftazidime
(500 µg/ml) et de la ticarciline (500 µg/ml).
L’obtention de ces prélèvements est conforme à la législation française et approuvé
par le comité de protection des personnes OUESTIII.
84

. Isolement des cellules
Au laboratoire, les échantillons pulmonaires sont rapidement disséqués sous la loupe
binoculaire à l’aide de ciseaux de microdissection. Après l'ablation des tissus conjonctifs, du
cartilage et des tissus musculaires lisses, les tissus épithéliaux sont découpés en petits
morceaux. Les cellules épithéliales sont ensuite dissociées mécaniquement en passant le tissu
bronchique à plusieurs reprises dans des pipettes pasteur de diamètre décroissant. Les cellules
sont ensuite ensemencées sur des boites de culture dans un milieu de culture DMEM/HAM-
F12 contenant de l’insuline (5 µg/ml), de la transferine (7,5 µg/ml), de l’hydrocortisone (10 -6
M), de la triiodothyronine (3,10 -8 M), de la L-glutamine (1 mM), de l’EGF (25 ng/ml), de
l’ECGS (2 µg/ml) et de la pénicilline /streptomycine (100 µg/ml). Les cellules pourront être
utilisées au bout de quelques heures nécessaires à leur adhésion dans la boite. Cette partie est
réalisée au laboratoire par le Dr Luc Dannhoffer.
1.2 Lignées cellulaires
a. Les cellules CF-KM4 et MM39
Pour cette étude nous avons utilisé :
- la lignée cellulaire CF-KM4 : lignée d’origine trachéale glandulaire humaine
transformée par le virus SV40 et provenant d’un patient homozygote pour la mutation
F508del-CFTR (Kammouni et al., 1999).
- la lignée cellulaire MM39 : lignée d’origine trachéale glandulaire humaine
transformé par le virus SV40 et provenant d’un patient non mucoviscidosique (Merten et al.,
1996).
- la lignée cellulaire CHO (Chinese Hamster Ovary) : système d’expression
d’hétérologue, le clone initial CHO-K1 dérive de l’ovaire d’un hamster chinois adulte (Puck
et al., 1957). Les lignées CHO que nous avons utilisées expriment de façon stable le CFTR
sauvage (CHO-CFTRwt).
85

. Entretien des lignées cellulaires
Les lignées sont cultivées à 37°C sous une atmosphère humide composée de 5% de
CO2 et de 95% d’O2. Les cellules CF-KM4 et les MM39 sont cultivées dans un milieu de
culture DMEM/HAM-F12 avec rouge de phénol (Gibco ® ) contenant de l’amphotéricine B (2
µg/ml), du glucose (Routaboul et al., 2007), du sodium pyruvate (0,22 g/L), de l’ultroser G
100X (1%), de l’épinéphrine (10 µg/ml), des acides aminées (L-cystéine, isoleucine, leucine,
valine : 0,1 g/L) et de la pénicilline/streptomycine (100 U/ml, 100 µg/ml). Les cellules CHO
sont cultivées dans un milieu MEM modifié avec glutamax (Gibco ® ) enrichi par 7% de SVF
(sérum de veaux fœtal). Ce milieu est complété de méthotrexate (Aménoptérine, Sigma) :100
µM pour les CHO CFTR wt et 150 µM pour les CHO F508del-CFTR. Le méthotrexate est un
inhibiteur de la DHFR, enzyme nécessaire à la synthèse des purines. Le plasmide intégrant la
séquence codante du gène CF contient un gène de résistance au méthotrexate, ainsi, seules les
cellules transfectées vont donc survivre et proliférer
Le repiquage des cellules s’effectue une fois par semaine lorsque les cellules sont à
80% de confluence cellulaire. Apres avoir éliminé le surnageant, les cellules sont rincées avec
du milieu HBSS (Ca 2+ /Mg 2+ free) puis incubées en présence de trypsine (2,5 g/l) /EDTA (0,2
g/l, Sigma). Une fois les cellules décrochées de leur support plastique, l’action de la trypsine
est stoppée par l’ajout de 35 ml de milieu de culture. Les cellules sont ensuite centrifugées à
1100 rpm pendant 7 minutes et le culot est resuspendu dans du milieu de culture. Les cellules
peuvent alors être ensemencées dans différents supports suivant le type d’expérience à
réaliser. Pour les cellules CF-KM4 et MM39, les flacons de routine sont préalablement traités
avec du collagène de type I (0,1 mg/ml).
c. La congélation et décongélation des lignées cellulaires
Pour la congélation, le culot est resuspendu dans du milieu de culture contenant 30%
de DMSO suivant le type cellulaire. Les échantillons sont ensuite congelés dans des cryotubes
pendant 48h à -80°C afin d’effectuer un refroidissement progressif, puis dans l’azote liquide
(-180°C). Ils peuvent être ainsi conservés de nombreux mois.
La décongélation doit être rapide afin que les cellules restent le moins longtemps
possible en contact avec le DMSO. Ainsi le contenu du cryotube est immédiatement versé
dans un grand volume de milieu de culture et centrifugé à 1100 rpm pendant 7 minutes.
86

2. Les modèles animaux
Les animaux nécessaires à notre étude sont fournis par le Centre d’Elevage, de Typage
et d’Archivage animal (CNRS-CDTA, Orléans). Deux souches de souris ont été utilisées pour
cette étude (Figure 33) :
- des souris sauvages (wild type : WT) C57BL/6 cftr +/+ et des souris invalidées pour le
gène cftr (knock-out : KO) C57BL/6 cftr -/- . Cette souche a été crée à partir de cellules souches
embryonnaires dans lesquelles le gène cftr a été interrompu au niveau de l’exon 10 grâce à
l’insertion par recombinaison homologue d’une cassette néomycine résistante (Snouwaert et
al., 1992).
- des souris sauvages (WT) 129/FVB cftr +/+ et des souris portant la mutation F508del-
CFTR 129/FVB cftr F508del/F508del . Cette souche a été crée à partir de cellules souches
embryonnaires grâce à une technique de « Hit and run » : dans ces cellules, l’exon 10 non
muté a été remplacé par un exon contenant la mutation F508del-CFTR par double
recombinaison homologue et sélection grâce à des cassettes de résistance (van Doorninck et
al., 1995).
Les souris sont soumises à un cycle luminosité/obscurité de 12h/12h. Elles reçoivent à
volonté une alimentation solide et de l’eau contenant 30 g/l de Movicol ® afin de prévenir
l’obstruction intestinale létale fréquente chez les souris C57BL/6 cftr -/- .
Figure 33 : souris C57Bl/6 et 129/FVB utilisées dans nos études. De gauche à droite:
129/FVB cftr F508del/F508del , 129/FVB cftr +/+ , C57BL/6 cftr -/- et C57BL/6 cftr +/+ .
87

II/ Techniques d’études in vitro
1. Les techniques de biologie moléculaire et de biochimie
1.1 Technique de transfection de « petit ARN interferants» (siRNA)
a. Principe
La technique de siRNA permet d’éteindre l’expression d’une protéine d’intérêt grâce à
de petits ARN double brins pouvant se lier spécifiquement à une séquence d'ARN messager
de la protéine cible et ainsi empêcher son expression en clivant cet ARN.
b. Protocole de transfection
Les siRNA et les milieux utilisés pour la transfection sont fournis par Santa Cruz
Biotechnologie. L’ensemble du protocole est réalisé sous une hotte à flux laminaire.
Les cellules sont cultivées dans des boites de pétries en plastique et sont transfectées
lorsqu’elles atteignent 60% de confluence. Les siRNA sont dilués dans 330 µl de milieu de
dilution et utilisés à une concentration de 0,5 g/ml.
Pour une boite de 35 mm de diamètre : deux solutions A et B sont préparées.
Solution A
Milieu de transfection 100 µl
siRNA 8 µl
Solution B
Milieu de transfection 100 µl
Réactif de transfection 6 µl
Tableau 8 : Composition des solutions A et B nécessaires à la transfection des cellules par siRNA.
Les solutions A et B sont mélangées et incubées 45 minutes à température ambiante.
Au bout de 45 minutes, 0,8 ml de milieu de transfection sont ajoutés à la solution AB. Les
cellules sont ensuite rincées avec 2 ml de milieu de transfection. Puis la solution AB est
déposée sur les cellules et incubée pendant 7 heures. Au bout de 7 heures, 1 ml de milieu 2
fois supplémenté en milieu de croissance et en antibiotiques sont rajoutés sur les cellules.
88

Elles sont incubées pendant 24 heures. Ensuite les cellules sont rincées et incubées dans un
milieu de culture standard. Les cellules sont utilisées dans notre protocole 48 heures après la
transfection.
L’extinction des ARN messager par le siRNA est ensuite vérifiée par RT-PCR quantitative
(Dr Vincent Thoreau, IPBC).
1.2 Technique de Western Blot
a. Principe
Cette technique permet de séparer les protéines en fonction de leur poids moléculaire
(KDa). En effet, les protéines sont extraites, séparées sur un gel de polyacrylamide par
électrophorèse et transférées sur une membrane. La membrane est ensuite traitée avec un
anticorps primaire correspondant à la protéine recherchée puis avec un anticorps secondaire
couplé à un fluorochrome, un isotope ou une enzyme.
b. Extraction et dosage des protéines
Les cellules sont rincées 3 fois dans un tampon PBS puis récupérées à l’aide d’un
grattoir dans 100 µl de tampon de lyse (Tableau 9) additionné d’inhibiteur de protéases
(Tableau 10). Les cellules sont ensuite broyées à travers l’aiguille d’une seringue à insuline
puis le lysat cellulaire est centrifugé à 14000 rpm pendant 5 minutes à 4°C. Le surnageant est
alors prélevé et dosé par la méthode de Bradford afin de déterminer la quantité totale de
protéines contenues dans le lysat.
Le Kit Bio-Rad Assay pour Bradford est dilué au 1/5 dans de l’eau distillée puis filtré
à 0,8 µM. Les échantillons de protéines sont dilués au 1/10 : 10 µl de lysat protéique + 5 ml
de réactif de Bradford. Le mélange est incubé pendant 15 minutes à température ambiante
puis la densité optique (DO) est mesurée au spectrophotomètre à 595 nm. La concentration
protéique est obtenue en reportant les valeurs de DO sur une courbe étalon réalisée
préalablement.
89

Tampon de lyse
Tris-HCl 50 mM
NaCl 150 mM
EDTA 1 mM
DTT 1 mM
Triton X-100 1%
SDS 0,1%
Na-Déoxycholate 1%
Tableau 9 : Composition du tampon de lyse.
Inhibiteurs de protéases
Benzamidine 0,2 mg/ml
Pepstatine A 1 µg/ml
Phénylméthylsulfonyl fluoride (PMSF) 0,1 mM
Aprotinine 20 µg/ml
Leupeptine 20 µg/ml
Tableau 10 : Composition du cocktail d’inhibiteurs de protéases.
c. Electrophorèse et transfert sur membrane
Les échantillons protéiques sont dénaturés dans un volume égal de tampon de laemmli
2X (Tableau 11) pendant 20 minutes à température ambiante.
Tampon du laemmli 2X
Tris-HCl (pH 6,8) 0,38 g
SDS 10% (p/v) 11,5 ml
1-thioglycerol 5% 2,5 ml
Glycerol 7,5 ml
Bleu de bromophénol 0,1% (p/v) 0,5 ml
H2O 0,38 g
Tableau 11 : Composition du tampon de laemmli 2X.
90

Ils sont ensuite déposés sur un gel avec un marqueur de poids moléculaire coloré
(Rainbow TM Recombinant, GE). Les échantillons sont concentrés dans un gel de
polyacrylamide 5% et séparé dans un gel de polyacrylamide 7% (Tableau 12). Les gels sont
coulés l’un après l’autre dans une cassette Invitrogen de 1 mm d’épaisseur. La migration des
protéines a lieu dans un tampon d’électrophorèse (Tableau 13) à 34 mA pendant environ 1
heure.
Tableau 12 : Composition des gels de polyacrylamide.
Tableau 13 : Composition du tampon d’électrophorèse 10X.
Les protéines séparées par électrophorèse sont ensuite transférées sur une membrane
de PVDF. Le gel d’acrylamide est placé sur la membrane préalablement incubée 45 minutes
dans un tampon de transfert afin de former un « sandwich » (2 mousses, papier wattman, gel,
membrane, papier wattman, 2 mousses).
Gel de séparation 7% Gel de concentration 7%
H2O 2,6 ml 2,6 ml
Tampon 4X pour gel de séparation 1,5 ml -
Tampon 4X pour gel de concentration - 1 ml
Acrylamide-Bisacrylamide 1,05 ml 400 µl
TEMED 6 µl 4µl
Persulfate d'ammonium 10 % (p/v) 60 µl 40 µl
Le montage est effectué dans un dispositif Invitrogen. Le transfert a lieu dans du
tampon de transfert (Tableau 14) à 30 mV et 150 mA pendant 2 heures.
CAPS 10X
CAPS 22,19 g
H2O qsp 1 L
pH 11,8
Tampon d'électrophorèse 10X
Tris base 0,025 M
Glycine 0,192 M
SDS (p/v) 0,1 %
Tableau 14 : Composition du tampon de transfert.
Tampon de transfert
Méthanol 100 % 20 ml
CAPS 10X 20 ml
H2O 160 ml
91

d. Saturation et hybridation de la membrane
Les sites non spécifiques de la membrane sont ensuite saturés pendant 3 heures à 4°C
dans une solution de PBS-Tween 0,1% contenant 5% de lait écrémé. La membrane est ensuite
rincée 3 fois avec du PBS-Tween 0,1% puis mise à incuber avec l’anticorps primaire
correspondant à la protéine étudiée toute la nuit à 4°C (Tableau 15).
Anticorps Dilution Provenance
Lapin anti-TRPC1 polyclonal 1/200e Sigma
Chèvre anti-TRPC6 polyclonal 1/300e Santa Cruz Biotech
Souris anti-GAPDH polyclonal 1/200e Invitrogen
Tableau 15 : Récapitulatif des anticorps primaires utilisés.
Le lendemain, la membrane est rincée de nouveau 3 fois avec du PBS-Tween 0,1%.
Elle est ensuite incubée pendant 1 heure avec un anticorps secondaire dirigé contre le type
d’immunoglobuline de l’anticorps primaire (Tableau 16) et dilué dans du PBS-Tween 0,1%
contenant 3% de lait. L’anticorps secondaire est couplé à la peroxydase.
Anticorps Dilution Provenance
IgG d’âne anti-lapin 1/10000e Amersham Biosciences
IgG de mouton anti-chèvre 1/10000e Santa Cruz Biotech
IgG de mouton anti-souris 1/10000e Amersham Biosciences
Tableau 16 : Récapitulatif des anticorps secondaire utilisés.
e. Révélation
Avant la révélation, la membrane est rincée 3 fois avec du PBS-Tween 0,1%. La
révélation est une réaction enzymatique par chémiluminescence, effectuée grâce au kit ECL
(Milipore). La révélation se fait par autoradiographie en apposant un film photographique
Hyperfilm ECL (Amercham Biosciences) sur la membrane.
92

2. Technique de physiologie cellulaire
2.1 Mesure de l’activité calcique intracellulaire
a. Principe de la sonde Fluo-4
La sonde Fluo-4 (Figure 34) ou acetomethly-ester (Fluo-4-AM , Fluoprobes ®) est une
sonde fluorescente qui dérive par modification chimique de chélateurs calciques tels que
l’EGTA ou le BAPTA, ce qui explique sa propriété de liaison spécifique du calcium.
Figure 34 : Structure de la sonde Fluo-4-AM.
La sonde possède un groupement ester qui lui permet de pénétrer et de s’accumuler
dans la cellule. Une fois dans le cytoplasme, le groupement ester est hydrolysé par des
estérases intracellulaires. La sonde alors libérée de ce groupement ester va se lier
spécifiquement au calcium (Figure 35).
Membrane plasmique
Excitation du
Fluo-4 à 488 nm
Ca2+ Ca lié aux
protéines
2+ lié aux
protéines
Fluo-4 liposoluble
car estérifiée
Fluo-4 liposoluble
Ca2+ Ca libre 2+ libre
Estérases
cellulaire
Fluo-4 s
Fluo-4 -
Ca2+ Ca2+ Emission du Fluo-4 à
522 nm
(forme liée)
Figure 35 : Principe de l’entrée de la sonde Fluo-4-AM dans les cellules.
93

La longueur d’onde d’excitation de la sonde Fluo-4 se situe à 488 nm et celle
d’émission à 522 nm. La quantité de fluorescence émise est directement proportionnelle à la
quantité de calcium intracellulaire libre.
b. Protocole de charge
Les cellules sont incubées pendant 20 minutes à température ambiante dans une
solution de Krebs (Tableau 17) contenant 3 µM de Fluo-4-AM, elles sont ensuite rincées et
disposées sur un support adapté sous le microscope confocal.
L’activité calcique est enregistrée par le microscope confocal équipé d’un laser
Argon/Krypton 15 mW (Biorad, MRC 1024, Hemel Hempstead, UK).
Krebs
NaCl 118,4 mM
KCl 4,7 mM
CaCl2
KH2PO4
MgSO4
NaHCO3
c. Analyse des résultats
2,5 mM
1,2 mM
1,2 mM
25 mM
Glucose 11,7 mM
pH 7.4
Tableau 17 : Composition de la solution de Krebs.
Le signal fluorescent est analysé sous le logiciel Software Lasershap 3.2 (Bio-Rad).
Les résultats sont exprimés en (F/Fo)-1 ou F correspond au signal fluorescent et Fo à
l’intensité de la fluorescence basale.
Le système d’acquisition permet la sélection de zone d’intérêt : différentes cellules au
sein d’un même champ cellulaire. Les variations de fluorescence au sein de chaque zone sont
retransmises sous forme d’intensité de fluorescence en fonction de fonction du temps (Figure
36).
94

[Ca 2+ [Ca ] i
2+ [Ca ] i
2+ ] i
200
150
100
50
Molécule agoniste
Zone d’intérêt
0.0 2.5 5.0 7.5
Temps (min)
Figure 36 : Tracés et images XY représentant l’évolution de fluorescence de la sonde Fluo-4 en fonction du
temps suite à l’application d’un agoniste.
Les résultats sont exploités après normalisation de l’aire sous la courbe, calculée sous
le logiciel Origin 5.0, et présentés sous forme d’histogramme.
2.2 Mesure du potentiel membranaire
a. Principe de la sonde oxonol
La sonde oxonol (Figure 37) ou bis-(1,3-diethylthiobarbituric acid)trimethine oxonol
([DiSBAC2(3)] Molecular Probes, Eugene, OR) est une sonde fluorescente sensible aux
variations du potentiel membranaire.
Figure 37 : Structure de la sonde [DiSBAC2(3)].
95

L’oxonol est une sonde chargée négativement. Elle est capable d’entrer dans les
cellules dépolarisées et de se lier aux protéines membranaires intracellulaires. L’augmentation
de la quantité d’oxonol dans la cellule va provoquer une augmentation de la fluorescence
émise. A l’inverse, l’hyperpolarisation, provoque une diminution de la quantité d’oxonol dans
la cellule et donc une diminution de la fluorescence.
La longueur d’onde d’excitation de la sonde oxonol se situe à 546 nm et celle
d’émission à 580 nm. La fluorescence augmente lors que la membrane est dépolarisée et
inversement, la fluorescence diminue lorsque la membrane est hyperpolarisée.
b. Protocole de charge
Pour facilité le transport de Cl - , les cellules sont incubées pendant 20 minutes à
température ambiante dans une solution de Krebs (Tableau 18) dépourvue de Cl - et contenant
250 nM d’oxonol, elles sont ensuite disposées dans un support adapté sous le microscope
confocal.
Krebs sans Cl -
Na gluconate 101 mM
K acetate 5 mM
Ca gluconate 2 mM
Mg acetate 2 mM
Mannitol 50 mM
Glucose 5 mM
Hepes-Tris 5 mM
pH 7.4
Tableau 18 : Composition de la solution de Krebs sans Cl - .
c. Analyse des résultats
La mesure d’oxonol est réalisée grâce à une station de microscopie confocale
(FV1000, Olympus) équipée d’un microscope inversé à fluorescence (IX-81, Olympus).
L’acquisition des signaux et le traitement des images sont réalisés à l’aide du logiciel
d’acquisition Fluoview v1.6. L’acquisition se fait à température ambiante et la fluorescence
basale est enregistrée pendant 3 minutes avant l’addition de la drogue. Le système
96

d’acquisition permet la sélection des différentes cellules au sein d’un même champ cellulaire.
Les variations de fluorescence au sein de chaque zone sont retransmises sous forme
d’intensité de fluorescence en fonction du temps. Les résultats sont présentés en pourcentage
de variation de la fluorescence (Fx) selon l’équation : Fx = ([Ft – Fo]/Fo) x 100 ou Ft et Fo sont
respectivement l’intensité de fluorescence à un temps t et au temps t0 correspondant à
l’addition de la drogue sur les cellules (Figure 38). Les résultats sont exploités sous le logiciel
Origin 5.0.
[(Ft-F0)/F0]*100
80
60
40
20
Figure 38 : Tracés et images XY représentant l’évolution de fluorescence de la sonde [DiSBAC2(3)] en
fonction du temps suite à l’application d’un agoniste et d’un inhibiteur.
2.3 Efflux d’iodure
0
-20
a. Principe
Molécule agonist Inhibiteur
0 5 10 15
Temps (min)
La technique des efflux de radiotraceurs est un bon outil d’étude de la fonctionnalité
de la plupart des canaux ioniques. Pour l’étude des canaux chlorure, l’utilisation de l’iodure
radioactif 125 I - est préférée au chlorure 36 Cl - pour plusieurs raisons : il a une courte demi-vie
(30 jours pour l’isotope 125 I - contre 300000 ans pour le 36 Cl - ), il est environ 10 fois moins
97

onéreux que le 36 Cl - et la plupart des canaux chlorure présentent une plus grande sélectivité à
l’iodure (PI/PCl > 1,5).
Cette technique repose sur la mesure des changements de concentrations en traceur de
part et d’autre de la membrane cellulaire. Cette mesure est rendue possible par l’émission
d’un rayonnement γ que l’on peut ensuite détecter par voie externe. Le principe de la
technique des efflux est le suivant : une petite quantité de radiotraceur est ajoutée dans le
compartiment extracellulaire ; le traceur finit par s’équilibrer de part et d’autre de la
membrane plasmique. La mesure de l’activité du transporteur s’effectue ensuite en
déterminant la quantité de radiotraceur qui sort de la cellule après l’ajout de différents agents
pharmacologiques.
b. Protocole
Les cellules, mises en culture dans des plaques 24 puits, sont rincées plusieurs fois
avec du milieu d’efflux (Tableau 19) pour éliminer les cellules mortes. Elles sont ensuite
incubées avec 500 µl de solution de charge (1 µCi/ml de 125 INa dans du milieu d’efflux)
pendant 1 heure, au cours de laquelle l’iodure radioactif s’équilibre de part et d’autre de la
membrane. La solution de charge contient un excès d’iode non radioactif par rapport à l’iode
radioactif afin de saturer les sites de fixation aspécifique l’iode. Toutes les étapes suivantes
sont automatisées et réalisées à l’aide d’un robot MultiPROBE ® II (Packard). Après la phase
d’incubation, les cellules sont rincées avec le milieu d’efflux afin d’éliminer toutes la
radioactivité non incorporée, puis placées en présence de 500 µl de solution d’efflux. Le
surnageant est ensuite collecté toutes les minutes dans des tubes à hémolyse (pour un
comptage ultérieur) et le milieu est remplacé par un volume équivalent de milieu d’efflux. Les
prélèvements des trois premières minutes correspondent à l’efflux basal de radiotraceur (sortie
passive des ions 125 I). Les six prélèvements suivants sont obtenus en présence des agents
pharmacologiques à tester. La sortie de l’iodure est ainsi mesurée pendant 9 minutes. A la
dixième minute, les cellules sont lysées pendant environ 30 minutes sous agitation grâce à
l’ajout de 500 µl de NaOH (0,1N) / 0,1% SDS (pH 7,4). Cette étape permet de récupérer la
radioactivité résiduelle contenue dans les cellules. Enfin l’ensemble des fractions collectées
dans les tubes à hémolyses sont mesurées en coups par minute (cpm) grâce à un compteur
gamma (Cobra ® II, Packard).
98

