P10607119-8 A2 - Questel

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147 pPJV7590 que é um derivado de pPJV7389 que inclui um sítio de clonagem múltiplo (MCS) imediatamente a montante do promotor de CMV. pPJV7572 que é um derivado de pPJV7389 que contêm a 5 seqüência codificadora para o peptídeo de sinal da lisozima de galinha (CLSP) diretamente a montante do antígeno codificado. Isto possibilita a secreção extracelular de antígenos fundidos no terminal C. (i) Construção de pPJV7785 (Plasmídeo Aceitador LTA) pPJV7563 foi cortado com Sal 1 , com extremidade abrupta e 10 cortado com Nde 1 para criar um fragmento de vetor. pPJV7590 foi cortado com Sphl, com extremidade abrupta, e cortado com Ndel para criar um fragmento de inserto contendo um MCS e as cinco extremidades de iniciador do promotor de CMV. Estes fragmentos foram ligados para gerar pPJV7592. pPJV7592 foi cortado com Nco 1 e Bg12 para criar um 15 fragmento de vetor. pPJV7572 foi cortado com Ncol e Nhel para criar um fragmento de inserto contendo a extremidade 3' do promotor de CMV, as regiões não traduzidas 5', e o CLSP. pPJV2004 foi cortado com Nhe 1 e BamHl para criar um fragmento de inserto contendo a subunidade LTA. Estes fragmentos foram ligados para gerar o plasmídeo pPJV7785. 20 (ii) Construção de pPJV7787 (Plasmídeo Doador LTB) pPJV7389 foi cortado com Ncol e EcoR1 para criar um fragmento de vetor. pPJV7572 foi cortado com Nco 11 e Nhe 1 para criar um fragmento de inserto contendo a extremidade 3' do promotor de CMV, a região não traduzida 5', e o CLSP. pPJV2005 foi cortado com Nhel e BamH1 25 para criar um fragmento de inserto contendo a subunidade LTB. pPJV7586 foi cortado com Bg12 e EcoR1 para criar um fragmento de inserto contendo a região de poliadenilação de beta-globina de coelho. Estes fragmentos foram ligados para gerar pPJV7787. (iii) Construção de pPJV7788
148 pPJV7785 foi cortado com Xho 1 e Mfe 1 para criar um fragmento de vetor contendo o cassete de expressão LTA. pPJV7787 foi cortado com Xho 1 e EcoR1 para criar um fragmento de inserto contendo o cassete de expressão LTB. Estes fragmentos foram ligados para gerar 5 pPJV7788 que expressará as subunidades LTA e LTB quando introduzidas em células de mamífero. na construção pPJV7788. A Tabela 8 abaixo fornece a localização dos vários elementos Tabela 8: Componente ID para pPJV7788 Números de Base Componente 1-44 Tn903, remanescentes de pUC4K 45-860 KanR (Tn903) 861-983 Tn903, remanescentes de pUC4K 984 —1001 pUC19 MCS 1002 -1686 CMV Pro 1687-1817 Exon 1/2 de CMV 1818-1823 fusão Bam/Bgl 1824-1956 Intron A da insulina de rato 1857-1962 sítio BamHl 1963-2083 UTR 5' de HBV pre-S2 2084-2143 Lisozima SP 2144-2149 Sítio Nhel 2150-2462 LTB 2463-2593 RBGpA 2594-2623 Sítio de Clonagem Múltipla 2624-3308 CMV Pro 3309-3439 Exon 1/2 de CMV 3440-3445 fusão Bam/Bgl 3446-3578 Ins IntA de Rato
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sítio poliA região rB-glob Pa 21/
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