Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalÃ¼Ã¼tilise ...

TARTU ÜLIKOOL 

LOODUS- JA TEHNOLOOGIATEADUSKOND 

MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT 

GENEETIKA ÕPPETOOL 

Triin Elmi 

Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise 

tsentri aminohapete kindlakstegemine mutatsioonanalüüsiga 

Bakalaureusetöö 

Juhendajad: Triinu Visnapuu, magister 

dots Tiina Alamäe, bioloogiakandidaat 

TARTU 2011

SISUKORD 

SISUKORD ...................................................................................................................................... 2 

KASUTATUD LÜHENDID ............................................................................................................ 3 

SISSEJUHATUS .............................................................................................................................. 4 

1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE ....................................................................................................... 5 

1.1 Glükosiidi hüdrolaasid ............................................................................................................ 5 

1.2 Glükosiidi hüdrolaaside perekondadesse 32 ja 68 kuuluvate valkude omadused ja ehitus .... 5 

1.3 Fruktosüültransferaaside ehitus ja aktiivtsenter...................................................................... 7 

1.3.1 Fruktosüültransferaaside katalüütilised aminohapped ja kristallstruktuurid ................... 7 

1.3.2 Fruktosüültransferaaside mutatsioonianalüüs ................................................................ 11 

2. EKSPERIMENTAALOSA ........................................................................................................ 13 

2.1 Töö eesmärgid ...................................................................................................................... 13 

2.2 Materjal ja metoodika ........................................................................................................... 13 

2.2.1 Kasutatud tüved ja plasmiidid ........................................................................................ 13 

2.2.2 Levaansukraasi geeni suunatud muteerimine ja kloneerimine pURI3 vektorisse ......... 14 

2.2.3 Elektroporatsioon, kolooniate kontrollimine, DNA eraldamine ja sekveneerimine ...... 16 

2.2.4 Transformantide kasvatus, levaansukraaside ekspresseerimine ja rakuekstraktide 

tegemine .................................................................................................................................. 17 

2.2.5 Levaansukraasi aktiivsuse määramine ........................................................................... 18 

2.2.6 Mutantsete levaansukraaside puhastamine Ni +2 -afiinsuskromatograafiaga .................. 19 

2.2.7 Geelelektroforees ........................................................................................................... 20 

2.2.8. Õhukese kihi kromatograafia ........................................................................................ 21 

2.3 Tulemused ja arutelu ............................................................................................................ 21 

2.3.1 Levaansukraasi Lsc3 võimalike katalüütiliste aminohapete ennustamine ja vastavate 

mutantide konstrueerimine ..................................................................................................... 21 

2.3.2 Levaansukraasi mutantide iseloomustamine ja katalüütilise kolmiku aminohapete 

identifitseerimine .................................................................................................................... 25 

2.3.2.1 Mutantsete levaansukraaside ekspresseerimine, transformantide fenotüübi uurimine 

ning levaansukraasi koguaktiivsused rakuekstraktides ........................................................... 25 

2.3.2.2 Mutantsete valkude puhastamine ja nende kineetilised parameetrid .......................... 29 

2.3.2.3 Mutantsete Lsc3 valkude polümerisatsiooniproduktid ............................................... 31 

2.3.2.4 Valgu Lsc3 katalüütilise kolmiku aminohapete identifitseerimine ............................ 33 

KOKKUVÕTE ............................................................................................................................... 34 

SUMMARY ................................................................................................................................... 35 

KASUTATUD KIRJANDUS ........................................................................................................ 36 

KASUTATUD VEEBIAADRESSID ............................................................................................ 39 

LISA 1 

LISA 2 

LISA 3 

2

KASUTATUD LÜHENDID 

ah – aminohape 

AjFT – Aspergillus japonicus’e fruktosüültransferaas 

Ala (A) – alaniin 

Amp – ampitsilliin 

ap – aluspaar(i) 

Asn (N) – aparagiin 

Asp (D) – aspartaat 

CAZy – Carbohydrate-Active enZYmes Database 

DNSA – 3,5-dinitrosalitsüülhape 

FEH – fruktaani eksohüdrolaas 

FOS – fruktooligosahhariid 

FTF – fruktosüültransferaas 

GH – glükosiidi hüdrolaas 

Glu (E) – glutamaat 

His (H) – histidiin 

Inu – Lactobacillus reuteri inulosukraas 

k cat – katalüütiline konstant (1/min) 

k cat /K m – katalüütiline efektiivsus (1/M*min) 

K i – inhibitsioonikonstant (mM) 

K m – Michaelise konstant, mis näitab ensüümi afiinsust substraadile (mM) 

Leu (L) – leutsiin 

Lev – Lactobacillus reuteri levaansukraas 

LevU – Zymomonas mobilis’e levaansukraas 

Lsc1, Lsc2, Lsc3 – Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 levaansukraasid 

LsdA – Gluconacetobacter diazotrophicus’e levaansukraas 

PA – polümerisatsiooniaste 

PDB – Protein Data Bank 

Pro (P) – proliin 

pv. – patovar (alamliik) 

SacB – Bacillus subtilis’e levaansukraas 

SDS-PAGE – Na-dodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidgeelelektroforees 

TA – transfruktosüleeriv ehk polümeriseeriv aktiivsus 

V max – maksimaalne reaktsioonikiirus (U/mg) 

3

SISSEJUHATUS 

Levaansukraas on bakteriaalne eksoensüüm, mis katalüüsib substraadi, peamiselt sahharoosi 

hüdrolüüsi ning fruktoosijääkide ülekannet aktseptormolekulile. Seega on levaansukraasidel 

fruktosüültransferaasne aktiivsus. Ensüümi sünteesiproduktideks on fruktaanid – polümeerne 

levaan või lühemad fruktooligosahhariidid. Mitmed mikroobid kasutavad fruktaane 

erinevatele pindadele kinnitumiseks, biofilmi moodustamiseks, süsinikuallikana või 

virulentsusfaktorina taimepatogeneesis. Mikroobsetel fruktaanidel on täheldatud mitmeid 

tervisele kasulikke toimeid, näiteks rasvumise ja vähivastast mõju, mistõttu võiks neid 

ühendeid kasutada ravimite või toidulisanditena. 

Levaansukraasid koosnevad β-lehtedest, mis moodustavad viielabalise β-propellerstruktuuri, 

mille keskel on substraati siduv aktiivtsenter. Levaansukraasi aktiivtsentrisse kuuluvad kolm 

happelist aminohapet (katalüütiline kolmik), mis on konserveerunud kõigis seni uuritud 

levaansukraasides, aga ka invertaasides ja fruktaani eksohüdrolaasides. Katalüütilisse 

kolmikusse kuuluvad kaks aspartaati, millest üks on nukleofiil ja teine vaheühendi 

stabiliseerija, ning glutamaat, mis täidab alus-hape katalüüsija rolli. 

Minu bakalaureusetöö eesmärk oli ennustada Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 

levaansukraasil Lsc3 aktiivtsentri katalüütilise kolmiku aminohappeid ja kontrollida neid 

ennustusi vastavate mutantide konstrueerimise ja iseloomustamisega (vt. pt. 2.1). Seni on 

pseudomonaadide levaansukraaside biokeemilisi omadusi vähe uuritud ja nende 

mutatsioonanalüüsi on seni tehtud ainult meie töögrupis. Meie grupi senised tulemused 

näitavad, et Lsc3 valk on suure katalüütilise aktiivsusega, ta sünteesib odavatest substraatidest 

(sahharoosist ja melassist) nii polümeerset levaani kui ka fruktooligosahhariide ning on 

võimeline kasutama ka alternatiivseid fruktosüüli aktseptoreid, sünteesides 

heterooligofruktaane. Kõigile neile sünteesiproduktidele ennustatakse ning on ka näidatud 

praktilisi biotehnoloogilisi rakendusi. 

Töö tehti Tartu Ülikooli Molekulaar- ja Rakubioloogia Instituudis Geneetika õppetoolis. 

Tahaksin tänada oma juhendajaid Triinu Visnapuud ning Tiina Alamäed, kes aitasid 

käesolevat tööd planeerida ja koostada. Sooviksin tänada ka teisi TÜMRI töötajaid, kes selle 

töö valmimisele kaasa aitasid. 

4

1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE 

1.1 Glükosiidi hüdrolaasid 

Glükosiidi hüdrolaasid (GH-d) on ensüümid, mis hüdrolüüsivad suhkruid, lagundades 

glükosiidsideme kahe monosahhariidi või süsivesiku ja mittesahhariidse molekuli vahel 

(Vuong ja Wilson, 2010). GH-de hulka kuuluvad ka transferaasse aktiivsusega ensüümid, mis 

kannavad substraadi hüdrolüüsi käigus vabanenud monosahhariidid erinevatele 

aktseptorsuhkrutele (http://www.cazy.org). Sellistel sünteesiproduktidel on erinevates 

organismides tähtis bioloogilne roll: fruktoosijääkidest koosnevad fruktaanid võivad olla 

olulised keskkonnastressi üleelamiseks ja rakumembraani stabiliseerimiseks, näiteks taimedel 

põua ja külma korral. Lisaks on fruktaanid paljudes taimedes (~40000 taimeliigis) ka 

varuaineteks. Mikroobid kasutavad fruktaane biokile moodustamisel ning pindadele 

kinnitumiseks (Velazquez-Hernandez et al., 2008). Näiteks bakter Streptococcus mutans on 

inimese suuõõne patogeen, kes kinnitub polüfruktaani (levaani) abil hammastele ning 

põhjustab hambaaukude teket (Schroeder et al., 1989). P. syringae pv. phaseolicola on 

taimepatogeen, kes põhjustab oataimedel nekroosilaikude teket ning kellele fruktaanid on 

virulentsusfaktoriks (Li ja Ullrich, 2001). Mullabakteril Bacillus subtilis on leitud, et levaani 

laguprodukt levaanbioos võib toimida signaalmolekulina (Daguer et al., 2004). 

GH-d on valkude aminohappeliste järjestuste ning struktuuride alusel jaotatud 14 sugukonda 

ja 113 perekonda ning koondatud CAZy andmebaasi (Carbohydrate-Active enZYmes 

Database; http://www.cazy.org) (Cantarel et al., 2009). Taimede ja hallitusseente 

fruktosüültransferaasid (FTF-id), aga ka invertaasid ja β-fruktofuranosidaasid kuuluvad GHde 

perekonda 32. Enamik bakteriaalseid FTF-e on paigutatud perekonda 68. Nende kahe 

perekonna valgud on sarnase struktuuriga ning nad on seetõttu ühendatud samasse sugukonda 

GH-J. Sellesse sugukonda kuuluvate ensüümide valgujärjestuste sarnasus on küll väike 

(identsus alla 15%), kuid neil on mitmeid homoloogilisi järjestusmotiive ja struktuurielemente 

(Coutinho ja Henrissat, 1999; Pons et al., 2000; Naumoff, 2001). 

1.2 Glükosiidi hüdrolaaside perekondadesse 32 ja 68 kuuluvate valkude 

omadused ja ehitus 

GH-de perekond 32 koondab taimseid ja bakteriaalseid invertaase, hallitusseente ja bakterite 

inulinaase ning levanaase, taimseid fruktaani eksohüdrolaase (FEH) ja fruktosüültransferaase. 

Invertaasid hüdrolüüsivad sahharoosi molekuli glükosiidsideme ning tekivad glükoos ja 

fruktoos. Samas FEH-id hüdrolüüsivad fruktaane, kandes ahela terminaalse fruktoosijäägi vee 

molekulile. Taimsed FEH-id ei ole võimelised sahharoosi lagundama ning see suhkur võib 

5

ensüümile hoopis inhibiitorina mõjuda (De Roover et al., 1999; van Riet et al., 2008). On 

leitud, et taimed vajavad fruktaanide sünteesiks kahte või enamat FTF-i, samas bakteritel 

toimub see ühe multifunktsionaalse ensüümiga (van den Ende ja van Laere, 1996; Martinez- 

Fleites et al., 2005). 

Perekonda 68 kuuluvad bakteriaalsed FTF-id katalüüsivad kaht tüüpi reaktsioone: kui 

aktseptoriks on näiteks sahharoos või fruktaanahel, siis toimub fruktoosijäägi ülekanne 

nendele aktseptoritele. Kui aktseptorina toimib vesi, siis toimub substraadi hüdrolüüs ja 

eraldub fruktoos. Bakteriaalsed FTF-id sünteesivad sahharoosist fruktaane – 

fruktoosijääkidest koosnevaid oligo- ja polüsahhariide. 

Taimsete ja bakteriaalsete fruktaanide hulka kuuluvad levaan, inuliin ja fruktooligosahhariidid 

(FOS-id). Fruktaanid erinevad üksteisest ahela pikkuse ehk polümerisatsiooniastme (PA), 

hargnemiste määra ja fruktoosijääke ühendava sideme poolest (Banguela ja Hernandez, 

2006). Inuliinid on β-2,1-sidemetega seotud fruktaanid, mida leidub eelkõige taimedes, aga 

neid sünteesivad ka bakteriaalsed inulosukraasid. Ka levaan on fruktoosijääkidest koosnev 

polümeer, kuid fruktoosijääkide vahel on β-2,6-sidemed. Bakteriaalse levaani 

polümerisatsiooniaste võib olla väga suur (PA 100-100000). FOS-id (näiteks kestoos ja 

nüstoos) on lühema ahelaga oligosahhariidid polümerisatsiooniastmega alla 9 (Velazquez- 

Hernandez et al., 2008). 

Fruktooligosahhariididel on täheldatud imetajatele kasulikke toimeid, mistõttu on nad 

kasutusele võetud prebiootikumidena ning madala kalorsuse tõttu on nad leidnud rakendust 

toiduainetööstuses magusainetena (Crittenden ja Playne, 1996; Roberfroid ja Slavin, 2000). 

See ongi üks oluline põhjus, miks levaansukraase ja nende valkude reaktsiooniprodukte võiks 

uurida. Oligofruktaanid kuuluvad imetajate jaoks seedumatute suhkrute hulka. Seetõttu 

jõuavad FOS-id seedumatult jämesoolde, kus neid kääritavad bifido- ja piimhappebakterid, 

millega kaasnevad mitmed kasulikud toimed inimese tervisele. Näiteks on leitud, et väheneb 

soolesisu pH, stimuleeritakse immuunsüsteemi, väheneb rasvumise ja diabeedi risk, sest 

kolesterooli, triglütseriidide ja fosfolipiidide kontsentratsioon veres väheneb, ning suureneb 

mitmete mineraalide (Fe, Ca, Mg) imendumine (Roberfroid ja Slavin, 2000). 

Bakteriaalsete FTF-ide hulka kuuluvad levaansukraasid (EC 2.4.1.10) ning inulosukraasid 

(EC 2.4.1.9). Inulosukraase on seni leitud ainult piimhappebakteritest, näiteks Lactobacillus 

reuteri’st. Levaansukraasid on olemas aga nii gramnegatiivsetel kui ka grampositiivsetel 

bakteritel, kuid nende valgujärjestuste identsus on väike (vaid 20%) (van Hijum et al., 2006). 

Grampositiivsetest bakteritest pärit levaansukraasid on üldiselt suuremad ning nende 

molekulis eristuvad erineva funktsiooniga piirkonnad. Näiteks L. reuteri levaansukraasil 

eristuvad N-terminaalne signaalpeptiid, mille abil suunatakse valk rakust välja, N-terminaalne 

6

varieeruv piirkond, konserveerunud katalüütiline tsenter ja C-terminaalne osa, millega 

seotakse valk rakukesta külge (van Hijum et al., 2006). Gramnegatiivsete bakterite 

levaansukraasid on väiksemad ja lihtsama ehitusega ning neil tavaliselt puudub N-terminaalne 

signaalpeptiid (Geier ja Geider, 1993; Song ja Rhee, 1994; Hettwer et al., 1998). Erandiks on 

gramnegatiivse bakteri Gluconacetobacter diazotrophicus’e levaansukraas, millel on leitud 

sekretsiooni vahendav N-terminaalne signaalpeptiid (Hernandez et al., 2000). 