Milieu d’efflux
NaCl 136,9 mM
KCl 5,4 mM
KH2PO4
NaH2PO4
NaHCO3
CaCl2
MgCl2
MgSO4
0,3 mM
0,3 mM
4,2 mM
1,8 mM
0,8 mM
0,4 mM
HEPES 10 mM
Glucose 5,6 mM
Tableau 19 : Composition du milieu d’efflux pour les systèmes d’expression endogènes.
c. Analyse des résultats
Les résultats en cpm sont exprimés sous la forme de vitesse de sortie d’iodure
radioactif (k) exprimé en min -1 et calculés d’après la formule suivante : k = [ln( 125 I t1) – ln
( 125 I t2)]/ t2-t1. 125 I t1 : cpm au temps t1, 125 I t2 : cpm au temps t2 (Figure 39).
k (min-1)
0.25
0.20
0.15
0.10
Agent à tester
k pic
0.05
kbasal 0.00
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Temps (min)
Figure 39 : Représentation graphique des efflux d’iodures.
Afin de s’affranchir des variations correspondantes à la sortie passive de
radioéléments, les résultats sont exprimés en kpic-kbasal.
99

III/ Techniques d’études ex vivo et in vivo
1. La technique de chambre de Ussing
1.1 Principe
Le principe de la chambre de Ussing repose sur la propriété d’étanchéité de
l’épithélium, ainsi que sur l’existence d’une asymétrie de distribution des protéines de
transport. Il en résulte un flux d’ions et de solutés au travers du tissu. La technique de
chambre de Ussing est utilisée pour étudier les transports ioniques au travers d’un épithélium
d’un grand nombre de tissus ou de culture de cellules épithéliales.
1.2 Système expérimentale
Le système utilisé est composé de 6 chambres de Ussing (Easymount ® , EM-CSYS-6,
Physiologic Instruments) thermorégulées (37°C) par un bloc chauffant et oxygénées par un
mélange 95% O2 et 5% CO2. Les inserts sont montés entre deux hémi-chambres en plexiglas.
Celles-ci indépendantes peuvent contenir la même solution expérimentale ou deux solutions
différentes. Cette séparation permet aussi l’addition de drogues sur la face désirée (apicale,
basolatérale ou les deux). Le système est composé de deux paires d’électrodes d’agar KCl
3M reliées à un voltmètre : une paire d’électrodes de voltage pour mesurer la différence de
potentiel (ddp) développée par le tissu en cours d’étude et une paire d’électrodes de courant
pour mesurer le courant de court-circuit (Isc pour short circuit current). Elles sont situées dans
chacune des hémi-chambres de part et d’autre du tissu (Figure 40 ; Figure 41). Afin de
mesurer le courant de court-circuit, la technique de « voltage clamp » est utilisée :
l’épithélium est « court-circuité » par l’injection d’un courant permettant de maintenir la ddp
transepitheliale à 0 mV. Le courant de court-circuit correspond à la valeur du courant
nécessaire pour annuler la ddp. Les électrodes sont reliées à un amplificateur par le biais d’un
pré-amplificateur (VCC MC2, Physiologic Instruments). L’amplificateur est relié à
l’ordinateur par le biais d’une interface (DI-720-P, Physiologic Instruments). Les
enregistrements sont réalisés à l’aide du logiciel Acquire Analyse 2.3 (DATAQ ® Instruments
100

Inc). Périodiquement, un voltage déterminé par l’expérimentateur et non nul (+2 mV lors de
nos expériences) est imposé afin d’obtenir une estimation de la résistance transépitheliale
(Rte). Celle-ci pourra être obtenue par l’équation d’Ohm : Rte( )= U(mV)/ Isc(µA).
Hémi-chambre
Insèrt de 2mm²
contenant le tissu
Figure 40 : Chambre de Ussing
Figure 41 : Représentation schématique d’une chambre de Ussing
1.3 Préparation des tissus
Enfin d’éviter l’utilisation d’anesthésiques chimiques, les souris sont sacrifiées le plus
rapidement possible par dislocation cervicale. Elles sont ensuite placées en décubitus dorsal
pour le prélèvement du côlon.
Système
d’oxygénation
Electrode de voltage
Electrode de courant
101

Une ouverture ventrale est pratiquée, de l’extrémité inférieure du sternum jusqu’au
pubis. Une portion de côlon de 2 cm environ est prélevée et placée immédiatement dans une
solution froide de Krebs (Tableau 20). A l’aide d’une seringue sans aiguille remplie de Krebs,
le contenu du côlon est éliminé. La couche musculaire est ôtée et le fragment de côlon est
coupé longitudinalement. Il est placé dans un insert qui est ensuite introduit entre les 2 hémi-
chambres. Il est nécessaire d’attendre entre 15 et 40 minutes pour que le courant de court-
circuit basal soit stable avant de commencer l’enregistrement. Cette période de latence est due
à la manipulation du tissu et au temps nécessaire pour que les échanges se stabilisent.
Krebs « normal »
NaCl 107 mM
KCl 4,5 mM
CaCl2
NaH2PO4
Na2HPO4
MgSO4
NaHCO3
1,2 mM
0,2 mM
1,8 mM
1,2 mM
25 mM
Glucose 12 mM
pH 7.4
Tableau 20 : Composition de la solution de Krebs « normal ».
1.4 Protocole de dépolarisation
Afin de favoriser la mesure d’un courant chlorure induit par le CFTR, un protocole de
dépolarisation est appliqué au niveau du tissu. En effet, un gradient de concentrations en ions
chlorure favorisant la sécrétion d’ion chlorure est créé en utilisant une solution de Krebs
dépourvue d’ions chlorure sur la face apicale (107 mM K-gluconate, 4.5 mM KCl, 25 mM
NaHCO3, 1 mM MgS04, 1.8 mM Na2HPO4, 0.2 mM NaH2PO4, 5.75 mM, Ca-gluconate et 12
mM D-glucose) et une solution de Krebs « normal » sur la face basolatérale du tissu (111.5
mM KCl, 25 mM NaHCO3, 1 mM MgS04, 1.8 mM Na2HPO4, 0.2 mM NaH2PO4, 1.25 mM
CaCl2 et 12 mM D-glucose).
102

2. Mesure de la sécrétion salivaire
2.1 Principe
La sécrétion salivaire est une technique fiable et peu onéreuse qui permet d’évaluer in
vivo l’effet de molécules modulatrices du CFTR et du CaCC. En effet, les glandes salivaires
des souris cftr -/- sont réfractaires à la stimulation ß-adrénergique (Sato & Sato, 1984). En se
basant sur cette donnée, Best et Quinton ont mis au point en 2005 une technique de mesure de
la sécrétion salivaire chez la souris (Best & Quinton, 2005). En effet, ils ont mis en évidence
qu’il existe deux voies de signalisation induisant la sécrétion salivaire, une voie dépendante
des récepteurs ß-adrénergique, l’activation de cette voie induit une augmentation de la
quantité d’AMPc intracellulaire et par conséquent une activation des canaux CFTR et une
voie dépendante des récepteurs muscarinique, l’activation de cette voie induit une
augmentation de la quantité de Ca 2+ et par conséquent une activation des CaCC (Figure 42).
CFTR
2.2 Protocole et analyse
Figure 42 : Schéma de régulation des glandes salivaires
Les souris sont anesthésiées par l’injection intrapéritonéale d’une solution de NaCl
0.9% contenant de la kétamine (10 mg/ml) et de la xylazine (1,5mg/ml) à raison de 100µl
pour 10 grammes de poids vif. Une fois endormies, les souris sont placées en décubitus dorsal
et maintenues dans cette position à l’aide de ruban adhésif.
Cl -
AMPc
Cl -
Ca 2+
βAR M
CaCC
Isoprénaline Acétylcholine
Atropine
103

Les drogues sont dissoutes dans du NaCl 0,9% et injectées par voie sous cutanée dans la face
externe de la joue. La salive est recueillie grâce à des bandelettes de papier Whatman de 2
mm de large et 25 mm de long. Elles sont placées dans la bouche de l’animal contre la joue
qui a reçue l’injection. Toutes les 3 minutes, la bandelette est remplacée par une autre
bandelette et placée dans un tube eppendorf. La masse de salive secrétée pendant les 3
minutes est calculée en soustrayant le poids du tube avant et après la collecte. La sécrétion de
salive est représentée sous forme d’une vitesse de sécrétion exprimée en µg de salive par
minutes et par gramme de souris. La masse totale de salive secrétée en réponse à la drogue est
également calculée en additionnant toutes les masses collectées et en rapportant cette somme
au poids de l’animal, elle est exprimée en mg par gramme de souris.
IV/ Méthodes statistiques
Les résultats sont exprimés selon leur moyenne ± SEM, la significativité statistique
entre les différentes conditions est calculée par le test de student (t test) : ns : non significatif ;
* : P

I/ Identification d’une nouvelle famille d’activateurs
de CFTR
1. Contexte de travail
Le groupe CFTR de l’équipe PPCI dans lequel j’ai réalisé ma thèse a pour thématique
principale la pharmacologie du CFTR. Ses axes de recherche reposent sur l’identification de
molécules pouvant activer, inhiber ou corriger la protéine CFTR sauvage ou mutée.
Lors de mon arrivée, les effets inhibiteurs d’une nouvelle famille de molécules, les adduits
méthylglyoxal-alpha-aminoazahétérocycle avaient été identifiés suite à une collaboration avec
le Département de Pharmacochimie Moléculaire, UMR 5063, de l’Université de Grenoble
dirigé par le Pr Jean-Luc Décout. Il s’agit de composés hétérocycles non-toxiques et solubles
dans l’eau obtenus par la réaction entre le méthylglyoxal et l’-aminoazahétérocycle
(Routaboul et al., 2002 ; Figure 43).
Figure 43 : Réaction entre le méthylglyoxal et l’-aminoazahétérocycle.
(D’après Routaboul et al., 2002)
Cette réaction induit la formation de deux isomères a et b, l’isomère a représente la forme
majoritaire du mélange et l’isomère b, la forme minoritaire.
Les composés issus de la réaction sont actifs sur les protéines CFTR sauvages, F508del
corrigées, G551D, G1349D et présentent la particularité d’agir à de faibles concentrations
(Tableau 21).
méthylglyoxal
-aminoazahétérocycle
a : Isomère majoritaire
b : Isomère minoritaire
105

Tableau 21 : Détermination de l’IC50 (concentration du composé inhibant 50 % de l'effet observé) des
adduits méthylglyoxal les plus efficaces, testés en efflux d’iodure.
Moyenne ± SEM, avec n = 4 à 8 pour chaque conditions testées. Les cellules F508del-CFTR sont incubées avant
l’expérience pendant 24h à 27°C. Les expériences sont réalisées en présence de 1 µM forskoline (WT-CFTR), 10
µM forskoline + 30 µM génistéine (G551D-CFTR) ou 10 µM forskoline + 250 µM MPB-91 (G1349D-CFTR).
Lors du criblage et de la réalisation d’une étude de structure-activité sur cette famille
de molécules, le composé GPact-11a a été identifié, non pas comme un inhibiteur, mais
comme un potentiateur du CFTR (Figure 44).
Figure 44 : Exemples de tracés d’efflux iodure représentant la potentialisation par le GPact-11a et
l’inhibition par le GPinh-5a de la réponse forskoline (Fsk) dans des cellules CHO-CFTRwt (n = 4).
IC50
Molécules WT-CFTR F508del-CFTR G551D-CFTR G1349D-CFTR
5a
(GPinh-5a)
93,3 ± 1,3 pM 67,3 ± 1,3 pM 43,1 ± 1,5 nM 72,3 ± 1,1 pM
8a,b 15,7 ± 1,1 nM 8.7 ± 1,2 nM 190 ± 2 nM 79,4 ± 2 nM
7a,b 2,3 ± 1,5 nM 6,3 ± 2,1 nM 154 ± 2 nM 7,0 ± 1,1 nM
3a,b 11,2 ± 1,6 µM 7,0 ± 1,4 M 35,5 ± 1,6 µM 9,0 ± 1,8 M
4a,b 11,9 ± 1,7 µM 6,0 ± 3,3 M 110 ± 2 µM 2,9 ± 1,4 M
k (min -1 )
0.50
0.25
0.00
0 2 4 6 8 10
Temps (min)
Fsk 1µM + GPact-11a 3µM
Fsk 1µM
Fsk 1µM + GPinh-5a 1µM
106

Ces résultats sont d’autant plus surprenants que le GPact-11a présente une structure chimique
très proche du GPinh-5a, qui a été décrit comme l’inhibiteur le plus efficace de cette famille
de molécules (Figure 45).
A
HO
O
OH
GPinh-5a
Figure 45 : Structure chimique du GPinh-5a et du GPact-11a.
Il est alors apparu intéressant de confirmer et de valider l’effet activateur du GPact-11a
par différentes techniques et sur différents modèles cellulaires.
Dans une première étude, nous avons donc mis en avant l’effet in vitro, ex vivo et in vivo du
GPact-11a (Bertrand et al., 2010)
2. Etude d’un nouvel activateur de CFTR : le GPact-11a
2.1 Article 1
N
N
COO
OH
HN
N
N
OH
B
N
N
HN
N
N
GPact-11a
COO
OH
OH
GPact
107

108

109

110

111

112

113

114

115

116

117

118

119

2.2 Résultats complémentaires
Des expériences additionnelles ont été conduites afin d’identifier le mécanisme
d’action du GPact-11a et de comprendre les différences d’EC50 (concentration du composé
nécessaire pour obtenir 50% d’effet) obtenues in vitro (EC50 = 2,1 ± 1,3 µM) ou ex vivo (EC50
= 175.6 ± 1,1 µM) dans l’article 1.
a. Accessibilité du GPact-11a
Dans l’article 1, nous avons mis en évidence, par l’utilisation de nystatine (agent
antifongique qui perméabilise les membranes), que le GPact-11a agit sur une conductance à la
membrane apicale de l’épithélium colonique. Pourtant, l’addition de GPact-11a, uniquement
au niveau de la membrane apicale du tissu, n’induit qu’une faible augmentation du courant de
court-circuit ( Isc = 2,26 ± 1,01 µA/cm², n = 7 ; Figure 46).
A
Isc (µA/cm²)
30
25
20
15
10
amiloride 100µM
GPact-11a 1mM
apical
basolateral
Glibenclamide 500µM
10 min
Figure 46: Effet du GPact-11a sur la membrane apicale et/ou basolatérale de l’épithélium colonique.
A- Exemple de mesure du courant de court-circuit en chambre de Ussing sur le côlon de souris cftr +/+ .
B- Histogrammes présentant les moyennes de courant de court-circuit induites par GPact-11a (1 mM) sur le
côlon de souris cftr +/+ au niveau des membranes apicale (ap) et basolaterale (bl) en comparaison d’une
application de GPact-11a au niveau des deux membranes (ap + bl).
Au contraire, ajouté au niveau de la membrane basolatérale du tissu, le GPact-11a induit une
augmentation du courant de court-circuit ( Isc = 9,05 ± 1,71 µA/cm², n = 5) non
B
∆Isc (µA/cm²)
15 **
10
5
0
GPact-11a ap + bl
ns
16 7 5
GPact-11a ap
GPact-11a bl
120

significativement différente de celle obtenue lorsqu’il est présent des deux côtés de la
membrane ( Isc = 11,89 ± 1,69 µA/cm², n = 16 ; Figure 46).
Ces résultats suggèrent soit un mécanisme d’action indirect du GPact-11a via une protéine
présente au niveau de la membrane basolatérale, soit un problème d’accessibilité du GPact-
11a au niveau de la membrane apicale.
Afin de tester la seconde hypothèse, le mucus du coté apical a été perméabilisé avec
un détergent spécifique : le dithiothreitol (DTT) qui réduit les ponts disulfures (Ohara et al.,
1993). Les résultats sont présentés Figure 47.
Figure 47 : Effet du GPact-11a sur l’épithélium colonique en présence et en absence de DTT.
Histogrammes présentant les moyennes de courant de court-circuit induits par le GPact-11a (1 mM) sur le côlon
de souris cftr +/+ en présence ou en absence de DTT. ap : GPact-11a appliqué au niveau de la membrane apicale,
ap + bl : GPact-11a appliqué au niveau des deux membranes.
Lorsque le mucus est solubilisé, le GPact-11a ajouté en apical induit une augmentation du
courant de court-circuit ( Isc = 10,4 ± 2,2 µA/cm², n=7) identique à celle obtenue lorsqu’il
est présent des deux côtés de la membrane ( Isc = 11,89 ± 1,69 µA/cm², n = 16 ; Figure 47).
L’absence d’effet du GPact-11a lorsqu’il est ajouté uniquement au niveau de la membrane
apicale correspond donc bien à un défaut d’accessibilité ou à une dégradation du GPact-11a
par l’un des composants du mucus.
∆Isc (µA/cm²)
15
10
5
0
GPact-11a ap + bl
**
ns
16 7 7
GPact-11a ap
GPact-11a ap + DTT
121

Afin d’augmenter l’accessibilité du GPact-11a au niveau des tissus, l’équipe du Pr
Décout nous a fourni de la cystéine et de la -cyclodextrine dans le but de réaliser des
complexes moléculaires avec le GPact-11a. En effet, la cystéine possède un groupement thiol
qui permet de réduire les mucines composant le mucus. Les cyclodextrines quant à elles, sont
des molécules-cages d’origines naturelles qui vont encapsuler le GPact-11a et masquer ses
charges ioniques (Figure 48).
Figure 48 : Effet du GPact-11a sur le colon en présence de DTT, de cystéine et de -cyclodextrine.
Histogrammes présentant les moyennes de courant de court-circuit induit par GPact-11a (1 mM) sur le côlon de
souris cftr +/+ en présence soit de DTT (10 mM), de cysteine ou de -cyclodextrine (1 mM). ap : GPact-11a
appliqué au niveau de la membrane apicale.
Les résultats obtenus ne montrent pas d’amélioration de l’accessibilité du GPact-11a en
présence de cystéine ou de cyclodextrine (Figure 48). Cependant, il s’agit de résultats
préliminaires, il est nécessaire de faire varier la concentration de ces molécules pour favoriser
la formation de complexes avec le GPact-11a afin de confirmer ces résultats. De plus, d’autres
molécules, tel que le tryptophane qui rendrait le GPact-11a plus hydrophobe, doivent encore
être testées.
∆Isc (µA/cm²)
14
12
10
8
6
4
2
0
GPact-11a ap
7 7 4 3
GPact-11a ap + DTT
GPact-11a ap + Cysteine
GPact-11a + γ-Cyclodextrin
GPact-11a ap + bl
122

. Effet du GPact-11a sur les mutants de classe III
L’utilisation d’activateurs de CFTR est une pharmacologie adaptée plus
particulièrement aux mutants de classe III. En effet, avec ce type de mutations, CFTR est
correctement localisé à la membrane apicale des cellules mais présente un défaut d’activation.
Le GPact-11a a donc également été testé sur des mutants CFTR de classe III (Figure 49).
A
kpeak-kbasal (min-1)
0.3
0.2
0.1
0.0
0 2 4 6 8 10
Temps (min)
G551D-CFTR
Fsk10µM
+1µM GPact-11a
+10µM GPact-11a
+100µM GPact-11a
+ Gst 30µM
G551D-CFTR
Figure 49: Effet du GPact-11a sur des mutants de classe III.
G1349D-CFTR
A- Efflux d’iodure induit par des concentrations croissantes de GPact-11a sur le mutant G551D-CFTR en
présence de forskoline (Fsk) 10 µM. B- Histogrammes résumant l’effet du GPact-11a sur les mutants G551D-,
G1349D- et G551D/G1349D(2GD)-CFTR. Les cocktails forskoline + genistéine (Gst) ou forskoline + MPB-91
sont utilisés comme contrôles positifs, n = 4 pour chaque condition testée.
2GD-CFTR
La Figure 49 démontre l’absence d’effet potentiateur du GPact-11a sur les mutants de classe
III, G551D-, G1349D- et sur le double mutant G551D/G1349D-CFTR. Les mutants G551D et
G1349D sont situés respectivement dans le domaine NBD1 et NBD2 et modifient la liaison et
l’hydrolyse de l’ATP ainsi que la phosphorylation du domaine R. L’absence d’effet du GPact-
11a sur ces mutants nous permet d’émettre une hypothèse sur le mécanisme d’action de la
molécule. En effet, le GPact-11a pourrait interagir directement avec le CFTR sur l’un des
deux sites de fixation de l’ATP. Pour valider cette hypothèse, des études complémentaires
seront nécessaires, notamment des expériences de « binding » entre le GPact-11a et la
protéine CFTR et des expériences de mutagénèse dirigée pour identifier son site de fixation.
B
kpeak-kbasal (min -1 )
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
Fsk + GPact-11a
Fsk + Gst or MPB-91
123

3. Etude de structure-activité
Les composés inhibiteurs de la famille des adduits méthylglyoxal-alpha-
aminoazahétérocycle présentent une efficacité de l’ordre du picomolaire, au contraire le
GPact-11a présente une efficacité de l’ordre de la dizaine de micromolaires. Une étude
structure-activité a donc été réalisée en collaboration avec le Pr Jean-Luc Décout afin
d’identifier l’activateur le plus actif de cette famille.
Grâce à cette stratégie, le GPact-26a a été identifié comme activateur du CFTR. Il ne diffère
du GPact-11a que par le remplacement de la chaine hydrophobe propyl par une chaine
hydrophobe allyl (Figure 50).
GPact-11a
Figure 50 : Evolution de la structure du GPact-11a vers le GPact-26a.
Dans un premier temps, grâce aux efflux d’iodure, nous avons démontré que le GPact-
26a active le CFTR sur des cellules CHO-CFTRwt, avec une EC50 de 7,5 µM (Figure 51).
% d'activation maximale
125 EC50 = 7.5 ± 1.7 µM
100
75
50
25
0
-7 -6 -5 -4
Log[GPact-26a] (M)
Figure 51 : Evaluation de l’effet du GPact-26a sur les cellules CHO-CFTRwt
par la technique d’efflux iodure.
GPact-11a GPact-26a
Courbe dose-réponse de l’efflux d’iodure induit par le GPact-26a sur les cellules CHO-CFTRwt, n = 4.
124

