Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalÃ¼Ã¼tilise ...

More documents

Recommendations

Info

puhastamisel lähtuti E. Kallase kasutatud metoodikast, mida kohandati Lsc3 valgule (Kallas, 2010). Saadud 10 ml rakulüsaadile lisati 400 μl Ni 2+ -NTA agaroosi (Hispanagar, Hispaania) ja inkubeeriti 2 h 4°C end-over-end segajal (Bio RS-24, BioSan, Läti), et levaansukraas seonduks maatriksile. Ni 2+ -maatriks tsentrifuugiti põhja (380 g, 1 min, 4°C) ning pesti kaks korda 5 ml sonikeerimispuhvriga. Ni 2+ -maatriks suspendeeriti 2 ml sonikeerimispuhvris ja kanti ilma membraanita RNA minikolonnidele ning tsentrifuugiti (380 g, 1 min, 4°C). Seejärel levaansukraasi valgud elueeriti maatriksilt 1 ml elueerimispuhvriga (500 mM imidasool, 50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 10% glütserool; pH 6.0). Levaansukraasi sisaldavad eluaadid viidi Spectra/Por 3 dialüüsimembraani, mis ei lase läbi suuremaid molekule kui 3500 daltonit (Da) (Mw cut-off 3.5 kDa; Spectrum Laboratories, Holland). Valgulahust dialüüsiti 4°C 24 h Na-asiidi sisaldavas McIllvaine’i puhvris (pH 6.0). Seejärel kaeti membraanid polüetüleenglükooliga, mille molekulmass on 8000 Da (PEG8000; SIGMA, USA), ning kontsentreeriti 4°C, kuni lahuse maht vähenes ligi kaks korda. Saadud levaansukraasi lahust kasutati puhta valgupreparaadina. Kõikidest valgu puhastamise etappidest võeti proovid ning neid analüüsiti denatureerival polüakrüülamiidgeelil (SDS- PAGE) (pt. 2.2.7). 2.2.7 Geelelektroforees DNA fragmentide lahutamiseks ja plasmiidse DNA kontrolliks kasutati elektroforeesi 1% agaroosgeelil 0.5 x TAE puhvris (40 mM Tris-atsetaatpuhver, 1 mM EDTA; pH 8.2). Agaroosgeel sisaldas etiidiumbromiidi (0.35 μg/ml). Geelile kantavatele segudele lisati glütserooli sisaldavat geelivärvi (1x DNA Loading Dye, Fermentas) ja geelelektroforees toimus toatemperatuuril 0.5 x TAE puhvris ning pingel 10 V/cm. DNA fragmendid tehti nähtavaks ultraviolettvalguses UV Transillumnator-iga (UVP, USA). Produktide suuruse määramiseks kasutati GeneRuler 1 kb DNA markerit (Fermentas). Rakulüsaatides sisalduvad valgud lahutati nii denatureeriva (SDS) kui ka natiivse (mittedenatureeriva) polüakrüülamiidgeelelektroforeesiga (PAGE). Natiivne 7.5% PAGE geel valmistati standardprotokolli järgi (Sambrook et al., 1989; Visnapuu et al., 2008). Geeli rajale kanti 20 μg rakuekstrakti, mis oli suspendeeritud 50% glütserooliga broomfenoolsinise lahuses. Geel voolutati Hoefer-i (USA) geelelektroforeesi süsteemiga madalal temperatuuril (4°C) 10 V/cm ja voolutuspuhvrina kasutati 0.5 x TBE puhvrit (pH 8.3). Tehti paralleelleselt 2 natiivset PAGE geeli – üks ilmutati aktiivsuse järgi toatemperatuuril 10% sahharoosiga McIllvaine’i puhvris (pH 6.0) ligi 20 h ning teine geel värviti valgule Coomassie Brilliant Blue G250 (Serva, Saksamaa) lahusega. 20