Levaansukraaside peamiseks substraadiks on sahharoos, aga mitmetel ensüümidel on näidatud 

ka rafinoosi ja stahhüoosi hüdrolüüsimise ning neist levaani sünteesimise võimet (Yanase et 

al., 2002; Andersone et al., 2004; Visnapuu et al., 2008). Levaansukraasi katalüütilised 

omadused sõltuvad nii substraadi kontsentratsioonist, temperatuurist kui ka keskonna pH-st. 

B. subtilis’e levaansukraasi puhul on näidatud, et sahharoosi hüdrolüüsireaktsioon, kus 

tekivad glükoos ja fruktoos, on eelistatud madalamatel sahharoosi kontsentratsioonidel (250 

mM) (Lammens et al., 2009). Erinevatel levaansukraasi aktiivsustel võivad olla erinevad 

temperatuurioptimumid. Näiteks P. syringae pv. phaseolicola ensüümi kõige sobivam 

temperatuur sahharoosi hüdrolüüsiks on 60°C, aga levaani sünteesiks 18°C (Hettwer et al., 

1995). Enamiku seni uuritud levaansukraaside pH optimum jääb vahemikku 5.0-6.5. Näiteks 

Zymomonas mobilis’e levaansukraasil on nii hüdrolüüsi- kui ka 

polümerisatsioonireaktsioonide toimumiseks optimaalne pH 5.0 (Sangiliyandi et al., 1999). 

Glükosiidi hüdrolaaside perekonnad 68 ja 32 on koondatud sugukonda GH-J, sest neil 

valkudel on sarnane ruumiline struktuur. Selle sugukonna ensüümid koosnevad β-lehtedest, 

mis moodustavad viielabalise β-propellerstruktuuri, mille keskel on substraati siduv 

aktiivtsenter. Iga β-leht koosneb neljast antiparalleelsest valguahelast. Katalüütilisse tsentrisse 

kuuluvad konserveerunud happelised aminohapped – kaks aspartaati (Asp) ja glutamaat (Glu) 

(vt. ka 1.3.1) (Meng ja Fütterer, 2003; Chuankhayan et al., 2010). Erinevalt GH68 perekonna 

ensüümidest esineb GH32 valkudel C-terminaalne lisadomään, mis koosneb kahest β-lehest ja 

moodustab kahekihilise nn. võileivastruktuuri (β-sandwich) (Lammens et al., 2009; 

Chuankhayan et al., 2010). 

1.3 Fruktosüültransferaaside ehitus ja aktiivtsenter 

1.3.1 Fruktosüültransferaaside katalüütilised aminohapped ja kristallstruktuurid 

Fruktosüültransferaaside katalüütilised aminohapped on konserveerunud kõigil seni uuritud 

GH-J ensüümidel (Lammens et al., 2009). Need kolm olulist aminohapet (katalüütiline 

kolmik) on kaks aspartaati ja üks glutamaat (Tabel 1). Üks aspartaatidest käitub nukleofiilina, 

7

teine on moodustuva vaheühendi stabiliseerija ning glutamaat toimib alus-hape katalüüsijana. 

FTF-ide katalüütiline mehhanism on 2-etapiline. Esimeses etapis toimub aspartaadi 

nukleofiilne rünnak substraadi anomeersele süsinikule ning fruktoosijäägi ja ensüümi vahel 

moodustub kovalentselt seotud vaheühend. Samal ajal käitub alus-hape katalüüsija (Glu) kui 

hape, loovutades prootoni eralduvale glükoosijäägile. Teises etapis toimib alus-hape 

katalüüsija alusena ja eemaldab aktseptormolekulilt prootoni, toimub fruktosüül-ensüüm 

vaheühendi hüdrolüüs ja fruktoosijäägi ülekanne aktseptorile (Koshland et al., 1954; Lee et 

al., 2003). Teine aspartaat, mis asub konserveerunud Arg-Asp-Pro ehk RDP-motiivis, ei ole 

otseselt katalüüsiga seotud, vaid moodustab vesiniksidemed fruktoosijäägi C3 ja C4 

hüdroksüülrühmadega, osaledes substraadi sidumisel ja fruktosüül-ensüüm vaheühendi 

stabiliseerimisel (Nagem et al., 2004). 

Mitmetel levaansukraasidel, inulosukraasidel ja hallitusseente FTF-idel on katalüütilise 

kolmiku aminohapped kindlaks tehtud mutatsioonianalüüsiga või kristallstruktuuri mudelite 

abil. Mõnede levaansukraaside, inulosukraaside ja teiste FTF-ide aktiivtsentri aminohapped, 

nende positsioonid ning ensüümi kuuluvus on toodud Tabelis 1. 

Praeguseks on kristallstruktuurid kirjeldatud grampositiivse bakteri B. subtilis’e 

levaansukraasil SacB ja gramnegatiivse G. diazotrophicus’e levaansukraasil LsdA (Meng ja 

Fütterer, 2003; Martinez-Fleites et al., 2005) ning Aspergillus japonicus’e 

fruktosüültransferaasil AjFT (Chuankhayan et al., 2010). 

Tabel 1. Erinevate fruktosüültransferaaside katalüütilised aminohapped ja nende positsioonid. 

Kristallstruktuuri andmed on olemas SacB, LsdA ja AjFT valkude kohta. 

Ensüümi tüüp 

Ensüüm 

Levaansukraas 

Inulosukraas 

FTF 

B. 

G. 

Z. L. L. A. 

SacB a LsdA b LevU c Lev d Inu e AjFT f 

subtilis’e diazotrophicus’e mobilis’e reuteri reuteri japonicus’e 

Nukleofiil Asp68 Asp135 Asp48 Asp249 Asp272 Asp60 

Stabiliseerija Asp247 Asp309 Asp194 Asp404 Asp424 Asp191 

Alus-hape 

katalüüsija 

Glu342 Glu401 Glu278 Glu503 Glu523 Glu292 

GH perekond GH68 GH68 GH68 GH68 GH68 GH32 

Andmed pärinevad alljärgnevatest artiklitest: 

a Meng ja Fütterer, 2003, 2008 

b Martinez-Fleites et al., 2005 

c Yanase et al., 2002 

d,e Ozimek et al., 2004 

f 

Chuankhayan et al., 2010 

8

B. subtilis’e levaansukraas SacB on 439 ah pikkune monomeerne valk, mis katalüüsib 

peamiselt suure molekulmassiga levaani moodustumist, vähesel määral sünteesitakse ka 

fruktooligosahhariide. SacB on on kristalliseeritud kompleksis nii sahharoosi kui rafinoosiga 

ning ka substraadivabas vormis (Meng ja Fütterer, 2003, 2008). Levaansukraasi struktuuri 

analüüs näitas, et valk on voltunud viielabalise β-propelleri kujuliselt, mille keskel on 

lehtritaoline negatiivselt laetud õõnsus, kus asub aktiivtsenter (Joonis 1A, B). Propelleri β- 

lehed ehk labad koosnevad neljast antiparalleelsest β-ahelast. Levaansukraasi N-terminus 

paikneb risti üle esimese β-lehe, C-terminus on aga pakitud vastu viiendat laba ja ei ole 

vesiniksidemete kaudu seotud esimese β-lehega (Meng ja Fütterer, 2003). 

Joonis 1. Kristalliseeritud 

levaansukraaside ehitus. B. subtilis’e 

levaansukraas (A) (Protein Data Bank 

ID: 1W18) ja selle aktiivtsenter (B) 

ning G. diazotrophicus’e 

levaansukraas (C) (PDB ID: 1OYG) ja 

selle aktiivtsenter (D). Katalüütilise 

kolmiku aminohapped (Asp – D; Glu – 

E) on tähistatud punasega (Lammens 

et al., 2009). 

Valgu SacB katalüütilise kolmiku aminohapeteks on Asp86, Asp247 ja Glu342 (Tabel 1; 

Joonis 1B). Selleks, et teha kindlaks nende aminohapete funktsioon, muteeriti need 

positsioonid alaniinideks. Üksikmutantide Asp86Ala ja Asp247Ala kristallstruktuur näitas, et 

selline aminohappe vahetus ei muutnud eriti aktiivsaidi geomeetriat, kuid praktiliselt kadus 

ensüümi katalüüsivõime (Meng ja Fütterer, 2008). Lisaks leiti, et vahetult katalüütiliste 

aminohapete läheduses paiknev Arg360 on oluline levaani polümerisatsioonil. Kuigi see 

aminohape ei ole otseselt reaktsioonimehhanismiga seotud, vastutab ta 

transfruktosüleerimisreaktsiooni spetsiifilisuse ja tõhususe eest (Meng ja Fütterer, 2003; 

Lammens et al., 2009). Arg360 on konserveerunud grampositiivsete bakterite 

9

levaansukraasides, kuid gramnegatiivsetes bakterites on homoloogilises positsioonis histidiin 

– His296 Z. mobilis’e ja His419 G. diazotrophicus’e levaansukraasil (Yanase et al., 2002). 

Sahharoosiga kompleksis oleval mutantse SacB (Glu342Ala) analüüsil näidati, et ensüümi -1 

ja +1 alapiirkonda seonduvad vastavalt fruktoosi- ja glükoosijääk. -1 piirkonnal on kõrge 

spetsiifilisus fruktoosijäägi seondumiseks, kuid +1 piirkonda võib seonduda glükoosijääk, mis 

on pärit doonorsubstraadilt, aga ka mõni muu sahhariidne aktseptormolekul (Ozimek et al., 

2006). On näidatud, et SacB -1 alapiirkonda kuuluvad nukleofiil Asp86 ja stabiliseerija 

Asp247. Alus-hape katalüüsija Glu342 moodustab tugeva sideme konserveerunud RDPmotiivis 

asuva arginiiniga Arg246 ja vesiniksideme türosiiniga positsioonis 411, mis 

omakorda moodustab tugeva H-sideme Arg360-ga. Nii Arg360 kui ka Glu340 moodustavad 

+1 piirkonnas glükosüülijäägiga H-sideme (Joonis 1B ) (Meng ja Fütterer, 2008). 

Gramnegatiivsetest bakteritest pärinevad levaansukraasid ei vaja katalüüsiks metallilisi 

kofaktoreid, kuid B. subtilis’e enüümi puhul on näidatud Ca 2+ seondumispiirkonna olemasolu. 

Leiti, et Ca 2+ -ioonide seondumist vahendab Asp339 (Meng ja Fütterer, 2003). 

Valgujärjestuste joondus GH68 perekonna ensüümidega näitas, et aminohapped, mis on 

vajalikud Ca 2+ seondumisel, on konserveerunud enamikes grampositiivsete bakterite 

levaansukraasides, kuid puuduvad gramnegatiivsete mikroobide ensüümidel (Ozimek et al., 

2005; van Hijum et al., 2006). Gramnegatiivsetel bakteritel võib sarnane struktuuri 

stabiliseeriv funktsioon olla disulfiidsildadel. Näiteks G. diazotrophicus’e LsdA valgu 

uurimisel leiti üks disulfiidsild (Martinez-Fleites et al., 2005). 

G. diazotrophicus’e levaansukraas LsdA koosneb 584 aminohappest, millest 30 ah pikkune 

N-terminaalne järjestus moodustab signaalpeptiidi, mis eemaldatakse tüüp II sekretsiooni 

käigus. LsdA sünteesib suures kogustes tri- ja tetrasahhariide (FOS-e), kuid polüsahhariidset 

levaani tekib vähe (Martinez-Fleites et al., 2005; Velazquez-Hernandez et al., 2008). 

Üldiselt on LsdA kristallstruktuur sarnane SacB-ga, moodustades viielabalise β-propelleri, 

mille keskel paikneb konserveerunud aktiivtsenter (Joonis 1C, D). LsdA aminohappeline 

järjestus on B. subtilise SacB valguga 26% ulatuses identne. β-lehtede ja enamiku α-heeliksite 

paiknemine on mõlemal valgul sarnane. LsdA mutatsioonianalüüsiga on tõestatud, et 

katalüütilise kolmiku aminohapped on Asp135 (nukleofiil), Asp309 (stabiliseerija) ja Glu401 

(alus-hape katalüüsija), mis paiknevad β-lehtede esimestel (sisemistel) β-ahelatel (Tabel 1; 

Joonis 1D) (Martinez-Fleites et al., 2005). 

A. japonicus’e fruktosüültransferaasil AjFT on levaansukraasidele sarnane N-terminaalne 5- 

labaline β-propelleristruktuur koos katalüütilise tsentriga, kuid lisaks on sellel valgul ka C- 

terminaalne kihiline struktuur, mis koosneb kahest 6-ahelalisest β-lehest (Chuankhayan et al., 

2010). Arvatavasti aitab see lisadomään valku stabiliseerida (Lammens et al., 2009). 

10

1.3.2 Fruktosüültransferaaside mutatsioonanalüüs 

Meng ja Fütterer (2003) muteerisid B. subtilis’e SacB kristallstruktuuri põhjal ennustatud 

aktiivtsentri aminohappeid (Tabel 1) alaniiniks ning määrasid mutantsetel valkudel levaani 

teket. Selgus, et mutandid (Asp86Ala, Asp247Ala, Glu342Ala) olid inaktiivsed ning levaani 

ei sünteesitud (Meng ja Fütterer, 2003). 

Martinez-Fleites et al. (2005) näitasid, et G. diazotrophicus’e LsdA Asp135 asendamisel 

asparagiiniga vähenes ensüümi katalüütiline konstant (k cat ) 2300 korda. Kui LsdA kohtsuunatud 

mutageneesil RDP-motiivis paiknev aspartaat 309 asendati asparagiiniga, alanes 

ensüümi võime sahharoosi hüdrolüüsida ja k cat vähenes ligi 75 korda. Samas ei toimunud 

muutusi ensüümi afiinsuses sahharoosile. Sellega tõestati, et Asp135 ja Asp309 on LsdA 

valgus vastavalt katalüütiline nukleofiil ja vaheühendi stabiliseerija (Tabel 1) (Batista et al., 

1999; Martinez-Fleites et al., 2005). 

Analüüsides Z. mobilis’e levaansukraasi LevU juhuslikke ja koht-suunatud mutageneesiga 

saadud mutante leiti, et Glu278 asendamine aspartaadiga vähendas mutantse valgu 

katalüütilise konstandi väärtust ligi 30 korda, olgugi et üks negatiivne aminohape vahetati 

teise negatiivse laenguga aminohappe vastu. Kui Glu278 asendati positiivse laenguga 

histidiiniga, muutus k cat 210 korda väiksemaks, kuid nii mutansete ensüümide afiinsus (K m ) 

sahharoosile kui ka transfruktosüleeriv ehk polümeriseeriv aktiivsus (TA) jäid peaaegu 

samaks. Yanase et al. (2002) järeldasid, et Glu278 on ilmselt alus-hape katalüüsija. Asp194 

muteerimisel asparagiiniks kaotas ensüüm peaaegu täielikult võime sahharoosi hüdrolüüsida – 

k cat vähenes ligi 3400 korda. Afiinsus sahharoosi suhtes tõusis 3 korda, kuid 

transfruktosüleerivas aktiivsuses muutusi polnud. Seega Asp194, mis paikneb kõrgelt 

konserveerunud RDP-motiivis, on samuti substraadi hüdrolüüsil oluline aminohape ning 

reakstiooni vaheühendi stabiliseerija (Tabel 1) (Yanase et al., 2002). 