Dans un deuxième temps, par la technique de mesure de fluorescence avec la sonde oxonol,
nous avons déterminé l’effet du GPact-26a sur les cellules trachéales humaines MM39 qui
expriment le CFTR de manière endogène (Figure 52).
A
Fx
80
60
40
20
0
-20
Fsk
GPact-26a
CFTR inh-172
0 2 4 6 8 10 12 14
Temps (min)
Figure 52 : Effet du GPact-26a sur les cellules MM39 par la technique d’oxonol.
Exemples de tracés représentatifs obtenus après l’addition de 100 µM de GPact-26 sur des cellules MM39 en
présence (A) ou en absence (B) de 1 µM forskoline (Fsk), n = 12 cellules pour chaque expériences.
La Figure 52 montre que l’addition de GPact-26a induit une augmentation de la fluorescence
en présence de forskoline mais également en absence de forskoline. Cette réponse est inhibée
par un inhibiteur spécifique du CFTR, le CFTRinh-172. Le GPact-26a est donc à la fois un
potentiateur et un activateur de CFTR.
Bien que l’EC50 in vitro du GPact-26a ne soit pas plus efficace que celle du GPact-
11a, une étude plus approfondie de la molécule à tout de même été menée in vivo. Nous avons
déterminé l’effet du GPact-26a, in vivo, sur le modèle de souris cftr +/+ par la technique de
mesure de la sécrétion salivaire sur des souris sauvages (Figure 53).
B
Fx
30
20
10
0
-10
GPact-26a
CFTR inh-172
0 2 4 6 8 10
Temps (min)
125

A
Moyenne de secretion
salivaire (µg.min-1.g-1)
18
12
6
0
Figure 53 : Sécrétion salivaire induite par le GPact-26a sur les souris cftr +/+ .
A- Tracés représentant la mesure de la sécrétion salivaire totale induite par le GPact-26a en présence ou en
absence d’isoprénaline. B- Histogrammes représentant la stimulation de la sécrétion salivaire totale induite par le
GPact-26a en présence ou en absence d’isoprénaline.
L’ensemble de ces résultats révèlent un effet activateur in vitro mais aussi in vivo d’un
second composé de la famille des adduits méthylglyoxal-alpha-aminoazahétérocycle : le
GPact-26a. Ces résultats font l’objet d’une publication en cours d’écriture.
4. Discussion
Isoprénaline 10µM (N=9)
Iso + GPact-26a 30µM (N=10)
GPact-26a 30µM (N=5)
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
Temps (min)
L’ensemble de ces travaux a permis de mettre en évidence deux nouveaux activateurs
de la protéine CFTR, le GPact-11a et le GPact-26a.
0.4 *
De part leurs caractères hydrosolubles et leurs absences de toxicité, les GPact représentent des
candidats intéressants pour le développement d’une thérapie pharmacologique de la
mucoviscidose. Bien que le GPact-11a présente une EC50 relativement élevée, il est sélectif du
CFTR. En effet, le GPact-11a n’a aucun effet sur les cellules CF non corrigées ou sur les
souris cftr -/- . D’autre part, le GPact-11a active le CFTR en absence d’une préactivation par la
forskoline, contrairement à de nombreuses molécules pharmacologiques (Illek et al., 1995;
Pedemonte et al., 2005a; Noel et al., 2006). Il apparaît donc à la fois, comme un activateur et
un potentiateur du CFTR. De plus, lors de notre étude, nous avons démontré que le GPact-11a
présente un effet activateur sur les lignées cellulaires et les cellules issues de biopsies
B
Sécretion salivaire totale (mg.g -1 )
0.3
0.2
0.1
0.0
Isoprenaline 10µM
Iso + GPact-26a 30µM
GPact-26a 30µM
9 10 5
126

pulmonaires portant la mutation F508del-CFTR, or peu d’activateurs de la protéine F508del-
CFTR ont été caractérisés et proposés pour thérapie.
L’absence d’effet du GPact-11a sur le taux d’AMPc et sur les mutants G551D-,
G1349D- et le double mutant G551D/G1349D, suggère un effet direct de ce composé sur le
CFTR. Les mutations G551D et G1349D sont situés respectivement dans les domaines NBD1
et NBD2 au niveau des sites de liaisons et d’hydrolyse de l’ATP. Dans la littérature, la
génistéine a également été décrite comme incapable de stimuler le CFTR portant la mutation
G1349D et la double mutation G551D/G1349D (Derand et al., 2002; Melin et al., 2004). En
effet, la glycine 551 dans le domaine NBD1 est un site important pour l’inhibition du CFTR
par la génistéine alors que la glycine 1349 dans le domaine NBD2 est un site majeur pour
l’activation du CFTR par la génistéine. La genisteine agit avec un « effet cloche » sur le
CFTR, en effet elle active CFTR pour des concentrations inférieur à 50 µM mais devient
inhibitrice pour des concentrations plus élevées (Derand et al., 2002; Lansdell et al., 2000;
Melin et al., 2004). Bien que le GPact-11a ne soit pas inhibiteur de CFTR à fortes
concentration, la famille des adduits méthylglyoxal-alpha-aminoazahétérocycle auquel il
appartient comprend à la fois des inhibiteurs et des activateurs de CFTR. L’hypothèse d’une
action directe du GPact-11a sur le CFTR et plus particulièrement sur les sites de fixations de
l’ATP peut donc être émise. Bien que cette hypothèse doit encore être vérifiée, elle renforce
l’intérêt de ces molécules pour la mucoviscidose.
Les composés GPinh-5a, GPact-11a et GPact-26a sont issus de la réaction entre deux
composés le méthylglyoxal et un composé 9-propyladénine. Ils sont constitués d’un noyau
aromatique de bases puriques (en bleu, Figure 54) avec de part et d’autres, une chaine propyl
hydrophobe (en rouge, Figure 54) et un noyau hydrophile (en noir, Figure 54) formé par la
condensation du méthylglyoxal et de la 9-propyladénine (Figure 54).
HO
OH
O
N
N
HN
N
N
COO
OH
OH
Figure 54 : Structure chimique du GPinh-5a et du GPact-11a.
N
N
HN
N
N
COO
OH
OH
127

En collaboration avec le Pr Jean-Luc Décout, nous avons émis l’hypothèse que la partie
hydrophile chargée de ces molécules constituerait le pharmacophore. Le motif structural
minimum du pharmacophore serait alors constitué de la fonction carboxylique COO - et de la
fonction azotée HN +, communes au GPinh-5a et au GPact-11a (Figure 55).
Figure 55 : Motif structural minimum du pharmacophore supposé.
Ce pharmacophore se fixerait aux acides aminés chargés au niveau des sites NBD1 ou NBD2
du CFTR. Cette hypothèse est corroborée par le fait que d’autres modulateurs de CFTR
possèdent également deux charges opposés au niveau de leurs structures chimiques, tel que
les quinolizinium comme le MPB-91 et le MPB-104 (Figure 56 ; Becq, 2006).
Figure 56 : Structure chimique des quinolizium.
Cette hypothèse est également soutenue par le fait qu’un grand nombre d’inhibiteurs de
CFTR possèdent une fonction carboxylique, parmi eux, la phloxine B (Pedemonte et al.,
2005a), l’ibuprofène (Devor & Schultz, 1998), l’acide niflumique, l’acide flufénamique
(Verkman & Galietta, 2009), et le CFTRinh-172 (cf figure 13 ; Ma et al., 2002).
La chaine hydrophobe (en rouge Figure 54) qui diffère entre les molécules de cette famille
déterminerait quand à elle l’effet inhibiteur ou activateur du composé. Les activateurs
permettraient après fixation une stabilisation de la forme ouverte du canal CFTR alors que les
inhibiteurs déstabiliseraient cette forme ouverte aboutissant à la fermeture du canal. Partant de
ce principe, de nouvelles études de structure-activité sont actuellement menées dans le but
d’identifier de nouveaux modulateurs du CFTR.
N +
O -
128

En conclusion, de part leurs différentes caractéristiques (hydrosolubles, peu toxiques,
spécifiques), les molécules activatrices de la famille des adduits méthylglyoxal-alpha-
aminoazahétérocycle apparaissent comme une alternative séduisante de thérapie
pharmacologique. En effet, la mise en place d’un traitement commun avec un activateur, tel
que le GPact-11a, et un correcteur de CFTR représente une stratégie intéressante pour les
patients présentant une mutation F508del, soit plus de 90% des malades.
129

II/ Etude d’une nouvelle voie d’activation du CaCC
1. Contexte de travail
Une étude réalisée dans notre laboratoire en 2008 a mis en évidence un nouvel
activateur du CaCC : le guanabenz (Norez et al., 2008c). Cette molécule active le CaCC par
une entrée de Ca 2+ extracellulaire avec une EC50 de 831 nM sur des cellules épithéliales
nasales humaines CF (CF15 ; Figure 57).
A
k (min -1 )
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
guanabenz 100µM
basal
0 2 4 6 8
Temps (min)
Figure 57 : Effet du guanabenz sur l’activation du CaCC dans les cellules CF15.
A- Exemple de tracés représentatifs de l’activation d’un efflux d’iodure sur des cellules CF15 stimulées par le
guanabenz ou non stimulées (Boucher et al., 1986), n = 20. B- Courbe dose-réponse correspondante (n = 4).
(Norez et al., 2008c)
Plus récemment, lors de son doctorat au sein de notre groupe, Fabrice Antigny a
démontré une dérégulation de l’homéostasie calcique dans les cellules CF (Antigny et al.,
2008). Lors d’une seconde étude, il a aussi démontré la présence des canaux TRP (TRPC1,
C6, V1, V2 et V3) dans nos lignées cellulaires et en particulier il a mis en évidence une
activité plus importante de TRPC6 dans les cellules CF (Antigny et al., 2010).
La seconde étude qui m’a été confiée, a donc eu pour but, d’une part de confirmer
l’effet du guanabenz sur différents modèles cellulaires, sur des tissus murins et in vivo sur
différents modèles de souris. D’autre part, d’étudier s’il existait une relation entre TRPC6 et
l’activation du CaCC par le guanabenz.
B
k peak-k basal (min -1 )
0.15
0.10
0.05
EC 50 = 831 ± 0.94 nM
0.00
-9 -7 -5 -3
Log [Guanabenz] (M)
130

2. Contexte bibliographique
Les canaux TRP ont été isolés chez la Drosophile (Sun et al., 2002). L’isolation du
gène trp a conduit à l’identification d’un canal perméable au calcium activé par une voie
impliquant la rhodopsine et la phospholipase C. La superfamille des TRP contient de
nombreuses entités (Figure 58).
Figure 58 : Arbre phylogénétique de la famille des canaux TRP humains.
Il est possible de regrouper ces différentes protéines en trois classes appelées TRPC
(pour canonical), TRPV (pour vanilloid) et TRPM (pour melastatin). Il existe d’autres canaux
qui peuvent être apparentés aux TRP (TRPA, TRPP, TRP-N, TRP-ML) mais dont
l’homologie de séquence est restreinte à quelques segments transmembranaires (Clapham et
al., 2003).
1.1 TRPV
La famille des TRPV compte 6 membres (TRPV1-TRPV6). Les TRPV1 à TRPV4
sont des canaux cationiques non sélectifs et faiblement perméables au Ca 2+ . Les canaux
TRPV1 à V3 sont sensibles aux fortes températures (Benham et al., 2003) et les TRPV4 sont
activés par le gonflement cellulaire (Arniges et al., 2004).
131

Les propriétés des canaux TRPV5 et TRPV6 sont différentes. Ils possèdent une forte
sélectivité pour le Ca 2+ et sont régulés par le Ca 2+ intracellulaire (Nilius et al., 2000). Ils
jouent un rôle important dans les transports transépithéliaux de Ca 2+ et agissent comme une
voie d’influx de Ca 2+ dans les cellules non excitables (Nijenhuis et al., 2003). Les canaux
TRPV sont inhibés par le rouge de ruthénium (Tableau 22).
Protéines Activation Inhibition
TRPV1
Capsaicin, 2-APB, dépolarisation, forte température
>43°C
Rouge de ruthénium
Capsazepine
TRPV2 Forte température >53°C Rouge de ruthénium
TRPV3
TRPV4
2-ABP
23°C53°C
Gonflement cellulaire
PMA
TRPV5 Constitutivement actif
TRPV6 Constitutivement actif
Rouge de ruthénium
La 3+
Rouge de ruthénium
La 3+ , Gd 3+
Rouge de ruthénium
Pb 2+ , Cu 2+ , Gd 3+
Rouge de ruthénium
La 3+ , Cd 3+ , Mg 2+
Tableau 22: Résumé des caractéristiques d’activation et d’inhibition des canaux TRPV.
1.2 TRPC
La famille des TRPC compte 7 membres : de TRPC1 à TRPC7.
Les canaux TRPC1, TRPC4 et TRPC5 sont très similaires structurellement et
fonctionnellement. Le canal TRPC1 a été le premier TRPC identifié chez les mammifères, il
est exprimé au niveau neuronal, dans les muscles et dans les cellules épithéliales bronchiques
humaines (Corteling et al., 2004). Les canaux TRPC1, TRPC4 et TRPC5 sont fortement
perméables au Ca 2+ et activables par la déplétion des stocks calciques intracellulaires (SOC :
Store-Operated Channel, Galan et al., 2010 ; Worley et al., 2007 ; Beech, 2005). Cependant,
des études ont décrit que lorsque la protéine TRPC1 est exprimée de manière hétérologue,
elle peut être activée de manière indépendante de la vidange des stocks calciques
intracellulaires (Montell, 2005).
Le TRPC2 est un pseudogène chez l’homme, c'est-à-dire qu’il possède une séquence d’ADN
associée à un gène fonctionnel mais qui n’est pas transcrit à cause de mutations ou de la perte
de séquences de régulation (Wes et al., 1995).
132

Les canaux TRPC3, TRPC6 et TRPC7 possèdent entre eux 75 % d’homologie au niveau des
acides aminés et une sensibilité commune au DAG (Hofmann et al., 1999). Les canaux
TRPC3 et TRPC6 sont des RAC (Receptor Activated Channel), leur activation n’est pas
dépendant de la vidange calcique (Boulay et al., 1997) et ils sont activés par le DAG (Tableau
23). Cependant, des études recentes montrent que les canaux TRPC3 et TRPC6 sont
également regulés par la proteine STIM1 (Galan et al., 2010 ; Worley et al., 2007). Les
canaux TRPC3 et TRPC6 sont localisés à la membrane apicale des cellules épithéliales
polarisées. Enfin, le canal TRPC7 est le dernier TRPC découvert. En 2004, Lievremont et
collaborateurs ont montré que TRPC7 pouvait être à la fois un RAC et un SOC (Lievremont
et al., 2004; Tableau 23).
Protéines Activation Inhibition
TRPC1 SOC
Gd 3+ , La 3+ ,
2-APB, SKF96365
TRPC2 Analogue du DAG 2-APB
TRPC3 RAC, OAG
TRPC4 SOC
TRPC5
TRPC6
SOC,
La 3+ , Gd 3+
RAC, OAG,
AIF4, flufenamate, hyperforine, H2O2
TRPC7 RAC, OAG
Gd 3+ , La 3+ ,
2-ABP, SKF96365, Pyr3
La 3+ ,
2-ABP
La 3+ ,
SKF96365
Gd 3+ , La 3+ , amiloride,
2-ABP, SKF96365
La 3+ ,
SKF96365, amiloride
Tableau 23 : Résumé des caractéristiques d’activation et d’inhibition des canaux TRPC.
En résumé les canaux TRPV et TRPC possèdent les caractéristiques et la localisation
nécessaires pour jouer un rôle dans l’entrée du calcium induite par le guanabenz dans nos
modèles de cellules épithéliales humaines.
Au cours de ce travail, nous avons décrit l’effet in vitro, ex vivo et in vivo du
guanabenz. Ensuite, nous avons déterminé son mécanisme d’action, en nous basant sur les
données bibliographiques et sur les résultats obtenus par notre laboratoire (Antigny et al.,
2010).
133

3. Effet du guanabenz in vitro, ex vivo et in vivo
3.1 Effet du guanabenz in vitro
Dans un premier temps, nous avons cherché à confirmer l’effet du guanabenz, sur nos
modèles de cellules épithéliales trachéales humaines CF (Kammouni et al., 1999) et non-CF
(MM39). Les résultats obtenus sont résumés dans la Figure 59.
A guanabenz
guanabenz + DIDS
B
B
0.25 basal
k (min -1 k (min )
-1 )
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
CF-KM4
0 2 4 6 8
Temps (min)
Figure 59 : Effet du guanabenz sur l’activation des CaCC dans les cellules CF15, CF-KM4 et MM39.
A- Exemple de tracés représentatifs de l’activation d’un efflux d’iodure induit par le guanabenz et inhibé par le
DIDS dans les cellules CF-KM4. B- Histogrammes récapitulatifs de l’effet du guanabenz sur les cellules CF15,
CF-KM4 et MM39. Les concentrations utilisées sont 100 µM de guanabenz et 500 µM de DIDS, n = 4 pour
chaque condition testée.
La Figure 59 montre que le guanabenz active un efflux d’iodure, inhibé par le DIDS, dans les
cellules mucoviscidosiques nasales CF15, trachéales CF-KM4 et non-mucoviscidosiques
trachéales MM39. Cet efflux est inhibé par le DIDS, un inhibiteur des canaux CaCC. Cette
première série d’expériences confirme que le guanabenz est un activateur du CaCC dans les
cellules épithéliales et démontre que son effet est indépendant des caractéristiques
mucoviscidosiques des cellules.
kpeak-kbasal (min -1 kpeak-kbasal (min )
-1 )
-0.05
guanabenz guanabenz
+ + DIDS DIDS
basal basal
guanabenz guanabenz
+ + DIDS DIDS
basal basal
guanabenz guanabenz
+ + DIDS DIDS
basal basal
Dans un deuxième temps, nous avons déterminé l’effet du guanabenz sur des cellules
fraîchement dissociées issues de biopsies pulmonaires humaines, grâce aux mesures de
0.15
0.10
0.05
0.00
CF15 CF-KM4 MM39
n = 4
134

variations de fluorescence avec la sonde oxonol. Ce test a été réalisé sur des cellules non-CF
et des cellules CF homozygotes ou hétérozygote pour la mutation F508del (F508del/H1085R ;
F508del/R1066C) : ces mutants correspondent à des mutants d’adressage de la protéine
CFTR. Cette technique a été préférée aux efflux d’iodure car elle permet de manipuler sur un
nombre restreint de cellules. Les résultats obtenus sont présentés Figure 60.
A B
Fx
40 guanabenz
30
20
10
0
-10
DIDS
n = 3
0 5
Temps (min)
10
Figure 60 : Effet du guanabenz sur l’activation des CaCC sur des cellules pulmonaires humaines.
A- Exemple de tracé représentatif de l’augmentation de la fluorescence induit par le guanabenz et inhibé par le
DIDS sur des cellules issues de poumons non-CF. B- Histogrammes représentants l’effet du guanabenz sur des
cellules épithéliales humaines non-CF et de CF portant différentes mutations d’adressage. Les concentrations
utilisées sont 100 µM de guanabenz et 500 µM de DIDS.
Ces résultats montrent que le guanabenz induit une augmentation de fluorescence inhibée par
le DIDS dans les cellules pulmonaires humaines fraîchement dissociées non-CF ou CF. Cette
deuxième série d’expériences confirme par une seconde technique l’effet non-
mucoviscidosique-dépendant de l’activation du CaCC par le guanabenz. D’autre part, ces
résultats montrent que le guanabenz active les CaCC non seulement des lignées cellulaires
épithéliales mais aussi des cellules fraîchement dissociées.
F508del/H1085R
F508del/H1085R
F508del/H1085R
F508del/H1085R
F508del/R1066C
F508del/R1066C
F508del/F508del
F508del/F508del
Ensuite, afin de constituer une monocouche de cellules épithéliales polarisées, des
cellules humaines issues de biopsies pulmonaires non-CF ont été mises en culture sur des
inserts (Corning, pore 4 µM) constitués d’une membrane semi-perméable de polycarbonate en
interface air-liquide : ces conditions permettent de recréer un environnement physiologique
∆Fx ∆Fx
30
20
10
0
non-CF
CF
6 13 7 6
135

nécessaire pour le développement d’un épithélium. Les inserts montés en chambre de Ussing,
nous permettent de déterminer l’effet du guanabenz sur un épithélium reconstitué de cellules
polarisées (Figure 61).
A B
10µA/cm 2
5min
Figure 61 : Effet du guanabenz sur l’activation des CaCC sur des cellules pulmonaires polarisées non-CF.
A- Exemple de tracé représentatif de l’augmentation du courant de court-circuit (Isc) obtenue après l’addition de
guanabenz en présence d’amiloride et inhibé par le DIDS. B- Histogramme récapitulatif de l’effet du guanabenz
sur des cellules humaines polarisées. Les concentrations utilisées sont 100 µM de guanabenz, 500 µM de DIDS
et 100 µM d’amiloride.
L’amiloride, un inhibiteur des canaux ENaC, est utilisé pour tester la viabilité de nos inserts.
La Figure 61 montre que le guanabenz induit une augmentation du courant de court-circuit
inhibée par le DIDS sur des cellules polarisées issues de poumons humains. Ces résultats sont
concordants avec ceux publiés précédemment (Norez et al., 2008c) démontrant un effet du
guanabenz sur un épithélium reconstitué à partir de cellules de lignées CF, CF15. Ces
éléments démontrent que l’effet activateur de CaCC du guanabenz n’est pas dépendant de la
polarisation des cellules.
Amiloride
guanabenz
En conclusion, nous avons mis en évidence que le guanabenz active les canaux CaCC
dans l’ensemble des modèles cellulaires utilisés, qu’ils soient CF ou non-CF, polarisés ou non
d’origine nasale, trachéale ou pulmonaire. Des expériences additionnelles ont ensuite été
conduites, dans le but de déterminer les effets du guanabenz ex vivo et in vivo sur des modèles
de souris cftr -/- et cftr F508del/F508del .
DIDS
∆Isc (µA/cm 2 )
25
0
-50
-75
-100
5
amiloride
5
guanabenz
136

3.2 Effet du guanabenz ex vivo
Dans un premier temps, les effets ex vivo du guanabenz sur l’épithélium colonique de
souris cftr -/- ont été testés par la technique de chambre de Ussing (Figure 62).
A
A
Isc (µA/cm²)
5
0
-5
-10
-15
3µM
1µM
10µM
30µM
Guanabenz
100µM
300µM
500µM
10min
Figure 62 : Effet du guanabenz sur l’épithélium colonique de souris cftr -/- .
A- Tracé représentatif de l’augmentation dose-dépendante du courant de court-circuit induite par des
concentrations croissantes de guanabenz, après la solubilisation du mucus apical par 10 mM de dithiothreitol.
B- Courbe dose-réponse correspondante. Ces expériences sont réalisées en présence d’amiloride, un inhibiteur
du canal sodium ENaC, présent comme le CFTR à la membrane apicale des cellules épithéliales.
La Figure 62 met en évidence que le guanabenz induit une augmentation dose-dépendante du
courant de court-circuit chez les souris cftr -/- avec une EC50 de 93 µM. Le guanabenz est donc
un activateur, ex vivo, du CaCC sur le colon de souris cftr -/- .
3.3 Effet du guanabenz in vivo
Les effets in vivo du guanabenz sur le CaCC ont ensuite été testés par la technique de
mesure de la sécrétion salivaire sur les souris cftr -/- (Figure 63). Le guanabenz a été testé en
présence d’acétylcholine qui permet une activation des CaCC chez ces souris (Best &
Quinton, 2005). La Figure 63 démontre que le guanabenz potentialise la sécrétion salivaire
induite par l’acétylcholine chez les souris cftr -/- . Cette potentialisation est dose-dépendante, et
devient significativement différente pour 500 µM de guanabenz.
B
B
% d'activation maximale
100
80
60
40
20
0
EC50 = 93 ± 1.3 µM
-6 -5 -4 -3
Log [Guanabenz] (M)
137

