P10607119-8 A2 - Questel

43
Tipicamente uma seqüência de intron funcional, por exemplo
uma variante funcional (ii) ou um fragmento funcional (iii) é uma que tenha
substancialmente a mesma atividade como, e/ou complemente a atividade de
um intron natural (i). Em uma forma de realização a atividade é a atividade de
união.
As seqüências de intron (c) podem ser testadas quanto a
atividade de união usando um ensaio de união de rotina. No geral um
homólogo funcional (ii) ou fragmento funcional (iii) mostrarão pelo menos
50%, por exemplo 60%, 70%, 80%, 90% e até 100% ou mais da eficiência de
10 união do intron natural (i) no ensaio.
No geral a seqüência heteróloga do intron, quando presente na
construção da invenção, realçará a expressão. Tipicamente, uma intron
variante (ii) ou fragmento (iii) causará realce comparável a um intron natural
(i). Em alguns casos, uma diminuição na expressão seria observada incluindo
15 qualquer um dos níveis aqui mencionados.
A funcionalidade da seqüência de intron potencial (c) pode ser
testada usando o Ensaio de Expressão Comparativa abaixo. O intron
heterólogo é trocado no vetor base. No geral a seqüência heteróloga de intron
é funcional se a adição da seqüência aumenta a expressão em pelo menos um,
20 mas preferivelmente dois tipos de célula de referência em 25% ou mais,
comparado com o vetor base. Tipicamente as células de referência são células
HEK293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 ou COS de mamífero. As células SSC15
ou B16 podem ser usadas. O aumento na expressão pode ser de pelo menos
35%, 45%, 55% ou mais. O aumento pode ser qualquer um dos níveis aqui
25 mencionados. De acordo com este ensaio, uma variante funcional (i) ou
fragmento funcional (ii) de uma seqüência de intron natural (i) é tipicamente
uma que possibilite mais do que 50% da melhora na expressão obtidos pela
seqüência natural. Em casos onde uma diminuição na expressão é observada a
diminuição, por exemplo, pode ser qualquer um dos níveis aqui mencionados.