Grampositiivsel piimhappebakteril L. reuteri’l on olemas nii inulosukraas (Inu) kui ka 

levaansukraas (Lev). Valkude järjestuste joondus B. subtilis’e SacB-ga näitas, et L. reuteri 

FTF-ide võimalikud katalüütilised aminohapped on Asp249, Asp404, Glu503 (Lev) ja 

Asp272, Asp424, Glu523 (Inu) (vt. ka Tabel 1) (Ozimek et al., 2004). Kinnitamaks nende ahte 

olulisust katalüüsis, muteeriti vastavad järjestused suunatult asparagiiniks või glutamiiniks 

ning määrati ensüümide koguaktiivsust, mõõtes sahharoosi hüdrolüüsil tekkivat glükoosi 

hulka. Mutantide katalüüsi aktiivsus, võrreldes muteerimata valguga, oli vähenenud vähemalt 

10000 korda. Määrati ka mutantide kineetilisi parameetreid ja leiti, et näiteks k cat sahharoosi 

suhtes mutantsel Lev valgul Asp404Asn oli langenud 613000 korda, samas afiinsus substraadi 

suhtes ei muutunud (Ozimek et al., 2004). 

11

Hallitusseene A. japonicus’e FTF-i AjFT aktiivtsentri moodustavad Asp60, Asp191 ja Glu292 

(Tabel 1). Need aminohapped katalüüsivad fruktosüüli ülekannet ning seovad fruktoosijäägi - 

1 alapiirkonda. Need aminohapped muteeriti suunatult alaniiniks ning näidati, et mutantsed 

ensüümid kaotasid peaaegu täielikult oma aktiivsuse (Chuankhayan et al., 2010). 

12

2. EKSPERIMENTAALOSA 

2.1 Töö eesmärgid 

1. Erinevate levaansukraaside valgujärjestuste joonduse alusel ennustada, millised 

aminohapped võiksid kuuluda taimepatogeeni Pseudomonas syringae pv. tomato 

DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilisse tsentrisse. 

2. Muteerida koht-suunatult levaansukraasi Lsc3 aspartaat (Asp) positsioonis 62 ja 

glutamaat (Glu) positsioonis 303 alaniiniks (Ala) ning kloneerida vastavate 

mutatsioonidega lsc3 geenid pURI3 ekspressioonivektorisse, kus lisandub 

sünteesitavatele valkudele N-terminaalne His 6 -järjestus. 

3. Kloneerida pURI3 vektorisse mutantsed lsc3 geenid, kus aspartaadid (Asp) 

positsioonis 219 või 225 olid muudetud alaniiniks (Ala) või asparagiiniks (Asn). 

4. Ekspresseerida mutantseid levaansukraase (Lsc3 Asp62Ala; Asp219Ala; 

Asp219Asn; Pro222Leu; Asp225Ala; Asp225Asn; Glu303Ala) Escherichia coli 

tüves BL21(DE3) ja määrata mutantsete ensüümide funktsionaalsust ning omadusi, 

et kindlaks teha, kas need aminohapped võiksid olla Lsc3 katalüüsis olulised. 

2.2 Materjal ja metoodika 

2.2.1 Kasutatud tüved ja plasmiidid 

Konstruktide tegemiseks kasutati E. coli tüve DH5α (supE44 ΔlacU169 (φ80 lacZΔM15) 

recA1 endA1 hsdR17 thi-1 gyrA96 relA1) (Invitrogen, CA, USA; Miller, 1972) ning 

mutantseid valke ekspresseeriti E. coli tüves BL21(DE3) (hsdS gal (λcIts857 ind1 Sam7 nin5 

lacUV5-T7 gene 1)) (Studier and Moffatt, 1986). 

Töös kasutatud ja konstrueeritud plasmiidid on esitatud Tabelis 2. 

Metsiktüüpi ja mutantsete levaansukraaside ekspresseerimiseks kasutasime pURI3 vektorit 

(2737 ap) (Rivas et al., 2007), kuhu oli kloneeritud bakteri P. syringae pv. tomato DC3000 

algne või mutantne levaansukraasi kodeeriv geen lsc3, ning saadi konstrukt pURI3-lsc3 (3820 

ap). Kõigis pURI3 vektori konstruktides liitub ekspresseeritava Lsc3 valgu N-terminusse 

His 6 - järjestus. 

13

Tabel 2. Kasutatud plasmiidid, nende päritolu, koodonite ja vastavate aminohapete vahetused 

ning mutatsioonide asukohad valgus. Alla on joonitud vastavas koodonis muteeritud 

nukleotiidid. 

Plasmiid 

pHIPMalprom-lsc3D219A 

pHIPMalprom-lsc3D219N 

pHIPMalprom-lsc3D225A 

pHIPMalprom-lsc3D225N 

pURI3 

(ekspressioonivektor) 

pURI3-lsc3 

(sisaldab muteerimata lsc3-e) 

pURI3-lsc3D62A 


pURI3-lsc3D219N 

pURI3-lsc3P222L 


pURI3-lsc3D225N 

pURI3-lsc3E303A 

Koodoni ja 

aminohappe 

vahetus 

GAC→GCC; 

Asp→Ala 

GAC→AAC; 

Asp→Asn 

GAT→GCC; 

Asp→Ala 

GAT→AAT; 

Asp→Asn 

Mutatsiooni 

asukoht valgus 

Viide 

219 Tiirik, 2010 

219 Tiirik, 2010 

225 Tiirik, 2010 

225 Tiirik, 2010 

- - Rivas et al., 2007 

- - 

GAC→GCC; 

Asp→Ala 

GAC→GCC; 

Asp→Ala 

GAC→AAC; 

Asp→Asn 

CCG→CTG; 

Pro→Leu 

GAT→GCC; 

Asp→Ala 

GAT→AAT; 

Asp→Asn 

GAG→GCG; 

Glu→Ala 

62 

T. Visnapuu, 

avaldamata andmed 

käesolev töö; 

LISA 1 

219 käesolev töö 


222 

K. Mardo, 

avaldamata andmed 



303 

käesolev töö; 

LISA 1 

2.2.2 Levaansukraasi geeni suunatud muteerimine ja kloneerimine pURI3 

vektorisse 

Mutatsioonide Asp62Ala ja Glu303Ala koht-suunatult lsc3 geeni viimiseks kasutati PCR-i 

(Polymerase Chain Reaction) põhist megapraimeri meetodit (Wei et al., 2004; Tiirik, 2010). 

Kõik muteerimiseks vajalikud amplifikatsioonietapid tehti Fermentase (Leedu) Pfu DNA 

polümeraasiga. Restriktsiooniks kasutati sama firma restriktaase ning tootjapoolset 

standardprotokolli. Pikk praimer (megapraimer) sünteesiti PCR-i reaktsioonisegus, mis 

sisaldas 1x Pfu puhvrit (Fermentas), 0.2 mM dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP; Fermentas), 

4 mM MgSO 4, kumbagi praimerit 0.5 pmol, 0.025 U/μl Pfu DNA polümeraasi. Matriitsina 

kasutati muteerimata levaansukraasi geeni sisaldavat plasmiidi pURI3-lsc3. Praimeriteks olid 

14

vastavalt kas päripraimer T7 (5’ TAATACGACTCACTATAGGG 3’) ja vastupraimer 

D62ARev (5’ CATGGTGGCCCAGATGAAT 3’) või päripraimer E303AFw (5’ 

TGATCAGACCGCGCGCC 3’) ja vastupraimer Ampsaba (5’ CTGAGATAGGTGCCTCAC 

3’). Muteerimispraimerid D62ARev ja E303AFw sisaldavad selliseid lämmastikaluse 

vahetusi (praimeri järjestuses alla joonitud), et Asp62 ja Glu303 asendatakse koodoni 

muutuse kaudu alaniiniga (vt. Tabel 2). PCR-i produktid (megapraimerid) lahutati 

elektroforeesiga (vt. pt. 2.2.7). Vastavalt 320 ap ja 555 ap pikkused DNA fragmendid lõigati 

geelist välja ning puhastati Mo Bio (USA) Ultra Clean TM 15 DNA puhastamise komplektiga 

tootjapoolse protokolli järgi. Seejärel tehti megapraimerite pikendamiseks uus PCR. 

Reaktsioonisegu sisaldas vastavat megapraimerit, matriits-DNA-d (pURI3-lsc3), 1x Pfu 

puhvrit, 0.04 mM dNTP, 4 mM MgSO 4, 0.05 U/μl Pfu DNA polümeraasi ning programm oli 

järgmine: 

1. DNA ahelate denatureerimine 96°C 2 minutit; 

2. Megapraimeri paardumine DNA ahelaga 60°C 2 minutit; 

3. DNA süntees 72°C 5 minutit; 

Tsüklite arv: 10. 

Proove inkubeeriti restriktaasiga DpnI (lõppkonts. 0.2 U/µl) 90 min 37°C, et lagundada segus 

algne metüleeritud matriits-DNA. Mutatsiooni sisaldav lsc3 fragment (1369 ap) paljundati 

segust praimeritepaariga Lsc3pURI3Fw (5’ 

CATCATGGTGACGATGACGATAAGATGTACAATAGCAACTCTGCTGTAA 3’) ja 

Lsc3pURI3Rev (5’ 

AAGCTTAGTTAGCTATTATGCGTAGTTCTTCAGGTATGGGAACGGCGTG 3’). 

Kaldkirjas on pURI3 vektoriga komplementaarne järjestus ning ülejäänud osa praimerist 

seondub lsc3 geeni otstele. Produkti olemasolu kontrolliti 1% agaroosgeelil ning puhastati 

geelist Mo Bio Ultra Clean TM 15 komplektiga. 

Mutatsiooni sisaldava lsc3 geeni liitmiseks pURI3 vektorisse kasutasime restriktaasi- ja 

ligeerimisvaba PCR-i põhist kloneerimist (Geiser et al., 2001; Rivas et al., 2007). pURI3 

vektoriga komplementaarsete otstega lsc3 geen paljundati plasmiididelt pHIPMalpromlsc3D219A, 

pHIPMalprom-lsc3D219N, pHIPMalprom-lsc3D225A, pHIPMalpromlsc3D225N 

praimeritega Lsc3pURI3Fw ja Lsc3pURI3Rev või saadi suunatud muteerimisega, 

nagu on kirjeldatud eespool. Saadud mutantsed lsc3 fragmendid lahutati agaroosgeelis, 

puhastati ja tehti ekstensioonietapp, kus lsc3 geen kloneerub pURI3 vektorisse. 

Reaktsioonisegu sisaldas puhastatud lsc3 fragmenti, vektorit pURI3, 0.1 mM dNTP, 1x Pfu 

puhvrit, 4 mM MgSO 4 , 0.05 U/μl Pfu DNA polümeraasi ning programm oli järgmine: 

1. DNA ahelate denatureerimine 95°C 1 minut; 

15

2. lsc3 fragmendi otste seondumine vektorile pURI3 55°C 1 minut; 

3. DNA ahela süntees 72°C 3 minutit; 

Tsüklite arv: 18. 

Segusid töödeldi DpnI-ga (lõppkonts. 0.2 U/µl), et lagundada segusse allesjäänud pURI3 

vektor, produktid puhastati ning restrikteeriti NotI-ga (lõppkonts. 0.2 U/µl), mis „lõikab“ 

algset pURI3 vektorit, kuid mitte inserteerunud lsc3 geeniga plasmiidi. Segud elektroporeeriti 

E. coli DH5α tüvesse, kolooniaid kontrolliti PCR-iga lsc3-spetsiifiliste praimeritega, 

plasmiidne DNA puhastati ning mutatsiooni asukohta ning õigsust kontrolliti geeni järjestuse 

sekveneerimisega (pt. 2.2.3). Saadud mutantsed plasmiidid nimetati pURI3-lsc3D62A, 

pURI3-lsc3E303A, pURI3-lsc3D219A, pURI3-lsc3D219N, pURI3-lsc3D225A ja pURI3- 

lsc3D225N (vt. Tabel 2). Meie töögrupis olid varem konstrueeritud plasmiidid pURI3- 

lsc3P222L ja pURI3-lsc3. 

2.2.3 Elektroporatsioon, kolooniate kontrollimine, DNA eraldamine ja 

sekveneerimine 

Kõik mutantset lsc3 geeni kandvad pURI3 plasmiidid viidi E. coli DH5α ja BL21(DE3) 

tüvedesse elektroporatsiooniga (Sharma ja Schimke, 1996). Bakterirakke kasvatati 4 ml 

YENB söötmes (0.75% pärmiekstrakt, 0.8% toitepuljong) 37°C loksutil kuni OD 600 oli ~0.4. 

Seejärel bakterikultuuri tsentrifuugiti 13700 g 30 s ning rakke pesti 3 korda steriilse 15% 

glütserooliga ning suspendeeriti 50 μl 15% glütseroolilahuses. Rakkudele lisati etanooliga 

sadestatud kloneerimissegu või puhastatud plasmiidset DNA-d. Elektroporatsioon tehti pingel 

2.5 kV E. coli Pulser-iga (BIO-RAD, USA) ning rakke kasvatati 1 h 1 ml Luria-Bertani (LB) 

söötmes ja plaaditi ampitsilliini (Amp) sisaldavale LB selektiivsöötmele. 

lsc3 geeni olemasolu kolooniates kontrolliti PCR-iga, kasutades praimeritepaari Lsc3Fw3 (5’ 

GAAGCGCAGAACTCAAGCTGG 3’) ja Lsc3Rev2 (5’ TCATTGGCCGGTACGGACCG 

3’), millega saadi 427 ap pikkune DNA lõik. PCR-i segu sisaldas 6.25 mM MgCl 2 , 1x Taq 

puhvrit (Fermentas), 0.2 mM dNTP, kumbagi praimerit 0.5 pmol/μl ja Taq DNA polümeraasi 

0.05 U/μl. 

Plasmiidne DNA eraldati AxyPrep Plasmid Miniprep komplekti (Axygen Biosciences, 

USA) kasutades. Plasmiidide olemasolu ja saagist kontrolliti 1% agaroosgeelil (pt. 2.2.7). 

Konstrueeritud plasmiidides kontrolliti mutatsioonide asukohta ja õigsust lsc3 geenijärjestuse 

sekveneerimisega. Selleks kasutati BigDye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit-i 

(Applied Biosystems, Kanada). Eelnevalt valmistati PCR-i produktid levaansukraasi geeni N- 

ja C-terminaalsest osast. Geeni N-terminuse paljundamiseks kasutati praimereid T7 ja 

Lsc1ja3Rev1 (5’ TGCGCTTCGGTTTGATAATAGG 3’), millega saadi 760 ap pikkune DNA 

16

lõik. Levaansukraasi geeni teise poole 938 ap pikkune fragment amplifitseeriti praimeritega 

Lsc1ja3Fw1 (5’ GCGATCGCCAAAGTACG 3’) ning Ampsaba. Seejärel tehti proovidele 

ExoI-SAP töötlus 15 min 37°C, kus reaktsioonisegusse lisati aluseline fosfataas (Shrimp Acid 

Phosphatase – SAP; Fermentas; lõppkonts. 0.2 U/µl) ja eksonukleaas ExoI (Fermentas; 0.4 

U/µl), et lagundada segusse allesjäänud praimerid ja algne DNA. Järgnevalt DNA sadestati 

96° etanooliga ja proovid valmistati vastavalt tootjapoolsele soovitusele. Sekveneeriti ABI 

3130xl Cenetic Analyser või ABI 3730xl DNA Analyzer sekvenaatoriga (Applied 

Biosystems, Kanada). 