A
Figure 63 : Sécrétion salivaire induite par le guanabenz sur des souris cftr -/- .
A- Tracé représentant la mesure de la sécrétion salivaire totale induite par le guanabenz en présence ou en
absence d’acétylcholine. B- Histogrammes représentant la stimulation de la sécrétion salivaire totale induite par
le guanabenz en présence d’acétylcholine.
Les souris cftr F508del/F508del représentant un meilleur modèle d’étude pour la
mucoviscidose que les souris cftr -/- , nous avons réalisé des expériences identiques sur ce type
de souris. Les résultats sont présentés Figure 64.
A
Moyenne de secretion
salivaire (µg.min-1.g-1)
Moyenne de secretion
salivaire (µg.min-1.g-1)
60 Acetylcholine 100µM (N=14)
40
20
0
100 Acetylcholine 100µM (N=24)
80
60
40
20
0
+ Guanabenz 500µM (N=14)
0 3 6 9 12 15
Temps (min)
+ Guanabenz 700µM (N=9)
6 9 12 15 18 21
Temps (min)
Figure 64 : Sécrétion salivaire induite par le guanabenz sur des souris cftr -/- .
A- Tracé représentant la mesure de la sécrétion salivaire totale induite par le guanabenz en présence ou en
absence d’acétylcholine. B- Histogrammes représentant la stimulation de la sécrétion salivaire totale induite par
le guanabenz en présence d’acétylcholine.
B
Sécretion salivaire totale
(mg.g -1 )
B
Sécretion salivaire totale
(mg.g -1 )
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0.6
0.4
0.2
0.0
24 23
Acetylcholine 100µM
+ Guanabenz 100µM
+ Guanabenz 500µM
*
14 7 14
Acetylcholine 100µM
+ Guanabenz 500µM
+ Guanabenz 700µM
*
9
138

La Figure 64 montre que le guanabenz potentialise la sécrétion salivaire induite par
l’acétylcholine chez les souris cftr F508del/F508del . Cette potentialisation devient significativement
différente pour 700µM de guanabenz.
L’ensemble des résultats présentés Figure 63 et Figure 64 démontrent que le guanabenz est un
activateur, in vivo, du CaCC dans les modèles de souris cftr -/- et cftr F508del/F508del .
En conclusion de cette première partie, nous avons démontré l’efficacité in vitro, ex
vivo et in vivo du guanabenz sur différentes lignées cellulaires et différents modèles de souris
CF ou non. Ces résultats bien que préliminaires sont encourageants dans le cadre du
développement d’une pharmacologie alternative pour la mucoviscidose.
4. Mécanisme d’action du guanabenz
Le guanabenz est une molécule commercialisée pour être un agoniste 2-adrénergique.
Nous nous sommes donc intéressés à la possible implication des récepteurs 2-adrénergiques
dans la réponse du guanabenz. Ayant précédemment démontré que l’action du guanabenz se
faisait via une entrée de calcium extracellulaire (Norez et al., 2008c). Nous avons par la suite
testé l’effet du guanabenz sur les canaux TRPC et TRPV qui possèdent les caractéristiques
nécessaires pour jouer un rôle dans l’entrée de calcium induite par le guanabenz.
4.1 Le guanabenz : un agoniste 2-adrénergique
Le guanabenz est un agoniste 2-adrénergique utilisé pour le traitement de
l’hypertension (Wytensin ® ). Pour tester l’implication de ces récepteurs dans la réponse au
guanabenz, nous avons déterminé l’effet de la clonidine, un agoniste 2-adrénergique, et de la
cirazoline, un antagoniste 2-adrénergique et un agoniste 1-adrénergique sur les canaux
CaCC (Figure 65).
139

A B
k peak-k basal (min -1 )
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
guanabenz
Figure 65 : Comparaison des effets du guanabenz, de la clonidine et de la cirazoline
sur l’activation des CaCC.
A- Histogrammes représentants l’efflux d’iodure induit par le guanabenz, la clonidine et la cirazoline.
B- Histogrammes représentants la fluorescence induite par le guanabenz, la clonidine et la cirazoline. Les
concentrations utilisées sont 100 µM de guanabenz, 100 µM de clonidine et 100 µM de cirazoline.
Par deux techniques différentes, nous avons mis en évidence dans la Figure 65 que la
clonidine et la cirazoline ne présentent aucun effet sur l’activation des CaCC. Bien que
demandant a être confirmés (autres agonistes 2-adrénergiques, différentes concentrations…),
ces résultats semblent démontrer que l’activation des CaCC par le guanabenz est
indépendante des récepteurs 2-adrénergiques.
4.2 Effet du guanabenz sur les canaux TRPC et TRPV
a. Effet des inhibiteurs des canaux TRPC et TRPV
Afin de déterminer l’implication des canaux TRPC et TRPV dans l’activation des
CaCC par le guanabenz, nous avons utilisé deux inhibiteurs spécifiques : le rouge de
ruthénium (RR), un inhibiteur des canaux TRPV et le SKF96365, un inhibiteur des canaux
TRPC (Figure 66).
**
ns
clonidine
ns
cirazoline
basal
n = 12
∆Fx
30
20
10
0
-10
63
guanabenz
43
clonidine
33
cirazoline
140

Figure 66 : Effet du guanabenz sur l’activation des CaCC en présence de rouge de ruthénium ou de SKF.
Histogrammes représentants l’efflux d’iodure (A) et l’augmentation de fluorescence (B) induits par le guanabenz
en présence de rouge de ruthénium (RR) et de SKF96365. Les concentrations utilisées sont 100 µM de
guanabenz, 50 µM de rouge de ruthénium et 10 µM de SKF96365.
La Figure 66 montre, par deux techniques différentes, que l’activation des CaCC par le
guanabenz est inhibée uniquement par le SKF96365 alors que le rouge de ruthénium ne
présente aucun effet. Le SKF96365 est un inhibiteur spécifique des canaux TRPC, ces
résultats suggèrent donc une action du guanabenz sur les canaux TRPC.
Précédemment, notre laboratoire a décrit la présence dans ces trois modèles cellulaires
(CF15, CF-KM4 et MM39) des canaux TRPC1 et TRPC6 (Antigny et al., 2010). Dans la
seconde partie de cette étude, nous nous sommes donc intéressés plus particulièrement à
l’effet du guanabenz sur les canaux TRPC1 et TRPC6 par la mise en place d’une stratégie de
siRNA.
A B
% d'activation maximale
150
100
50
0
guanabenz
b. Effet du guanabenz sur les canaux TRPC1
Par la transfection de siRNA TRPC1, nous avons induit l’extinction de la protéine
TRPC1 dans notre modèle de cellules CF-KM4 et avons ensuite mesuré la mobilisation
calcique et l’activation des CaCC induites par le guanabenz dans des cellules transfectées
avec le siRNA TRPC1 en comparaison des réponses obtenues dans des cellules transfectées
avec du siRNA contrôle (Ctrl) ou des cellules non-traitées (NT). Dans un premier temps, nous
avons vérifié l’extinction de notre protéine d’intérêt par western-blot. Les résultats sont
présentés Figure 67.
ns
+ RR
***
+ SKF
ns
basal
n = 12
% d'activation maximale
100
80
60
40
20
0
guanabenz
ns
+ RR
***
37 17 21
+ SKF
141

A B
86 KDa
70 KDa
NT
siRNA
Ctrl
Figure 67 : Effet du siRNA contrôle et TRPC1 sur l’expression de la protéine TRPC1 dans les cellules CF-
KM4, en comparaison avec une protéine de référence.
A- Exemple de western-blot représentatif de l’extinction de la protéine TRPC1 en présence de siRNA TRPC1.
B- Histogrammes représentant de la quantité relative de protéine TRPC1 par rapport à la protéine de référence.
La Figure 67 montre une extinction de 40% de l’expression de la protéine TRPC1. Dans ces
expériences une protéine de référence, la protéine Hsp70 a été utilisé et une transfection par
un siRNA contrôle a servi de contrôle négatif. Le siRNA TRPC1 permet donc une extinction
efficace mais partielle de la protéine TRPC1.
Dans un deuxième temps, nous avons mesuré la mobilisation de calcium induite par le
guanabenz sur des cellules CF-KM4 préalablement transfectées avec le siRNA contrôle ou le
siRNA TRPC1 (Figure 68).
siRNA
TRPC1
WB: TRPC1
WB: Hsp70
A B
10mM
50s
Guanabenz
siRNA Ctrl
siRNA TRPC1
Figure 68 : Effet de l’extinction de TRPC1 sur la mobilisation calcique induite par le guanabenz sur les
cellules CF-KM4 transfectées avec un siRNA contrôle ou un siRNA TRPC1.
A- Exemple représentatif de l’augmentation du calcium intracellulaire induite par la stimulation avec 100 µM de
guanabenz. B- Histogramme représentant la normalisation de l’aire sons la courbe en réponse à la stimulation.
Ratio TRPC1/Hsp70
1.25
1.00
0.75
0.50
0.25
0.00
Aires sous la courbe
normalisées
NT
100
80
60
40
20
0
siRNA Ctrl
siRNA Ctrl
siRNA TRPC1
ns
16 14
siRNA TRPC1
n = 3
142

Le guanabenz induit une mobilisation du calcium extracellulaire identique dans les cellules
CF-KM4 transfectées par le siRNA contrôle ou le siRNA TRPC1. Le canal TRPC1 ne semble
donc pas impliqué dans l’entrée de calcium extracellulaire induite par le guanabenz.
Dans un troisième temps, nous avons étudié l’activation du CaCC par le guanabenz sur
des cellules CF-KM4 transfectées ou non par le siRNA TRPC1 (Figure 69).
A
k (min -1 )
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
n = 4
0 2 4 6 8
Temps (min)
Figure 69 : Effet de l’extinction de TRPC1 sur l’activation des CaCC par le guanabenz dans des cellules
CF-KM4 transfectées ou non avec un siRNA contrôle ou un siRNA TRPC1.
A- Exemple de tracés représentatifs de l’activation d’un efflux d’iodure induit par 100 µM de guanabenz sur des
cellules CF-KM4 transfectées ou non. B- Histogrammes récapitulatifs l’activation du CaCC par 100 µM de
guanabenz, inhibée par 10µM de SKF96365 sur des cellules CF-KM4 transfectées ou non.
Le guanabenz induit une activation du CaCC non significativement différentes dans les
cellules CF-KM4 transfectées par du siRNA TRPC1, du siRNA contrôle ou non transfectées.
Le canal TRPC1 ne semble donc pas impliqué dans l’activation du CaCC induite par le
guanabenz.
En conclusion, le siRNA TRPC1 induit une extinction de la protéine TRPC1 mais
aucune modification de la mobilisation calcique et de l’activation du CaCC induit par le
guanabenz. Ces résultats suggèrent que le mécanisme d’action du guanabenz est indépendant
du TRPC1.
guanabenz
NT
siRNA Ctrl
siRNA TRPC1
B
% d'activation maximale
125
100
75
50
25
0
NT siRNA Ctrl siRNA TRPC1
guanabenz
+ SKF
basal
ns
guanabenz
+ SKF
basal
ns
guanabenz
+ SKF
basal
n = 4
143

c. Effet du guanabenz sur les canaux TRPC6
De la même façon, nous avons étudié l’effet de l’extinction de la protéine TRPC6 sur
la mobilisation calcique et l’activation des CaCC induites par le guanabenz.
Dans un premier temps, nous avons vérifié l’extinction de la protéine TRPC6 après
transfection avec du siRNA TRPC6 par western-blot. La protéine ß-tubuline a servi de
protéine référence lors de ces expériences. Les résultats sont présentés Figure 70.
Figure 70 : Effet du siRNA contrôle et TRPC6 sur l’expression de la protéine TRPC6 dans les cellules CF-
KM4, en comparaison avec une protéine de référence.
A- Exemple de gel représentatif de l’extinction de la protéine TRPC6 en présence de siRNA TRPC6.
B- Histogrammes représentant de la quantité relative de protéine TRPC6 par rapport à la protéine de référence.
Nous avons démontré que le siRNA TRPC6 induit l’extinction d’environ 50% de la protéine
TRPC6.
A B
100 KDa
55 KDa
NT
siRNA
TRPC6
WB: TRPC6
WB: ß-Tubulin
Dans un deuxième temps, nous avons testé l’effet du siRNA TRPC6 sur la
mobilisation calcique induite par le guanabenz (Figure 71). Nous avons mis en évidence que
l’extinction de la protéine TRPC6 provoque une diminution d’environ 40% de la mobilisation
calcique induite par le guanabenz. Le canal TRPC6 semble donc impliqué dans l’entrée de
calcium extracellulaire induite par le guanabenz.
Ratio TRPC6/βtubulin
1.25
1.00
0.75
0.50
0.25
0.00
NT
***
siRNA TRPC6
n = 2
144

A
10mM
50s
Guanabenz
siRNA Ctrl
siRNA TRPC6
Figure 71 : Effet de l’extinction de TRPC6 sur la mobilisation calcique induite par le guanabenz sur les
cellules CF-KM4 transfectées avec un siRNA contrôle ou un siRNA TRPC6.
A- Exemple représentatif de l’augmentation du calcium intracellulaire induite par la stimulation avec 100 µM de
guanabenz. B- Histogramme représentant la normalisation de l’aire sons la courbe en réponse à la stimulation.
B
Aires sous la courbe
normalisées
100
80
60
40
20
0
siRNA Ctrl
***
34 33
siRNA TRPC6
145

Enfin, nous avons testé l’effet du siRNA TRPC6 sur l’activation du CaCC induite par le
guanabenz (Figure 72).
A
k (min -1 )
0.4
0.3
0.2
0.1
guanabenz
0.0
n = 4
0 2 4 6 8
Temps (min)
NT
siRNA Ctrl
siRNA TRPC6
Figure 72 : Effet de l’extinction de TRPC6 sur l’activation des CaCC par le guanabenz dans des cellules
CF-KM4 transfectées ou non avec un siRNA contrôle ou un siRNA TRPC6.
A- Exemple de tracés représentatifs de l’activation d’un efflux d’iodure induit par 100 µM de guanabenz sur des
cellules CF-KM4 transfectées ou non. B- Histogrammes récapitulatifs l’activation du CaCC par 100 µM de
guanabenz, inhibée par 10 µM de SKF96365 sur des cellules CF-KM4 transfectées ou non.
Nous avons montré que cette diminution de la mobilisation calcique s’accompagne
d’une diminution d’environ 50% de l’activation des CaCC par le guanabenz. Les 50% de la
réponse restant sont inhibé par le SKF96365.
L’extinction même partielle de la protéine TRPC6 induit à la fois une diminution de la
mobilisation de calcium et d’activation des CaCC induite par le guanabenz. Ces résultats
suggèrent que le canal TRPC6 est impliqué dans l’activation des CaCC par le guanabenz en
permettant une entrée du calcium extracellulaire dans les cellules. Notre travail a donc permis
l’identification de la cible ou d’une des cibles du guanabenz : le canal calcique TRPC6.
4.3 Identification d’une nouvelle voie d’activation des CaCC
Le canal TRPC6 est impliqué dans l’activation des CaCC par le guanabenz,
l’activation de ce canal peut donc être considérée comme une nouvelle voie d’activation des
CaCC dans les cellules épithéliales. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons testé l’effet
B
% d'activation maximale
125
100
75
50
25
0
guanabenz
+ SKF
basal
NT siRNA Ctrl siRNA TRPC6
ns
guanabenz
+ SKF
basal
***
guanabenz
+ SKF
basal
4

d’un activateur connu du canal TRPC6, l’OAG (Oleoyl-2-Acetyl-sn-Glycerol), sur
l’activation des CaCC.
Nous avons d’abord vérifié que l’OAG induit une mobilisation de calcium inhibée par
le SKF96365 dans notre modèle de cellules CF-KM4 (Figure 73).
Figure 73 : Exemple de tracé représentatif de la mobilisation calcique induite par l’OAG et inhibée par le
(Figure 74).
50nM
100s
SKF96365 dans les cellules CF-KM4.
Ensuite, nous avons testé l’effet de l’OAG sur l’activation du CaCC en efflux d’iodure
A B
k (min -1 )
0.20
0.15
0.10
0.05
OAG
basal
0.00
n = 4
0 2 4 6 8
Temps (min)
k (min -1 )
Figure 74 : Effet de l’OAG sur l’activation des CaCC sur les cellules CF-KM4.
A- Exemple de tracés représentatifs de l’activation d’un efflux d’iodure induite par 100 µM d’OAG.
B- Histogramme récapitulatif de l’effet de 100 µM d’OAG en présence de 10 µM CFTRinh-172, de 10 µM de
OAG
+SKF
0.15
0.10
0.05
0.00
-0.05
OAG
-172
inh
OAG+CFTR
OAG+DIDS
OAG+RR
DIDS, de 50 µM de rouge de ruthénium et de 10 µM de SKF96365.
ns
ns
*** *** ***
OAG+SKF
basal
n = 4
147

Nous avons démontré que l’OAG induit l’activation d’un efflux d’iodure inhibé par le DIDS
mais pas par le CFTRinh-172. L’OAG est donc un activateur des CaCC. De plus, cette réponse
est inhibée par le SKF96365 mais pas par le rouge de ruthénium. Ces résultats suggèrent que
l’OAG est un activateur des CaCC par l’intermédiaire de l’activation du canal TRPC6.
Au delà de la découverte d’une cible du guanabenz, notre étude a donc permis
l’identification d’une nouvelle voie d’activation des CaCC via le canal TRPC6. Cette
découverte présente un intérêt thérapeutique dans la mucoviscidose en proposant le TRPC6
comme nouvelle cible dans les approches pharmacologiques. Ce travail fait l’objet d’un
article en cours d’écriture.
5. Discussion
Le guanabenz (Wytensin ® ) est une molécule prescrite pour le traitement de
l’hypertension. Précédemment, nous avions démontré que le guanabenz permettait l’activation
des canaux chlorure calcium-dépendants dans les cellules épithéliales nasales CF, CF15.
Cette nouvelle étude, nous a permis dans un premier temps de confirmer l’effet
activateur du CaCC par le guanabenz en utilisant des lignées cellulaires trachéales CF et non
CF (CF-KM4 et MM39) et des cellules humaines bronchiques fraichement dissociées issues
de poumons CF ou non-CF. En effet nous avons mis en évidence que le guanabenz est un
activateur de CaCC aussi bien sur des cellules CF présentant différentes mutations
d’adressage de la protéine CFTR (F508del/F508del ; F508del/H1085R ; F508del/R1066C)
que sur des cellules non-CF, sur des cellules polarisées ou non et sur plusieurs modèles
cellulaires (trachéal, nasal et bronchique). Nous avons ensuite démontré l’activation du CaCC
par le guanabenz ex vivo sur du colon de souris cftr F508del/F508del et in vivo grâce à des mesures
de sécrétion salivaire.
Ces résultats sont prometteurs et ouvrent des pistes pour une nouvelle application
pharmacologique du guanabenz dans le cadre de la mucoviscidose. En effet, bien que la voie
des CaCC ait été proposée comme une alternative dans la mucoviscidose, peu d’agent ont été
développé. L’exemple le plus abouti concerne Moli1901 qui fait aujourd’hui l’objet d’essais
148

cliniques ayant donnés des résultats encourageants. Ces essais montrent que la molécule
stimule le transport des ions chlorures in vivo au niveau de l’épithélium nasal. De plus, le
traitement est apparu sans danger pour les patients adolescents et adultes présentant une
altération modérée de leur fonction pulmonaire (Grasemann et al., 2007; Zeitlin et al., 2004).
D’autre part, il n’existe à l’heure actuelle que peu d’activateurs connus du CaCC. Ces
résultats concernant le guanabenz, s’ils venaient à se confirmer sur des cellules non-
épithéliales, apporterait alors un nouvel outil dans le monde scientifique et pourrait être
intéressants dans le cas de pathologie ou une déficience de l’activité du CaCC a été observée.
Dans un deuxième temps, nous avons cherché à identifier le mécanisme d’action du
guanabenz. Nous avons démontré par l’utilisation de clonidine et de cirazoline,
respectivement un agoniste et un antagoniste 2-adrénergique, que le guanabenz agit de façon
indépendante des récepteurs adrénergiques. En effet, la clonidine et la cirazoline n’activent
pas le CaCC, au contraire du guanabenz.
Dans la poursuite de l’étude, nous avons mis en évidence que le guanabenz active le CaCC,
via l’entrée de calcium extracellulaire par le canal TRPC6. Le mécanisme d’action du
guanabenz sur le TRPC6 reste inconnu, sa structure chimique ne présente pas d’analogie avec
les activateurs connus du TRPC6 tel que le DAG (diacylglycérol ; Figure 75).
Guanabenz
Figure 75 : Structure chimique du guanabenz, du DAG et d’un dérivé actif de l’hyperforine.
En 2007, un composé de la famille des phloroglucinols, l’hyperforine a été décrite comme
étant un nouvel activateur spécifique du TRPC6 (Leuner et al., 2007). Récemment une étude
structure-activité de cette famille de molécules a été réalisée afin d’identifier le
pharmacophore nécessaire à l’activation du canal TRPC6 (Leuner et al., 2010). Cette étude a
mis en évidence l’importance de la structure 2,4-diacylphloroglucinols pour l’activation du
TRPC6 (Leuner et al., 2010). Cependant le guanabenz ne présente pas d’analogie de structure
149

avec les 2,4- diacylphloroglucinols (Figure 75). Une étude de structure-activité à partir de
dérivés du guanabenz est donc en cours en collaboration avec l’équipe du Dr Marc Blondel
(INSERM U613, équipe génétique moléculaire et génétique épidémiologique de Brest) afin
de déterminer le pharmacophore de cette famille et de proposer des molécules plus
spécifiques du TRPC6.
L’identification d’un nouvel activateur de TRPC6 présente également un intérêt
thérapeutique. En effet, le TRPC6 semble jouer un rôle critique dans la constriction des
petites artères et artérioles (Welsh et al., 2002), il a aussi été décrit comme ayant un rôle
important dans la régulation du volume vasculaire (Inoue et al., 2001) et dans la contraction
du muscle lisse bronchique (Gosling et al., 2005). Il a également été décrit comme étant
impliqué dans l’hypertension pulmonaire (Loot et al., 2010), les maladies cardiovasculaires
(Rowell et al., 2010) et la glomérulosclérose focale segmentaire (Winn et al., 2005). De plus,
il semble jouer un rôle dans le développement de nombreux cancer tel que le cancer du sein
(Guilbert et al., 2008), le cancer des poumons (Zhang et al., 2010), les cancers de l’œsophage
et de l’estomac (Prevarskaya et al., 2007). Or à ce jour, la pharmacologie du TRPC6 reste
pauvre. Depuis sa découverte en 2007 (Leuner et al., 2007) l’hyperforine a été décrite comme
ayant des effets neurobiologiques positifs en vue d’une thérapie pour la maladie d’Alzheimer
(Griffith et al., 2010). Ces travaux ouvrent des perspectives intéressantes pour de potentielles
applications du guanabenz.
En conclusion, cette seconde étude a permis de mettre en lumière l’intérêt que pouvait
représenter le guanabenz dans la mucoviscidose tout en relevant une nouvelle voie originale
d’activation du CaCC via TRPC6. L’identification d’un nouvel agent pharmacologique
activateur du TRPC6 et indirectement du CaCC ainsi que d’une nouvelle voie d’activation du
CaCC représente une avancée scientifique importante pouvant se répercuter sur de
nombreuses pathologies.
150

