Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...
Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...
Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
M 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. M<br />
Joonis 4. SDS-PAGE-iga lahutatud levaansukraase sisaldavd E. coli transformantide<br />
rakuekstraktid. Rajad: 1. pURI3 (tühi vektor); 2. <strong>Lsc3</strong> D62A; 3. <strong>Lsc3</strong> D219A; 4. <strong>Lsc3</strong><br />
D219N; 5. <strong>Lsc3</strong> E303A; 6. puhastatud muteerimata <strong>Lsc3</strong> valk; 7. <strong>Lsc3</strong> wt; 8. <strong>Lsc3</strong> P222L; 9.<br />
<strong>Lsc3</strong> D225A; 10. <strong>Lsc3</strong> D225N; M on suurusmarker PageRuler TM SM0671 (Fermentas).<br />
Nägime, et uuritavate <strong>levaansukraasi</strong> mutantide rakuekstraktid sisaldavad suures koguses<br />
valku, mis on SDS-geelis samasuguse liikuvusega nagu muteerimata levaansukraas. See<br />
tõestab, et muteeritud valgud ekspresseeruvad hästi ning muutused valkude aktiivsuses<br />
tulenevad nende erinevatest omadustest, mitte valgu hulga vähenemisest rakuekstraktis.<br />
Ainuke erand oli <strong>Lsc3</strong> mutant Asp219Asn, mis rekombinantses rakuekstraktis ei<br />
ekspresseerunud.<br />
Et kontrollida <strong>levaansukraasi</strong>de ensümaatilist aktiivsust, lahutasime rekombinantsed<br />
rakuekstraktid mittedenatureerivas polüakrüülamiidgeelis. Paralleelset valmistasime kaks<br />
natiivset geeli – ühe ilmutasime levaani sünteesi järgi toatemperatuuril McIllvaine’i puhvriga<br />
(pH 6.0) 10% sahharoosi lahuses ning teise geeli värvisime valgu järgi. Kontrollina kandsime<br />
geelile puhastatud muteerimata <strong>Lsc3</strong> valku ning tühja vektorit sisaldavat E. coli rakuekstrakti<br />
(Joonis 5).<br />
26
Change language