Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...

2. lsc3 fragmendi otste seondumine vektorile pURI3 55°C 1 minut;
3. DNA ahela süntees 72°C 3 minutit;
Tsüklite arv: 18.
Segusid töödeldi DpnI-ga (lõppkonts. 0.2 U/µl), et lagundada segusse allesjäänud pURI3
vektor, produktid puhastati ning restrikteeriti NotI-ga (lõppkonts. 0.2 U/µl), mis „lõikab“
algset pURI3 vektorit, kuid mitte inserteerunud lsc3 geeniga plasmiidi. Segud elektroporeeriti
E. coli DH5α tüvesse, kolooniaid kontrolliti PCR-iga lsc3-spetsiifiliste praimeritega,
plasmiidne DNA puhastati ning mutatsiooni asukohta ning õigsust kontrolliti geeni järjestuse
sekveneerimisega (pt. 2.2.3). Saadud mutantsed plasmiidid nimetati pURI3-lsc3D62A,
pURI3-lsc3E303A, pURI3-lsc3D219A, pURI3-lsc3D219N, pURI3-lsc3D225A ja pURI3-
lsc3D225N (vt. Tabel 2). Meie töögrupis olid varem konstrueeritud plasmiidid pURI3-
lsc3P222L ja pURI3-lsc3.
2.2.3 Elektroporatsioon, kolooniate kontrollimine, DNA eraldamine ja
sekveneerimine
Kõik mutantset lsc3 geeni kandvad pURI3 plasmiidid viidi E. coli DH5α ja BL21(DE3)
tüvedesse elektroporatsiooniga (Sharma ja Schimke, 1996). Bakterirakke kasvatati 4 ml
YENB söötmes (0.75% pärmiekstrakt, 0.8% toitepuljong) 37°C loksutil kuni OD 600 oli ~0.4.
Seejärel bakterikultuuri tsentrifuugiti 13700 g 30 s ning rakke pesti 3 korda steriilse 15%
glütserooliga ning suspendeeriti 50 μl 15% glütseroolilahuses. Rakkudele lisati etanooliga
sadestatud kloneerimissegu või puhastatud plasmiidset DNA-d. Elektroporatsioon tehti pingel
2.5 kV E. coli Pulser-iga (BIO-RAD, USA) ning rakke kasvatati 1 h 1 ml Luria-Bertani (LB)
söötmes ja plaaditi ampitsilliini (Amp) sisaldavale LB selektiivsöötmele.
lsc3 geeni olemasolu kolooniates kontrolliti PCR-iga, kasutades praimeritepaari Lsc3Fw3 (5’
GAAGCGCAGAACTCAAGCTGG 3’) ja Lsc3Rev2 (5’ TCATTGGCCGGTACGGACCG
3’), millega saadi 427 ap pikkune DNA lõik. PCR-i segu sisaldas 6.25 mM MgCl 2 , 1x Taq
puhvrit (Fermentas), 0.2 mM dNTP, kumbagi praimerit 0.5 pmol/μl ja Taq DNA polümeraasi
0.05 U/μl.
Plasmiidne DNA eraldati AxyPrep Plasmid Miniprep komplekti (Axygen Biosciences,
USA) kasutades. Plasmiidide olemasolu ja saagist kontrolliti 1% agaroosgeelil (pt. 2.2.7).
Konstrueeritud plasmiidides kontrolliti mutatsioonide asukohta ja õigsust lsc3 geenijärjestuse
sekveneerimisega. Selleks kasutati BigDye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit-i
(Applied Biosystems, Kanada). Eelnevalt valmistati PCR-i produktid levaansukraasi geeni N-
ja C-terminaalsest osast. Geeni N-terminuse paljundamiseks kasutati praimereid T7 ja
Lsc1ja3Rev1 (5’ TGCGCTTCGGTTTGATAATAGG 3’), millega saadi 760 ap pikkune DNA
16