Conclusions générales et perspectives
La mucoviscidose est une maladie héréditaire, causée par la mutation du canal CFTR.
L’objectif principal de la thérapie pharmacologique consiste donc à restaurer la sécrétion des
ions chlorures au niveau des épithéliums mucoviscidosiques. Les études présentées dans ce
manuscrit ont été axées sur deux familles de molécules capables de restaurer cette sécrétion
chlorure. La première famille de molécules étudiées agit en activant la protéine CFTR (Figure
76) : le membre le plus efficace de cette famille est le GPact-11a. Le second composé étudié
active une voie alternative de sécrétion des ions chlorure dépendante du CaCC (Figure 76), il
s’agit du guanabenz.
Activateur du CaCC :
Guanabenz
Activateurs du CFTR :
GPact-11a et GPact-26a
Figure 76 : Répresentation schématique de l’effet du guanabenz, du GPact11a et du GPact-26a
sur les transports ioniques à la surface d’une cellule.
La première partie de ma thèse correspond à l’étude d’une nouvelle famille
d’activateurs de CFTR, les adduits méthylglyoxal-alpha-aminoazahétérocycle, en
collaboration avec le Département de Pharmacochimie Moléculaire dirigé par le Pr Jean-Luc
Décout. Bien que les premières molécules de cette famille aient été caractérisée comme des
inhibiteurs de CFTR, i.e le GPinh-5a (Routaboul et al., 2007), cette nouvelle étude nous a
permis identifier deux activateur : le GPact-11a et le GPact-26a. En effet, nous avons décrit
l’effet activateur du GPact-11a sur différentes lignées cellulaires (EC50 de 2 µM), et sur des
151

cellules issues de biopsies pulmonaires non-CF ou CF préalablement corrigées par le
miglustat. Nous avons également démontré que le GPact-11a stimule ex vivo et in vivo
l’activité du CFTR. Cependant des études complémentaires ont démontré un défaut
d’accessibilité du GPact-11a à la membrane apicale de l’épithélium colonique causé par
l’épaisse couche de mucus au niveau subapical. La première perspective de notre étude,
consiste donc à la réalisation de complexes avec des molécules capables de solubiliser ou
d’encapsuler le GPact-11a. Dans la littérature, des travaux ont décrit une amélioration de
l’absorption intestinale lors de la co-administration d’un composé d’intérêt avec un agent
mucolytique ou un surfactant non-ionique (Takatsuka et al., 2006a; Takatsuka et al., 2006b;
Takatsuka et al., 2008). Bien que les premiers résultats préliminaires que nous avons obtenus
avec la cystéine et la cyclodextrine ne soient pas concluant, nous allons continuer ces
expériences en testant avec différents types d’agents mucolytiques et de surfactants non-
ioniques.
La perspective de notre étude, consiste à réaliser des expériences de gavage intrapéritonéale
et orale de souris cftr F508del/F508del avec le GPact-11a et un correcteur de CFTR tel que le
miglustat. Ces expériences de gavages permettront d’évaluer les effets d’un traitement à long
terme sur la survie et la sécrétion salivaire des souris. Les résultats de cette étude pourraient
avoir un intérêt majeur dans l’optique d’une bithérapie de la mucoviscidose et d’un futur essai
clinique.
Dans un deuxième temps, une étude structure-activité de la famille des adduits méthylglyoxal-
alpha-aminoazahétérocycle a permis l’identification d’une autre molécule activatrice du
CFTR : le GPact-26a (EC50 = 7.5 µM). L’effet activateur de cette molécule a également été
confirmé ex vivo et in vivo. Nous allons donc poursuivre l’étude structure-activité que nous
réalisons en collaboration avec le Pr Jean-Luc Décout afin d’identifier des molécules plus
efficaces et spécifiques du CFTR.
Dans un troisième temps, la recherche du mécanisme d’action de ces composés représente une
perspective importante. Des pistes sur le mécanisme d’action du GPact-11a ont été identifiées
lors de notre étude. L’absence d’effet du GPact-11a sur le taux d’AMPc et son inefficacité à
stimuler la sécrétion chlorure des mutants G551D-, G1349D-, et du double mutant
G551D/G1349D-CFTR suggèrent un effet direct de la molécule sur le domaine NBD1 et/ou
NDB2 du CFTR au niveau des sites de fixations et d’hydrolyse de l’ATP. Cette famille de
molécules comprend à la fois des inhibiteurs et des activateurs de CFTR, le meilleur
152

inhibiteur et le meilleur activateur ont une structure chimique très proche, il est donc probable
qu’ils se lient sur le même site de fixation et y entrainent deux actions opposées (Figure 77).
A
HO
Figure 77 : Structure chimique du GPinh-5a, GPact-11a et GPact-26a.
La partie hydrophile et chargée commune à ces trois molécules (entourée en noir, Figure 77)
constituerait le site de fixation du GPact-11a sur le CFTR et la chaine hydrophobe qui diffère
(entourée en rouge, Figure 77) déterminerait l’effet inhibiteur ou activateur.
Afin d’identifier le site de fixation exacte du GPact-11a sur le CFTR, des expériences
complémentaires de « binding » doivent être menées, et pour cela des expériences de
mutagénèses dirigées seront nécessaires. Ce type d’expérience est déjà réalisé, dans notre
équipe, par Arnaud Billet, dans le but d’identifier le site de fixation du MBP-91 sur le CFTR.
Nous disposons donc des compétences et des outils nécessaires pour la poursuite de cette
étude. Par ailleurs, les constructions récentes de modèles en trois dimensions du CFTR
réalisées entre autres par le Dr Callebaut (Mornon et al., 2008; Mornon et al., 2009)
permettraient des approches d’études in silico pour l’identification du site de liaison du
GPact-11a sur le CFTR.
La seconde partie de mon travail de thèse est basée sur l’étude d’un nouvel activateur
du CaCC, le guanabenz, identifié en collaboration avec l’équipe de génétique moléculaire et
génétique épidémiologique du Dr Marc Blondel. Tout d’abord, nous avons confirmé l’effet
activateur du guanabenz sur le CaCC en utilisant deux lignées cellulaires trachéales et
bronchiques humaines CF et non CF. Puis nous avons mis en évidence que le guanabenz
stimule de la sécrétion chlorure CaCC ex vivo et in vivo.
De plus, la recherche du mécanisme d’action du guanabenz a permis l’identification d’une
nouvelle voie d’activation du CaCC via une entrée de calcium extracellulaire par le canal
TRPC6.
O
N
N
HN
N
OH
GPinh-5a
COO
OH
N
OH
GPact-11a
GPact-11a GPact-26a
153

Nous avons démontré une relation entre le CaCC et le TRPC6 cependant nous ne pouvons pas
conclure quand à la nature de celle-ci. En effet, l’interaction entre ces deux canaux peut être
physique ou uniquement fonctionnelle. Une étude précédente réalisée dans notre équipe par
Fabrice Antigny a déjà mis en évidence un couplage fonctionnel entre le canal TRPC6 et le
CFTR dans un complexe moléculaire (Antigny et al., 2010). De plus, plusieurs études
précédentes ont mis en évidence une relation entre le canal CFTR et le CaCC (Kunzelmann et
al., 1997; Wei et al., 2001). On peut donc envisager que les canaux TRPC6, CaCC et CFTR
fassent partie du même complexe moléculaire. De plus, nous émettons l’hypothèse que
l’augmentation de calcium provoquée par le guanabenz est un phénomène local et sous
membranaire, dans ce cas le TRPC6 et le CaCC seraient physiquement proches. Cependant
nous ne pouvons pas exclure l’hypothèse que le TRPC6 induit une augmentation de la
quantité totale de calcium dans la cellule. L’ensemble de ces hypothèses seront testées afin
d’identifier le véritable lien qui unit ces deux protéines.
Un gavage de souris cftr -/- et cftr F508del/F508del au guanabenz peut également être envisagé afin
d’évaluer les effets d’un traitement à long terme sur la survie des souris. Des gavages de
souris au guanabenz ont déjà été réalisés, dans l’équipe du Dr Marc Blondel, sur un modèle de
souris présentant une maladie à prions. Le gavage au guanabenz ne pas induit d’effets
secondaires indésirables sur les animaux (Tribouillard-Tanvier et al., 2008).
A plus long terme, la recherche de l’identité moléculaire du CaCC dans nos modèles de
cellules trachéales apparait comme une perceptive séduisante. Il serait d’abord nécessaire
pour cette étude d’identifier les protéines TMEM16, bestrophines et SL26 présentent dans nos
cellules. Par exemple, une étude récente a permis la quantification des ARNm de différents
candidats moléculaire du CaCC dans plusieurs tissus, par la technique de RT-PCR
quantitative (Braun et al., 2010).
L’ensemble de ces résultats nous permettent aujourd’hui d’aborder de nouveaux
champs d’investigation et de découverte de traitement de la mucoviscidose. La pharmacologie
associée à la mucoviscidose est de plus en plus riche et diversifiée (Figure 78).
154

Figure 78 : Schéma représentatif des molécules pharmacologiques existantes dans le traitement de la
mucoviscidose.
Les classes de mutation de la protéine CFTR sont encerclée en bleu et numérotée de I à IV.
ENac : canaux sodiques épithéliaux, RE : réticulum endoplasmique, GI et GII : glucosidases I et II,
HSP : protéine de choc thermique, IBMX : isobutyl méthlyxanhine, MPB : benzoquinolizinium,
PDE : phosphodiesterases, SERCA : pompe calcium ATPase, Ub : ubiquitine.
Au vue du grand nombre de cibles pharmacologiques pour le traitement de la mucoviscidose,
il est possible de concevoir des thérapies multiples associant par exemple un correcteur de
CFTR, et un activateur des CaCC afin de potentialiser au maximum la sécrétion chlorure au
niveau des épithéliums.
En conclusion, dans notre étude, l’identification de deux nouvelles familles de
molécules capables de restaurer la sécrétion chlorure au niveau des épithéliums CF et d’une
voie d’activation du CaCC apparaissent désormais comme autant de nouvelles stratégies de
traitement pharmacologique de la mucoviscidose.
155

BIBLIOGRAPHIE
A
Abbott, B. J., Fukuda, D. S., Dorman, D. E., Occolowitz, J. L., Debono, M., & Farhner, L.
(1979). Microbial transformation of A23187, a divalent cation ionophore antibiotic.
Antimicrob.Agents Chemother. 16, 808-812.
Ai, T., Bompadre, S. G., Wang, X., Hu, S., Li, M., & Hwang, T. C. (2004). Capsaicin
potentiates wild-type and mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
chloride-channel currents. Mol.Pharmacol. 65, 1415-1426.
Al Nakkash, L. & Hwang, T. C. (1999). Activation of wild-type and deltaF508-CFTR by
phosphodiesterase inhibitors through cAMP-dependent and -independent mechanisms.
Pflugers Arch. 437, 553-561.
Andersen, D. H (1938). Cystic fibrosis of the pancreas and its retention to celac disease.
Am.J.Dis.Child 56, 344-399.
Anderson, M. P. & Welsh, M. J. (1992). Regulation by ATP and ADP of CFTR chloride
channels that contain mutant nucleotide-binding domains. Science 257, 1701-1704.
Antigny, F., Norez, C., Dannhoffer, L., Bertrand, J., Raveau, D., Corbi, P., Jayle, C., Becq, F.,
& Vandebrouck, C. (2010). TRPC6 Links Ca2+ Mishandling to CFTR Channel Dysfunction
in Cystic Fibrosis. Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.
Antigny, F., Norez, C., Becq, F., & Vandebrouck, C. (2008). Calcium homeostasis is
abnormal in cystic fibrosis airway epithelial cells but is normalized after rescue of F508del-
CFTR. Cell Calcium 43, 175-183.
Arniges, M., Vazquez, E., Fernandez-Fernandez, J. M., & Valverde, M. A. (2004). Swellingactivated
Ca2+ entry via TRPV4 channel is defective in cystic fibrosis airway epithelia.
J.Biol.Chem. 279, 54062-54068.
Arreola, J., Begenisich, T., Nehrke, K., Nguyen, H. V., Park, K., Richardson, L., Yang, B.,
Schutte, B. C., Lamb, F. S., & Melvin, J. E. (2002). Secretion and cell volume regulation by
salivary acinar cells from mice lacking expression of the Clcn3 Cl- channel gene. J.Physiol
545, 207-216.
Arreola, J., Melvin, J. E., & Begenisich, T. (1995). Inhibition of Ca(2+)-dependent Cl-
channels from secretory epithelial cells by low internal pH. J.Membr.Biol. 147, 95-104.
Avella, M., Loriol, C., Boulukos, K., Borgese, F., & Ehrenfeld, J. (2010). SLC26A9
stimulates CFTR expression and function in human bronchial cell lines. J.Cell Physiol.
156

B
Bachmann, A., Russ, U., & Quast, U. (1999). Potent inhibition of the CFTR chloride channel
by suramin. Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol. 360, 473-476.
Bakall, B., McLaughlin, P., Stanton, J. B., Zhang, Y., Hartzell, H. C., Marmorstein, L. Y., &
Marmorstein, A. D. (2008). Bestrophin-2 is involved in the generation of intraocular pressure.
Invest Ophthalmol.Vis.Sci. 49, 1563-1570.
Baron, A., Pacaud, P., Loirand, G., Mironneau, C., & Mironneau, J. (1991). Pharmacological
block of Ca(2+)-activated Cl- current in rat vascular smooth muscle cells in short-term
primary culture. Pflugers Arch. 419, 553-558.
Barro-Soria, R., Aldehni, F., Almaca, J., Witzgall, R., Schreiber, R., & Kunzelmann, K.
(2010). ER-localized bestrophin 1 activates Ca2+-dependent ion channels TMEM16A and
SK4 possibly by acting as a counterion channel. Pflugers Arch. 459, 485-497.
Barro-Soria, R., Schreiber, R., & Kunzelmann, K. (2008). Bestrophin 1 and 2 are components
of the Ca(2+) activated Cl(-) conductance in mouse airways. Biochim.Biophys.Acta 1783,
1993-2000.
Bebok, Z., Collawn, J. F., Wakefield, J., Parker, W., Li, Y., Varga, K., Sorscher, E. J., &
Clancy, J. P. (2005). Failure of cAMP agonists to activate rescued deltaF508 CFTR in
CFBE41o- airway epithelial monolayers. J.Physiol 569, 601-615.
Becq, F. (2010). Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator modulators for
personalized drug treatment of cystic fibrosis: progress to date. Drugs 70, 241-259.
Becq,F. (2006). On the discovery and development of CFTR chloride channel activators.
Curr.Pharm.Des 12, 471-484.
Becq, F., Mettey, Y., Gray, M. A., Galietta, L. J., Dormer, R. L., Merten, M., Metaye, T.,
Chappe, V., Marvingt-Mounir, C., Zegarra-Moran, O., Tarran, R., Bulteau, L., Derand, R.,
Pereira, M. M., McPherson, M. A., Rogier, C., Joffre, M., Argent, B. E., Sarrouilhe, D.,
Kammouni, W., Figarella, C., Verrier, B., Gola, M., & Vierfond, J. M. (1999). Development
of substituted Benzo[c]quinolizinium compounds as novel activators of the cystic fibrosis
chloride channel. J.Biol.Chem. 274, 27415-27425.
Becq, F., Verrier, B., Chang, X. B., Riordan, J. R., & Hanrahan, J. W. (1996). cAMP- and
Ca2+-independent activation of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator channels
by phenylimidazothiazole drugs. J.Biol.Chem. 271, 16171-16179.
Becq, F., Jensen, T. J., Chang, X. B., Savoia, A., Rommens, J. M., Tsui, L. C., Buchwald, M.,
Riordan, J. R., & Hanrahan, J. W. (1994). Phosphatase inhibitors activate normal and
defective CFTR chloride channels. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 91, 9160-9164.
Becq, F., Fanjul, M., Merten, M., Figarella, C., Hollande, E., & Gola, M. (1993). Possible
regulation of CFTR-chloride channels by membrane-bound phosphatases in pancreatic duct
cells. FEBS Lett. 327, 337-342.
157

Bedwell, D. M., Kaenjak, A., Benos, D. J., Bebok, Z., Bubien, J. K., Hong, J., Tousson, A.,
Clancy, J. P., & Sorscher, E. J. (1997). Suppression of a CFTR premature stop mutation in a
bronchial epithelial cell line. Nat.Med. 3, 1280-1284.
Beech, D.J. (2005). TRPC1: store-operated channel and more. Pflugers Arch. 451, 53-60.
Benham, C. D., Gunthorpe, M. J., & Davis, J. B. (2003). TRPV channels as temperature
sensors. Cell Calcium 33, 479-487.
Berger, A. L., Ikuma, M., & Welsh, M. J. (2005a). Normal gating of CFTR requires ATP
binding to both nucleotide-binding domains and hydrolysis at the second nucleotide-binding
domain. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 102, 455-460.
Berger, A. L., Randak, C. O., Ostedgaard, L. S., Karp, P. H., Vermeer, D. W., & Welsh, M. J.
(2005b). Curcumin stimulates cystic fibrosis transmembrane conductance regulator Cl-
channel activity. J.Biol.Chem. 280, 5221-5226.
Bertrand, C. A., Zhang, R., Pilewski, J. M., & Frizzell, R. A. (2009). SLC26A9 is a
constitutively active, CFTR-regulated anion conductance in human bronchial epithelia.
J.Gen.Physiol 133, 421-438.
Bertrand, J., Boucherle, B., Billet, A., Melin-Heschel, P., Dannhoffer, L., Vandebrouck, C.,
Jayle, C., Routaboul, C., Molina, M. C., Decout, J. L., Becq, F., & Norez, C. (2010).
Identification of a novel water soluble activator of wild-type and F508del CFTR: GPact-11a.
Eur.Respir.J.
Best, J. A. & Quinton, P. M. (2005). Salivary secretion assay for drug efficacy for cystic
fibrosis in mice. Exp.Physiol 90, 189-193.
Bianchet, M. A., Ko, Y. H., Amzel, L. M., & Pedersen, P. L. (1997). Modeling of nucleotide
binding domains of ABC transporter proteins based on a F1-ATPase/recA topology: structural
model of the nucleotide binding domains of the cystic fibrosis transmembrane conductance
regulator (CFTR). J.Bioenerg.Biomembr. 29, 503-524.
Billet, A., Melin, P., Jollivet, M., Mornon, J. P., Callebaut, I., & Becq, F. (2010). The Cterminus
of nucleotide binding domain 1 contains critical features for cystic fibrosis
transmembrane conductance regulator trafficking and activation. J.Biol.Chem.
Bleich,M., Briel,M., Busch,A.E., Lang,H.J., Gerlach,U., Gogelein,H., Greger,R., &
Kunzelmann,K. (1997). KVLQT channels are inhibited by the K+ channel blocker 293B
Pflugers Arch. 434, 459-501.
Boucher, R. C., Cheng, E. H., Paradiso, A. M., Stutts, M. J., Knowles, M. R., & Earp, H. S.
(1989). Chloride secretory response of cystic fibrosis human airway epithelia. Preservation of
calcium but not protein kinase C- and A-dependent mechanisms. J.Clin.Invest 84, 1424-1431.
Boucher, R. C., Stutts, M. J., Knowles, M. R., Cantley, L., & Gatzy, J. T. (1986). Na+
transport in cystic fibrosis respiratory epithelia. Abnormal basal rate and response to
adenylate cyclase activation. J.Clin.Invest 78, 1245-1252.
158

Boulay, G., Zhu, X., Peyton, M., Jiang, M., Hurst, R., Stefani, E., & Birnbaumer, L. (1997).
Cloning and expression of a novel mammalian homolog of Drosophila transient receptor
potential (Trp) involved in calcium entry secondary to activation of receptors coupled by the
Gq class of G protein. J.Biol.Chem. 272, 29672-29680.
Braun, J., Mundhenk, L., Range, F., & Gruber, A. D. (2010). Quantitative expression analyses
of candidates for alternative anion conductance in cystic fibrosis mouse models.
J.Cyst.Fibros.
C
Cabantchik, Z. I. & Greger, R. (1992). Chemical probes for anion transporters of mammalian
cell membranes. Am.J.Physiol 262, C803-C827.
Callebaut, I., Eudes, R., Mornon, J. P., & Lehn, P. (2004). Nucleotide-binding domains of
human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator: detailed sequence analysis and
three-dimensional modeling of the heterodimer. Cell Mol.Life Sci. 61, 230-242.
Caputo, A., Caci, E., Ferrera, L., Pedemonte, N., Barsanti, C., Sondo, E., Pfeffer, U.,
Ravazzolo, R., Zegarra-Moran, O., & Galietta, L. J. (2008). TMEM16A, a membrane protein
associated with calcium-dependent chloride channel activity. Science 322, 590-594.
Chan, H. C., Kaetzel, M. A., Gotter, A. L., Dedman, J. R., & Nelson, D. J. (1994). Annexin
IV inhibits calmodulin-dependent protein kinase II-activated chloride conductance. A novel
mechanism for ion channel regulation. J.Biol.Chem. 269, 32464-32468.
Canessa,C.M., Schild,L., Buell,G., Thorens,B., Gautschi,I., Horisberger,J.D., & Rossier,B.C.
(1994). Amiloride-sensitive epithelial Na+ channel is made of three homologous subunits.
Nature 367, 463-467.
Chen,E.Y.; Bartlett,M.C.; Loo,T.W.; Clarke,D.M. (2004) The DeltaF508 mutation disrupts
packing of the transmembrane segments of the cystic fibrosis transmembrane conductance
regulator. J.Biol.Chem. 279, 39620-39627.
Cheng, S. H., Gregory, R. J., Marshall, J., Paul, S., Souza, D. W., White, G. A., O'Riordan, C.
R., & Smith, A. E. (1990b). Defective intracellular transport and processing of CFTR is the
molecular basis of most cystic fibrosis. Cell 63, 827-834.
Chinet, T., Fajac, I., Ferec, C., Garcia, C. T., & Nguyen-Khoa, T. (2000). [Diagnosis of cystic
fibrosis in adults]. Rev.Mal Respir. 17, 739-748.
Choo-Kang, L. R. & Zeitlin, P. L. (2001). Induction of HSP70 promotes DeltaF508 CFTR
trafficking. Am.J.Physiol Lung Cell Mol.Physiol 281, L58-L68.
Clancy, J. P., Bebok, Z., & Sorscher, E. J. (1997). Purification, characterization, and
expression of CFTR nucleotide-binding domains. J.Bioenerg.Biomembr. 29, 475-482.
159