Denatureeriv polüakrüülamiidgeelelektroforees (SDS-PAGE) tehti tritsiin-SDS-PAGE geeliga (Schägger, 2006). Geeli rajale kanti 10 μg rakulüsaati või 1 µg puhastatud levaansukraasi, mis oli eelnevalt suspendeeritud 1 x Laemmli puhvris (Laemmli, 1970) ning kuumutatud 5 min 96°C. Geelid voolutati Mini-PROTEAN Tetra süsteemiga (BIO-RAD, USA) toatemperatuuril ja pingel 11 V/cm. Seejärel geel värviti Coomassie Brilliant Blue G250 lahusega ning levaansukraaside ligikaudset molekulmassi hinnati valkude suurusmarkeris PageRuler TM SM0671 (Fermentas) sisalduvate valkude liikumise alusel. Positiivse kontrollina kanti geelidele ka 1 µg meie töögrupis eelnevalt puhastatud Lsc3 muteerimata valku. 2.2.8. Õhukese kihi kromatograafia Levaansukraasi reaktsiooniproduktide lahutamiseks kasutati õhukese kihi kromatograafiat (Thin Layer Chromatography – TLC). Reaktsioonisegu oli samasugune, nagu kasutati transfruktosüleeriva aktiivsuse määramiseks (vt. pt. 2.2.5). 0.5 μl 4x destilleeritud vees lahjendatud proovi kanti koos sama koguse markersuhkrutega kontsentreeriva tsooniga TLC plaadi stardijoonele (Silica gel 60 F254; Merck, Saksamaa). Markeriteks kasutati 2% levaani, 25 mM kestoosi ja nüstoosi ning 0.1 M fruktoosi ja sahharoosi. Kromatograafiaplaati voolutati kaks korda seguga kloroform-metanool-vesi (90:65:15) (Tajima et al., 2000). Fruktoosi sisaldavate suhkrute ilmutamiseks kasteti plaat uurea reaktiivi (3% uurea, 1 M fosforhape veega küllastatud butanoolis) ja kuumutati temperatuuril 120°C ~10 min kuni suhkrulaikude värvumiseni (St. John et al., 1996). 2.3 Tulemused ja arutelu 2.3.1 Levaansukraasi Lsc3 võimalike katalüütiliste aminohapete ennustamine ja vastavate mutantide konstrueerimine Levaansukraas on ensüüm, mis hüdrolüüsib sahharoosi või mõne muu sobiva substraadi glükosiidsidet ning polümeriseerib fruktoosi jäägid polüsahhariidseks levaaniks või oligosahhariidideks. Tomati ja müürlooga (Arabidopsis thaliana) patogeeni P. syingae pv. tomato DC3000 genoomis on kolm levaansukraasi kodeerivat geeni: lsc1, lsc2 ja lsc3 (Buell et al., 2003; Visnapuu et al., 2008), mille täpsed funktsioonid on seni teadmata. Antud töös uuritakse põhjalikumalt Lsc3 valku ning selle mutante. Eelnevalt on meie töögrupis konstrueeritud Lsc3 valgu ekspressiooniplasmiid pHIPMalprom-lsc3, millega saab E. coli’s levaansukraasi heteroloogiliselt ekspresseerida. Levaansukraasi eriaktiivsus rekombinantsetes rakuekstraktides oli kõrge ja Lsc3 valk moodustas raku valkudest olulise osa – kuni 20%. 21
Page 1 and 2: TARTU ÜLIKOOL LOODUS- JA TEHNOLOOG
Page 3 and 4: KASUTATUD LÜHENDID ah - aminohape
Page 5 and 6: 1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE 1.1 Glükos
Page 7 and 8: varieeruv piirkond, konserveerunud
Page 9 and 10: B. subtilis’e levaansukraas SacB
Page 11 and 12: 1.3.2 Fruktosüültransferaaside mu
Page 13 and 14: 2. EKSPERIMENTAALOSA 2.1 Töö eesm
Page 15 and 16: vastavalt kas päripraimer T7 (5’
Page 17 and 18: lõik. Levaansukraasi geeni teise p
Page 19: sahharoosi (puhastatud valkude puhu
Page 23 and 24: 80 90 100 110 120 130 140 ....|....
Page 25 and 26: 2.3.2 Levaansukraasi mutantide isel
Page 27 and 28: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Page 29 and 30: Tabel 4. Levaansukraaside 100 mM sa
Page 31 and 32: substraadiks oli rafinoos. Afiinsus
Page 33 and 34: eristada. Valkude Lsc3 D225A, D225N
Page 35 and 36: Identification of catalytic triad a
Page 37 and 38: the plant phatogens Pseudomonas syr
Page 39 and 40: Visnapuu, T. (2007). Levaansukraasi
Page 41 and 42: LISA 2 Ni +2 -afiinsuskromatograafi

Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalÃ¼Ã¼tilise ...

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?