2.2.4 Transformantide kasvatus, levaansukraaside ekspresseerimine ja 

rakuekstraktide tegemine 

Levaansukraaside ekspresseerimiseks viidi mutantset või algset levaansukraasi geeni 

sisaldavad pURI3 plasmiidid ja ilma inserdita pURI3 vektor elektroporatsiooniga E. coli 

ekspressioonitüvesse BL21(DE3) (pt. 2.2.3). Transformante kasvatati ampitsilliini (lõppkonts. 

0.15 mg/ml) sisaldavas LB tard- või vedelsöötmes 37°C. Vedelkultuure aereeriti loksutil. 

Fenotüüpide uurimiseks külvati transformandid 10% sahharoosiga LB Amp söötmetassidele, 

kasvatati 37°C üleöö ja seejärel inkubeeriti tasse kuni 7 p toatemperatuuril (~23°C). 

Rakuekstraktide tegemiseks külvati muteeritud või algset levaansukraasi geeniga plasmiidi 

sisaldavad E. coli BL21(DE3) kolooniad 5 ml LB Amp vedelsöötmesse, kasvatati üleöö ning 

kultuurid külvati 30 ml LB Amp söötmesse algtihedusega 0.05 (OD 600 ) ja kasvatati opilise 

tiheduse väärtuseni ~0.5. Levaansukraaside ekspressiooni aktiveerimiseks lisati söötmesse 

IPTG-d (isopropüül-β-D-1-tiogalaktopüranosiid) (lõppkonts. 0.5 mM) ja transformante 

kasvatati madalama temperatuuriga (22°C) loksutil 20 h. Bakterirakud sadestati 

tsentrifuugimisega (2400 g, 10 min, 4°C), neid pesti kaks korda 50 mM K-fosfaatpuhvriga 

(pH 7.0), suspendeeriti 0.02% Na-asiidiga McIllvaine’i puhvris (130 mM Na 2 HPO 4 ja 40 mM 

sidrunhape; pH 6.0) ning purustati ultraheliga (Ultrasonic Homogenizer 4710, Cole-Parmer 

Instrument Co., USA). Tahke fraktsioon sadestati tsentrifuugimisega (13700 g, 4°C) 20 

minuti jooksul ning supernatanti kasutati rakuekstraktina. Rakuekstrakte hoiti jääl või 

külmutati -20°C. 

Mutantsete levaansukraaside puhastamiseks külvati E. coli BL21(DE3) transformandid 200 

ml LB Amp vedelsöötmesse ning neid kasvatati ja levaansukraaside ekspressioon algatati, 

nagu on kirjeldatud eespool. Bakterikultuuri tsentrifuugiti 2400 g (5 min, 4°C) ja pesti kaks 

korda 25 ml K-fosfaatpuhvriga (50 mM; pH 7.0). Rakud suspendeeriti 10 ml 

sonikeerimispuhvris (10 mM imidasool, 50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 10% glütserool; 

pH 6.0), külmutati 3x vedelas lämmastikus ning sulatati leiges vees, et suurendada valgu 

17

saagist, ja purustati ultraheliga. Segu tsentrifuugiti (2400 g, 20 min, 4°C) ning supernatanti 

kasutati levaansukraaside allikana. 

2.2.5 Levaansukraasi aktiivsuse määramine 

Levaansukraasi koguaktiivsuse määramine glükoosi tekke järgi 

Levaansukraasi koguaktiivsus määrati glükoosi moodustumise järgi sahharoosist, kasutades 

Glycose Liquicolor-i reaktiivi (Human GmbH, Saksamaa) ja eelnevalt väljatöötatud 

metoodikat (Visnapuu et al., 2008). Reaktsioonisegu sisaldas 0.02% Na-asiidiga McIllvaine’i 

puhvrit (pH 6.0), 100 mM sahharoosi ning rakuekstrakti või puhastatud valgu sobivat 

lahjendust. Reaktsioon tehti 37°C ning sobivatel ajapunktidel võeti 50 µl reaktsioonisegu, 

pipeteeriti see 150 µl Tris (trishüdroksümetüülaminometaan) puhvrile (200 mM; pH 8.3) ning 

reaktsioon peatati proovi kuumutamisega 5 min 96°C. Tekkinud glükoosi hulk määrati 

Glycose Liquicolor-i reaktiiviga vastavalt tootjapoolsetele soovitustele. Ensüümi 

koguaktiivsus väljendati sahharoosi hüdrolüüsil vabanenud glükoosi kogusena mikromoolides 

ühes minutis mg valgu kohta (U/mg). 

Puhastatud mutantsete levaansukraaside afiinsus sahharoosile (K m ), maksimaalne 

reaktsioonikiirus (V max ) ja rafinoosi inhibitsioonikonstant K i määrati glükoosi tekke järgi. 

Reaktsioonisegud sisaldasid erineva kontsentratsiooniga sahharoosi (15, 20, 30, 50, 100 või 

200 mM), asiidiga McIllvaine’i puhvrit ja samas puhvris lahjendatud puhastatud 

levaansukraasi. K i määramiseks mõõdeti levaansukraaside koguaktiivsust erinevatel 

sahharoosi kontsentratsioonidel, kui segusse oli lisatud 100 mM rafinoos. Mutantsete valkude 

kineetilised parameetrid arvutati Michaelis-Menteni võrrandi alusel, kasutades programmi 

SigmaPlot 2001 (SYSTAT, USA) ensüümikineetika moodulit (Enzyme Kinetics Module 1.1). 

Katalüütiline konstant k cat (1/min) arvutati võttes arvesse vastava valgu V max väärtust ja 

ensüümi molekulmassi. Molekulmassid valkudele Pro222Leu (49589 g/mol), Asp225Ala 

(49529 g/mol) ja Asp225Asn (49572 g/mol) arvutati ExPasy serveris 

(http://expasy.org/tools/pi_tool.html). Katalüütiline efektiivsus (1/M*min) leiti k cat ja K m 

jagatise kaudu. 

Redutseerivate suhkrute määramine 

Levaansukraaside rafinoosi ja sahharoosi, mis on mõlemad mitteredutseerivad suhkrud, 

hüdrolüüsiva aktiivsuse võrdlemiseks määrati redutseerivate suhkrute teket rakuekstraktide ja 

puhastatud Lsc3 valkudega, kasutades 3,5-dinitrosalitsüülhappe (DNSA) reaktiivi (Miller, 

1959). Reaktsioon toimus temperatuuril 37°C ning inkubatsioonisegu (1.5 ml) sisaldas 0.02% 

Na-asiidiga McIllvaine’i puhvrit (pH 6.0), kuhu oli lisatud 100 mM rafinoosi või 100 mM 

18

sahharoosi (puhastatud valkude puhul vastavalt 400 mM rafinoosi või sahharoosi) ning 

levaansukraasi sisaldava rakuekstrakti või valgupreparaadi lahjendust. Erinevates 

ajapunktides eemaldati 200 μl reaktsioonisegu ning lisati see 400 μl DNSA reaktiivile. 

Reaktsiooni peatamiseks kuumutati proove 100°C 5 min ning jahutati jääl. Lisati 800 μl 

destilleeritud vett ning mõõdeti lahuse optiline tihedus (OD 540 ) (Visnapuu et al., 2008). 

Ensüümiaktiivsus väljendati sahharoosist või rafinoosist 1 min jooksul moodustunud 

redutseerivate suhkrute kogusena mikromoolides mg valgu kohta (U/mg). 

K m -i ja V max -i määramiseks rafinoosile mõõdeti mutantsetel levaansukraasidel redutseerivate 

suhkrute teket järgmistel rafinoosi kontsentratsioonidel: 25, 50, 100, 200 ja 300 mM. 

Vastavad kineetilised parameetrid rafinoosile arvutati, nagu on kirjeldatud eespool sahharoosi 

korral. 

Transfruktosüleeriv aktiivsus 

Levaansukraasi polümeriseeriv ehk transfruktosüleeriv aktiivsus (TA) määrati ensümaatilisel 

meetodil, mõõtes reaktsioonisegus vaba glükoosi ja fruktoosi hulka, mille vahe kaudu saab 

välja arvutada, kui suur osa reageerinud sahharoosis sisalduvast fruktoosist 

polümeriseeritakse (van Hijum et al., 2001; Yanase et al., 2002; Toomemaa, 2007). 

Inkubatsioonisegu sisaldas 0.02% Na-asiidiga McIllvaine’i puhvrit (pH 6.0), 1200 mM 

sahharoosi ja 2.7 U/ml puhastatud levaansukraasi või 50 µl rakulüsaati mutantide puhul, 

millel koguaktiivsus praktiliselt puudus. Valkude aktiivsuse arvutusteks kasutati 100 mM 

sahharoosist glükoosi tekke järgi aktiivsuse määramisel saadud tulemusi. Reaktsioon toimus 

temperatuuril 37°C 20 h jooksul ja lõpetati proovide kuumutamisega 5 min 96°C. Segudest 

tehti destilleeritud vette sobivad lahjendused ning pipeteeriti 10 µl proovi küvetti, mis sisaldas 

970 μl reaktsioonipuhvrit (5 mM MgCl 2 , 2 mM β-NAD, 1.1 mM ATP, glükoos-6-fosfaadi 

dehüdrogenaas 2.8 U, 200 mM imidasoolpuhver; pH 6.9). Määrati optilist tihedust (OD 340 ) 

heksokinaasi (1.5 U) ning fosfoglükoisomeraasi (1.4 U) lisamisel ja polümeriseeriv aktiivsus 

arvutati valemiga ([Glc]-[Fru v ])/[Glc])*100, kus [Glc] näitab glükoosi ja [Fru v ] vaba 

polümeriseerimata fruktoosi kontsentratsiooni reaktsioonisegus. TA väljendati protsendina, 

mis näitab polümeriseerimisproduktidesse lülitatud fruktoosi osakaalu. 

Valgu kontsentratsiooni määramiseks kasutati Lowry meetodit (Lowry et al., 1951). 

2.2.6 Mutantsete levaansukraaside puhastamine Ni +2 -afiinsuskromatograafiaga 

E. coli BL21(DE3) transformante, mis sisaldasid ekspressioonikonstrukte pURI3-lsc3P222L, 

pURI3-lsc3D225A või pURI3-lsc3D225N, kasvatati, mutantse levaansukraasi ekspressioon 

indutseeriti ning rakuekstrakt valmistati, nagu on näidatud peatükis 2.2.4. Valkude 

19

puhastamisel lähtuti E. Kallase kasutatud metoodikast, mida kohandati Lsc3 valgule (Kallas, 

2010). Saadud 10 ml rakulüsaadile lisati 400 μl Ni 2+ -NTA agaroosi (Hispanagar, Hispaania) 

ja inkubeeriti 2 h 4°C end-over-end segajal (Bio RS-24, BioSan, Läti), et levaansukraas 

seonduks maatriksile. Ni 2+ -maatriks tsentrifuugiti põhja (380 g, 1 min, 4°C) ning pesti kaks 

korda 5 ml sonikeerimispuhvriga. Ni 2+ -maatriks suspendeeriti 2 ml sonikeerimispuhvris ja 

kanti ilma membraanita RNA minikolonnidele ning tsentrifuugiti (380 g, 1 min, 4°C). 

Seejärel levaansukraasi valgud elueeriti maatriksilt 1 ml elueerimispuhvriga (500 mM 

imidasool, 50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 10% glütserool; pH 6.0). Levaansukraasi 

sisaldavad eluaadid viidi Spectra/Por 3 dialüüsimembraani, mis ei lase läbi suuremaid 

molekule kui 3500 daltonit (Da) (Mw cut-off 3.5 kDa; Spectrum Laboratories, Holland). 

Valgulahust dialüüsiti 4°C 24 h Na-asiidi sisaldavas McIllvaine’i puhvris (pH 6.0). Seejärel 

kaeti membraanid polüetüleenglükooliga, mille molekulmass on 8000 Da (PEG8000; 

SIGMA, USA), ning kontsentreeriti 4°C, kuni lahuse maht vähenes ligi kaks korda. Saadud 

levaansukraasi lahust kasutati puhta valgupreparaadina. Kõikidest valgu puhastamise 

etappidest võeti proovid ning neid analüüsiti denatureerival polüakrüülamiidgeelil (SDS- 

PAGE) (pt. 2.2.7). 

2.2.7 Geelelektroforees 

DNA fragmentide lahutamiseks ja plasmiidse DNA kontrolliks kasutati elektroforeesi 1% 

agaroosgeelil 0.5 x TAE puhvris (40 mM Tris-atsetaatpuhver, 1 mM EDTA; pH 8.2). 

Agaroosgeel sisaldas etiidiumbromiidi (0.35 μg/ml). Geelile kantavatele segudele lisati 

glütserooli sisaldavat geelivärvi (1x DNA Loading Dye, Fermentas) ja geelelektroforees 

toimus toatemperatuuril 0.5 x TAE puhvris ning pingel 10 V/cm. DNA fragmendid tehti 

nähtavaks ultraviolettvalguses UV Transillumnator-iga (UVP, USA). Produktide suuruse 

määramiseks kasutati GeneRuler 1 kb DNA markerit (Fermentas). 

Rakulüsaatides sisalduvad valgud lahutati nii denatureeriva (SDS) kui ka natiivse 

(mittedenatureeriva) polüakrüülamiidgeelelektroforeesiga (PAGE). Natiivne 7.5% PAGE geel 

valmistati standardprotokolli järgi (Sambrook et al., 1989; Visnapuu et al., 2008). Geeli rajale 

kanti 20 μg rakuekstrakti, mis oli suspendeeritud 50% glütserooliga broomfenoolsinise 

lahuses. Geel voolutati Hoefer-i (USA) geelelektroforeesi süsteemiga madalal temperatuuril 

(4°C) 10 V/cm ja voolutuspuhvrina kasutati 0.5 x TBE puhvrit (pH 8.3). Tehti paralleelleselt 

2 natiivset PAGE geeli – üks ilmutati aktiivsuse järgi toatemperatuuril 10% sahharoosiga 

McIllvaine’i puhvris (pH 6.0) ligi 20 h ning teine geel värviti valgule Coomassie Brilliant 

Blue G250 (Serva, Saksamaa) lahusega. 

20

Denatureeriv polüakrüülamiidgeelelektroforees (SDS-PAGE) tehti tritsiin-SDS-PAGE 

geeliga (Schägger, 2006). Geeli rajale kanti 10 μg rakulüsaati või 1 µg puhastatud 

levaansukraasi, mis oli eelnevalt suspendeeritud 1 x Laemmli puhvris (Laemmli, 1970) ning 

kuumutatud 5 min 96°C. Geelid voolutati Mini-PROTEAN Tetra süsteemiga (BIO-RAD, 

USA) toatemperatuuril ja pingel 11 V/cm. Seejärel geel värviti Coomassie Brilliant Blue 

G250 lahusega ning levaansukraaside ligikaudset molekulmassi hinnati valkude 

suurusmarkeris PageRuler TM SM0671 (Fermentas) sisalduvate valkude liikumise alusel. 

Positiivse kontrollina kanti geelidele ka 1 µg meie töögrupis eelnevalt puhastatud Lsc3 

muteerimata valku. 