Clapham, D. E., Montell, C., Schultz, G., & Julius, D. (2003). International Union of
Pharmacology. XLIII. Compendium of voltage-gated ion channels: transient receptor
potential channels. Pharmacol.Rev. 55, 591-596.
Clarke, L. L., Grubb, B. R., Gabriel, S. E., Smithies, O., Koller, B. H., & Boucher, R. C.
(1992). Defective epithelial chloride transport in a gene-targeted mouse model of cystic
fibrosis. Science 257, 1125-1128.
Corteling, R. L., Li, S., Giddings, J., Westwick, J., Poll, C., & Hall, I. P. (2004). Expression
of transient receptor potential C6 and related transient receptor potential family members in
human airway smooth muscle and lung tissue. Am.J.Respir.Cell Mol.Biol. 30, 145-154.
Cotten, J. F. & Welsh, M. J. (1997). Covalent modification of the regulatory domain
irreversibly stimulates cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J.Biol.Chem.
272, 25617-25622.
Cunningham, S. A., Worrell, R. T., Benos, D. J., & Frizzell, R. A. (1992). cAMP-stimulated
ion currents in Xenopus oocytes expressing CFTR cRNA. Am.J.Physiol 262, C783-C788.
Curci, S., Debellis, L., Caroppo, R., & Fromter, E. (1994). Model of bicarbonate secretion by
resting frog stomach fundus mucosa. I. Transepithelial measurements. Pflugers Arch. 428,
648-654.
Cuthbert, A. W. (2003). Benzoquinolines and chloride secretion in murine colonic epithelium.
Br.J.Pharmacol. 138, 1528-1534.
Cutting, G. R., Kasch, L. M., Rosenstein, B. J., Zielenski, J., Tsui, L. C., Antonarakis, S. E.,
& Kazazian, H. H., Jr. (1990). A cluster of cystic fibrosis mutations in the first nucleotidebinding
fold of the cystic fibrosis conductance regulator protein. Nature 346, 366-369.
D
Davis, P. B., Drumm, M., & Konstan, M. W. (1996). Cystic fibrosis. Am.J.Respir.Crit Care
Med. 154, 1229-1256.
Dean, M., Hamon, Y., & Chimini, G. (2001). The human ATP-binding cassette (ABC)
transporter superfamily. J.Lipid Res. 42, 1007-1017.
DeCarvalho, A. C., Ndi, C. P., Tsopmo, A., Tane, P., Ayafor, J., Connolly, J. D., & Teem, J.
L. (2002). A novel natural product compound enhances cAMP-regulated chloride
conductance of cells expressing CFTR[delta]F508. Mol.Med. 8, 75-87.
Dechecchi, M. C., Nicolis, E., Norez, C., Bezzerri, V., Borgatti, M., Mancini, I., Rizzotti, P.,
Ribeiro, C. M., Gambari, R., Becq, F., & Cabrini, G. (2008). Anti-inflammatory effect of
miglustat in bronchial epithelial cells. J.Cyst.Fibros. 7, 555-565.
160

Derand, R., Bulteau-Pignoux, L., & Becq, F. (2003). Comparative pharmacology of the
activity of wild-type and G551D mutated CFTR chloride channel: effect of the
benzimidazolone derivative NS004. J.Membr.Biol. 194, 109-117.
Derand, R., Bulteau-Pignoux, L., & Becq, F. (2002). The cystic fibrosis mutation G551D
alters the non-Michaelis-Menten behavior of the cystic fibrosis transmembrane conductance
regulator (CFTR) channel and abolishes the inhibitory Genistein binding site. J.Biol.Chem.
277, 35999-36004.
Derand, R., Bulteau-Pignoux, L., Mettey, Y., Zegarra-Moran, O., Howell, L. D., Randak, C.,
Galietta, L. J., Cohn, J. A., Norez, C., Romio, L., Vierfond, J. M., Joffre, M., & Becq, F.
(2001). Activation of G551D CFTR channel with MPB-91: regulation by ATPase activity and
phosphorylation. Am.J.Physiol Cell Physiol 281, C1657-C1666.
Devor, D. C. & Schultz, B. D. (1998). Ibuprofen inhibits cystic fibrosis transmembrane
conductance regulator-mediated Cl- secretion. J.Clin.Invest 102, 679-687.
Devor, D. C., Singh, A. K., Bridges, R. J., & Frizzell, R. A. (1996). Modulation of Cl-
secretion by benzimidazolones. II. Coordinate regulation of apical GCl and basolateral GK.
Am.J.Physiol 271, L785-L795.
Doring, G. (1996). Mechanisms of airway inflammation in cystic fibrosis. Pediatr.Allergy
Immunol. 7, 63-66.
Dormer, R. L., Harris, C. M., Clark, Z., Pereira, M. M., Doull, I. J., Norez, C., Becq, F., &
McPherson, M. A. (2005). Sildenafil (Viagra) corrects DeltaF508-CFTR location in nasal
epithelial cells from patients with cystic fibrosis. Thorax 60, 55-59.
Dormer, R. L., Derand, R., McNeilly, C. M., Mettey, Y., Bulteau-Pignoux, L., Metaye, T.,
Vierfond, J. M., Gray, M. A., Galietta, L. J., Morris, M. R., Pereira, M. M., Doull, I. J., Becq,
F., & McPherson, M. A. (2001). Correction of delF508-CFTR activity with
benzo(c)quinolizinium compounds through facilitation of its processing in cystic fibrosis
airway cells. J.Cell Sci. 114, 4073-4081.
Dorwart,M.R., Shcheynikov,N., Yang,D., Muallem,S. (2008). The solute carrier 26 family of
proteins in epithelial ion transport. Physiology. (Betheseda) 23, 104-114.
Drumm, M. L., Wilkinson, D. J., Smit, L. S., Worrell, R. T., Strong, T. V., Frizzell, R. A.,
Dawson, D. C., & Collins, F. S. (1991). Chloride conductance expressed by delta F508 and
other mutant CFTRs in Xenopus oocytes. Science 254, 1797-1799.
Dulhanty, A. M. & Riordan, J. R. (1994). Phosphorylation by cAMP-dependent protein
kinase causes a conformational change in the R domain of the cystic fibrosis transmembrane
conductance regulator. Biochemistry 33, 4072-4079.
Duszyk,M., MacVinish,L., & Cuthbert,A.W. (2001). Phenanthrolines--a new class of CFTR
chloride channel openers. Br.J.Pharmacol. 134, 853-863.
161

E
Egan, M. E., Pearson, M., Weiner, S. A., Rajendran, V., Rubin, D., Glockner-Pagel, J.,
Canny, S., Du, K., Lukacs, G. L., & Caplan, M. J. (2004). Curcumin, a major constituent of
turmeric, corrects cystic fibrosis defects. Science 304, 600-602.
Egan, M. E., Glockner-Pagel, J., Ambrose, C., Cahill, P. A., Pappoe, L., Balamuth, N., Cho,
E., Canny, S., Wagner, C. A., Geibel, J., & Caplan, M. J. (2002). Calcium-pump inhibitors
induce functional surface expression of Delta F508-CFTR protein in cystic fibrosis epithelial
cells. Nat.Med. 8, 485-492.
Egan, M. E., Schwiebert, E. M., & Guggino, W. B. (1995). Differential expression of ORCC
and CFTR induced by low temperature in CF airway epithelial cells. Am.J.Physiol 268, C243-
C251.
Eggermont, J. (2004). Calcium-activated chloride channels: (un)known, (un)loved?
Proc.Am.Thorac.Soc. 1, 22-27.
Elble, R. C., Widom, J., Gruber, A. D., Abdel-Ghany, M., Levine, R., Goodwin, A., Cheng,
H. C., & Pauli, B. U. (1997). Cloning and characterization of lung-endothelial cell adhesion
molecule-1 suggest it is an endothelial chloride channel. J.Biol.Chem. 272, 27853-27861.
Ellgaard, L. & Helenius, A. (2003). Quality control in the endoplasmic reticulum.
Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 4, 181-191.
F
Fanconi, G., Uehlinger, E., and Knauer, C. (1936) Das coeliakiessyndrom bei zystischer
pankreafibromatose und bronchiestasien .
Farber, S. (1945). Some organic digestive disturbances in early life. J.Mich.State Med.Soc.
44, 587-594.
Ficicioglu, C. (2008). Review of miglustat for clinical management in Gaucher disease type 1.
Ther.Clin.Risk Manag. 4, 425-431.
Fischer, H., Schwarzer, C., & Illek, B. (2004). Vitamin C controls the cystic fibrosis
transmembrane conductance regulator chloride channel. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 101, 3691-
3696.
Flores,C.A., Cid,L.P., Sepulveda,F.V., Niemeyer,M.I. (2009). TMEM16 proteins: the long
awaited calcium-activated chloride channels? Braz.J.Med.Biol.Res. 42, 993-1001.
Frings, S., Reuter, D., & Kleene, S. J. (2000). Neuronal Ca2+ -activated Cl- channels-homing
in on an elusive channel species. Prog.Neurobiol. 60, 247-289.
162

Fuller, M. D., Thompson, C. H., Zhang, Z. R., Freeman, C. S., Schay, E., Szakacs, G., Bakos,
E., Sarkadi, B., McMaster, D., French, R. J., Pohl, J., Kubanek, J., & McCarty, N. A. (2007).
State-dependent inhibition of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator chloride
channels by a novel peptide toxin. J.Biol.Chem. 282, 37545-37555.
G
Galan,C., Woodard,G.E., Dionisio,N., Salido,G.M., Rosado,J.A. (2010). Lipid rafts modulate
the activation but not the maintenance of store-operated Ca( 2+ ) entry. Biochim.Biophys.Acta.
1803, 1083-1093.
Galietta, L. J. (2009). The TMEM16 protein family: a new class of chloride channels?
Biophys.J. 97, 3047-3053.
Gandhi, R., Elble, R. C., Gruber, A. D., Schreur, K. D., Ji, H. L., Fuller, C. M., & Pauli, B. U.
(1998). Molecular and functional characterization of a calcium-sensitive chloride channel
from mouse lung. J.Biol.Chem. 273, 32096-32101.
Ge, H., Hou, T. T., Sun, J. J., & Yang, H. (2009). [Butyl-p-hydroxybenzoate stimulates cystic
fibrosis transmembrane conductance regulator Cl- transport]. Yao Xue.Xue.Bao. 44, 32-37.
Gentzsch, M., Cui, L., Mengos, A., Chang, X. B., Chen, J. H., & Riordan, J. R. (2003). The
PDZ-binding chloride channel ClC-3B localizes to the Golgi and associates with cystic
fibrosis transmembrane conductance regulator-interacting PDZ proteins. J.Biol.Chem. 278,
6440-6449.
GIBSON, L. E. & COOKE, R. E. (1959). A test for concentration of electrolytes in sweat in
cystic fibrosis of the pancreas utilizing pilocarpine by iontophoresis. Pediatrics 23, 545-549.
Gosling, M., Poll, C., & Li, S. (2005). TRP channels in airway smooth muscle as therapeutic
targets. Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol. 371, 277-284.
Grasemann, H., Stehling, F., Brunar, H., Widmann, R., Laliberte, T. W., Molina, L., Doring,
G., & Ratjen, F. (2007). Inhalation of Moli1901 in patients with cystic fibrosis. Chest 131,
1461-1466.
Gribkoff, V. K., Champigny, G., Barbry, P., Dworetzky, S. I., Meanwell, N. A., & Lazdunski,
M. (1994). The substituted benzimidazolone NS004 is an opener of the cystic fibrosis chloride
channel. J.Biol.Chem. 269, 10983-10986.
Griffith, T. N., Varela-Nallar, L., Dinamarca, M. C., & Inestrosa, N. C. (2010).
Neurobiological effects of Hyperforin and its potential in Alzheimer's disease therapy.
Curr.Med.Chem. 17, 391-406.
Gruber, A. D., Elble, R. C., Ji, H. L., Schreur, K. D., Fuller, C. M., & Pauli, B. U. (1998).
Genomic cloning, molecular characterization, and functional analysis of human CLCA1, the
first human member of the family of Ca2+-activated Cl- channel proteins. Genomics 54, 200-
214.
163

Guilbert, A., Dhennin-Duthille, I., Hiani, Y. E., Haren, N., Khorsi, H., Sevestre, H.,
Ahidouch, A., & Ouadid-Ahidouch, H. (2008). Expression of TRPC6 channels in human
epithelial breast cancer cells. BMC.Cancer 8, 125.
H
Haardt, M., Benharouga, M., Lechardeur, D., Kartner, N., & Lukacs, G. L. (1999). C-terminal
truncations destabilize the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator without
impairing its biogenesis. A novel class of mutation. J.Biol.Chem. 274, 21873-21877.
Hanrahan, J. W., Kone, Z., Mathews, C. J., Luo, J., Jia, Y., & Linsdell, P. (1998). Patchclamp
studies of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator chloride channel.
Methods Enzymol. 293, 169-194.
Hartzell,H.C., Qu,Z., Yu,K., Xiao,Q., Chien,L.T. (2008) Molecular physiology of
bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies.
Physiol Rev. 88, 639-672.
Hartzell, C., Putzier, I., & Arreola, J. (2005). Calcium-activated chloride channels.
Annu.Rev.Physiol 67, 719-758.
Haws, C. M., Nepomuceno, I. B., Krouse, M. E., Wakelee, H., Law, T., Xia, Y., Nguyen, H.,
& Wine, J. J. (1996). Delta F508-CFTR channels: kinetics, activation by forskolin, and
potentiation by xanthines. Am.J.Physiol 270, C1544-C1555.
Ho,M.W., Kaetzel,M.A., Armstrong,D.L., Shears,S.B.(2001). Regulation of a human chloride
channel. a paradigm for integrating input from calcium, type ii calmodulin-dependent protein
kinase, and inositol 3,4,5,6-tetrakisphosphate. J.Biol.Chem. 276, 18673-18680.
Hofmann, T., Obukhov, A. G., Schaefer, M., Harteneck, C., Gudermann, T., & Schultz, G.
(1999). Direct activation of human TRPC6 and TRPC3 channels by diacylglycerol. Nature
397, 259-263.
Hwang, T. C., Wang, F., Yang, I. C., & Reenstra, W. W. (1997). Genistein potentiates wildtype
and delta F508-CFTR channel activity. Am.J.Physiol 273, C988-C998.
Hwang,T.C., Nagel,G., Nairn,A.C., & Gadsby,D.C. (1994). Regulation of the gating of cystic
fibrosis transmembrane conductance regulator C1 channels by phosphorylation and ATP
hydrolysis. Proc.Nat1.Acad.Sci.U.S.A 91, 4698-4702.
Hwang,T.C., Horie,M., & Gadsby,D.C. (1993). Functionally distinct phospho-forms underlie
incremental activation of protein kinase-regulated Cl- conductance in mammalian heart.
J.Gen.Physiol 101, 629-650.
164

I
Illek, B., Fischer, H., Santos, G. F., Widdicombe, J. H., Machen, T. E., & Reenstra, W. W.
(1995). cAMP-independent activation of CFTR Cl channels by the tyrosine kinase inhibitor
genistein. Am.J.Physiol 268, C886-C893.
Inoue, R., Okada, T., Onoue, H., Hara, Y., Shimizu, S., Naitoh, S., Ito, Y., & Mori, Y. (2001).
The transient receptor potential protein homologue TRP6 is the essential component of
vascular alpha(1)-adrenoceptor-activated Ca(2+)-permeable cation channel. Circ.Res. 88,
325-332.
Ito, Y., Aoyama, M., Yamada, N., Mizuno, Y., Kume, H., & Yamaki, K. (2001).
[(Dihydroindenyl)oxy]alkonic acid inhibits the cystic fibrosis transmembrane conductance
regulator. Eur.J.Pharmacol. 426, 175-178.
J
Jentsch, T. J., Stein, V., Weinreich, F., & Zdebik, A. A. (2002). Molecular structure and
physiological function of chloride channels. Physiol Rev. 82, 503-568.
Jiang, C., Fang, S. L., Xiao, Y. F., O'Connor, S. P., Nadler, S. G., Lee, D. W., Jefferson, D.
M., Kaplan, J. M., Smith, A. E., & Cheng, S. H. (1998). Partial restoration of cAMPstimulated
CFTR chloride channel activity in DeltaF508 cells by deoxyspergualin.
Am.J.Physiol 275, C171-C178.
Jorgensen, A. J., Bennekou, P., Eskesen, K., & Kristensen, B. I. (1997). Annexins from
Ehrlich ascites cells inhibit the calcium-activated chloride current in Xenopus laevis oocytes.
Pflugers Arch. 434, 261-266.
K
Kaetzel, M. A., Chan, H. C., Dubinsky, W. P., Dedman, J. R., & Nelson, D. J. (1994). A role
for annexin IV in epithelial cell function. Inhibition of calcium-activated chloride
conductance. J.Biol.Chem. 269, 5297-5302.
Kammouni, W., Moreau, B., Becq, F., Saleh, A., Pavirani, A., Figarella, C., & Merten, M. D.
(1999). A cystic fibrosis tracheal gland cell line, CF-KM4. Correction by adenovirusmediated
CFTR gene transfer. Am.J.Respir.Cell Mol.Biol. 20, 684-691.
Kelley, T. J., Thomas, K., Milgram, L. J., & Drumm, M. L. (1997). In vivo activation of the
cystic fibrosis transmembrane conductance regulator mutant deltaF508 in murine nasal
epithelium. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 94, 2604-2608.
Kelley, T. J., Al Nakkash, L., Cotton, C. U., & Drumm, M. L. (1996). Activation of
endogenous deltaF508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator by
phosphodiesterase inhibition. J.Clin.Invest 98, 513-520.
165

Kelley, T. J., Al Nakkash, L., & Drumm, M. L. (1995). CFTR-mediated chloride permeability
is regulated by type III phosphodiesterases in airway epithelial cells. Am.J.Respir.Cell
Mol.Biol. 13, 657-664.
Kennedy, M. J. (2002). Current status of gene therapy for cystic fibrosis pulmonary disease.
Am.J.Respir.Med. 1, 349-360.
Kerem, B., Rommens, J. M., Buchanan, J. A., Markiewicz, D., Cox, T. K., Chakravarti, A.,
Buchwald, M., & Tsui, L. C. (1989). Identification of the cystic fibrosis gene: genetic
analysis. Science 245, 1073-1080.
Kidd, J. F. & Thorn, P. (2000). Intracellular Ca2+ and Cl- channel activation in secretory
cells. Annu.Rev.Physiol 62, 493-513.
Knowles, M. R., Paradiso, A. M., & Boucher, R. C. (1995). In vivo nasal potential difference:
techniques and protocols for assessing efficacy of gene transfer in cystic fibrosis. Hum.Gene
Ther. 6, 445-455.
Knowles, M. R., Clarke, L. L., & Boucher, R. C. (1991). Activation by extracellular
nucleotides of chloride secretion in the airway epithelia of patients with cystic fibrosis.
N.Engl.J.Med. 325, 533-538.
Knowles, M. R., Stutts, M. J., Spock, A., Fischer, N., Gatzy, J. T., & Boucher, R. C. (1983).
Abnormal ion permeation through cystic fibrosis respiratory epithelium. Science 221, 1067-
1070.
Kunzelmann, K., Kongsuphol, P., Aldehni, F., Tian, Y., Ousingsawat, J., Warth, R., &
Schreiber, R. (2009). Bestrophin and TMEM16-Ca(2+) activated Cl(-) channels with different
functions. Cell Calcium 46, 233-241.
Kunzelmann, K. (2001). CFTR: interacting with everything? News Physiol Sci. 16, 167-170.
Kunzelmann, K., Mall, M., Briel, M., Hipper, A., Nitschke, R., Ricken, S., & Greger, R.
(1997). The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator attenuates the endogenous
Ca2+ activated Cl- conductance of Xenopus oocytes. Pflugers Arch. 435, 178-181.
L
Lansdell, K. A., Cai, Z., Kidd, J. F., & Sheppard, D. N. (2000). Two mechanisms of genistein
inhibition of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator Cl- channels expressed in
murine cell line. J.Physiol 524 Pt 2, 317-330.
Lazarowski, E. R. & Boucher, R. C. (2009). Purinergic receptors in airway epithelia.
Curr.Opin.Pharmacol. 9, 262-267.
166

Leblanc, N., Ledoux, J., Saleh, S., Sanguinetti, A., Angermann, J., O'Driscoll, K., Britton, F.,
Perrino, B. A., & Greenwood, I. A. (2005). Regulation of calcium-activated chloride channels
in smooth muscle cells: a complex picture is emerging. Can.J.Physiol Pharmacol. 83, 541-
556.
Leuner,K., Heiser,J.H., Derksen,S., Mladenov,M.I., Fehske,C.J., Schubert,R., Gollasch,M.,
Schneider,G., Harteneck,C., Chatterjee,S.S., & Muller,W.E. (2010). Simple 2,4diacylphloroglucinols
as classic transient receptor potential-6 activators--identification of a
novel pharmacophore. Mol. Pharmacol. 77, 368-377.
Leuner, K., Kazanski, V., Muller, M., Essin, K., Henke, B., Gollasch, M., Harteneck, C., &
Muller, W. E. (2007). Hyperforin--a key constituent of St. John's wort specifically activates
TRPC6 channels. FASEB J. 21, 4101-4111.
Lewis, H. A., Buchanan, S. G., Burley, S. K., Conners, K., Dickey, M., Dorwart, M., Fowler,
R., Gao, X., Guggino, W. B., Hendrickson, W. A., Hunt, J. F., Kearins, M. C., Lorimer, D.,
Maloney, P. C., Post, K. W., Rajashankar, K. R., Rutter, M. E., Sauder, J. M., Shriver, S.,
Thibodeau, P. H., Thomas, P. J., Zhang, M., Zhao, X., & Emtage, S. (2004). Structure of
nucleotide-binding domain 1 of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.
EMBO J. 23, 282-293.
Lievremont,J.P., Bird,G.S., & Putney,J.W.,Jr. (2004). Canonical transient receptor potential
TRPC7 can function as both a receptor- and store-operated channel in HEK-293 cells. Am.J
Physiol Cell Physiol 287, C1709-C1716.
Lohi, H., Lamprecht, G., Markovich, D., Heil, A., Kujala, M., Seidler, U., & Kere, J. (2003).
Isoforms of SLC26A6 mediate anion transport and have functional PDZ interaction domains.
Am.J.Physiol Cell Physiol 284, C769-C779.
Loot,A.E., & Fleming,I. (2010) Cytochrome P450-Derived Epoxyeicosatrienoic Acids and
Pulmonary Hypertension: Central Role of Transient Receptor Potential (TRP) C6 Channels. J.
Cardiovasc.Pharmacol.
Lubamba, B., Lebacq, J., Lebecque, P., Vanbever, R., Leonard, A., Wallemacq, P., & Leal, T.
(2009). Airway delivery of low-dose miglustat normalizes nasal potential difference in
F508del cystic fibrosis mice. Am.J.Respir.Crit Care Med. 179, 1022-1028.
Lubamba, B., Lecourt, H., Lebacq, J., Lebecque, P., De Jonge, H., Wallemacq, P., & Leal, T.
(2008). Preclinical evidence that sildenafil and vardenafil activate chloride transport in cystic
fibrosis. Am.J.Respir.Crit Care Med. 177, 506-515.
Luo, J., Pato, M. D., Riordan, J. R., & Hanrahan, J. W. (1998). Differential regulation of
single CFTR channels by PP2C, PP2A, and other phosphatases. Am.J.Physiol 274, C1397-
C1410.
167

