Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...
Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...
Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
2.3.2 Levaansukraasi mutantide iseloomustamine ja katalüütilise kolmiku<br />
aminohapete identifitseerimine<br />
2.3.2.1 Mutantsete <strong>levaansukraasi</strong>de ekspresseerimine, transformantide<br />
fenotüübi uurimine ning <strong>levaansukraasi</strong> koguaktiivsused rakuekstraktides<br />
E. coli BL21(DE3) transformante, mis sisaldasid plasmiide pURI3-lsc3D62A, pURI3-<br />
lsc3D219A, pURI3-lsc3D219N, pURI3-lsc3P222L, pURI3-lsc3D225A, pURI3-lscD225N või<br />
pURI3-lsc3E303A, kasvatati LB Amp tardsöötmel. Võrdlemaks metsiktüüpi ja mutantsete<br />
<strong>levaansukraasi</strong>de fenotüüpi, külvati transformandid IPTG-ga ja 10% sahharoosiga LB Amp<br />
söötmetassidele (Joonis 3). Kontrollina kasutasime ilma <strong>levaansukraasi</strong>ta tühja vektorit<br />
pURI3 sisaldavat ja muteerimata <strong>Lsc3</strong> valku ekspresseerivat E. coli transformanti. Sahharoosi<br />
sisaldaval LB tardsöötmel lähevad limaseks nende transformantide kolooniad, mis<br />
ekspresseerivad katalüütiliselt aktiivset <strong>levaansukraasi</strong> ja toodavad sahharoosist<br />
polüsahhariidset levaani.<br />
Joonis 3. Tühja vektorit (pURI3), muteerimata <strong>levaansukraasi</strong> (<strong>Lsc3</strong> wt) ja mutantseid<br />
levaansukraase sisaldavatele E. coli BL21(DE3) transformantidele iseloomulikud<br />
kasvufenotüübid 1 mM IPTG-d ja 10% sahharoosi sisaldaval LB Amp söötmel.<br />
Jooniselt 3 on näha, et <strong>Lsc3</strong> mutandid Asp62Ala, Asp219Ala, Asp219Asn ning Glu303Ala on<br />
kaotanud võime toota levaani (lima), kuid Pro222 muteerimine leutsiiniks ning Asp225<br />
muteerimine alaniiniks või asparagiiniks ei ole transformantide fenotüüpi oluliselt muutnud.<br />
Transformante kasvatasime, indutseerisime <strong>levaansukraasi</strong> tootmise ning valmistasime<br />
rakuekstraktid, nagu on kirjeldatud peatükis 2.2.4. Lahutasime E. coli rakuekstraktid<br />
denatureerivas polüakrüülamiidgeelis ja värvisime Coomassie Brilliant Blue lahusega (pt.<br />
2.2.7), et kontrollida <strong>levaansukraasi</strong> valkude ekspressiooni ning välistada võimalus, kus<br />
mutantsete <strong>levaansukraasi</strong>de aktiivsus puudub sellepärast, et valgu ekspressioon on<br />
vähenenud. Geelile kandsime 10 µg mutantseid <strong>Lsc3</strong> valke ekspresseerivaid või tühja vektorit<br />
sisaldavat E. coli rakuekstrakte, puhastatud <strong>Lsc3</strong> muteerimata valku ja valgu suurusmarkerit<br />
PageRuler TM SM0671 (Fermentas) (Joonis 4).<br />
25
Change language