2.2.8. Õhukese kihi kromatograafia 

Levaansukraasi reaktsiooniproduktide lahutamiseks kasutati õhukese kihi kromatograafiat 

(Thin Layer Chromatography – TLC). Reaktsioonisegu oli samasugune, nagu kasutati 

transfruktosüleeriva aktiivsuse määramiseks (vt. pt. 2.2.5). 0.5 μl 4x destilleeritud vees 

lahjendatud proovi kanti koos sama koguse markersuhkrutega kontsentreeriva tsooniga TLC 

plaadi stardijoonele (Silica gel 60 F254; Merck, Saksamaa). Markeriteks kasutati 2% levaani, 

25 mM kestoosi ja nüstoosi ning 0.1 M fruktoosi ja sahharoosi. Kromatograafiaplaati 

voolutati kaks korda seguga kloroform-metanool-vesi (90:65:15) (Tajima et al., 2000). 

Fruktoosi sisaldavate suhkrute ilmutamiseks kasteti plaat uurea reaktiivi (3% uurea, 1 M 

fosforhape veega küllastatud butanoolis) ja kuumutati temperatuuril 120°C ~10 min kuni 

suhkrulaikude värvumiseni (St. John et al., 1996). 

2.3 Tulemused ja arutelu 

2.3.1 Levaansukraasi Lsc3 võimalike katalüütiliste aminohapete ennustamine ja 

vastavate mutantide konstrueerimine 

Levaansukraas on ensüüm, mis hüdrolüüsib sahharoosi või mõne muu sobiva substraadi 

glükosiidsidet ning polümeriseerib fruktoosi jäägid polüsahhariidseks levaaniks või 

oligosahhariidideks. Tomati ja müürlooga (Arabidopsis thaliana) patogeeni P. syingae pv. 

tomato DC3000 genoomis on kolm levaansukraasi kodeerivat geeni: lsc1, lsc2 ja lsc3 (Buell 

et al., 2003; Visnapuu et al., 2008), mille täpsed funktsioonid on seni teadmata. Antud töös 

uuritakse põhjalikumalt Lsc3 valku ning selle mutante. Eelnevalt on meie töögrupis 

konstrueeritud Lsc3 valgu ekspressiooniplasmiid pHIPMalprom-lsc3, millega saab E. coli’s 

levaansukraasi heteroloogiliselt ekspresseerida. Levaansukraasi eriaktiivsus rekombinantsetes 

rakuekstraktides oli kõrge ja Lsc3 valk moodustas raku valkudest olulise osa – kuni 20%. 

21

Leiti, et Lsc3 kasutab substraadina hüdrolüüsi- ja polümerisatsiooniproduktide tootmiseks 

lisaks sahharoosile ka rafinoosi ja stahhüoosi ning ensüümi afiinsus sahharoosile oli ligi kaks 

korda suurem kui teistele substraatidele (Visnapuu, 2007; Visnapuu et al., 2008). Lisaks 

polümeersele levaanile toodab Lsc3 ka lühemaid oligosahhariide, millel võib olla prebiootilist 

toimet (Visnapuu et al., 2009). 

Käesoleva töö eesmärgiks oli levaansukraasi Lsc3 võimalike katalüüsis oluliste aminohapete 

ennustamine, vastavate mutantide konstrueerimine ja mutatsioonide mõju hindamine Lsc3 

koguaktiivsusele, katalüütilistele parameetritele ja polümerisatsiooniproduktide tekkele. 

Kõigepealt joondati Z. mobilis’e, G. diazotrophicus’e ja Rahnella aquatilis’e levaasukraaside 

järjestused Lsc3-ga (Joonis 2). Järjestused valiti gramnegatiivsete bakterite levaansukraaside 

hulgast, sest need valgud on suhteliselt sarnased ja joonduvad omavahel hästi. 

Grampositiivsete bakterite levaansukraasid on aga pikemad, järjestuselt gramnegatiivsete 

bakterite levaansukraasidest rohkem erinevad ja seetõttu halvemini nendega joonduvad. Nii P. 

syringae DC3000 Lsc3 valgu kui ka teiste gramnegatiivsete bakterite levaansukraaside 

valgujärjestused võeti CAZy andmebaasist (http://www.cazy.org). Joonduseks kasutati 

programmi BioEdit moodulit ClustalW (Thompson et al., 1994). Vastavate valkude joondus 

on esitatud Joonisel 2 ning välja on toodud konserveerunud katalüütilised aminohapped. 

Valkude struktuuri ja funktsiooni vaheliste seoste uurimiseks kasutatakse tihti koht-suunatud 

mutageneesi. Selleks tekitatakse valku kodeerivasse geeni punktmutatsioonid, millega 

vahetub aminohappe koodon, ning mutantseid valke iseloomustades hinnatakse vastava 

aminohappe asenduse mõju. Näiteks G. diazotrophicus’e LsdA valgu kristallstruktuuri alusel 

ennustati, et katalüütilise kolmiku aminohapped on Asp135 (nukleofiil), Asp309 

(stabiliseerija) ja Glu401 (alus-hape katalüüsija) (Martinez-Fleites et al., 2005) (Tabel 1; 

Joonis 1 ja 2). LsdA koht-suunatud mutageneesiga on eksperimentaalselt tõestatud Asp309 ja 

Asp135 olulisus: mutantidel Asp309Asn ja Asp135Asn oli väga tugevasti langenud 

katalüüsivõime (vt. pt. 1.3.2) (Batista et al., 1999; Martinez-Fleites et al., 2005). 

Ennustasime levaansukraasi valkude joonduse abil (Joonis 2) võimalikud Lsc3 valgu 

katalüütilise kolmiku aminohappeid: nukleofiil Asp62, RDP-motiivis asuv stabiliseerija 

Asp219 ja alus-hape katalüüsija Glu303. 

22

80 90 100 110 120 130 140 

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 

Ps PLVDNIKYPP-----TVWSRADALKVNEN------------DPTTTQPLVSADFPVMSDTVFIWDTMPLR 67 

Gd SIHTQQAYDPQSDFTARWTRADALQIKAHSDATVAAGQNSLPAQLTMPNIPADFPVINPDVWVWDTWTLI 140 

Zm MLNKAGIAEP-----SLWTRADAMKVHTD------------DPTATMPTIDYDFPVMTDKYWVWDTWPLR 53 

Ra --MTNLNYTP-----TIWTRADALKVNEN------------DPTTTQPIVDADFPVMSDEVFIWDTMPLR 51 

150 160 170 180 190 200 210 

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 

Ps ELDGTVVSVNGWSVIITLTADRHPDDPQYLGPDGRYDIKRDWEDRHGRARMCYWYSRTGK---------D 128 

Gd DKHADQFSYNGWEVIFCLTADPN--------------AGYGFDDRHVHARIGFFYRRAGIPASRRPVNGG 196 

Zm DINGQVVSFQGWSVIFALVADR---------------TKYGWHNRNDGARIGYFYSRGGS---------N 99 

Ra SLDGTVVSVDGWSVIFTLTAQRNNNNSEYLDAEGNYDITSDWNNRHGRARICYWYSRTGK---------D 112 

220 230 240 250 260 270 280 

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 

Ps WIFGGRVMAEGVSPTT---------REWAGTPILLNDKGD-IDLYYTCV-----------TPG-AAIAKV 176 

Gd WTYGGHLFPDGASAQVYAGQTYTNQAEWSGSSRLMQIHGNTVSVFYTDVAFNRDANANNITPPQAIITQT 266 

Zm WIFGGHLLKDGANPRS---------WEWSGCTIMAPGTANSVEVFFTSVND---------TPSESVPAQC 151 

Ra WIFGGRVMAEGVSPTS---------REWAGTPILLNEDGD-IDLYYTCV-----------TPG-ATIAKV 160 

RDP-motiiv 

Nukleofiil 

290 300 310 320 330 340 350 

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 

Ps RGRIVTSDQGVELKDFTQVKKLFEADGTYYQTEAQNSSWNFRDPSPFIDPND-GKLYMVFEGNVAGERGS 245 

Gd LGRIHADFNHVWFTGFTAHTPLLQPDGVLYQNGAQNEFFNFRDPFTFEDPKHPGVNYMVFEGNTAGQRGV 336 

Zm KGYIYADDKSVWFDGFDKVTDLFQADGLYYADYAENNFWDFRDPHVFITPKI-GKTYALFEGNVAMERGT 220 

Ra RGKVLTSEEGVTLAGFNEVKSLFSADGVYYQTESQNPYWNFRDPSPFIDPHD-GKLYMVFEGNVAGERGS 229 

Alus-hape katalüüsija 

360 370 380 390 400 410 420 

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 

Ps HTVGVAELGPVP--PGHEDVG-----GARFQVGCIGLAVAKDLSGEEWEILPPLVTAVGVNDQTERPHYV 308 

Gd ANCTEADLGFRPNDPNAETLQEVLDSGAYYQKANIGLAIATDSTLSKWKFLSPLISANCVNDQTERPQVY 406 

Zm VAVGEEEIGPVP--PKTETPD-----GARYCAAAIGIAQALNEARTEWKLLPPLVTAFGVNDQTERPHVV 283 

Ra HVIGKQEMGTLP--PGHRDVG-----NARYQAGCIGMAVAKDLSGDEWEILPPLVTAVGVNDQTERPHFV 292 

430 440 450 460 470 480 490 

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 

Ps FQDGKYYLFTISHKFTYADGVTGPDGVYGFVGEH-LFGPYRPMN-ASGLVLGNPPEQ------------- 363 

Gd LHNGKYYIFTISHRTTFAAGVDGPDGVYGFVGDG-IRSDFQPMNYGSGLTMGNPTDLNTAAGTDFDPSPD 475 

Zm FQNGLTYLFTISHHSTYADGLSGPDGVYGFVSENGIFGPYEPLN-GSGLVLGNPSSQ------------- 339 

Ra FQDGKYYLFTISHKFTYADGLTGPDGVYGFLSDN-LTGPYSPMN-GSGLVLGNPPSQ------------- 347 

500 510 520 530 540 550 560 

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 

Ps ----PFQTYSHCVMPNGLVTSFIDSVPTTGED-YRIGGTEAPTVRILLKGDRSFVQEEYD------YGYI 422 

Gd QNPRAFQSYSHYVMPGGLVESFIDTVEN------RRGGTLAPTVRVRIAQNASAVDLRYGNGGLGGYGDI 539 

Zm ----PYQAYSHYVMTNGLVTSFIDTIPSSDPNVYRYGGTLAPTIKLELVGHRSFVTEVKG------YGYI 399 

Ra ----PFQTYSHCVMPNGLVTSFIDNVPTSDGN-YRIGGTEAPTVKIVLKGNRSFVERVFD------YGYI 406 

Joonis 2. Väljavõte nelja gramnegatiivsest bakterist pärineva levaansukraasi joondusest. 

Joondus on esitatud ilma N- ja C-terminaalsete osadeta: P. syringae pv. tomato Lsc3 (Ps) 

positsioonidest 15-422 (täispikkus 431 ah), G. diazotrophicus’e LsdA positsioonidest (Gd) 

71-539 (täispikkus 584 ah), Z. mobilis’e LevU (Zm) positsioonidest 1-399 (täispikkus 423 

ah), R. aquatilis’e LsrA (Ra) positsioonidest 1-406 (täispikkus 415 ah). Joondus tehti 

programmiga ClustalW (Thompson et al., 1994). Identsed aminohapped on näidatud mustal 

taustal ja sarnased hallil taustal. Roosa taustaga on märgitud käesolevas töös uuritud Lsc3 

mutandid, kus on asendatud aspartaadid positsioonides 62, 219 või 225, proliin positsioonis 

222 või glutamaat positsioonis 303 (vt. Tabel 2). 

23

Et katseliselt kinnitada Asp62 ja Glu303 kuuluvust katalüütilisse kolmikusse, muteeriti 

vastavad aspartaadi koodonid lsc3 geenis alaniini koodoniteks (vt. Tabel 2). Mutantsed lsc3 

geenid saadi nn. megapraimeri meetodiga (pt. 2.2.2), mis põhineb lsc3 geenilõigu 

paljundamisel mutatsiooni sisaldava praimeriga ning järjestuse edasisel pikendamisel (Wei et 

al., 2004; Tiirik, 2010). Mutatsiooni sisaldavad lsc3 geenid kloneeriti restriktaasi- ja 

ligeerimisvaba metoodikat kasutades vektorisse pURI3 (pt. 2.2.2; Geiser et al., 2001; Rivas et 

al., 2007). Selles vektoris geeni ekspresseerides liitub valgule N-terminaalne His 6 -järjestus, 

millega valk seondub Ni 2+ -agaroosile, ning võimaldab seega valgu lihtsat puhastamist E. coli 

transformandi rakuekstraktist. Konstrueerisime plasmiidid pURI3-lsc3D62A ning pURI3- 

lsc3E303A (Tabel 2, LISA 1). 

Meie töörühmas on eelnevalt valmistatud Lsc3 mutandid Asp219Ala, Asp219Asn, 

Asp225Ala, Asp225Asn, millele vastavad geenid on kloneeritud Hansenula polymorpha 

maltaasi geeni promootori kontrolli alla vektorisse pHIPMalprom. Oletasime, et Asp219 

võiks olla Lsc3 valgu katalüütiline aminohape (stabiliseerija). Samas mõjutab Asp225 

asendamine Lsc3 valgus katalüütilist aktiivsust vähe ning ilmselt see aminohape katalüütilisse 

kolmikusse ei kuulu (Tiirik, 2010). Käesoleva töö raames kloneeriti eelpool nimetatud 

mutantsed lsc3 järjestused pURI3 vektorisse, et uurida puhastatud mutantsete valkude 

omadusi ja kinnitada nende aminohapete positsioonide eelneval uurimisel saadud tulemusi. 

Vastavat mutatsiooni sisaldav levaansukraasi geen amplifitseeriti sobivatest pHIPMalprom 

konstruktidest spetsiifiliste pikkade praimeritega (Lsc3pURI3Fw ja Lsc3pURI3Rev), mis 

tekitavad levaansukraasi geeni otstele pURI3 vektoriga komplementaarsed järjestused, ning 

geenid kloneeriti vektorisse pURI3. Saadi plasmiidid pURI3-lsc3D219A, pURI3-lsc3D219N, 

pURI3-lsc3D225A, pURI3-lsc3D225N (Tabel 2). 

Kuna meie töörühmas on levaansukraasi keemilise mutageneesi teel saadud raamatukogust 

isoleeritud juhuslik mutant Pro222Leu (Mardo, 2011), mille mutatsioon asub aktiivtsentri 

läheduses, siis puhastasime ka selle mutantse valgu ja uurisime tema omadusi. 

Saadud plasmiidid transformeeriti E. coli tüvesse DH5α ja transformandid plaaditi LB 

söötmetassidele, kuhu oli lisatud kolooniate selektsiooniks ampitsilliini (pt. 2.2.4). 

Kolooniatel kontrolliti lsc3 geeni olemasolu PCR-iga, eraldati plasmiidne DNA ning 

mutatsioonide asukohta kontrolliti lsc3 geeni järjestuse sekveneerimisega (pt. 2.2.3). 

24

2.3.2 Levaansukraasi mutantide iseloomustamine ja katalüütilise kolmiku 

aminohapete identifitseerimine 

2.3.2.1 Mutantsete levaansukraaside ekspresseerimine, transformantide 

fenotüübi uurimine ning levaansukraasi koguaktiivsused rakuekstraktides 

E. coli BL21(DE3) transformante, mis sisaldasid plasmiide pURI3-lsc3D62A, pURI3- 

lsc3D219A, pURI3-lsc3D219N, pURI3-lsc3P222L, pURI3-lsc3D225A, pURI3-lscD225N või 

pURI3-lsc3E303A, kasvatati LB Amp tardsöötmel. Võrdlemaks metsiktüüpi ja mutantsete 

levaansukraaside fenotüüpi, külvati transformandid IPTG-ga ja 10% sahharoosiga LB Amp 

söötmetassidele (Joonis 3). Kontrollina kasutasime ilma levaansukraasita tühja vektorit 

pURI3 sisaldavat ja muteerimata Lsc3 valku ekspresseerivat E. coli transformanti. Sahharoosi 

sisaldaval LB tardsöötmel lähevad limaseks nende transformantide kolooniad, mis 

ekspresseerivad katalüütiliselt aktiivset levaansukraasi ja toodavad sahharoosist 

polüsahhariidset levaani. 