M
Ma, T., Thiagarajah, J. R., Yang, H., Sonawane, N. D., Folli, C., Galietta, L. J., & Verkman,
A. S. (2002). Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks
cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J.Clin.Invest 110, 1651-1658.
MADDY, A. H. (1964). A FLUORESCENT LABEL FOR THE OUTER COMPONENTS
OF THE PLASMA MEMBRANE. Biochim.Biophys.Acta 88, 390-399.
Maertens, C., Wei, L., Voets, T., Droogmans, G., & Nilius, B. (1999). Block by fluoxetine of
volume-regulated anion channels. Br.J.Pharmacol. 126, 508-514.
Mall,M., Grubb,B.R., Harkema,J.R., O'Neal,W.K., & Boucher,R.C. (2004). Increased airway
epithelial Na+ absorption produces cystic fibrosis-like lung disease in mice. Nat.Med. 10,
487-493.
Mall, M., Bleich, M., Kuehr, J., Brandis, M., Greger, R., & Kunzelmann, K. (1999). CFTRmediated
inhibition of epithelial Na+ conductance in human colon is defective in cystic
fibrosis. Am.J.Physiol 277, G709-G716.
Mall, M., Bleich, M., Greger, R., Schreiber, R., & Kunzelmann, K. (1998). The amilorideinhibitable
Na+ conductance is reduced by the cystic fibrosis transmembrane conductance
regulator in normal but not in cystic fibrosis airways. J.Clin.Invest 102, 15-21.
Marcet, B., Becq, F., Norez, C., Delmas, P., & Verrier, B. (2004). General anesthetic octanol
and related compounds activate wild-type and delF508 cystic fibrosis chloride channels.
Br.J.Pharmacol. 141, 905-914.
Marivingt-Mounir, C., Norez, C., Derand, R., Bulteau-Pignoux, L., Nguyen-Huy, D., Viossat,
B., Morgant, G., Becq, F., Vierfond, J. M., & Mettey, Y. (2004). Synthesis, SAR, crystal
structure, and biological evaluation of benzoquinoliziniums as activators of wild-type and
mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator channels. J.Med.Chem. 47, 962-
972.
Matchkov, V. V., Aalkjaer, C., & Nilsson, H. (2004). A cyclic GMP-dependent calciumactivated
chloride current in smooth-muscle cells from rat mesenteric resistance arteries.
J.Gen.Physiol 123, 121-134.
McCormack, P. L. & Goa, K. L. (2003). Miglustat. Drugs 63, 2427-2434.
McDonough, S., Davidson, N., Lester, H. A., & McCarty, N. A. (1994). Novel pore-lining
residues in CFTR that govern permeation and open-channel block. Neuron 13, 623-634.
Melin, P., Thoreau, V., Norez, C., Bilan, F., Kitzis, A., & Becq, F. (2004). The cystic fibrosis
mutation G1349D within the signature motif LSHGH of NBD2 abolishes the activation of
CFTR chloride channels by genistein. Biochem.Pharmacol. 67, 2187-2196.
Merten, M. D., Kammouni, W., Renaud, W., Birg, F., Mattei, M. G., & Figarella, C. (1996).
A transformed human tracheal gland cell line, MM-39, that retains serous secretory functions.
Am.J.Respir.Cell Mol.Biol. 15, 520-528.
168

Miki, H., Zhou, Z., Li, M., Hwang, T. C., & Bompadre, S. G. (2010). Potentiation of diseaseassociated
CFTR mutants by hydrolyzable ATP analogs. J.Biol.Chem.
Milenkovic, V. M., Langmann, T., Schreiber, R., Kunzelmann, K., & Weber, B. H. (2008).
Molecular evolution and functional divergence of the bestrophin protein family.
BMC.Evol.Biol. 8, 72.
Mills, A. D., Yoo, C., Butler, J. D., Yang, B., Verkman, A. S., & Kurth, M. J. (2010). Design
and synthesis of a hybrid potentiator-corrector agonist of the cystic fibrosis mutant protein
DeltaF508-CFTR. Bioorg.Med.Chem.Lett. 20, 87-91.
Montell, C. (2005). The TRP superfamily of cation channels. Sci.STKE. 2005, re3.
Mornon, J. P., Lehn, P., & Callebaut, I. (2009). Molecular models of the open and closed
states of the whole human CFTR protein. Cell Mol.Life Sci. 66, 3469-3486.
Mornon, J. P., Lehn, P., & Callebaut, I. (2008). Atomic model of human cystic fibrosis
transmembrane conductance regulator: membrane-spanning domains and coupling interfaces.
Cell Mol.Life Sci. 65, 2594-2612.
Moskowitz, S. M., Chmiel, J. F., Sternen, D. L., Cheng, E., & Cutting, G. R. (1993).
Muanprasat, C., Kaewmokul, S., & Chatsudthipong, V. (2007). Identification of new small
molecule inhibitors of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein: in vitro
and in vivo studies. Biol.Pharm.Bull. 30, 502-507.
Muanprasat, C., Sonawane, N. D., Salinas, D., Taddei, A., Galietta, L. J., & Verkman, A. S.
(2004). Discovery of glycine hydrazide pore-occluding CFTR inhibitors: mechanism,
structure-activity analysis, and in vivo efficacy. J.Gen.Physiol 124, 125-137.
N
Namkung, W., Thiagarajah, J. R., Phuan, P. W., & Verkman, A. S. (2010). Inhibition of
Ca2+-activated Cl- channels by gallotannins as a possible molecular basis for health benefits
of red wine and green tea. FASEB J.
Naren, A. P., Cobb, B., Li, C., Roy, K., Nelson, D., Heda, G. D., Liao, J., Kirk, K. L.,
Sorscher, E. J., Hanrahan, J., & Clancy, J. P. (2003). A macromolecular complex of beta 2
adrenergic receptor, CFTR, and ezrin/radixin/moesin-binding phosphoprotein 50 is regulated
by PKA. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 100, 342-346.
Nijenhuis, T., Hoenderop, J. G., Nilius, B., & Bindels, R. J. (2003). (Patho)physiological
implications of the novel epithelial Ca2+ channels TRPV5 and TRPV6. Pflugers Arch. 446,
401-409.
Nilius, B., Vennekens, R., Prenen, J., Hoenderop, J. G., Bindels, R. J., & Droogmans, G.
(2000). Whole-cell and single channel monovalent cation currents through the novel rabbit
epithelial Ca 2+ channel ECaC. J.Physiol 527 Pt 2, 239-248.
169

Nilius,B.; Prenen,J.; Voets,T.; Eggermont,J.; Bruzik,K.S.; Shears,S.B.; Droogmans,G. (1998).
Inhibition by inositoltetrakisphosphates of calcium- and volume-activated Cl- currents in
macrovascular endothelial cells. Pflugers Arch. 435, 637-644.
Nilius, B., Prenen, J., Voets, T., Van den, B. K., Eggermont, J., & Droogmans, G. (1997).
Kinetic and pharmacological properties of the calcium-activated chloride-current in
macrovascular endothelial cells. Cell Calcium 22, 53-63.
Noel, S., Wilke, M., Bot, A. G., De Jonge, H. R., & Becq, F. (2008). Parallel improvement of
sodium and chloride transport defects by miglustat (n-butyldeoxynojyrimicin) in cystic
fibrosis epithelial cells. J.Pharmacol.Exp.Ther. 325, 1016-1023.
Noel, S., Faveau, C., Norez, C., Rogier, C., Mettey, Y., & Becq, F. (2006). Discovery of
pyrrolo[2,3-b]pyrazines derivatives as submicromolar affinity activators of wild type, G551D,
and F508del cystic fibrosis transmembrane conductance regulator chloride channels.
J.Pharmacol.Exp.Ther. 319, 349-359.
Norez, C., Antigny, F., Noel, S., Vandebrouck, C., & Becq, F. (2009). A cystic fibrosis
respiratory epithelial cell chronically treated by miglustat acquires a non-cystic fibrosis-like
phenotype. Am.J.Respir.Cell Mol.Biol. 41, 217-225.
Norez, C., Bilan, F., Kitzis, A., Mettey, Y., & Becq, F. (2008a). Proteasome-dependent
pharmacological rescue of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator revealed by
mutation of glycine 622. J.Pharmacol.Exp.Ther. 325, 89-99.
Norez, C., Pasetto, M., Dechecchi, M. C., Barison, E., Anselmi, C., Tamanini, A., Quiri, F.,
Cattel, L., Rizzotti, P., Dosio, F., Cabrini, G., & Colombatti, M. (2008b). Chemical
conjugation of DeltaF508-CFTR corrector deoxyspergualin to transporter human serum
albumin enhances its ability to rescue Cl- channel functions. Am.J.Physiol Lung Cell
Mol.Physiol 295, L336-L347.
Norez, C., Vandebrouck, C., Antigny, F., Dannhoffer, L., Blondel, M., & Becq, F. (2008c).
Guanabenz, an alpha2-selective adrenergic agonist, activates Ca2+-dependent chloride
currents in cystic fibrosis human airway epithelial cells. Eur.J.Pharmacol. 592, 33-40.
Norez, C., Noel, S., Wilke, M., Bijvelds, M., Jorna, H., Melin, P., DeJonge, H., & Becq, F.
(2006). Rescue of functional delF508-CFTR channels in cystic fibrosis epithelial cells by the
alpha-glucosidase inhibitor miglustat. FEBS Lett. 580, 2081-2086.
O
Ohara, S., Ishihara, K., & Hotta, K. (1993). Regional differences in pig gastric mucins. Comp
Biochem.Physiol B 106, 153-158.
Oppenheimer, E. A., Case, A. L., Esterly, J. R., & Rothberg, R. M. (1970). Cervical mucus in
cystic fibrosis: a possible cause of infertility. Am.J.Obstet.Gynecol. 108, 673-674.
170

P
Papassotiriou, J., Eggermont, J., Droogmans, G., & Nilius, B. (2001). Ca(2+)-activated Cl-
channels in Ehrlich ascites tumor cells are distinct from mCLCA1, 2 and 3. Pflugers Arch.
442, 273-279.
Pariwat, P., Homvisasevongsa, S., Muanprasat, C., & Chatsudthipong, V. (2008). A natural
plant-derived dihydroisosteviol prevents cholera toxin-induced intestinal fluid secretion.
J.Pharmacol.Exp.Ther. 324, 798-805.
Pasyk, E. A., Morin, X. K., Zeman, P., Garami, E., Galley, K., Huan, L. J., Wang, Y., & Bear,
C. E. (1998). A conserved region of the R domain of cystic fibrosis transmembrane
conductance regulator is important in processing and function. J.Biol.Chem. 273, 31759-
31764.
Pauli, B. U., Abdel-Ghany, M., Cheng, H. C., Gruber, A. D., Archibald, H. A., & Elble, R. C.
(2000). Molecular characteristics and functional diversity of CLCA family members.
Clin.Exp.Pharmacol.Physiol 27, 901-905.
Pedemonte, N., Diena, T., Caci, E., Nieddu, E., Mazzei, M., Ravazzolo, R., Zegarra-Moran,
O., & Galietta, L. J. (2005a). Antihypertensive 1,4-dihydropyridines as correctors of the cystic
fibrosis transmembrane conductance regulator channel gating defect caused by cystic fibrosis
mutations. Mol.Pharmacol. 68, 1736-1746.
Pedemonte, N., Lukacs, G. L., Du, K., Caci, E., Zegarra-Moran, O., Galietta, L. J., &
Verkman, A. S. (2005b). Small-molecule correctors of defective DeltaF508-CFTR cellular
processing identified by high-throughput screening. J.Clin.Invest 115, 2564-2571.
Pedemonte, N., Sonawane, N. D., Taddei, A., Hu, J., Zegarra-Moran, O., Suen, Y. F., Robins,
L. I., Dicus, C. W., Willenbring, D., Nantz, M. H., Kurth, M. J., Galietta, L. J., & Verkman,
A. S. (2005c). Phenylglycine and sulfonamide correctors of defective delta F508 and G551D
cystic fibrosis transmembrane conductance regulator chloride-channel gating.
Mol.Pharmacol. 67, 1797-1807.
Petrukhin, K., Koisti, M. J., Bakall, B., Li, W., Xie, G., Marknell, T., Sandgren, O., Forsman,
K., Holmgren, G., Andreasson, S., Vujic, M., Bergen, A. A., McGarty-Dugan, V., Figueroa,
D., Austin, C. P., Metzker, M. L., Caskey, C. T., & Wadelius, C. (1998). Identification of the
gene responsible for Best macular dystrophy. Nat.Genet. 19, 241-247.
Pitt, J. J. (2010). Newborn screening. Clin.Biochem.Rev. 31, 57-68.
Poschet, J. F., Timmins, G. S., Taylor-Cousar, J. L., Ornatowski, W., Fazio, J., Perkett, E.,
Wilson, K. R., Yu, H. D., De Jonge, H. R., & Deretic, V. (2007). Pharmacological modulation
of cGMP levels by phosphodiesterase 5 inhibitors as a therapeutic strategy for treatment of
respiratory pathology in cystic fibrosis. Am.J.Physiol Lung Cell Mol.Physiol 293, L712-L719.
Prevarskaya,N., Zhang,L., & Barritt,G. (2007).TRP channels in cancer. Biochim.Biophys.Acta
1772, 937-946.
171

PUCK,T.T., CIECIURA,S.J., and FISHER,H.W. (1957) Clonal growth in vitro of human cells with
fibroblastic morphology; comparison of growth and genetic characteristics of single epithelioid and
fibroblast-like cells from a variety of human organs J. Exp. Med., 106, 145-158.
Q
Qu, Z. & Hartzell, C. (2004). Determinants of anion permeation in the second transmembrane
domain of the mouse bestrophin-2 chloride channel. J.Gen.Physiol 124, 371-382.
Qu,Z., Wei,R.W., Mann,W., Hartzell,H.C. (2003). Two bestrophins cloned from Xenopus
laevis oocytes express Ca(2+)-activated Cl(-) currents. J.Biol.Chem. 278, 49563-49572.
Qu, Z. & Hartzell, H. C. (2001). Functional geometry of the permeation pathway of Ca2+activated
Cl-channels inferred from analysis of voltage-dependent block. J.Biol.Chem. 276,
18423-18429.
Qu, Z. & Hartzell, H. C. (2000). Anion permeation in Ca(2+)-activated Cl(-) channels.
J.Gen.Physiol 116, 825-844.
Quinton, P. M. (1983). Chloride impermeability in cystic fibrosis. Nature 301, 421-422.
R
Reddy, M. M. & Quinton, P. M. (1999). Bumetanide blocks CFTR GCl in the native sweat
duct. Am.J.Physiol 276, C231-C237.
Riordan, J. R. (1993). The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.
Annu.Rev.Physiol 55, 609-630.
Riordan, J. R., Rommens, J. M., Kerem, B., Alon, N., Rozmahel, R., Grzelczak, Z., Zielenski,
J., Lok, S., Plavsic, N., Chou, J. L., & . (1989). Identification of the cystic fibrosis gene:
cloning and characterization of complementary DNA. Science 245, 1066-1073.
Robert, R., Carlile, G. W., Liao, J., Balghi, H., Lesimple, P., Liu, N., Kus, B., Rotin, D.,
Wilke, M., De Jonge, H. R., Scholte, B. J., Thomas, D. Y., & Hanrahan, J. W. (2010).
Correction of the Delta phe508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
trafficking defect by the bioavailable compound glafenine. Mol.Pharmacol. 77, 922-930.
Robert, R., Carlile, G. W., Pavel, C., Liu, N., Anjos, S. M., Liao, J., Luo, Y., Zhang, D.,
Thomas, D. Y., & Hanrahan, J. W. (2008). Structural analog of sildenafil identified as a novel
corrector of the F508del-CFTR trafficking defect. Mol.Pharmacol. 73, 478-489.
Robinson, N. C., Huang, P., Kaetzel, M. A., Lamb, F. S., & Nelson, D. J. (2004).
Identification of an N-terminal amino acid of the CLC-3 chloride channel critical in
phosphorylation-dependent activation of a CaMKII-activated chloride current. J.Physiol 556,
353-368.
172

Rommens, J. M., Iannuzzi, M. C., Kerem, B., Drumm, M. L., Melmer, G., Dean, M.,
Rozmahel, R., Cole, J. L., Kennedy, D., Hidaka, N., & . (1989). Identification of the cystic
fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science 245, 1059-1065.
Routaboul, C., Norez, C., Melin, P., Molina, M. C., Boucherle, B., Bossard, F., Noel, S.,
Robert, R., Gauthier, C., Becq, F., & Decout, J. L. (2007). Discovery of alphaaminoazaheterocycle-methylglyoxal
adducts as a new class of high-affinity inhibitors of
cystic fibrosis transmembrane conductance regulator chloride channels.
J.Pharmacol.Exp.Ther. 322, 1023-1035.
Routaboul,C., Dumas,L., Gautier-Luneau,I., Vergne,J., Maurel,M.C., & Decout,J.L. (2002).
New stereoselective reaction of methylglyoxal with 2-aminopyridine and adenine derivatives:
formation of imino acid-nucleic base derivatives in water under mild conditions.
Chem.Commun. 10, 1114-1115.
Rowe, S. M., Pyle, L. C., Jurkevante, A., Varga, K., Collawn, J., Sloane, P. A., Woodworth,
B., Mazur, M., Fulton, J., Fan, L., Li, Y., Fortenberry, J., Sorscher, E. J., & Clancy, J. P.
(2010). DeltaF508 CFTR processing correction and activity in polarized airway and nonairway
cell monolayers. Pulm.Pharmacol.Ther.
Rowell,J., Koitabashi,N., & Kass,D.A. (2010). TRP-ing up Heart and Vessels: Canonical
Transient Receptor Potential Channels and Cardiovascular Disease. J. Cardiovasc. Transl.
Res. 3, 516-524.
Rubenstein, R. C., Egan, M. E., & Zeitlin, P. L. (1997). In vitro pharmacologic restoration of
CFTR-mediated chloride transport with sodium 4-phenylbutyrate in cystic fibrosis epithelial
cells containing delta F508-CFTR. J.Clin.Invest 100, 2457-2465.
Rudolf, M. T., Dinkel, C., Traynor-Kaplan, A. E., & Schultz, C. (2003). Antagonists of myoinositol
3,4,5,6-tetrakisphosphate allow repeated epithelial chloride secretion.
Bioorg.Med.Chem. 11, 3315-3329.
S
Sato, K. & Sato, F. (1984). Defective beta adrenergic response of cystic fibrosis sweat glands
in vivo and in vitro. J.Clin.Invest 73, 1763-1771.
Saurin, W., Hofnung, M., & Dassa, E. (1999). Getting in or out: early segregation between
importers and exporters in the evolution of ATP-binding cassette (ABC) transporters.
J.Mol.Evol. 48, 22-41.
Schreiber, R., Uliyakina, I., Kongsuphol, P., Warth, R., Mirza, M., Martins, J. R., &
Kunzelmann, K. (2010). Expression and function of epithelial anoctamins. J.Biol.Chem. 285,
7838-7845.
Schroeder, B. C., Cheng, T., Jan, Y. N., & Jan, L. Y. (2008). Expression cloning of
TMEM16A as a calcium-activated chloride channel subunit. Cell 134, 1019-1029.
173

Schultz, B. D., Singh, A. K., Devor, D. C., & Bridges, R. J. (1999). Pharmacology of CFTR
chloride channel activity. Physiol Rev. 79, S109-S144.
Schultz, B. D., DeRoos, A. D., Venglarik, C. J., Singh, A. K., Frizzell, R. A., & Bridges, R. J.
(1996). Glibenclamide blockade of CFTR chloride channels. Am.J.Physiol 271, L192-L200.
Schwiebert,E.M., Benos,D.J., Egan,M.E., Stutts,M.J., and Guggino,W.B. (1999) CFTR is a
conductance regulator as well as a chloride channel Physiol Rev., 79, S145-S166.
Schwiebert, E. M., Morales, M. M., Devidas, S., Egan, M. E., & Guggino, W. B. (1998).
Chloride channel and chloride conductance regulator domains of CFTR, the cystic fibrosis
transmembrane conductance regulator. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 95, 2674-2679.
Seibert, F. S., Jia, Y., Mathews, C. J., Hanrahan, J. W., Riordan, J. R., Loo, T. W., & Clarke,
D. M. (1997). Disease-associated mutations in cytoplasmic loops 1 and 2 of cystic fibrosis
transmembrane conductance regulator impede processing or opening of the channel.
Biochemistry 36, 11966-11974.
Sermet-Gaudelus, I., De Boeck, K., Casimir, G. J., Vermeulen, F., Leal, T., Mogenet, A.,
Roussel, D., Fritsch, J., Hanssens, L., Hirawat, S., Miller, N. L., Constantine, S., Reha, A.,
Ajayi, T., Elfring, G. L., & Miller, L. L. (2010). Ataluren (PTC124) Induces CFTR Protein
Expression and Activity in Children with Nonsense Mutation Cystic Fibrosis.
Am.J.Respir.Crit Care Med.
Serohijos, A. W., Hegedus, T., Aleksandrov, A. A., He, L., Cui, L., Dokholyan, N. V., &
Riordan, J. R. (2008). Phenylalanine-508 mediates a cytoplasmic-membrane domain contact
in the CFTR 3D structure crucial to assembly and channel function. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A
105, 3256-3261.
Sheppard, D. N. & Welsh, M. J. (1999). Structure and function of the CFTR chloride channel.
Physiol Rev. 79, S23-S45.
Sheppard, D. N., Rich, D. P., Ostedgaard, L. S., Gregory, R. J., Smith, A. E., & Welsh, M. J.
(1993). Mutations in CFTR associated with mild-disease-form Cl- channels with altered pore
properties. Nature 362, 160-164.
Sheppard, D. N. & Welsh, M. J. (1992). Effect of ATP-sensitive K+ channel regulators on
cystic fibrosis transmembrane conductance regulator chloride currents. J.Gen.Physiol 100,
573-591.
Smith, S. N., Middleton, P. G., Chadwick, S., Jaffe, A., Bush, K. A., Rolleston, S., Farley, R.,
Delaney, S. J., Wainwright, B., Geddes, D. M., & Alton, E. W. (1999). The in vivo effects of
milrinone on the airways of cystic fibrosis mice and human subjects. Am.J.Respir.Cell
Mol.Biol. 20, 129-134.
Snouwaert, J. N., Brigman, K. K., Latour, A. M., Malouf, N. N., Boucher, R. C., Smithies, O.,
& Koller, B. H. (1992). An animal model for cystic fibrosis made by gene targeting. Science
257, 1083-1088.
174

