Revista Newslab Edição 160

Autores: Geraldo Picheth1; Mauren Isfer Anghebem1,2; Guilherme Fadel Picheth3; Fabiane Gomes de Moraes Rego1
ARTIGO 01
Nas medições da atividade enzimática,
controlar fatores outros diferentes da concentração
de enzima, que alteram a velocidade
de reação, é mandatório. A forma
de controlar estas variáveis é padronizar no
ensaio estas fontes de variação, a chamada
“condições de ensaio” ou de forma popular o
“protocolo” do ensaio (5). O quadro 1, apresenta
os principais fatores a serem padronizados
para a medição enzimática.
Quadro 1: Padronização dos fatores que afetam a
velocidade de reação
Obs. Características específicas das enzimas e do sistema reacional
condicionam como estes fatores são padronizados. A relevância
dos elementos apresentados está amplamente discutida
em texto de Bioquímica, Físico-Química e de Química Clínica (ou
Bioquímica Clínica).
Em termos práticos, a padronização da química
das condições de ensaio, é o que nos
oferece um reagente comercial (kit) para
determinação de uma enzima. Nos produtos
comerciais, o tampão, pH, concentração de
substrato e ativadores, em soluções estabilizadas,
caracterizam as condições adequadas
para que a velocidade de reação seja atribuída
somente a concentração de enzima na
amostra biológica. Reiterando que a temperatura
de reação deve ser definida e estável
durante toda a medição. Nas condições padronizadas
descritas, a velocidade de reação
tem relação direta com a quantidade de enzima,
portanto reflete a sua concentração na
amostra (5, 7).
A medida da velocidade de reação
Com as condições de ensaio e temperatura
padronizadas, a velocidade da reação (ou
cinética da reação) catalisada por enzima
pode ser representada didaticamente com os
elementos da figura 4 (7).
Figura 4: Principais etapas de uma reação enzimática com condições
de ensaio padronizadas.
Velocidade de reação (absorbância do indicador x tempo) de uma
reação teórica, catalisada por enzima, identificando na curva as principais
etapas da reação:
1-Lag fase (0-45 s): sem linearidade, baixa velocidade, equilíbrio
térmico e outros eventos.
2-Período linear (1-4 minutos): velocidade de reação proporcional à
concentração de enzima
3-Perda da linearidade (>4 minutos): exaustão do substrato e outros
eventos.
A primeira fase de uma reação enzimática é a
“lag fase” ou período de indução, definida como
tempo requerido para que a reação atinja uma
velocidade estável e linear. Na lag fase, ocorrem
a estabilização da temperatura de reação,
o tempo para a interação da Enzima-Substrato
(com cofatores e ativadores) e o equilíbrio das
reações auxiliares e indicadora. O tempo de
lag fase, depende do sistema reacional, e, é
muito variável para as enzimas clínicas, sendo
para algumas quase inexistente para outras se
prolonga em vários minutos. A atividade enzimática
deve ser realizada após a lag fase estar
completa (7, 8).
O “período linear”, corresponde a velocidade
de reação (consumo de substrato X tempo)
associado à quantidade de enzima, onde todos
os demais fatores que afetam a velocidade de
reação estão controlados. Por exemplo, o substrato
em excesso garante que a reação não seja
limitada por este fator. A atividade enzimática
deve ser medida no período linear, onde a velocidade
de reação depende da quantidade de
enzima presente na amostra (7).
O período perda da linearidade, tem na
“exaustão do substrato” a causa primordial,
onde a cinética de ordem zero (excesso de substrato)
deixa de ocorrer. Esta parte curva da cinética
enzimática, também pode ser decorrente
da inibição da reação pelo acúmulo do produto
(inibição por feedback negativo), a reação reversa
(as enzimas catalisam a reação em ambos
os sentidos) pode atingir uma taxa significativa
com o aumento do produto da reação, proporcionando
a perda de linearidade. Em algumas
reações enzimáticas, a limitação do espectrofotômetro
na leitura de concentrações muito elevadas
do indicador da reação, também é fator
limitante e propicia a perda da linearidade (8).
Importante: amostras com quantidade muito
elevada de enzima (amostras“hiperativas”) irão
depletar o substrato rapidamente, e a perda de
cinética de ordem zero poderá ocorrer antes do
fim do período de medida proposto na metodologia
ou mesmo, em alguns casos, a perda
da linearidade pode ocorrer na lag fase (8, 9).
Estas amostras, obrigatoriamente, necessitam
ser diluídas em solução salina (NaCl 0,9% ou
154 mmol/L. A amostra diluída deve apresentar
a fase linear, caso contrário diluições superiores
devem ser realizadas. A diluição 1:10 (0,1 mL de
soro + 0,9 mL salina) é usual. O resultado final
da atividade deve ser multiplicado pela diluição
realizada.
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Revista NewsLab | Jun/Jul 2020