Joonis 3. Tühja vektorit (pURI3), muteerimata levaansukraasi (Lsc3 wt) ja mutantseid 

levaansukraase sisaldavatele E. coli BL21(DE3) transformantidele iseloomulikud 

kasvufenotüübid 1 mM IPTG-d ja 10% sahharoosi sisaldaval LB Amp söötmel. 

Jooniselt 3 on näha, et Lsc3 mutandid Asp62Ala, Asp219Ala, Asp219Asn ning Glu303Ala on 

kaotanud võime toota levaani (lima), kuid Pro222 muteerimine leutsiiniks ning Asp225 

muteerimine alaniiniks või asparagiiniks ei ole transformantide fenotüüpi oluliselt muutnud. 

Transformante kasvatasime, indutseerisime levaansukraasi tootmise ning valmistasime 

rakuekstraktid, nagu on kirjeldatud peatükis 2.2.4. Lahutasime E. coli rakuekstraktid 

denatureerivas polüakrüülamiidgeelis ja värvisime Coomassie Brilliant Blue lahusega (pt. 

2.2.7), et kontrollida levaansukraasi valkude ekspressiooni ning välistada võimalus, kus 

mutantsete levaansukraaside aktiivsus puudub sellepärast, et valgu ekspressioon on 

vähenenud. Geelile kandsime 10 µg mutantseid Lsc3 valke ekspresseerivaid või tühja vektorit 

sisaldavat E. coli rakuekstrakte, puhastatud Lsc3 muteerimata valku ja valgu suurusmarkerit 

PageRuler TM SM0671 (Fermentas) (Joonis 4). 

25

M 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. M 

Joonis 4. SDS-PAGE-iga lahutatud levaansukraase sisaldavd E. coli transformantide 

rakuekstraktid. Rajad: 1. pURI3 (tühi vektor); 2. Lsc3 D62A; 3. Lsc3 D219A; 4. Lsc3 

D219N; 5. Lsc3 E303A; 6. puhastatud muteerimata Lsc3 valk; 7. Lsc3 wt; 8. Lsc3 P222L; 9. 

Lsc3 D225A; 10. Lsc3 D225N; M on suurusmarker PageRuler TM SM0671 (Fermentas). 

Nägime, et uuritavate levaansukraasi mutantide rakuekstraktid sisaldavad suures koguses 

valku, mis on SDS-geelis samasuguse liikuvusega nagu muteerimata levaansukraas. See 

tõestab, et muteeritud valgud ekspresseeruvad hästi ning muutused valkude aktiivsuses 

tulenevad nende erinevatest omadustest, mitte valgu hulga vähenemisest rakuekstraktis. 

Ainuke erand oli Lsc3 mutant Asp219Asn, mis rekombinantses rakuekstraktis ei 

ekspresseerunud. 

Et kontrollida levaansukraaside ensümaatilist aktiivsust, lahutasime rekombinantsed 

rakuekstraktid mittedenatureerivas polüakrüülamiidgeelis. Paralleelset valmistasime kaks 

natiivset geeli – ühe ilmutasime levaani sünteesi järgi toatemperatuuril McIllvaine’i puhvriga 

(pH 6.0) 10% sahharoosi lahuses ning teise geeli värvisime valgu järgi. Kontrollina kandsime 

geelile puhastatud muteerimata Lsc3 valku ning tühja vektorit sisaldavat E. coli rakuekstrakti 

(Joonis 5). 

26

1. 2. 3. 4. 5. 6. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 

7. 8. 9. 10. 7. 8. 9. 10. 

Joonis 5. Natiivsed polüakrüülamiidgeelid mutantsete levaansukraaside aktiivsuse 

hindamiseks E. coli rakulüsaatides. Paneelidel A ja C on 10% sahharoosi lahuses ilmutatud ja 

paneelidel B ja D valgule värvitud geelid. Rajad: 1. pURI3 (tühi vektor); 2. Lsc3 D62A; 3. 

Lsc3 D219A; 4. Lsc3 D219N; 5. Lsc3 E303A; 6. ja 10. puhastatud muteerimata Lsc3 valk; 7. 

Lsc3 P222L; 8. Lsc3 D225A; 9. Lsc3 D225N. 

Geelipiltidelt on näha, et Lsc3 mutandid Asp62Ala, Asp219Ala ning Glu303Ala ei tooda 

sahharoosiga ilmutatud geelil levaani (Joonis 5A), kuid paralleelselt tehtud ning valgule 

värvitud teine natiivne geel näitas, et mutantsete levaansukraaside ekspressioon oli olemas 

(Joonis 5B). Mutandil Asp219Asn ekspressioon puudus nagu nägime eelnevalt ka 

denatureeriva geeli analüüsil (Joonis 4). Mutantide Pro222Leu, Asp225Ala ning Asp225Asn 

rakuekstraktid sisaldasid suurel hulgal katalüütiliselt aktiivset levaansukraasi valku, mis oli 

võimeline sahharoosist levaani tootma (Joonis 5C, D). 

Järgmisena määrati rekombinantsetest rakulüsaatidest levaansukraasi koguaktiivsus, mõõtes 

100 mM sahharoosist moodustuvat glükoosi hulka (pt. 2.2.5). Saadud tulemused on 

koondatud Tabelisse 3. 

27

Tabel 3. Levaansukraasi koguaktiivsused rekombinantsetes E. coli BL21(DE3) 

rakulüsaatides. Ära on toodud kasutatud plasmiid, levaansukraasi kahe paralleelse määramise 

tulemusel saadud eriaktiivsus (U/mg) ning standardhälve. Tabeli kolmas lahter näitab 

protsentides, kui suure osa moodustas mutantse valgu eriaktiivsus muteerimata valgu 

eriaktiivusest. 

Levaansukraasi eriaktiivsus Säilinud eriaktiivsus 

Plasmiid 

(U/mg)* 

(%) 

pURI3-lsc3 (Lsc3 wt) 157.7 ± 8.2 100 

pURI3-lsc3D62A 0.01 ± 0.001 0.006 

pURI3-lsc3D219A 0.03 ± 0.001 0.02 

pURI3-lsc3D219N 0.01 ± 0.003 0.006 

pURI3-lsc3P222L 107.0 ± 0.05 68 

pURI3-lsc3D225A 154.1 ± 3.4 98 

pURI3-lsc3D225N 189.6 ± 5.7 120 

pURI3-lsc3D303A 0.04 ± 0.002 0.03 

pURI3 0.01 ± 0.003 0.006 

* Sahharoosi sisaldus reaktsioonisegus oli 100 mM ning reaktsioon toimus 37°C. 

Tabel 3 näitab, et mutantidel D62A, D219A, D219N ja E303A oli levaansukraasi aktiivsus 

peaaegu täielikult kadunud. Samas oli mutandil Pro222Leu säilinud üle poole algse valgu 

eriaktiivsusest ja mutant Asp225Ala oli väga sarnane muteerimata levaansukraasiga. 

Huvitaval kombel oli mutandil Asp225Asn, millel negatiivselt laetud aspartaat oli asendatud 

polaarse ja laadumata asparagiiniga, oli eriaktiivsus ligi viiendiku võrra tõusnud (Tabel 3). 

Rakulüsaatidest määratud mutantsete valkude koguaktiivsuste muster langeb üldjoontes 

kokku ka E. coli transformantide fenotüüpidega sahharoosi sisaldaval söötmel (Joonis 3) ning 

aktiivsuse järgi ilmutatud natiivse polüakrüülamiidgeeli katse tulemustega (Joonis 5A,C). Kui 

mutantset levaansukraasi ekspresseerivad bakterirakud sünteesisid söötmel ja geelis lahutatud 

rakuekstrakides levaani, oli ka vastavas lüsaadis ensüümi eriaktiivsus palju suurem kui lima 

mittesünteesival transformandil. 

Selleks, et kontrollida, kas mutantsete valkude substraadispetsiifikas on toimunud muutusi, 

määrasime rekombinantsetest rakulüsaatidest 100 mM sahharoosist ja rafinoosist 

redutseerivate suhkrute moodustumist (pt. 2.2.5) (Tabel 4). Kui sahharoosist tekivad 

levaansukraasi reaktsiooni käigus glükoos ja fruktoos, siis rafinoosist vabanevad fruktoos ja 

melibioos. Kõik mainitud suhkrud on redutseerivate omadustega ning neid saab määrata 

DNSA reaktiiviga. Eelnevalt on meie töögrupis näidatud, et sahharoos on Lsc3 valgule 

sobivam substraat kui rafinoos: 100 mM sahharoosist moodustub ~50% rohkem 

redutseerivaid suhkruid kui 100 mM rafinoosist (Visnapuu et al., 2008). 

28

Tabel 4. Levaansukraaside 100 mM sahharoosi ja rafinoosi hüdrolüüsiv aktiivsus (U/mg) 

rekombinantsetes rakulüsaatides määratuna redutseerivate suhkrute tekke järgi. Arvutatud on 

rafinoosi ja sahharoosi kasutamise suhe (%). 

Plasmiid 

Eriaktiivsus 

sahharoosiga (U/mg) 

Eriaktiivsus 

rafinoosiga (U/mg) 

Rafinoosi ja 

sahharoosi 

kasutamise suhe (%) 

pURI3-lsc3 (Lsc3 wt) 291.2 ± 9.5 127.0 ± 2.7 44 

pURI3-lsc3P222L 165.3 ± 4.3 74.0 ± 4.1 45 

pURI3-lsc3D225A 108.1 ± 1.2 54.8 ± 0.6 51 

pURI3-lsc3D225N 319.1 ± 0.8 148.0 ± 0.2 46 

Tabelist 4 on näha, et mutantsete valkude Pro222Leu, Asp225Ala ning Asp225Asn võime 

kasutada substraadina rafinoosi on väga sarnane muteerimata Lsc3 valguga – rafinoosist tekib 

redutseerivaid suhkruid ligi poole vähem kui sahharoosist. Kuna Lsc3 mutantidel Asp62Ala, 

Asp219Asn, Asp219Ala ja Glu303Ala levaansukraasi aktiivsus rakulüsaatides praktiliselt 

puudus, siis ei olnud neil võimalik sahharoosi ja rafinoosi kasutamise suhet määrata. 

2.3.2.2 Mutantsete valkude puhastamine ja nende kineetilised parameetrid 

Valkude puhastamiseks kasvatati vastavad E. coli transformandid ja indutseeriti neil 

levaansukraasi tootmine ning valmistati rakulüsaat, nagu on näidatud peatükis 2.2.4. N- 

terminaalse His 6 -järjestusega mutantsed Lsc3 valgud Pro222Leu, Asp225Ala ja Asp225Asn 

puhastati Ni +2 -afiinsuskromatograafiaga ning seondunud mutantsed levaansukraasid elueeriti 

Ni-maatriksilt 500 mM imidasooli sisaldava puhvriga. Levaansukraasi sisaldavad fraktsioonid 

segati kokku ning dialüüsiti McIllvaine’i puhvris (pH 6.0) (pt. 2.2.6). Kõikidest valkude 

puhastamise etappidest võeti proovid (5 µl), mida analüüsiti denatureerivas 

polüakrüülamiidgeelis (SDS-PAGE) (pt. 2.2.7). Vastavad geelid on ära toodud LISA-s 2. 

Nägime, et valkude puhastamise saagis oli hea ning elueeritud levaansukraas moodustas geelil 

ühe konkreetse bändi. Sellest võib järeldada, et preparaat sisaldas ainult levaansukraasi ning 

mitte teisi E. coli valke, mis võiksid edasisi katseid segada. 

Kontrollisime puhastatud valkudega, kas mutantsete levaansukraaside substraadispetsiifikas 

võis olla toimunud muutusi. Tulemused on näidatud Tabelis 5. 

29

Tabel 5. Levaansukraasi sahharoosi ja rafinoosi (400 mM) hüdrolüüsiv aktiivsus puhastatud 

valkudel määratuna redutseerivate suhkrute järgi. 

Levaansukraas 

Eriaktiivsus 

sahharoosiga (U/mg) 

Eriaktiivsus 

rafinoosiga (U/mg) 

Rafinoosi protsent 

sahharoosi 

eriaktiivsusest (%) 

Lsc3 P222L 631.3 ± 4.5 285.5 ± 6.0 45 

Lsc3 D225A 876.0 ± 17.7 363.6 ± 36.3 42 

Lsc3 D225N 1095.5 ± 34.5 438.9 ± 18.6 40 

Tabelist 5 on näha, et mutantide P222L, D225A ning D225N võime kasutada substraadina 

rafinoosi on jäänud suhteliselt sarnaseks muteerimata Lsc3 valguga. Saadud tulemused 

langevad kokku ka rakulüsaatides määratud vastavate väärtustega (Tabel 4). 

Puhastatud mutantsete levaansukraaside afiinsus sahharoosile (K m ), maksimaalne 

reaktsioonikiirus (V max ) ja inhibitsioonikonstant K i määrati glükoosi eraldumise järgi 

sahharoosist Glucose Liquicolor-i reaktiiviga. Puhastatud valkude K m ja V max rafinoosi suhtes 

määrati, mõõtes redutseerivate suhkrute teket rafinoosist. Ensüümi kineetilised parameetrid 

arvutati programmiga SigmaPlot 2001 (pt. 2.2.5). Vastavad Michaelis-Menteni ja Eadie- 

Hofstee tüüpi graafikud on toodud LISA-s 3 ning saadud tulemused esitatud Tabelis 6. 

Tabel 6. Puhastatud levaansukraaside afiinsused (K m ; mM) sahharoosile ja rafinoosile, 

maksimaalne reaktsioonikiirus (V max ; U/mg) ning rafinoosi inhibitsioonikonstant (K i ; mM). 

SAHHAROOS 

RAFINOOS 

Valk K m (mM) V max (U/mg) K i (mM) K m (mM) V max (U/mg) 

Lsc3 wt* 18.5 ± 2.5 610.5 ± 82.0 39.9 ± 6.1 44.8 ± 0.4 221.1 ± 5.7 

Lsc3 P222L 24.6 ± 2.7 452.8 ± 15.7 26.1 ± 3.0 29.8 ± 5.4 160.1 ± 7.9 

Lsc3 D225A 23.6 ± 3.4 589.9 ± 26.0 39.3 ± 6.5 29.4 ± 7.4 206.9 ± 14.0 

Lsc3 D225N 27.6 ± 6.2 830.8 ± 62.9 - 22.8 ± 5.4 248.7 ± 14.1 

* Võrdluseks toodud puhastatud muteerimata Lsc3 valgu andmed on saadud T. Visnapuult. 

- Vastavat parameetrit polnud võimalik arvutada, sest rafinoos ei inhibeerinud reaktsiooni. 