Sousa, M., Ousingsawat, J., Seitz, R., Puntheeranurak, S., Regalado, A., Schmidt, A., Grego,
T., Jansakul, C., Amaral, M. D., Schreiber, R., & Kunzelmann, K. (2007). An extract from the
medicinal plant Phyllanthus acidus and its isolated compounds induce airway chloride
secretion: A potential treatment for cystic fibrosis. Mol.Pharmacol. 71, 366-376.
Stratford,F.L., Pereira,M.M., Becq,F., McPherson,M.A., Dormer,R.L. (2003).
Benzo(c)quinolizinium drugs inhibit degradation of Delta F508-CFTR cytoplasmic domain.
Biochem.Biophys.Res.Commun. 300, 524-530.
Sun, H., Tsunenari, T., Yau, K. W., & Nathans, J. (2002). The vitelliform macular dystrophy
protein defines a new family of chloride channels. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 99, 4008-4013.
Szkotak,A.J., Murthy,M., MacVinish,L.J., Duszyk,M., & Cuthbert,A.W. (2004). 4-Chlorobenzo[F]isoquinoline
(CBIQ) activates CFTR chloride channels and KCNN4 potassium
channels in Calu-3 human airway epithelial cells. Br.J.Pharmacol. 142, 531-542.
T
Tabcharani, J. A., Chang, X. B., Riordan, J. R., & Hanrahan, J. W. (1992). The cystic fibrosis
transmembrane conductance regulator chloride channel. Iodide block and permeation.
Biophys.J. 62, 1-4.
Tabcharani, J. A., Chang, X. B., Riordan, J. R., & Hanrahan, J. W. (1991). Phosphorylationregulated
Cl- channel in CHO cells stably expressing the cystic fibrosis gene. Nature 352,
628-631.
Takatsuka, S., Morita, T., Horikiri, Y., Yamahara, H., & Saji, H. (2008). Influence of various
combinations of mucolytic agent and non-ionic surfactant on intestinal absorption of poorly
absorbed hydrophilic compounds. Int.J.Pharm. 349, 94-100.
Takatsuka, S., Kitazawa, T., Morita, T., Horikiri, Y., & Yoshino, H. (2006a). Enhancement of
intestinal absorption of poorly absorbed hydrophilic compounds by simultaneous use of
mucolytic agent and non-ionic surfactant. Eur.J.Pharm.Biopharm. 62, 52-58.
Takatsuka, S., Morita, T., Koguchi, A., Horikiri, Y., Yamahara, H., & Yoshino, H. (2006b).
Synergistic absorption enhancement of salmon calcitonin and reversible mucosal injury by
applying a mucolytic agent and a non-ionic surfactant. Int.J.Pharm. 316, 124-130.
Tarran, R., Loewen, M. E., Paradiso, A. M., Olsen, J. C., Gray, M. A., Argent, B. E., Boucher,
R. C., & Gabriel, S. E. (2002). Regulation of murine airway surface liquid volume by CFTR
and Ca2+-activated Cl- conductances. J.Gen.Physiol 120, 407-418.
Taylor, C. J., Hardcastle, J., & Southern, K. W. (2009). Physiological measurements
confirming the diagnosis of cystic fibrosis: the sweat test and measurements of transepithelial
potential difference. Paediatr.Respir.Rev. 10, 220-226.
175

Tradtrantip, L., Sonawane, N. D., Namkung, W., & Verkman, A. S. (2009). Nanomolar
potency pyrimido-pyrrolo-quinoxalinedione CFTR inhibitor reduces cyst size in a polycystic
kidney disease model. J.Med.Chem. 52, 6447-6455.
Tribouillard-Tanvier, D., Beringue, V., Desban, N., Gug, F., Bach, S., Voisset, C., Galons, H.,
Laude, H., Vilette, D., & Blondel, M. (2008). Antihypertensive drug guanabenz is active in
vivo against both yeast and mammalian prions. PLoS.One. 3, e1981.
Tsutsumi, S., Kamata, N., Vokes, T. J., Maruoka, Y., Nakakuki, K., Enomoto, S., Omura, K.,
Amagasa, T., Nagayama, M., Saito-Ohara, F., Inazawa, J., Moritani, M., Yamaoka, T., Inoue,
H., & Itakura, M. (2004). The novel gene encoding a putative transmembrane protein is
mutated in gnathodiaphyseal dysplasia (GDD). Am.J.Hum.Genet. 74, 1255-1261.
V
Van Doorninck, J. H., French, P. J., Verbeek, E., Peters, R. H., Morreau, H., Bijman, J., &
Scholte, B. J. (1995). A mouse model for the cystic fibrosis delta F508 mutation. EMBO J. 14,
4403-4411.
Van Goor, F., Straley, K. S., Cao, D., Gonzalez, J., Hadida, S., Hazlewood, A., Joubran, J.,
Knapp, T., Makings, L. R., Miller, M., Neuberger, T., Olson, E., Panchenko, V., Rader, J.,
Singh, A., Stack, J. H., Tung, R., Grootenhuis, P. D., & Negulescu, P. (2006). Rescue of
DeltaF508-CFTR trafficking and gating in human cystic fibrosis airway primary cultures by
small molecules. Am.J.Physiol Lung Cell Mol.Physiol 290, L1117-L1130.
Verkman, A. S. & Galietta, L. J. (2009). Chloride channels as drug targets. Nat.Rev.Drug
Discov. 8, 153-171.
Vij, N., Fang, S., & Zeitlin, P. L. (2006). Selective inhibition of endoplasmic reticulumassociated
degradation rescues DeltaF508-cystic fibrosis transmembrane regulator and
suppresses interleukin-8 levels: therapeutic implications. J.Biol.Chem. 281, 17369-17378.
W
Walker, J. E., Saraste, M., Runswick, M. J., & Gay, N. J. (1982). Distantly related sequences
in the alpha- and beta-subunits of ATP synthase, myosin, kinases and other ATP-requiring
enzymes and a common nucleotide binding fold. EMBO J. 1, 945-951.
Wang,W., Bernard,K., Li,G., & Kirk,K.L. (2007). Curcumin opens cystic fibrosis
transmembrane conductance regulator channels by a novel mechanism that requires neither
ATP binding nor dimerization of the nucleotide-binding domains. J.Biol.Chem. 282, 4533-
4544.
Wang, W., Li, G., Clancy, J. P., & Kirk, K. L. (2005). Activating cystic fibrosis
transmembrane conductance regulator channels with pore blocker analogs. J.Biol.Chem. 280,
23622-23630.
176

Wang,F., Zeltwanger,S., Hu,S., & Hwang,T.C. (2000). Deletion of phenylalanine 508 causes
attenuated phosphorylation-dependent activation of CFTR chloride channels. J.Physiol 524 Pt
3, 637-648.
Wangemann, P., Wittner, M., Di Stefano, A., Englert, H. C., Lang, H. J., Schlatter, E., &
Greger, R. (1986). Cl(-)-channel blockers in the thick ascending limb of the loop of Henle.
Structure activity relationship. Pflugers Arch. 407 Suppl 2, S128-S141.
Warth,R., Hamm,K., Bleich,M.; Kunzelmann,K., von Hahn,T., Schreiber,R., Ullrich,E.,
Mengel,M., Trautmann,N., Kindle,P., Schwab,A., & Greger,R. (1999). Molecular and
functional characterization of the small Ca(2+)-regulated K+ channel (rSK4) of colonic crypts
Pflugers Arch. 438, 437-444.
Wei, L., Vankeerberghen, A., Cuppens, H., Cassiman, J. J., Droogmans, G., & Nilius, B.
(2001). The C-terminal part of the R-domain, but not the PDZ binding motif, of CFTR is
involved in interaction with Ca(2+)-activated Cl- channels. Pflugers Arch. 442, 280-285.
Weiss, D. J. & Pilewski, J. M. (2003). The status of gene therapy for cystic fibrosis.
Semin.Respir.Crit Care Med. 24, 749-770.
Welsh, D. G., Morielli, A. D., Nelson, M. T., & Brayden, J. E. (2002). Transient receptor
potential channels regulate myogenic tone of resistance arteries. Circ.Res. 90, 248-250.
Welsh, M. J. & Smith, A. E. (1993). Molecular mechanisms of CFTR chloride channel
dysfunction in cystic fibrosis. Cell 73, 1251-1254.
Wes, P. D., Chevesich, J., Jeromin, A., Rosenberg, C., Stetten, G., & Montell, C. (1995).
TRPC1, a human homolog of a Drosophila store-operated channel. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A
92, 9652-9656.
White, M. M. & Aylwin, M. (1990). Niflumic and flufenamic acids are potent reversible
blockers of Ca2(+)-activated Cl- channels in Xenopus oocytes. Mol.Pharmacol. 37, 720-724.
Wigley, W. C., Vijayakumar, S., Jones, J. D., Slaughter, C., & Thomas, P. J. (1998).
Transmembrane domain of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator: design,
characterization, and secondary structure of synthetic peptides m1-m6. Biochemistry 37, 844-
853.
Wilschanski, M., Yahav, Y., Yaacov, Y., Blau, H., Bentur, L., Rivlin, J., Aviram, M., Bdolah-
Abram, T., Bebok, Z., Shushi, L., Kerem, B., & Kerem, E. (2003). Gentamicin-induced
correction of CFTR function in patients with cystic fibrosis and CFTR stop mutations.
N.Engl.J.Med. 349, 1433-1441.
Winn,M.P., Conlon,P.J., Lynn,K.L., Farrington,M.K., Creazzo,T., Hawkins,A.F.,
Daskalakis,N., Kwan,S.Y., Ebersviller,S., Burchette,J.L., Pericak-Vance,M.A., Howell,D.N.,
Vance,J.M., & Rosenberg,P.B. (2005). A mutation in the TRPC6 cation channel causes
familial focal segmental glomerulosclerosis. Science 308, 1801-1804.
Worley,P.F., Zeng,W., Huang,G.N., Yuan,J.P., Kim,J.Y., Lee,M.G., & Muallem,S. (2007).
TRPC channels as STIM1-regulated store-operated channels. Cell Calcium 42, 205-211.
177

X
Xie,W., Solomons,K.R., Freeman,S., Kaetzel,M.A., Bruzik,K.S., Nelson,D.J., Shears,S.B.
(1998). Regulation of Ca 2+ -dependent Cl - conductance in a human colonic epithelial cell line
(T84): cross-talk between Ins(3,4,5,6)P4 and protein phosphatases. J Physiol 510, 661-673.
Xie,W.; Kaetzel,M.A.; Bruzik,K.S.; Dedman,J.R.; Shears,S.B.; Nelson,D.J. (1996). Inositol
3,4,5,6-tetrakisphosphate inhibits the calmodulin-dependent protein kinase II-activated
chloride conductance in T84 colonic epithelial cells. J.Biol.Chem. 271, 14092-14097.
Y
Yang, Y. D., Cho, H., Koo, J. Y., Tak, M. H., Cho, Y., Shim, W. S., Park, S. P., Lee, J., Lee,
B., Kim, B. M., Raouf, R., Shin, Y. K., & Oh, U. (2008). TMEM16A confers receptoractivated
calcium-dependent chloride conductance. Nature 455, 1210-1215.
Ye, L., Knapp, J. M., Sangwung, P., Fettinger, J. C., Verkman, A. S., & Kurth, M. J. (2010).
Pyrazolylthiazole as DeltaF508-cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
correctors with improved hydrophilicity compared to bithiazoles. J.Med.Chem. 53, 3772-
3781.
Young, A., Gentzsch, M., Abban, C. Y., Jia, Y., Meneses, P. I., Bridges, R. J., & Bradbury, N.
A. (2009). Dynasore inhibits removal of wild-type and DeltaF508 cystic fibrosis
transmembrane conductance regulator (CFTR) from the plasma membrane. Biochem.J. 421,
377-385.
Yu, K., Xiao, Q., Cui, G., Lee, A., & Hartzell, H. C. (2008). The best disease-linked Cl-
channel hBest1 regulates Ca V 1 (L-type) Ca2+ channels via src-homology-binding domains.
J.Neurosci. 28, 5660-5670.
Yurko-Mauro, K. A. & Reenstra, W. W. (1998). Prostaglandin F2alpha stimulates CFTR
activity by PKA- and PKC-dependent phosphorylation. Am.J.Physiol 275, C653-C660.
Z
Zeitlin, P. L., Boyle, M. P., Guggino, W. B., & Molina, L. (2004). A phase I trial of intranasal
Moli1901 for cystic fibrosis. Chest 125, 143-149.
Zhang,Q.; He,J.; Lu,W.; Yin,W.; Yang,H.; Xu,X.; Wang,D. (2010) [Expression of transient
receptor potential canonical channel proteins in human non-small cell lung cancer]. Zhongguo
13, 612-616.
178

LISTE DES PUBLICATIONS
Identification of a novel water soluble activator of wild-type and F508del CFTR: GPact-
11a.
J Bertrand, B Boucherle, A Billet, P Melin, L Dannhoffer, C Vandebrouck, C Jayle, C
Routaboul, M Molina, J Décout, F Becq and C Norez. Eur Respir J. 36, 311-322. 2010 Jan
28. DOI : 10.1183/09031936.00122509.
TRPC6 links Ca 2+ mishandling to CFTR channel dysfunction in cystic fibrosis.
F Antigny, C Norez, L Dannhoffer, J Bertrand, D Raveau, P Corbi, C Jayle, F Becq, and C
Vandebrouck. Am J Respir Cell Mol Bio. 2010 Marsh 4. DOI :10.1165/rcmb.2009-0347OC.
179

Présentations orales:
LISTE DES COMMUNICATIONS
- Identification of TRPC6 as a novel potential target to activate CaCC in human CF
airway epithelial cells.
The 33 rd European Cystic Fibrosis Conference, 16-19 June 2010, Valencia, France.
Résumé publié : Journal of Cystic Fibrosis (volume 9, Juin 2010) S16
- Pharmacological activation of Ca 2+ -dependent Cl - channels in human and mouse
epithelial cells.
5 ème congrès de Physiologie, Pharmacologie et thérapeutique, 23-25 Marsh 2010, Bordeaux,
France.
Résumé publié : Fundamental and Clinical Pharmacology (volume 24, Avril 2010) 8 et 348
- Pharmacological characterization of a novel water-soluble activator of F508del-CFTR.
The 32 nd European Cystic Fibrosis Conference, 10-13 June 2009, Brest, France.
Résumé publié : Journal of Cystic Fibrosis (volume 8, Juin 2009) S25
Résumé récompensé par le prix du jeune chercheur.
- GPact-11a: new CFTR activator.
2 nd European CF Young Investigator Meeting, 27-29 August 2008, Lille, France.
Présentations poster:
- Identification of TRPC6 as a novel potential target to activate CaCC in human CF
airway epithelial cells.
The 33 rd European Cystic Fibrosis Conference, 16-19 June 2010, Valencia, France.
Résumé publié : Journal of Cystic Fibrosis (volume 9, Juin 2010) S16
- Evaluation of a novel activator of Ca 2+ -dependent Cl - channel in Cystic Fibrosis and
knock-out models : guanabenz
The 23 nd annual North American Cystic Fibrosis Conference, 15-17 October 2009,
Minneapolis, USA.
Résumé publié : Pediatric Pulmonology (2009) 261
- Pharmacological characterization of a novel water-soluble activator of F508del-CFTR.
The 32 nd European Cystic Fibrosis Conference, 10-13 June 2009, Brest, France.
180

Résumé publié : Journal of Cystic Fibrosis (volume 8, Juin 2009) S25
Résumé récompensé par le prix du jeune chercheur.
- Evaluation des effets ex vivo et in vivo d’un nouvel activateur du courant chlorure
Ca 2+ -dépendant : le guanabenz
10 ème Colloque des Jeunes chercheurs en mucoviscidose, 16 Marsh 2009, Paris, France.
- In vivo evaluation and mechanism of action of a new CFTR activator: GPact-11a.
The 22 nd annual North American Cystic Fibrosis Conference, 23-25 October 2008, Orlando,
USA.
Résumé publié : Pediatric Pulmonology (2008)58
- GPact-11a: new CFTR activator.
2 nd European CF Young Investigator Meeting, 27-29 August 2008, Lille, France.
- Découverte d’un nouvel activateur sélectif de CFTR : le GPact-11a.
9 ème Colloque des Jeunes chercheurs en mucoviscidose, 21 Marsh 2008, Paris, France.
181

Johanna BERTRAND
Née le 12/08/1984 à Niort (79)
Adresse personnelle : Adresse professionnelle :
Résidence Compostelle Institut de Physiologie et de Biologie Cellulaire
8 boulevard Marat CNRS UMR 6187, PBS
Appt D 135 Pôle Biologie Santé Université de Poitiers
86000 Poitiers, France 1, rue Georges Bonnet
86022 Poitiers Cedex
Tel: 06 88 09 19 86 Tél: 05 49 45 39 31
Couriel: johanna.bertrand@etu.univ-poitiers.fr
FORMATION
2007 : MASTER Science Biologiques et Médicales Université NANTES
Option biologie, biotechnologies et recherche thérapeutique.
2005 : LICENCE Biologie Biochimie Université NANTES
Option biologie cellulaire et physiologie animale.
2004 : DEUG Science de la vie Université LA ROCHELLE
ACTIVITE DE RECHERCHE
Depuis Septembre 2007 : Doctorat
Projet : Thérapie pharmacologique de la mucoviscidose.
Co-direction scientifique : Pr Fréderic Becq et Dr Caroline Norez.
Institut de Physiologie et de Biologie Cellulaires, UMR CNRS 6187, Université de Poitiers, France.
Avril 2006 - Juin 2007 : Stage MASTER
Projet : Thérapie pharmacologique de la dystrophie musculaire de Duchenne.
Direction scientifique : Dr Corinne Huchet-Cadiou.
UMR CNRS 6204, Université de NANTES, France.
Mai - Juin 2005 : Stage LICENCE
Projet : Etude des propriétés des protéines contractiles.
Direction scientifique : Dr Corinne Huchet-Cadiou.
UMR CNRS 6204, Université de NANTES, France.
DOMAINES DE COMPETENCES
Techniques:
Techniques de biochimie et biologie moléculaire :
182

Transfection de siRNA, RT-PCR, Immunoprécipitation et Western-Blotting.
Techniques de biologie cellulaire :
Culture cellulaire.
Techniques de physiologie cellulaire :
Mesure de calcium (Fluo-4), mesure de potentiel membranaire (Oxonol) et mesure de courant
transepitheliaux sur cellules polarisées en chambre de Ussing.
Techniques de physiologie animale :
Mesure de sécrétion salivaire sur la souris et le rat, mesure de courant transepitheliaux sur organes
isolés en chambre de Ussing, prélèvement et microdissection manuelle de cellules musculaires
squelettiques (souris), mesure de contraction musculaire (fibres perméabilisées, muscle isolé) et tests
de motricité sur la souris (Grip strength - Wire test - Rotarod test- Déplacement -Curiosité).
Manipulation et Expérimentation sur animaux de laboratoire :
Dissection et manipulation de souris, prélèvement sanguin, gavage et gestion de l’élevage de souris
(entretien et reproduction).
Informatique :
Photoshop, confocal assitant, Acquire et analyse, Origin, GraphPrism et logiciels courants sous
windows.
Langues étrangères:
Anglais : lu parlé écrit notion
Espagnol : lu parlé notion
RESPONSABILITES COLLECTIVES
2008-2010 : Trésorière de l’Association des Doctorants en Biologie et Environnement de Poitiers
2008-2009 : Membre du comité de rédaction de la gazette de l’Institut de Physiologie de Biologie
Cellulaire.
FONCTION D’ENCADREMENT
2009 : Encadrement d’un étudiant en troisième année de licence Physiologie Animal et Neuroscience.
Stage de 6 semaines « Mesure de l’effet in vivo du GPact-11a sur le rat par la technique de sécrétion
salivaire ».
183

ACTIVITES D’ENSEIGNEMENT
2010-2011 8 h de travaux pratiques de physiologie (Licence 3)
2009-2010 18 h de cours magistraux de biologie cellulaire (Licence 3)
28 h de travaux pratiques de physiologie (Master 1)
8 h de travaux pratiques de physiologie (Licence 3)
2008-2009 6 h de travaux dirigés de biologie cellulaire (Licence 2)
PRIX
12 h de travaux pratiques de physiologie (Licence 2)
Prix du jeune chercheur à la 32 ième « European Cystic Fibrosis Conference » du 10 au 13 Juin 2009,
Brest, France.
184

Titre : Approches pharmacologiques de CFTR et de CaCC dans la mucoviscidose
Résumé
La mucoviscidose résulte de la mutation du gène codant pour la protéine CFTR
(Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) induisant un défaut de sécrétion des
ions chlorure à la membrane apicale des épithéliums respiratoires, digestifs et reproducteurs.
L’objectif de ce travail était de caractériser des molécules capables de restaurer une
sécrétion chlorure dans des modèles mucoviscidosiques in vitro, ex vivo et in vivo. Dans un
premier temps, nous avons identifié deux composés de la famille des adduits méthylglyoxalalpha-aminoazahétérocycle
(ie le GPact-11a et le GPact-26a) comme activateurs non-toxiques
et hydrosolubles des CFTR sauvages et F508del. Dans une seconde partie de l’étude, nous
avons identifié un nouvel activateur des canaux TRPC6 : le guanabenz. Nous avons mis en
évidence que le guanabenz induit l’activation des canaux chlorures calcium-dépendant
(CaCC) via une entrée de calcium extracellulaire par le canal TRPC6.
La restauration de la sécrétion chlorure grâce à l’activation du F508del-CFTR ou du
CaCC représente une approche pharmacologique efficace et mesurable pour le traitement de
la mucoviscidose. De plus, l’identification d’une nouvelle voie d’activation du CaCC via
TRPC6 représente une avancée scientifique pouvant se répercuter sur d’autres pathologies.
Mots clés : Pharmacologie, CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator),
CaCC (Calcium Activated Chloride Channel), mucoviscidose, souris transgéniques.
Summary
Cystic Fibrosis (CF) is a genetic disorder characterized by mutations on the CFTR
(Cystic Fibrosis Tran membrane conductance Regulator) protein resulting in a failure of
CFTR dependent chloride conductance in epithelial cells.
The aim of this work was focused on identifying compounds able to restore chloride
secretion in Cystic Fibrosis model using in vitro, ex vivo and in vivo techniques. Firstly, we
identified two methylglyoxal-alpha-aminoazaheterocycle adducts (GPact-11a and GPact-26a)
as new water-soluble and non-toxic wt- and F508del-CFTR activators. In a second part of this
study, we identified guanabenz as a new TRPC6 channel activator. We demonstrated that
guanabenz activates CaCC by an entry of extracellular calcium through TRPC6 channel.
Restoration of chloride secretion by the activation of F508del-CFTR or CaCC
represents an effective and measurable pharmacological approach for Cystic Fibrosis
treatments. Furthermore, identification of TRPC6 as a new target to activate CACC represents
a scientific breakthrough with several therapeutic applications.
Keywords: Pharmacology, CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator),
CaCC (Calcium Activated Chloride Channel), Cystic Fibrosis, transgenic mice.
Travaux réalisés au sein de l’Institut de Physiologie et Biologie Cellulaires,
CNRS, UMR 6187,
1, rue Georges Bonnet, 86022 POITIERS cedex
185