P10607119-8 A2 - Questel

C11 C12
R1 21 23
R2 45 47
R3 69 71
R4 24 26
R5 48 50
R6 72 2
Ensaios de ELISPOT
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Os ensaios de ELISPOT IFN-y foram realizadas em
esplenócitos frescos e as células de linfonodo como anteriormente descrito
exceto os antígenos para a estimulação foram peptídeos únicos ou reuniões de
5 peptídeo como definido para cada experimento na seção resultados. Em
alguns exemplos, antes do ensaio ELISPOT, as populações de célula T foram
esgotadas pelas pérolas magnéticas (Dynal) que seguem as instruções do
fabricante.
Ensaios de série de pérola citométrica (CBA)
10 Esplenócitos frescos foram coletados duas semanas a seguir da
segunda imunização e recolocados em suspensão a 1 x 10 7 células por ml em
SM (meio RPMI + 10% de soro bovino fetal suplementado com MEM
piruvato de sódio, aminoácidos não essenciais e 2-mercaptoetanol (Invitrogen,
Carlsbad, CA)). As amostras de célula foram plaqueadas a 1 x 10 6 células
15 (100 1_11) por reservatório em placas de fundo chato de 96 reservatórios. Os
esplenócitos foram tratados com alíquotas de 100 vil do peptídeo ICP27 em
SM ou apenas meio. A concentração de peptídeo final foi de 10 -8 M. Os
esplenócitos de controle de animais ingênuos foram também plaqueados com
e sem peptídeo e com e sem Con-A (concentração final de 2,5 mg/ml) para
20 servir como controles negativo e positivo, respectivamente.
As placas foram incubadas a 37° C por 48 horas e depois 160
gl de cada amostra foram coletados e armazenados a -20° C até ensaiados
usando o kit BD Cytometric Bead Array (CBA) Mouse Thl/Th2 (BD
Biosciences, San Jose, CA (cat. #551287)). Em resumo, este kit usa 5