Selgus, et mutandil Pro222Leu on maksimaalne reaktsioonikiirus (V max ) nii sahharoosiga kui 

ka rafinoosiga, võrreldes algse valguga, veidi alanenud. Pro222Leu valgu afiinsus 

sahharoosile sarnaneb metsiktüüpi Lsc3 valgu omaga, kuid afiinus rafinoosile on veidi 

suurenenud. Mutantsel valgul Asp225Ala on säilinud algsele valgule väga sarnased omadused 

ning tundub, et selline asendus ei häiri Lsc3 katalüüsi. Mutandil Asp225Asn on V max 

sahharoosile ligikaudu 36% võrra tõusnud. Sarnast ensüümiaktiivsuse tõusu nägime ka 

rakulüsaadis (Tabel 3). Ensüümi maksimaalne reaktsioonikiirus oli kasvanud ka juhul, kui 

30

substraadiks oli rafinoos. Afiinsus rafinoosile oli paranenud. Kuigi eespool kirjeldatud 

sahharoosi ja rafinoosi hüdrolüüsiva aktiivsuse võrdlemisel tundus, et valgu Asp225Asn 

substraadispetsiifikas muutusi ei ole toimunud (Tabel 6), näitas kineetika uurimine 

Asp225Asn valgul selgesti afiinsuse tõusu rafinoosile. 

Seejärel arvutasime valkude katalüütilised konstandid ning katalüütilise efektiivsuse. 

Katalüütiline konstant k cat (1/min) arvutati võttes arvesse vastava valgu V max väärtust ja 

ensüümi molekulmassi ning katalüütiline efektiivsus (1/M*min) leiti k cat ja K m jagatise kaudu. 

Katalüütiline konstant vastab maksimaalsele substraadi molekulide arvule, mille reageerimist 

on üks ensüümimolekul (aktiivtsenter) ajaühikus võimeline katalüüsima. Tulemused on 

toodud Tabelis 7. 

Tabel 7. Puhastatud levaansukraaside katalüütilised konstandid (k cat ; 1/min) ja katalüütilised 

efektiivused (k cat /K m ; 1/M*min) nii sahharoosiga kui ka rafinoosiga. Toodud on ka 

muteerimata valgu vastavad parameetrid. 

SAHHAROOS 

RAFINOOS 

Valk 

k 

k cat (1/min) 

cat /K m k cat (1/min) k cat /K m 

(1/M*min) 

(1/M*min) 

Lsc3 wt* 3.03 x 10 4 164.0 x 10 4 1.10 x 10 4 24.5 x 10 4 

Lsc3 P222L 2.25 x 10 4 84.4 x 10 4 0.79 x 10 4 26.6 x 10 4 

Lsc3 D225A 2.92 x 10 4 111.0 x 10 4 1.02 x 10 4 34.9 x 10 4 

Lsc3 D225N 4.11 x 10 4 149.0 x 10 4 1.23 x 10 4 54.1 x 10 4 

* Võrdluseks toodud puhastatud muteerimata Lsc3 valgu andmed on saadud T. Visnapuult. 

Nägime, et Lsc3 mutandi Pro222Leu katalüütiline efektiivsus sahharoosiga langes ~2 korda. 

Valkudel Asp225Ala ja Asp225Asn polnud olulist katalüütilise efektiivsuse langust märgata 

(vastavad näitajad langesid metsiktüüpi valguga võrreldes ~1.5 ja ~1.1 korda). Kui 

substraadiks oli rafinoos, siis katalüütiline efektiivsus oli valkudel Asp225Ala ja Asp225Asn 

veidi tõusnud. 

2.3.2.3 Mutantsete Lsc3 valkude polümerisatsiooniproduktid 

Selleks, et uurida, kas mutantsete levaansukraaside polümeriseerivas ehk 

transfruktosüleerivas aktiivsuses on toimunud muutusi, määrati ensümaatilisel meetodil 

reaktsioonisegus tekkinud vaba glükoosi ja fruktoosi hulka (pt. 2.2.5). Levaansukraasi TA 

väljendati protsendina, mis näitab polümeriseeritud fruktoosi osakaalu reageerinud 

sahharoosis sisaldunud fruktoosist. Võimalike katalüütilise tsentri aminohapete mutantide 

puhul kasutati ensüümpreparaadina rakulüsaate, mutantide Pro222Leu, Asp225Ala ning 

31

Asp225Asn puhul aga puhastatud valke. Varem on meie töörühmas näidatud, et muteerimata 

Lsc3 valgu TA on 76% (T. Visnapuu, avaldamata andmed). Antud töös tehtud katse näitas, et 

valgu Lsc3 Asp62Ala mutandi TA on tunduvalt langenud – 37%-ni. Asp219Ala ja Glu303Ala 

mutantidel polnud TA muutunud ning sarnanes metsiktüüpi valguga. Siinkohal peab 

arvestama, et nendel mutantidel olid rakulüsaatides eriaktiivsused väga väikesed (vt. Tabel 3), 

mistõttu ei pruugi saadud tulemused olla tõepärased ning määramisi tuleks korrata puhastatud 

preparaatidega. Puhastatud Lsc3 P222L, D225A ja D225N valkudel polümeriseerivas 

aktiivsuses olulisi erinevusi, võrreldes metsiktüüpi valguga, ei leitud. Kirjandusest võib leida 

andmeid, kus levaansukraaside katalüütilise kolmiku aminohapete muteerimisel TA on jäänud 

samuti väga sarnaseks muteerimata algsele valgule, näiteks Z. mobilis’e LevU korral, kus 

stabiliseerija mutandil Asp194Asn oli TA samasugune nagu metsiktüüpi valgul (Yanase et 

al., 2002). 

Mutantsete levaansukraaside reaktsiooniprodukte uurisime ka õhukese kihi kromatograafiaga 

(TLC) (Joonis 6). Reaktsioonisegud ja TLC tehti, nagu on näidatud eespool (pt. 2.2.5 ja 

2.2.8). 

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 

Joonis 6. Mutantsete valkude polümerisatsiooniproduktide lahutamine õhukese kihi 

kromatograafiaga. Reaktsioonisegud sisaldasid 1.2 M sahharoosi. Rajad: 1. markerid: levaan 

(2%), kestoos PA 3 (25 mM) ja fruktoos (0.1 M); 2. Markerid: nüstoos PA 4 (25 mM) ja 

sahharoos (0.1 M); 3. Lsc3 wt puhastatud valk; 4. Lsc3 D62A; 5. Lsc3 D219A; 6. Lsc3 

E303A; 7. Lsc3 D225A; 8. Lsc3 D225N; 9. Lsc3 P222L. F – fruktoos; S – sahharoos; K – 

kestoos; N – nüstoos; L – levaan. 

Õhukese kihi kromatograafiaga saadud tulemuste analüüs kinnitas, et Lsc3 mutantsetel 

valkudel D62A, D219A ning E303A polümeriseeriv aktiivsus praktiliselt puudus: tekkinud oli 

väga vähe polümerisatsiooniprodukte. Kõige inaktiivsem tundus olevat D62A mutant, sest 

peale substraadina reaktsioonisegusse lisatud sahharoosi polnud muid komponente võimalik 

32

eristada. Valkude Lsc3 D225A, D225N ja D225A sünteesitavate produktide spekter jäi aga 

sarnaseks Lsc3 muteerimata valguga. Tekkinud oli nii nüstoosi, kestoosi kui ka 

polüsahhariidset levaani, mis ei liikunud kromatograafiaplaadi stardijoonelt. 

2.3.2.4 Valgu Lsc3 katalüütilise kolmiku aminohapete identifitseerimine 

Mutantsete valkude analüüsil selgus, et suure tõenäosusega moodustavad Lsc3 valgu 

katalüütilise kolmiku Asp62, Asp219 ja Glu303, mis võiksid olla vastavalt nukleofiiliks, 

vahekompleksi stabiliseerijaks ja alus-hape katalüüsijaks. Rakulüsaatidest mõõdetud 

levaansukraasi koguaktiivsused näitasid, et mutantsetel valkudel D62A, D219A ja E303A 

puudus katlüütiline aktiivsus peaaegu täielikult (Tabel 3). Ka teiste bakterite levaansukraaside 

muteerimisega on näidatud, et katalüütilise tsentri aminohapete muteerimisel langeb 

katalüütiline efektiivsus väga tugevasti. Näiteks Z. mobilis’e levaansukraasi LevU alus-hape 

katalüüsija mutantidel Glu278Asp ja Glu278His langes ensüümi katalüütiline efektiivsus 

langes vastavalt ~40 ja ~450 korda. Kui aga fruktosüül-ensüümi vaheühendi stabiliseerija 

Asp194 muudeti asparagiiniks, siis LevU katalüütiline efektiivsus langes veel palju rohkem – 

8340 korda (Yanase et al., 2002). 

Puhastatud Lsc3 mutandil Pro222Leu ei olnud substraadispetsiifikas ega afiinsuse 

parameetrites suuri muutusi, võrreldes metsiktüüpi valguga, kuid katalüütiline aktiivsus oli 

mõnevõrra langenud. Lsc3 valgu mutant Asp225Ala käitus nagu muteerimata Lsc3. Mutandil 

Asp225Asn oli paranenud rafinoosi kasutamise. Aminohapete Asp225 ja Pro222 mutantidel 

ei muutunud sahharoosist sünteesitavate polümerisatsiooniproduktide muster. Saadud 

andmete põhjal võib järeldada, et Asp225 ning Pro222 katalüütilise tsentri aminohapete hulka 

ei kuulu ja katalüüsis eriti olulised ei ole. 

33

KOKKUVÕTE 

Levaansukraasid on glükosiidi hüdrolaaside perekonda 68 kuuluvad rakuvälised ensüümid, 

mis sünteesivad fruktooligosahhariide ja polümeerset levaani. Levaansukraase on leitud nii 

gramnegatiivsetest kui ka -positiivsetest bakteritest, kuid need ensüümid võivad 

valgujärjestuste poolest üsna palju erineda. Sellele vaatamata on levaansukraasidel väga 

sarnane struktuur ning aktiivtsenter. On leitud, et levaansukraasid, teised fruktosüüli 

transferaasid ning ka invertaasid on β-lehtedest koosnevad viielabalise β-propelleri ehitusega, 

mille keskel on happelistest aminohapetest tasku, kuhu seondub substraat. Mitmete bakterite 

levaansukraase on muteeritud, et teha kindlaks, millised aminohapped ja piirkonnad on 

ensüümi töös olulised. Substraadi sidumiseks ja hüdrolüüsiks on vajalikud kolm aminohapet 

(nn katalüütiline kolmik), mille moodustavad kaks aspartaati ja glutamaat, mis on 

konserveerunud kõigis seni uuritud levaansukraasides. 

Eelnevalt on meie töögrupis kirjeldatud Lsc3 valgu biokeemilisi omadusi ja näidatud, et Lsc3 

kasutab substraadina nii sahharoosi kui ka rafinoosi ja sünteesib neist fruktooligosahhariide ja 

ka heterooligosahhariide (Visnapuu et al., 2008; 2009; T. Visnapuu, avaldamata andmed). 

Antud töös keskenduti P. syringae pv. tomato DC3000 levaansukraasi Lsc3 koht-suunatud 

muteerimisele ja vastavate mutantide analüüsile, et teha kindlaks, millised aminohapped 

võiksid moodustada ensüümi katalüütilise kolmiku. 

Töö tulemused ja järeldused olid järgmised: 

1. Lsc3 valgu järjestus joondati teiste gramnegatiivsetest bakteritest pärinevate 

levaansukraasidega ja leiti, et Asp62, Asp219 ja Glu303 joonduvad kohakuti teiste 

levaansukraaside katalüütilise kolmiku aminohapetega. 

2. Mutantsed lsc3 geenid, mis kodeerivad Lsc3 valgus asendusi Asp219Ala, Asp219Asn, 

Asp225Ala ja Asp225Asn, kloneeriti ekspressioonivektorisse pURI3. 

3. Koht-suunatud muteerimisega tehti konstruktid Lsc3 valgu mutantide Asp62Ala ja 

Glu303Ala ekspressiooniks pURI3 vektoris. 

4. Mutantseid Lsc3 valke Asp62Ala, Asp219Ala, Asp219Asn, Pro222Leu, Asp225Ala, 

Asp225Asn, Glu303Ala ekspresseeriti E. coli’s ning iseloomustati biokeemiliste näitajate 

alusel. 

5. Mutandid Asp62Ala, Asp219Ala ja Glu303Ala kaotasid peaaegu täielikult võime 

sahharoosi lagundada ja levaani toota. Samas aminohapete Pro222 ja Asp225 asendused ei 

muutnud oluliselt ensüümi omadusi, millest järeldame, et need aminohapped ei ole 

olulised Lsc3 katalüüsis. 

6. Meie tulemuste kohaselt moodustavad Lsc3 valgu katalüütilise kolmiku Asp62, Asp219 ja 

Glu303. 

34

Identification of catalytic triad amino acids in Pseudomonas syringae pv. tomato 

levansucrase Lsc3 by mutational analysis 

Triin Elmi 

SUMMARY 

Levansucrases are bacterial exoenzymes belonging to glycoside hydrolase family 68. They 

catalyse the transfer of fructosyl residue from substrate to a variety of acceptors including 

water (sucrose hydrolysis), sucrose (oligofructose synthesis) and oligofructans (polymerase 

reaction). It has been shown that fructans, like polysaccharidic levan, are involved in fitness 

and survival of bacteria in the environment and in phytopathogenesis, e.g. in development of 

the dental plaque and biofilm. Moreover, fructooligosaccharides act as health-promoting 

prebiotics in the gut of humans and animals. 

Levansucrases and other fructosyl transferases and also invertases have a common five-blade 

β-propeller fold containing a catalytic pocket with three conserved acidic amino acids. The 

catalytic triad is composed of catalytic nucleophile (Asp), transition state stabilizer (Asp) and 

general acid/base catalyst (Glu). 

The aim of this study was to identify catalytic triad amino acids in the active centre of P. 

syringae pv. tomato DC3000 levansucrase Lsc3. Using sequence alignment of Lsc3 and 

levansucrases from other Gram-negative bacteria, Asp62, Asp219 and Glu303 were predicted 

to form the catalytic triad. We performed site-directed mutagenesis of the lsc3 gene to 

substitute Asp62 and Glu303 residues in Lsc3 protein with alanins and cloned the mutated 

lsc3 genes to pURI3 expression vector. Previously constructed mutant lsc3 genes (encoding 

substitutions Asp219Ala, Asp219Asn, Asp225Ala, Asp225Asn) were also cloned into pURI3 

vector. As a result of this study, several mutant levansucrases (Asp62Ala, Asp219Ala, 

Asp219Asn, Pro222Leu, Asp225Ala, Asp225Asn, Glu303Ala) were expressed in Escherichia 

coli and their properties were characterized. Mutation of Asp62, Asp219 and Glu303 virtually 

abolished catalytic activity of Lsc3. Substitution of Pro222 and Asp225 had no significant 

effect on catalytic properties of Lsc3. 

We conclude that Asp62, Asp219 and Glu303 are at key position in Lsc3 protein of P. 

syringae pv. tomato and most probably comprise catalytic triad of the active site. 

35

KASUTATUD KIRJANDUS 

Andersone, I., Auzina, L., Vigants, A., Mutere, O. and Zikmanis, P. (2004). Formation of 

levan from raffinose by levansucrase of Zymomonas mobilis. Eng. Life Sci. 4: 56-59. 

Banguela, A., Hernandez, L. (2006). Fructans: from natural sources to transgenic plants. 

Biotech. Appl. 23: 202-210. 

Batista, F. R., Hernandez, L., Fernandez, J. R., Arrieta, J., Menendez, C., Gomez, R., 

Tambara, Y. and Pons, T. (1999). Substitution of Asp-309 by Asn in the Arg-Asp-Pro (RDP) 

motif of Acetobacter diazotrophicus levansucrase affects sucrose hydrolysis, but not enzyme 

specificity. Biochem. J. 337: 503-506. 

Buell, C. R., Joardar, V., Lindeberg, M., Selengut, J., Paulsen, I. T. and Gwinn, M. L. (2003). 

The complete genome sequence of the Arabidopsis and tomato pathogen Pseudomonas 

syringae pv. tomato DC3000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 10181-10186. 

Cantarel, B. L., Coutinho, P. M., Rancurel, C., Bernard, T., Lombard, V. and Henrissat, B. 

(2009). The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): An expert resource for 

glycogenomics. Nucleic Acids Res 37: 233-238. 

Chuankhayan, P., Hsieh, C. Y., Huang, Y. C., Hsieh, Y. Y., Guan, H. H., Hsieh, Y. C., Tien, 

Y. C., Chen, C. D., Chiang, C. M. and Chen, C. J. (2010). Crystal structures of Aspergillus 

japonicus fructosyltransferase complex with donor/acceptor substrates reveal complete 

subsites in the active site for catalysis. J. Biol. Chem. 285: 23251-23264. 

Coutinho, P. M., Henrissat, B. (1999). Carbohydrate-active enzymes: an integrated database 

approach. Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering, RSC, Cambridge, 3-12. 

Crittenden, R. G., Platne, M. J. (1996). Production, properties and applications of food-grade 

oligosaccharides. Trends Food Sci. Tech. 7: 353-361. 

Daguer. J. P., Geissmann, T., Petit-Glatron, M. F. and Chambert, R. (2004). Autogenous 

modulation of the Bacillus subtilis sacB-levB-yveA levansucrase operon by the levB transcipt. 

Microbiology 150: 3669-3679. 

De Roover, J., van Laere, A., De Winter, M., Timmermans, J. W. and van den Ende, W. 

(1999). Purification and properties of a second fructan exohydrolase from the roots of 

Cichorium intybus. Physiol. Plant. 106: 28-34. 

van den Ende, W., van Laere, A. (1996). De-novo synthesis of fructans from sucrose in vitro 

by a combination of two purified enzymes (sucrose:sucrose fructosyl transferase and 

fructan:fructan fructosyl transferase) from chicory roots (Cichorium intybus L.). Planta 200: 

335-342. 

Geier, G., Geider, K. (1993). Characterization and influence on virulence of the levansucrase 

gene from the fireblight pathogen Erwinia amylovora. Physiol. Mol. Plant Pathol. 42: 387- 

404. 

Geiser, M., Cebe, R., Drewello, D. and Schmitz, R. (2001). Integration of PCR fragments at 

any specific site within cloning vectors without the use of restriction enzymes and DNA 

ligase. Biotechnology 31: 88-90. 

Hernandez, L., Sotolongo, M., Rosabal, Y., Menendez, C., Ramirez, R., Caballero-Mellado, J. 

and Arrieta, J. (2000). Structural levansucrase gene (lsdA) constitutes a functional locus 

conserved in the species Glyconacetobacter diazotrophicus. Arch. Microbiol. 174: 120-124. 

Hettwer, U., Gross, M. and Rudolph, K. (1995). Purification and characterization of an 

extracellular levansucrase from Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. J. Bacteriol. 177: 

2834-2839. 

Hettwer, U., Jaeckel, F. R., Boch, J., Meyer, M., Rudolph, K. and Ullrich, M. S. (1998). 

Cloning, nucleotic sequence, and expression in Escherichia coli of levansucrase genes from 

36

the plant phatogens Pseudomonas syringae pv. glycinea and P. syringae pv. phaseolicola. 

Appl. Env. Microbiol. 64: 3180-3187. 

van Hijum, S. A. F. T., Bonting, K., van der Maarel, M. J. E. C. and Dijkhuizen, L. (2001). 

Purification of a novel fructosyltransferase from Lactobacillus reuteri strain 121 and 

characterization of the levan produced. FEMS Microbiol. Lett. 205: 323-328. 

van Hijum, S. A. F. T., Kralj, S., Ozimek, L. K., Dijkhuizen, L. and van Geel-Schutten, I. G. 

H. (2006). Structure-function relationships of glucansucrase and fructansucrase enzymes from 

lactic acid bacteria. Mol. Biol. Rev. 70: 157-176. 

Kallas, E. (2010). IHF-i osalus Pseudomonas aeruginosa mobiilse elemendi ISPa20 

transpositsioonis. Magistritöö, Tartu Ülikool. 

Koshland, D. E., Stein, S. S. (1954). Correlation of bound breaking with enzyme specifity. 

Cleavage point of invertase. J. Biol. Chem. 208: 139-148. 

Lammens, W., Le Roy, K., Schroeven, L., van Laere, A., Rabijns, A. and van den Ende, W. 

(2009). Structural insights into glycoside hydrolase family 32 and 68 enzymes: functional 

implications. J. Exp. Bot. 60: 727-740. 

Lee, S. S., Yu, S. and Withers, S. G. (2003). Detailed dissection of a new mechanism for 

glycoside cleavage: alpha-1.4-glucan lyase. Biochemistry 42: 13081-13090. 

Li, H., Ullrich, M. S. (2001). Characterization and mutational analysis of three allelic lsc 

genes encoding levansucrase in Pseudomonas syringae. J. Bacteriol. 183: 3282-3292. 

Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. and Randall, R. J. (1951). Protein measurement 

with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265. 

Mardo, K. (2011). Pseudomonas syringae pv. tomato levaansukraasi Lsc3 struktuuri 

modelleerimine ja mutantide iseloomustamine. Magistritöö, Tartu Ülikool. 

Martinez-Fleites, C., Ortiz-Lombardia, M., Pons, T., Tarbouriech, N., Taylor, E. J., Arrieta, J. 

G., Hernandez, L. and Davies, G. J. (2005). Crystal structure of levansucrase from the 

Gramnegative bacterium Gluconacetobacter diazotrophicus. Biochem. J. 390: 19-27. 

Meng, G., Fütterer, K. (2003). Structural framework of fructosyl transfer in Bacillus subtilis 

levansucrase. Nature Struct. Biol. 10: 935-941. 

Meng, G., Fütterer, K. (2008). Donor substrate recognition in the raffinose-bound E342A 

mutant of fructosyltransferase Bacillus subtilis levansucrase. BMC Struct. Biol. 8, 1-12. 

Miller, G. L. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. 

Anal. Chem. 31: 426-428. 

Miller, J. H. (1972). Eksperiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbour Laboratory, 

Cold Spring Harbour, NY. 

Nagem, R. A. P., Rojas, A. L., Golubev, A. M., Korneeva, O. S., Eneyskaya, E. V., 

Kulminskaya, A. A., Neustroev, K. N. and Polikarpov, I. (2004). Crystal structure of exoinulinase 

from Aspergillus awamori: the enzyme fold and structural determinants of substrate 

recognition. J. Of Molec. Biol. 344: 471-480. 

Naumoff, D. G. (2001). Beta-fructosidase superfamily: homology with some alpha-Larabinases 

and beta-D-xylosidases. Protein. Struct. Function Genet. 42: 66-76. 

Ozimek, L. K., Euverink, G. J. W., van der Maarel, M. E. C. and Dijkhuizen, L. (2005). 

Mutational analysis of the role of calcium ions in the Lactobacillus reuteri strain 121 

fructosyltransferase (levansucrase and inulosucrase) enzymes. FEBS Lett. 579: 1124-1128. 

Ozimek, L. K., van Hijum, S. A. F. T., van Koningsveld, G. A., van der Maarel, M. J. E. C., 

van Geel-Schutten, G. H. and Dijkhuizen, L. (2004). Site-directed mutagenesis study of the 

three catalytic residues of the fructosyltransferases of Lactobacillus reuteri 121. FEBS Lett. 

560: 131-133. 

37

Ozimek, L. K., Kralj, S., van der Maarel, M. E. C. And Dijkhuizen, L. (2006). The 

levansucrase and inulosucrase enzymes of Lactobacillus reuteri 121 catalyse processive and 

non-processive transglycosylation reactions. Microbiology 152: 1187-1196. 

Pons, T., Hernandez, L., Batista, F. R. and Chinea, G. (2000). Prediction of a common 

betapropeller catalytic domain for fructosyltransferases of different origin and substrate 

specifity. Protein Sci. 9: 2285-2291. 

van Riet, L., Altenbach, D., Vergauwen, R., Clerens, S., Kawakami, A., Yoshida, M., van den 

Ende, W., Wiemken, A. and van Laere, A. (2008). Purification, cloning and functional 

differences of a third fructan 1-exohydrolase (1-FEHw3) from wheat (Triticum aestivum). 

Physiol. Plant. 133: 242-253. 

Rivas, de las B., Curiel, J. A., Mancheno, J. M. and Munos, R. (2007). Expression vectors for 

enzyme restriction- and ligation-independent cloning for producing recombinant His-fusion 

proteins. Biotechnol. Prog. 23: 680-686. 

Roberfroid, M., Slavin, J. (2000). Nondigestible oligosaccharides. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 

40: 461-480. 

Sambrook, J., Fritsch, E. T. and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, 

Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 

Sangiliyandi, G., Ray, K. C. and Gunasekaran, P. (1999). Elevated temperature and chemical 

modification selectively abolishes levan forming activity of levansucrase of Zymomonas 

mobilis. Biotechnol. Lett. 21: 179-182. 

Schroeder, V. A., Michalek, S. M. and Macrina, F. L. (1989). Biochemical characterization 

and evaluation of virulence of a fructosyltransferase-deficient mutant of Streptococcus mutans 

V403. Infect Immun 57: 3560-3569. 

Schägger, H. (2006). Tricin-SDS-PAGE. Nat. Protocols 1: 16-22. 

Sharma, R. C., Schimke, R. T. (1996). Preparation of electrocompetent E. coli using salt-free 

growth medium. Biotechniques 20: 42-44. 

Song, K. B., Rhee, S. K. (1994). Enzymatic synthesis of levan by Zymomonas mobilis 

levansucrase overexpressed in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 16: 1305-1310. 

St. John, J. A., Bonnett, G. D. and Simpson, R. J. (1996). A method for rapid quantification of 

sucrose and fructan oligosaccharides suitable for enzyme and physiological studies. New 

Phytol. 134: 197-203. 

Studier, F. W., Moffatt, B. A. (1986). Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct 

selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189: 113-130. 

Tajima, K., Tanio, T., Kobayashi, Y., Kohno, H., Fujiwara, M., Shiba, T., Erata, T., 

Munekata, M. and Takai, M. (2000). Cloning and sequencing of the levansucrase gene from 

Acetobacter xylinum NCI 1005. DNA Res. 7: 237-242. 

Thompson, J. D., Higgins, D. G. and Gibson, T. J. (1994). CLUSTAL W: improving the 

sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positionspecific 

gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680. 

Tiirik, K. (2010). Levaansukraasi katalüüsis osalevate aminohapete kindlakstegemine Asp219 

ja Asp225 muteerimisega. Bakalaureusetöö, Tartu Ülikool. 

Toomemaa, R. (2007). Pseudomonas syringae pv. tomato levaansukraaside omaduste 

uurimine. Bakalaureusetöö, Tartu Ülikool. 

Velazquez-Hernandez, M. L., Baizabal-Aguirre, V. M., Bravo-Patiño, A., Cajero-Juarez, M., 

Chavez-Moctezuma, M. P. and Valdez-Alarcon, J. J. (2008). Microbial fructosyltransferases 

and the role of fructans. J. Appl. Microbiol. 106: 1763-1778. 

38

Visnapuu, T. (2007). Levaansukraasi geenide ekspresseerimine E. coli’s ja valkude omaduste 

uurimine. Magistritöö, Tartu Ülikool. 

Visnapuu, T., Mäe, A. and Alamäe, T. (2008). Hansenula polymorpha maltase gene promoter 

with sigma 70-like elements is feasible for Escherichia coli-based biotechnological 

applications: Expression of three genomic levansucrase genes of Pseudomonas syringae pv. 

tomato. Process Biochem. 43: 414-422. 

Visnapuu, T., Zamfir, A. D., Mosoarca, C., Stanescu, M. D. and Alamäe, T. (2009). Fully 

automated chip-based negative mode nanoelectrospray mass spectrometry of 

fructooligosaccharides produced by heterologously expressed levansucrase from 

Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Rapid. Commun. Mass. Spectrom. 23: 1337- 

1346. 

Vuong, T. V., Wilson, D. B. (2010). Glycoside hydrolases: Catalytic base/nucleophile 

diversity. Biotechnol. Bioeng. 107: 195-205. 

Wei, D., Li, M., Zhang, X. and Xing, L. (2004). An improvement of the site-directed 

mutagenesis method by combination of megaprimer, one-side PCR and Dpn I treatment. 

Anal. Biochem. 331: 401-403. 

Yanase, H., Maeda, M., Hagiwara, E., Yagi, H., Taniguchi, K. and Okamoto, K. (2002). 

Identification of functionally important amino acid residues in Zymomonas mobilis 

levansucrase. J. Biochem. 132: 565-572. 

KASUTATUD VEEBIAADRESSID 

http://www.cazy.org 

http://expasy.org/tools/pi_tool.html 

39

LISA 1 

Töös konstrueeritud mutantseid lsc3 geene sisaldavad vektorid pURI3-lsc3D62A ja pURI3- 

lsc3E303A. Tähistatud on T7 promootor ja avatud lugemisraamid ning kasutatud praimerite 

seondumispositsioonid. Alla on joonitud megapraimeri sünteesiks kasutatud praimerid. 

His 6 -järjestus 

T7 promootor 

His 6 -järjestus 

T7 promootor 

40

LISA 2 

Ni +2 -afiinsuskromatograafiaga puhastatud mutantsete Lsc3 valkude P222L, D225A ja D225N 

puhastamise etappidest võetud proovid ning nende analüüs denatureerival 

polüakrüülamiidgeelil (SDS-PAGE). Rekombinantest rakuekstrakti kanti rajale 10 µg ja 5 µl 

proovi igast pesu- ja 1 µl elueerimise etapist. M – valgu suurusmarker PageRuler TM SM0671 

(Fermentas). 

M 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 

Lsc3 P222L valgu puhastuse etappide 

kontrollimine SDS-geelil. Rajad: 1. rakulüsaat; 

2-5. Ni +2 -maatriksi pesud 

sonikeerimispuhvriga; 6-8. levaansukraasi 

elueerimine; 9. puhastatud muteerimata Lsc3 

valk. 

M 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 

Lsc3 D225A valgu puhastuse etappide 

kontrollimine SDS-geelil. Rajad: 1. rakulüsaat; 

2-5. Ni +2 -maatriksi pesud sonikeerimispuhvriga; 

6-8. levaansukraasi elueerimine; 9. puhastatud 

muteerimata Lsc3 valk. 

M 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 

Lsc3 D225N valgu puhastuse etappide 

kontrollimine SDS-geelil. Rajad: 1. puhastatud 

muteerimata Lsc3 valk; 2-5. Ni +2 -maatriksi 

pesud sonikeerimispuhvriga; 6-8. 

levaansukraasi elueerimine; 9. rakulüsaat. 

41

LISA 3 

Puhastatud Lsc3 P222L, Lsc3 D225A ja Lsc3 D225N ensüümide Michaelis-Menteni (esitatud 

suurelt) ja Eadie-Hofstee (esitatud väiksemalt) tüüpi graafikud, mis on saadud programmiga 

SigmaPlot 2001. Mustad punktid (●) tähistavad erinevatel sahharoosi kontsentratsioonidel 

ilma rafinoosita määratud levaansukraasi reaktsioonikiirusi ning seest tühjad punktid (○) koos 

100 mM rafinoosiga määratud reaktsioonikiirusi. Toodud on ka vastavate andmete põhjal 

arvutatud V max , K m ja K i . 

42

Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalÃ¼Ã¼tilise ...

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?